CN110613865A - 碳二亚胺和多酚组合处理的生物瓣膜材料制备及保存方法 - Google Patents

碳二亚胺和多酚组合处理的生物瓣膜材料制备及保存方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种碳二亚胺和多酚组合处理的生物瓣膜材料制备及保存方法，制备方法包括如下步骤：a.将鱼鳔进行裁剪并脱细胞；b.将脱细胞的鱼鳔浸泡在糖胺多糖酶抑制剂溶液中；c.采用碳二亚胺，N‑羟基丁二酰亚胺，和姜黄素/原花青素混合溶液进行交联固定；d.采用碳二亚胺和N‑羟基丁二酰亚胺混合溶液进行交联固定；e.漂洗后采用抑菌溶剂保存或采用醇溶液脱水干燥后保存。本发明制备的生物瓣膜材料，提高了糖胺多糖、弹性蛋白的稳定性以及抗钙化性能，是一种具有应用前景的新型生物瓣膜材料。

Description

碳二亚胺和多酚组合处理的生物瓣膜材料制备及保存方法
技术领域
本发明属于生物瓣膜材料技术领域，具体涉及一种碳二亚胺和多酚组合处理的生物瓣膜材料制备及保存方法。
背景技术
当前市场上的人工生物心脏瓣膜材料主要采用猪或牛的心包膜作为原材料，并用戊二醛溶液交联制备而成。猪或牛的心包膜材料来源有限，特别是当出现大规模动物疫情时，原材料的采集以及运输不便。并且戊二醛交联的心包膜制备的人工生物瓣膜，因为钙化等问题导致其目前使用寿命只有10年左右。基于此，开发新型具有抗钙化性能的生物瓣膜材料具有重要的临床价值和社会意义。
发明内容
本发明的目的在于：为了解决现有技术中存在的不足，提供一种碳二亚胺和多酚组合处理的生物瓣膜材料制备及保存方法，能够提升生物瓣膜糖胺多糖稳定性及抗钙化性能，潜在地延长其使用寿命。
本发明采用的技术方案如下：
一种碳二亚胺和多酚组合处理的生物瓣膜材料制备方法，包括以下步骤：
a.裁剪鱼鳔并脱细胞，得到脱细胞的鱼鳔；
b.将步骤a所得脱细胞的鱼鳔浸泡在糖胺多糖酶抑制剂溶液中；
c.将上述浸泡后鱼鳔采用碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺和多酚化合物混合溶液进行交联固定；
d.将上述交联固定后的鱼鳔再次采用碳二亚胺以及N-羟基丁二酰亚胺混合溶液进行交联固定，然后漂洗，即得。
鱼鳔的组成成分与动物心包膜相似，主要成分包括胶原蛋白，弹性蛋白以及糖胺多糖。采用鱼鳔作为替代动物心包膜的生物瓣膜材料显示出更好的抗钙化性能，相当的力学性能。采用糖胺多糖酶抑制剂和碳二亚胺组合处理动物心包膜，相比于戊二醛交联的心包膜，可以有效提高糖胺多糖、弹性蛋白的稳定性以及抗钙化性能。
姜黄素又称姜黄色素、酸性黄，是从姜科植物姜黄、莪术、芥末、咖哩、郁金等根茎中提取的一种天然的酚类抗氧化剂，主链为不饱和脂族及芳香族基团，是植物界很稀少的具有二酮的色素，属二酮类化合物。多酚类化合物单独浸泡处理的鱼鳔瓣膜材料比戊二醛交联的鱼鳔瓣膜材料抗钙化性能得到提高。
原花青素是植物中广泛存在的一大类结构与花青素相似，是由黄烷-3-醇单体缩合而成的聚多酚类物质。具有极强的抗氧化等活性，已广泛应用于食品、药品、化妆品等领域。采用原花青素交联的动物心包膜，相比于戊二醛交联的心包膜，具有更好的抗钙化性能。
本发明采用碳二亚胺和姜黄素/原花青素组合处理制备的生物瓣膜材料，与现有猪或牛心包膜生物瓣膜材料以及现有戊二醛交联的鱼鳔生物瓣膜材料相比，提高了糖胺多糖、弹性蛋白的稳定性以及抗钙化性能，是一种具有应用前景的新型生物瓣膜材料。
