CN108498869A - 多酚类交联剂及其在制备抗钙化生物瓣膜中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种多酚类交联剂及其在制备抗钙化生物瓣膜中的应用，多酚类交联剂是将多酚类化合物溶于有机溶剂中，然后采用缓冲液稀释制备得到；多酚类化合物选自原花青素、姜黄素、白藜芦醇、葛根素、芦荟素和芦荟大黄素中的一种或多种；抗钙化生物瓣膜的制备方法包括步骤：将完全脱细胞的生物基材料浸入多酚类交联剂中进行交联，结束后进行充分清洗；再浸入PBS溶液和/或D‑Hanks溶液中进行后处理，得到抗钙化生物瓣膜。本发明提供的抗钙化生物瓣膜具备更好的力学性能及稳定性，能显著减少组织钙化、炎症及血栓，降低生物毒性，大大延长使用寿命，克服传统戊二醛交联方法处理的生物心脏瓣膜材料钙化严重、使用寿命短等缺陷。

Description

多酚类交联剂及其在制备抗钙化生物瓣膜中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学工程学技术领域，具体涉及一种多酚类交联剂及其在制备抗钙化生物瓣膜中的应用。
背景技术
近年来，全世界范围内心脏瓣膜类疾病的发病率持续升高，美国每年要进行8万例人工心脏瓣膜置换手术，同时大约有2万人直接死于此病。临床上瓣膜性心脏病的常规治疗方案以人工机械瓣膜和人工生物瓣膜置换为主，其中使用人工机械瓣膜的患者需要长期抗凝治疗，术后发生血栓和抗凝并发症的几率较大，因而近年来逐渐被人工生物瓣膜所取代。人工生物瓣膜以牛心包、猪心包为主要来源，经一系列交联及抗钙化处理后去除了免疫原性，保持了材料的原始结构和机械性能，植入后无需终生抗凝，血栓发生率低。
戊二醛在近50年以来一直是应用最广泛的化学交联剂，然而经其处理后的人工生物瓣膜晚期钙化现象严重，大量组织基质丢失，生物力学性能下降，瓣叶衰败率高，其中低龄患者更为明显，严重影响患者寿命。此外，残余戊二醛产生的游离醛基具有细胞毒作用，易引发严重反应，直接影响了生物瓣的生物相容性。因此研究者将经戊二醛交联后的生物瓣膜进行后处理，如醇类(如乙醇、丁二醇或丙三醇等)处理、金属离子(如Fe3+、Mg2+、Al3+等)络合磷酸基团、环氧化合物或羟基铬封闭羧基及氨基、α-氨基油酸络合醛基等方法可一定程度上延缓瓣膜发生钙化，但效果十分有限，且新的试剂引入会再次带来生物安全性问题。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种多酚类交联剂及其在制备抗钙化生物瓣膜中的应用，以通过采用多酚类天然化合物改性的生物心脏瓣膜材料，具备更好的力学性能及稳定性，能显著减少组织钙化、炎症及血栓，降低生物毒性，从而大大延长使用寿命，克服传统戊二醛交联方法处理的生物心脏瓣膜材料钙化严重、使用寿命短等缺陷。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种多酚类交联剂，多酚类交联剂是将多酚类化合物溶于有机溶剂中，然后采用缓冲液稀释制备得到；其中，多酚类化合物的质量和有机溶剂的体积的比值为1mg：(0.1～1000)mL。
优选地，多酚类化合物选自黄酮类、单宁类、酚酸类和花色苷类中的一种或多种；多酚类化合物选自原花青素、姜黄素、白藜芦醇、葛根素、芦荟素和芦荟大黄素中的一种或多种。
优选地，有机溶剂选自乙醇和/或二甲基亚砜；缓冲液选自PBS溶液和/或D-Hanks溶液；多酚类交联剂的浓度为0.001～10.0mg/mL，多酚类交联剂的pH值为5.0～9.0。本发明中，PBS磷酸盐缓冲液(1L)的配方组成如下：氯化钠(NaCl)8g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.42g，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.27g，氯化钾(KCl)0.2g；D-Hanks溶液(模拟体液)(1L)的配方组成如下：氯化钠(NaCl)8.0g，磷酸氢二钠七水合物(Na2HPO4.7H2O)0.09g，氯化钾(KCl)0.4g，磷酸二氢钾(KH2PO4)40.06g，氢氧化钠(NaHCO3)0.35g。
需要说明的是，多酚类化合物具有抗氧化、强化血管壁、促进肠胃消化、降低血脂肪、增强抵抗力、防止动脉硬化、抗血栓形成等作用，是一类可降解、无毒、无致癌性的天然物质。其中葡萄种子提取物原花青素是一种稳定胶原基质的天然交联剂，毒性远小于戊二醛，经其交联的牛肌腱和心包膜出现更多的胶原表达和沉积，移植后不发生钙化，且机械强度和抗酶降解能力与戊二醛相当。据推测，原花青素中的酚羟基可与生物心脏瓣膜中的胶原蛋白中的-OH、-COOH、ε-氨基团形成稳定的氢键，从而将其交联固定。因此，多酚类化合物可用于猪心包、牛心包、小肠、鱼鳔和肠系膜等人工生物瓣膜材料的交联处理，有效降低生物瓣膜的钙化和退变发生概率的同时大大降低交联剂的生物毒性。
第二方面，本发明还保护多酚类交联剂在制备抗钙化生物瓣膜中的应用。
多酚类交联剂在制备抗钙化生物瓣膜中的应用方法法包括步骤：将完全脱细胞的生物基材料浸入多酚类交联剂中进行交联，交联结束后采用PBS溶液和/或D-Hanks溶液进行充分清洗；将清洗后的生物基材料浸入PBS溶液和/或D-Hanks溶液中进行后处理，得到抗钙化生物瓣膜。
优选地，交联的温度为10～40℃，交联的摇动速度为20～200rpm，交联的时间为1～100h；后处理的时间为2～15天；抗钙化生物瓣膜保存在1～6℃的PBS溶液和/或D-Hanks溶液中备用。
完全脱细胞的生物基材料的制备方法包括步骤：S1：将生物基材料剥去表面脂肪，然后依次用去离子水、PBS溶液和/或D-Hanks溶液漂洗数次；其中，生物基材料包括但不限于猪心包、牛心包、小肠、鱼鳔和肠系膜中的一种或多种；S2：将S1处理后的生物基材料采用1％十二烷基磺酸钠(SDS)进行心包细胞脱除，然后采用PBS溶液和/或D-Hanks溶液漂洗数次，再在室温下使用1％Triton X-100处理0.5～4.0h；S3：将S2处理后的生物基材料采用PBS溶液和/或D-Hanks溶液在4℃漂洗7～14天，然后采用2U/mL DNase在37℃下以120rpm的转速匀速摇动6～24h；S4：将S3处理后的生物基材料采用PBS溶液和/或D-Hanks溶液以120rpm的转速摇动5～24h，得到完全脱细胞的生物基材料。需要说明的是，S2中采用PBS溶液和/或D-Hanks溶液漂洗数次，是为了去除残留SDS溶液；S3中采用PBS溶液和/或D-Hanks溶液在4℃漂洗7～14天，是为了去除残留溶液和细胞碎片；采用2U/mL DNase在37℃下以120rpm的转速匀速摇动6～24h，是为了脱去细胞核；S4中采用PBS溶液和/或D-Hanks溶液以120rpm的转速摇动5～24h，是为了彻底去除心包细胞残渣、碎片及游离蛋白质、核酸。