进一步地，鱼鳔取自鲤鱼、草鱼、鲫鱼、鲢鱼、鳙鱼、鳊鱼、黄花鱼、鲟鱼、鲅鱼或石首鱼。
进一步地，步骤a中脱细胞具体为：将鱼鳔放置于0.1-1wt％的十二烷基硫酸钠和0.1-1wt％的脱氧胆酸钠等体积混合的混合溶液中浸泡24-48h，然后在无菌PBS溶液中漂洗1-2d；优选为放置于0.5wt％十二烷基硫酸钠和0.5wt％脱氧胆酸钠等体积混合的混合溶液中常温处理24h。
进一步地，步骤b中糖胺多糖酶抑制剂包括：新霉素(CAS：1404-04-2)，硫酸新霉素(CAS：1405-10-3)，芹菜素(CAS：520-36-5)，山奈酚(CAS：520-18-3)，毛蕊花糖(CAS：546-62-3)中的至少一种；所述糖胺多糖酶浸泡具体为：将脱细胞的鱼鳔浸泡于1-100mM糖胺多糖酶抑制剂的PBS溶液中1-24h；优选为浸泡于50mM糖胺多糖酶抑制剂的PBS溶液中2h。
进一步地，步骤c中碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺以及多酚化合物混合溶液进行交联固定具体为：将浸泡后鱼鳔浸泡在等体积混合的碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺以及姜黄素/原花青素的乙醇和水混合pH缓冲溶液中24-48h；其中碳二亚胺浓度为10-50mM，N-羟基丁二酰亚胺浓度为1-20mM，姜黄素的浓度为1-100mM，原花青素的浓度为1-10mg/mL；优选为，碳二亚胺浓度为30mM，N-羟基丁二酰亚胺浓度为6mM，姜黄素的浓度为50mM，原花青素的浓度为5mg/mL。
进一步地，步骤d中碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺混合溶液进行交联固定具体为：将交联固定后的鱼鳔浸泡在等体积混合的10-50mM碳二亚胺和1-20mM N-羟基丁二酰亚胺的水混合pH缓冲溶液中24-48h；优选为浸泡在等体积混合的30mM碳二亚胺和6mM N-羟基丁二酰亚胺的水混合pH缓冲溶液中24h。
上述的制备方法制备得到的生物瓣膜材料。
上述的生物瓣膜材料的保存方法：采用抑菌溶剂保存或采用醇溶液脱水干燥后保存。
进一步地，抑菌溶剂保存具体为：将生物瓣膜材料浸泡于20-100vt％的异丙醇水溶液中保存；优选为浸泡于50vt％的异丙醇水溶液中保存。
进一步地，醇溶液脱水干燥后保存具体为：将生物瓣膜材料浸泡于10-30vt％甘油与70-90vt％乙醇等体积混合的混合溶液或10-30vt％甘油、35-45vt％乙醇与35-45vt％异丙醇等体积混合的混合溶液中4-24h，干燥，即可；优选为浸泡于20vt％甘油与80vt％乙醇等体积混合的混合溶液或20vt％甘油、40vt％乙醇与40vt％异丙醇等体积混合的混合溶液中4h。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、与现有猪或牛心包膜生物瓣膜材料以及现有戊二醛交联的鱼鳔生物瓣膜材料相比，本发明方法制备得到的生物瓣膜材料，显著提高了糖胺多糖和弹性蛋白的稳定性；
2、与现有猪或牛心包膜生物瓣膜材料以及现有戊二醛交联的鱼鳔生物瓣膜材料相比，本发明方法制备得到的生物瓣膜材料，提高了抗钙化性能；