优选地，S1中，生物基材料保存在2～10℃的储存运输液中；储存运输液为含有青霉素和链霉素的PBS溶液和/或含有青霉素和链霉素的D-Hanks溶液；含有青霉素和链霉素的PBS溶液或含有青霉素和链霉素的D-Hanks溶液中，青霉素的浓度为100U/mL，链霉素的浓度为0.1mg/mL。需要说明的是，对于猪心包和/或牛心包，也可以将新鲜的猪心和/或牛心保存在上述的2～10℃的储存运输液中，然后在4h内，在无菌环境中，从新鲜猪心和/或新鲜牛心剪取猪心包和/或牛心包，再剥去表面脂肪，然后依次用去离子水、PBS溶液和/或D-Hanks溶液漂洗数次，其也应该在本发明的保护范围内。
优选地，S2中，心包细胞脱除在室温下进行，心包细胞脱除的过程的摇动转速为0～200rpm，心包细胞脱除的时间为6h。
优选地，S4中，将完全脱细胞的生物基材料采用4℃的无菌PBS溶液储存备用。
本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：
(1)本发明提供的多酚类交联剂是指天然多酚类化合物，具有抗氧化、强化血管壁、降低血脂肪、防止动脉硬化、抗血栓形成等有益功能，同时毒性远低于现有的戊二醛、无致癌性；材料获取方便，产量高，成本低；用多酚类交联剂处理的心包材料出现更多的胶原表达和沉积，移植后不发生钙化，且机械强度和抗酶降解能力与戊二醛相当；
(2)脱细胞的生物基材料用于人工心脏瓣膜材料时需要进行交联以去除免疫原性、保持材料的原始结构和机械性能，而戊二醛作为使用最广泛的化学交联剂存在以下诸多问题：经其处理后的人工生物瓣膜晚期钙化现象严重，大量组织基质丢失，生物力学性能下降，瓣叶衰败率高，其中低龄患者更为明显，严重影响患者寿命；针对现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种利用多酚类天然化合物对生物瓣膜材料进行交联处理以延缓其钙化及退变的新方法；与现有技术的人工心脏瓣交联处理方法相比，本发明改性的生物瓣具备更好的力学性能及稳定性、能显著减少组织钙化、炎症及血栓，降低生物毒性，从而使用寿命大大延长，克服了传统戊二醛交联方法处理的生物心脏瓣膜材料钙化严重、使用寿命短等缺陷，为猪心包、牛心包、小肠、鱼鳔和肠系膜等生物材料用于生物瓣膜提出技术革新和可靠基础。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例中的脱细胞牛心包制备的人工心脏瓣膜材料的DNA含量，经H&E染色以分析脱细胞情况及细胞外基质胶原蛋白排布图；
图2为本发明中所用天然多酚类化合物所交联的脱细胞牛心包人工心脏瓣膜材料、传统交联剂戊二醛交联的脱细胞牛心包人工心脏瓣膜材料和未交联的脱细胞牛心包人工心脏瓣膜材料的傅里叶全反射红外(FTIR)图；
图3为本发明中所用天然多酚类化合物所交联的脱细胞牛心包人工心脏瓣膜材料、传统交联剂戊二醛交联的脱细胞牛心包人工心脏瓣膜材料和未交联的脱细胞牛心包人工心脏瓣膜材料的应力-应变曲线图；
图4为本发明中所用天然多酚类化合物所交联的脱细胞牛心包人工心脏瓣膜材料、传统交联剂戊二醛交联的脱细胞牛心包人工心脏瓣膜材料和未交联的脱细胞牛心包人工心脏瓣膜材料皮下埋植2周后H&E染色图；
图5为本发明中所用天然多酚类化合物所交联的脱细胞牛心包人工心脏瓣膜材料、传统交联剂戊二醛交联的脱细胞牛心包人工心脏瓣膜材料和未交联的脱细胞牛心包人工心脏瓣膜材料皮下埋植2周后Von Kossa染色图；
图6为本发明中所用天然多酚类化合物所交联的脱细胞牛心包人工心脏瓣膜材料和传统交联剂戊二醛交联的脱细胞牛心包人工心脏瓣膜材料皮下埋植2周后钙含量比较图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。
本发明提供一种多酚类交联剂，是将多酚类化合物溶解于有机溶剂乙醇和/或二甲基亚砜中，然后采用PBS溶液和/或D-Hanks溶液稀释制备得到，多酚类交联剂的浓度为0.001～10.0mg/mL，多酚类交联剂的pH值为5.0～9.0；
其中，多酚类化合物的质量和有机溶剂的体积的比值为1mg：(0.1～1000)mL，多酚类化合物选自原花青素、姜黄素、白藜芦醇、葛根素、芦荟素和芦荟大黄素中的一种或多种。
另外，本发明还提供了多酚类交联剂在制备抗钙化生物瓣膜中的应用方法，包括步骤：
将完全脱细胞的生物基材料浸入多酚类交联剂中进行交联，交联的温度为10～40℃，交联的摇动速度为20～200rpm，交联1～100h后，采用PBS溶液和/或D-Hanks溶液进行充分清洗；
将清洗后的生物基材料浸入PBS溶液和/或D-Hanks溶液中进行2～15天后处理，得到抗钙化生物瓣膜，置于1～6℃的PBS溶液和/或D-Hanks溶液中储存备用；
其中，完全脱细胞的生物基材料的制备方法包括步骤：
S1：获取新鲜的生物基材料，将新鲜的生物基材料保存在2～10℃的储存运输液中；储存运输液为含有青霉素和链霉素的PBS溶液和/或含有青霉素和链霉素的D-Hanks溶液；含有青霉素和链霉素的PBS溶液或含有青霉素和链霉素的D-Hanks溶液中，青霉素的浓度为100U/mL，链霉素的浓度为0.1mg/mL；其中，生物基材料包括但不限于猪心包、牛心包、小肠、鱼鳔和肠系膜中的一种或多种；
在4h内，在无菌环境中，将生物基材料剥去表面脂肪，然后依次用去离子水、PBS溶液和/或D-Hanks溶液漂洗数次；
S2：将S1处理后的生物基材料在室温下采用1％十二烷基磺酸钠(SDS)进行心包细胞脱除6h，心包细胞脱除过程的摇动转速为0～200rpm，然后采用PBS溶液和/或D-Hanks溶液漂洗数次，以去除残留的SDS溶液，再在室温下使用1％Triton X-100处理0.5～4.0h；
S3：将S2处理后的生物基材料采用PBS溶液和/或D-Hanks溶液在4℃漂洗7～14天，以去除残留溶液和细胞碎片；然后采用2U/mL DNase在37℃以120rpm的转速匀速摇动6～24h，以脱去细胞核；
S4：将S3处理后的生物基材料采用PBS溶液和/或D-Hanks溶液以120rpm的转速摇动5～24h，以彻底去除心包细胞残渣、碎片及游离蛋白质、核酸，得到完全脱细胞的生物基材料，置于4℃的无菌PBS溶液中储存备用。
下面结合具体实施例对本发明提供的技术方案作进一步说明。
实施例一
本实施例提供一种多酚类交联剂，是将姜黄素溶解于有机溶剂乙醇溶液中，然后采用PBS磷酸盐缓冲溶液稀释制备得到，具体制备方法包括步骤：
将0.8mg姜黄素用2mL无水乙醇溶液溶解，再用200mL PBS磷酸盐缓冲液稀释，配成0.004mg/mL的姜黄素交联剂溶液，并调节pH值为7.4；
其中，PBS磷酸盐缓冲液(1L)的配方组成如下：氯化钠(NaCl)8g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.42g，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.27g，氯化钾(KCl)0.2g。
实施例二
本实施例提供一种多酚类交联剂，是将白藜芦醇溶解于有机溶剂乙醇溶液中，然后采用PBS磷酸盐缓冲溶液稀释制备得到，具体制备方法包括步骤：
将100mg白藜芦醇粉末用4mL无水乙醇溶液溶解，再用6mLPBS磷酸盐缓冲液稀释，配成10.0mg/mL的白藜芦醇交联剂溶液，并调节pH值为7.4。