3、与现有猪或牛心包膜生物瓣膜材料以及现有戊二醛交联的鱼鳔生物瓣膜材料相比，本发明方法制备得到的生物瓣膜材料，力学性能略有提高。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
因此，以下对提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本发明较佳实施例提供的一种碳二亚胺和多酚组合处理的生物瓣膜材料制备及保存方法，具体步骤如下：
a.将鱼鳔进行裁剪并脱细胞：将所述鱼鳔放置于0.5wt％十二烷基硫酸钠和0.5wt％脱氧胆酸钠等体积混合的混合溶液中常温处理24h,之后用无菌PBS溶液中漂洗1d。
b.将脱细胞的鱼鳔浸泡在糖胺多糖酶抑制剂溶液中：将上述的脱细胞的鱼鳔材料常温浸泡于50mM新霉素PBS溶液中2h。
c.采用碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺以及姜黄素/原花青素混合溶液进行交联固定：上述鱼鳔室温浸泡在30mM碳二亚胺，6mM N-羟基丁二酰亚胺和50mM姜黄素/5mg/mL原花青素的乙醇和水混合pH缓冲溶液中24h。
d.采用碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺混合溶液进行交联固定：将上述鱼鳔室温浸泡在30mM碳二亚胺和6mM N-羟基丁二酰亚胺pH缓冲溶液中24h。
e.漂洗后采用抑菌溶剂保存或采用醇溶液脱水干燥后保存：将漂洗后的鱼鳔材料浸泡于20vt％甘油、40vt％乙醇和40vt％异丙醇等体积混合的混合溶液中4h后自然风干后室温保存。
实施例2
本发明较佳实施例提供的一种碳二亚胺和多酚组合处理的生物瓣膜材料制备及保存方法，具体步骤如下：
a.将鱼鳔进行裁剪并脱细胞：将所述鱼鳔放置于0.5wt％十二烷基硫酸钠和0.5wt％脱氧胆酸钠等体积混合的混合溶液中常温处理24h,之后用无菌PBS溶液中漂洗1d。
b.将脱细胞的鱼鳔浸泡在糖胺多糖酶抑制剂溶液中：将上述的脱细胞的鱼鳔材料常温浸泡于50mM硫酸新霉素PBS溶液中2h。
c.采用碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺以及姜黄素/原花青素混合溶液进行交联固定：上述鱼鳔室温浸泡在30mM碳二亚胺，6mM N-羟基丁二酰亚胺和50mM姜黄素/5mg/mL原花青素的乙醇和水混合pH缓冲溶液中24h。
d.采用碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺混合溶液进行交联固定：将上述鱼鳔室温浸泡在30mM碳二亚胺和6mM N-羟基丁二酰亚胺pH缓冲溶液中24h。
e.漂洗后采用抑菌溶剂保存或采用醇溶液脱水干燥后保存：将漂洗后的鱼鳔材料浸泡于20vt％甘油、40vt％乙醇和40vt％异丙醇等体积混合的混合溶液中4h后自然风干后室温保存。
实施例3
本发明较佳实施例提供的一种碳二亚胺和多酚组合处理的生物瓣膜材料制备及保存方法，具体步骤如下：
a.将鱼鳔进行裁剪并脱细胞：将所述鱼鳔放置于0.5wt％十二烷基硫酸钠和0.5wt％脱氧胆酸钠等体积混合的混合溶液中常温处理24h,之后用无菌PBS溶液中漂洗1天。
b.将脱细胞的鱼鳔浸泡在糖胺多糖酶抑制剂溶液中：将所述的脱细胞的鱼鳔材料常温浸泡于50mM新霉素PBS溶液中2h。