其中，PBS磷酸盐缓冲液(1L)的配方组成如下：氯化钠(NaCl)8g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.42g，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.27g，氯化钾(KCl)0.2g。
实施例三
本实施例提供一种多酚类交联剂，是将芦荟大黄素溶解于有机溶剂乙醇溶液中，然后采用PBS磷酸盐缓冲溶液稀释制备得到，具体制备方法包括步骤：
将3mg芦荟大黄素粉末用20mL无水乙醇溶液溶解，再用80mL PBS磷酸盐缓冲液稀释，配成0.03mg/mL的芦荟大黄素交联剂溶液，并调节pH值为7.4。
其中，PBS磷酸盐缓冲液(1L)的配方组成如下：氯化钠(NaCl)8g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.42g，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.27g，氯化钾(KCl)0.2g。
实施例四
本实施例提供一种完全脱细胞的牛心包人工心脏瓣膜材料的制备方法，包括步骤：
S1：剥取新宰杀的新鲜牛心，将新鲜牛心保存在4℃的储存运输液中；储存运输液为含有青霉素和链霉素的PBS溶液；含有青霉素和链霉素的PBS溶液中，青霉素的浓度为100U/mL，链霉素的浓度为0.1mg/mL；
在4h内，在无菌环境中，从新鲜牛心剪取牛心包，剥去表面脂肪，然后依次用去离子水、PBS溶液漂洗数次；
S2：将S1处理后的牛心包在室温下采用1％十二烷基磺酸钠(SDS)进行心包细胞脱除6h，心包细胞脱除过程的摇动转速为100rpm，然后采用PBS溶液漂洗数次，以去除残留的SDS溶液，再在室温下使用1％Triton X-100处理2.0h；
S3：将S2处理后的牛心包采用PBS溶液在4℃漂洗10天，以去除残留溶液和细胞碎片；然后采用2U/mL DNase在37℃以120rpm的转速匀速摇动15h，以脱去细胞核；
S4：将S3处理后的牛心包采用PBS溶液以120rpm的转速摇动12h，以彻底去除心包细胞残渣、碎片及游离蛋白质、核酸，得到完全脱细胞的牛心包人工心脏瓣膜材料，置于4℃的无菌PBS溶液中储存备用。
实施例五
本实施例提供一种采用实施例一的多酚类交联剂(姜黄素交联剂)、实施例四的完全脱细胞的牛心包人工心脏瓣膜材料制备抗钙化生物瓣膜的方法，包括步骤：
将完全脱细胞的牛心包心脏瓣膜材料浸入多酚类交联剂中进行交联，交联的温度为25℃，交联的摇动速度为100rpm，交联24h后，采用PBS溶液进行充分清洗；
将清洗后的牛心包材料浸入PBS溶液中进行2天的后处理，得到抗钙化生物瓣膜，置于4℃的PBS溶液中储存备用。
实施例六
本实施例提供一种采用实施例二的多酚类交联剂(白藜芦醇交联剂)、实施例四的完全脱细胞的牛心包人工心脏瓣膜材料制备抗钙化生物瓣膜的方法，包括步骤：
将完全脱细胞的牛心包心脏瓣膜材料浸入多酚类交联剂中进行交联，交联的温度为25℃，交联的摇动速度为100rpm，交联48h后，采用PBS溶液进行充分清洗；
将清洗后的牛心包材料浸入PBS溶液中进行2天的后处理，得到抗钙化生物瓣膜，置于4℃的PBS溶液中储存备用。
实施例七
本实施例提供一种采用实施例三的多酚类交联剂(芦荟大黄素交联剂)、实施例四的完全脱细胞的牛心包人工心脏瓣膜材料制备抗钙化生物瓣膜的方法，包括步骤：
将完全脱细胞的牛心包心脏瓣膜材料浸入多酚类交联剂中进行交联，交联的温度为25℃，交联的摇动速度为100rpm，交联36h后，采用PBS溶液进行充分清洗；
将清洗后的牛心包材料浸入PBS溶液中进行2天的后处理，得到抗钙化生物瓣膜，置于4℃的PBS溶液中储存备用。
对比例一
本对比例提供一种采用实施例四的完全脱细胞的牛心包人工心脏瓣膜材料制备抗钙化生物瓣膜的方法，包括步骤：
将完全脱细胞的牛心包人工心脏瓣膜材料浸入戊二醛交联剂中进行交联，交联的温度为25℃，交联的摇动速度为100rpm，交联36h后，采用PBS溶液进行充分清洗；
将清洗后的牛心包材料浸入PBS溶液中进行2天后处理，得到抗钙化生物瓣膜，置于4℃的PBS溶液中储存备用。
将本发明实施例四至实施例七制备得到的抗钙化生物瓣膜(脱细胞牛心包制备的人工心脏瓣膜材料)，进行组织学染色观察、力学性能测试，并进行了小鼠皮下埋植以评估抗钙化性能。并且采用对比例制备得到的抗钙化生物瓣膜(戊二醛交联)、实施例四制备得到的完全脱细胞的牛心包人工心脏瓣膜材料(未交联)作为对照。
1、组织学染色
抗钙化生物瓣膜(脱细胞牛心包制备的人工心脏瓣膜材料)经4％多聚甲醛固定6h后，用PBS溶液清洗几遍，30％(w/v)蔗糖脱水至样品沉入底部，用冰冻切片包埋剂(OCT)包埋样品，-20℃冰冻切片，厚度为6μm，进行H&E染色组织学分析脱细胞情况及细胞外基质胶原蛋白排布。
2、力学性能测试
将未交联的、多酚类交联和戊二醛交联的牛心包保存在PBS磷酸盐溶液中，并测试湿态下的力学性能：将需测试牛心包瓣膜材料沿胶原纤维方向剪成10mm*30mm的样品(n＝3)，拉伸速度10mm/min(model 3345,Norwood,MA)，分析应力-应变曲线得到最大拉伸强度、弹性模量、断裂伸长率。
各实施例、对比例的结果如下表1所示。表1为本发明所用天然多酚类化合物所交联的脱细胞牛心包人工心脏瓣膜材料，传统交联剂戊二醛交联的脱细胞牛心包人工心脏瓣膜材料和未交联的脱细胞牛心包人工心脏瓣膜材料的力学性能统计结果，包括最大拉伸强度、弹性模量、断裂伸长率。
表1最大拉伸强度、弹性模量、断裂伸长率结果
3、皮下植入模型评价瓣膜材料钙化
实验动物选用50g左右的Wistar雄性幼鼠，将未交联的、多酚类交联和戊二醛交联的牛心包剪成1cm×1cm大小，腹腔注射10％水合氯醛麻醉大鼠(0.33mL/100g体重)后，剃皮毛。左右侧背部皮下分别植入实验组样品和戊二醛交联对照组样品，缝合皮肤切口，2周后将动物安乐死，取出移植物。
(1)原子吸收光谱测定组织钙含量：将未交联的、多酚类交联和戊二醛交联的牛心包经80℃干燥48h后准确称重，加入浓硝酸和过氧化氢处理后微波消化，超纯水定容后采用原子吸收分光光度法测量钙含量。钙标准液浓度为0.0μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、4.0μg/mL、8.0μg/mL；
(2)组织学染色定性观察钙化情况：H&E和Von Kossa染色直观反映样品的组织形态学改变和局部微观钙化点分布。
实施例五结果：
经脱细胞得到的牛心包材料几乎无细胞核，说明脱细胞程度良好，极大地避免了免疫原性，且细胞外基质胶原纤维连续、完整，呈网状或波浪状分布(图1)。红外特征基团(图2)显示脱细胞牛心包表面有少量姜黄素存在。0.004mg/mL姜黄素交联得到的牛心包最大拉伸强度为12.30±1.72MPa(图3，表1)，远高于6.25mg/mL戊二醛交联的牛心包材料(最大拉伸强度8.35±1.31MPa)，弹性模量(78.49±6.34MPa)也远高于戊二醛组(34.42±8.15MPa)，断裂伸长率(53.67±4.98％)与戊二醛处理的牛心包相当(56.68±7.27％)，以上力学性能结果说明经低浓度姜黄素交联处理后即可取得力学强度及韧性高于传统戊二醛交联处理的弹性材料。皮下埋植2周H&E染色结果(图4)显示姜黄素交联组细胞浸润远好于戊二醛组，炎症反应程度远低于戊二醛组；Von Kossa染色结果(图5)显示姜黄素交联组牛心包周围几乎未出现钙结节，而戊二醛组出现大量钙沉积，预示其在体内存在严重钙化情况，说明经姜黄素交联的牛心包抗钙化能力远优于戊二醛交联组，整体表现出更优异的力学及抗钙化性能，多酚类交联剂在抗钙化生物瓣膜中有一定的应用前景。
实施例六结果：
交联后的牛心包生物瓣膜材料同样能维持心包原来的质感、柔润而不皱缩。10.0mg/mL白藜芦醇交联得到的牛心包最大拉伸强度为20.61±4.11MPa(图3，表1)，远高于6.25mg/mL戊二醛交联的牛心包材料(最大拉伸强度8.35±1.31MPa)，弹性模量(87.89±12.66MPa)也远高于戊二醛组(34.42±8.15MPa)，断裂伸长率(63.80±1.40％)高于戊二醛组(47.66±7.75％)，以上力学性能结果说明经白藜芦醇交联处理后可取得力学强度及韧性高于传统戊二醛交联处理的弹性材料。皮下埋植2周H&E染色结果(图4)显示白藜芦醇交联组细胞浸润到材料内部，浸润深度远好于戊二醛组，且炎症反应程度也低于戊二醛组；Von Kossa染色结果(图5)显示白藜芦醇交联组牛心包周围几乎未出现钙结节，而戊二醛组出现大量钙沉积，预示其在体内存在严重钙化情况，说明经白藜芦醇交联的牛心包抗钙化能力远优于戊二醛交联组，整体表现出更优异的力学及抗钙化性能，多酚类交联剂在抗钙化生物瓣膜中有一定的应用前景。
实施例七结果：
交联后的牛心包生物瓣膜材料同样能维持心包原来的质感、柔润而不皱缩。0.03mg/mL芦荟大黄素交联得到的牛心包最大拉伸强度为12.85±2.01MPa(图3，表1)，远高于6.25mg/mL戊二醛交联的牛心包材料(最大拉伸强度8.35±1.31MPa)，弹性模量(85.73±25.78MPa)也远高于戊二醛组(20.74±6.69MPa)，断裂伸长率(38.68±1.40％)略低于戊二醛组(47.66±7.75％)，以上力学性能结果说明经低剂量芦荟大黄素交联处理后即可取得力学性能优于传统戊二醛交联的牛心包弹性材料。
皮下埋植2周H&E染色结果(图4)显示芦荟大黄素交联组细胞大量分布在材料内部，细胞浸润十分充分，远好于戊二醛组，且炎症反应程度也远低于戊二醛组；Von Kossa染色结果(图5)显示芦荟大黄素交联组牛心包周围几乎未出现钙结节，而戊二醛组出现大量钙沉积，预示其在体内存在严重钙化情况，说明经芦荟大黄素交联的牛心包抗钙化能力远优于戊二醛交联组，整体表现出更优异的力学及抗钙化性能，多酚类交联剂在抗钙化生物瓣膜中有一定的应用前景。
实施例和对比例的钙化结果：图6为本发明中所用天然多酚类化合物所交联的脱细胞牛心包人工心脏瓣膜材料和传统交联剂戊二醛交联的脱细胞牛心包人工心脏瓣膜材料皮下埋植2周后钙含量比较图。***表示p<0.001，组间有显著差异。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。

Claims (10)

1.一种多酚类交联剂，其特征在于：
所述多酚类交联剂是将多酚类化合物溶于有机溶剂中，然后采用缓冲液稀释制备得到；
其中，所述多酚类化合物的质量和所述有机溶剂的体积的比值为1mg：(0.1～1000.0)mL。
2.根据权利要求1所述的多酚类交联剂，其特征在于：
所述多酚类化合物选自黄酮类、单宁类、酚酸类和花色苷类中的一种或多种；所述多酚类化合物选自原花青素、姜黄素、白藜芦醇、葛根素、芦荟素和芦荟大黄素中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的多酚类交联剂，其特征在于：
所述有机溶剂选自乙醇和/或二甲基亚砜；所述缓冲液选自PBS溶液和/或D-Hanks溶液；
所述多酚类交联剂的浓度为0.001～10.0mg/mL，所述多酚类交联剂的pH值为5.0～9.0。
4.权利要求1-3任一项所述的多酚类交联剂在制备抗钙化生物瓣膜中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括步骤：
将完全脱细胞的生物基材料浸入所述多酚类交联剂中进行交联，交联结束后采用PBS溶液和/或D-Hanks溶液进行充分清洗；
将清洗后的生物基材料浸入PBS溶液和/或D-Hanks溶液中进行后处理，得到抗钙化生物瓣膜。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：
所述交联的温度为10～40℃，所述交联的摇动速度为20～200rpm，所述交联的时间为1～100h；
所述后处理的时间为2～15天；
所述抗钙化生物瓣膜保存在1～6℃的PBS溶液和/或D-Hanks溶液中备用。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，
所述完全脱细胞的生物基材料的制备方法包括步骤：
S1：将生物基材料剥去表面脂肪，然后依次用去离子水、PBS溶液和/或D-Hanks溶液漂洗数次；其中，所述生物基材料包括但不限于猪心包、牛心包、小肠、鱼鳔和肠系膜中的一种或多种；
S2：将S1处理后的生物基材料采用1％十二烷基磺酸钠进行心包细胞脱除，然后采用PBS溶液和/或D-Hanks溶液漂洗数次，再在室温下使用1％TritonX-100处理0.5～4.0h；
S3：将S2处理后的生物基材料采用PBS溶液和/或D-Hanks溶液在4℃漂洗7～14天，然后采用2U/mL DNase在37℃下以120rpm的转速匀速摇动6～24h；
S4：将S3处理后的生物基材料采用PBS溶液和/或D-Hanks溶液以120rpm的转速摇动5～24h，得到所述完全脱细胞的生物基材料。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
S1中，所述生物基材料保存在2～10℃的储存运输液中；所述储存运输液为含有青霉素和链霉素的PBS溶液和/或含有青霉素和链霉素的D-Hanks溶液；所述含有青霉素和链霉素的PBS溶液或含有青霉素和链霉素的D-Hanks溶液中，所述青霉素的浓度为100U/mL，所述链霉素的浓度为0.1mg/mL。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
S2中，所述心包细胞脱除在室温下进行，所述心包细胞脱除的过程的摇动转速为0～200rpm，所述心包细胞脱除的时间为6h。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
S4中，将所述完全脱细胞的生物基材料采用4℃的无菌PBS溶液储存备用。
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