c.采用碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺以及姜黄素/原花青素混合溶液进行交联固定：上述鱼鳔室温浸泡在30mM碳二亚胺，6mM N-羟基丁二酰亚胺和50mM姜黄素/5mg/mL原花青素的乙醇和水混合pH缓冲溶液中24h。
d.采用碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺混合溶液进行交联固定：将上述鱼鳔室温浸泡在30mM碳二亚胺和6mM N-羟基丁二酰亚胺pH缓冲溶液中24h。
e.漂洗后采用抑菌溶剂保存或采用醇溶液脱水干燥后保存：将漂洗后的鱼鳔材料浸泡于50vt％的异丙醇水溶液中保存。
实验例
设置对照组1、对照组2和对照组3，与实施例1和实施例2制得的材料分别进行糖胺多糖稳定性测试、弹性蛋白稳定性测试、抗钙化性能测试和单轴力学拉伸性能测试。
对照组1：将猪心包放置于0.5wt％十二烷基硫酸钠和0.5wt％脱氧胆酸钠等体积混合的混合溶液中常温处理24h，之后用无菌PBS溶液中漂洗1天。依次浸泡在0.1vt％，0.5vt％，1vt％的戊二醛PBS溶液中交联24h。再浸泡于20vt％甘油、40vt％乙醇和40vt％异丙醇等体积混合的混合溶液中4h后自然风干后室温保存。
对照组2：将鲤鱼鱼鳔放置于0.5wt％十二烷基硫酸钠和0.5wt％脱氧胆酸钠等体积混合的混合溶液中常温处理24h，之后用无菌PBS溶液中漂洗1天。依次浸泡在0.1vt％，0.5vt％，1vt％的戊二醛PBS溶液中交联24h。浸泡于20vt％甘油、40vt％乙醇和40vt％异丙醇混合的混合溶液中4h后自然风干后室温保存。
对照组3：将猪心包放置于0.5wt％十二烷基硫酸钠和0.5wt％脱氧胆酸钠等体积混合的混合溶液中常温处理24h，之后用无菌PBS溶液中漂洗1天。然后浸泡于50mM硫酸新霉素PBS溶液中2h。浸泡在等体积混合的30mM碳二亚胺和6mM N-羟基丁二酰亚胺pH缓冲溶液中24h。浸泡于20vt％甘油、40vt％乙醇和40vt％异丙醇等体积混合的混合溶液中4h后自然风干后室温保存。
(1)糖胺多糖稳定性测试
已裁剪成1cm×1cm的试验组样品和对照组样品清洗好，向20天左右幼年SD大鼠大鼠腹腔注射3％戊巴比妥钠0.1mL进行麻醉，剃除脊柱两旁肌肉上的皮毛，碘酒和酒精常规消毒。右侧背部皮下植入试验组样品1个，左侧背部皮下植入对照组样品1个，缝合皮肤切口。30天后，采用颈椎脱臼法对动物进行安乐死，取出移植物。小心除去移植物表面的宿主组织，生理盐水冲洗干净。冷冻干燥后称量干重，之后采用Blyscan糖胺多糖试剂盒(Biocolor,UK)并按照其说明书进行总糖胺多糖的定量表征。
对实施例1、实施例2、对照组1、对照组2和对照组3制得的材料分别进行糖胺多糖稳定性测试，结果如下表1所示。由表1可知，实施例组的糖胺多糖含量显著提高。
表1总糖胺多糖含量表
g总糖胺多糖/10mg组织
对照组1 39.2±0.6
对照组2 198.5±1.7
对照组3 56.3±2.5
实施例1 412.4±5.6
实施例2 423.4±6.2
(2)弹性蛋白稳定性测试
已裁剪成1cm×1cm的试验组样品和对照组样品清洗好，向20天左右幼年SD大鼠大鼠腹腔注射3％戊巴比妥钠0.1mL进行麻醉，剃除脊柱两旁肌肉上的皮毛，碘酒和酒精常规消毒。右侧背部皮下植入试验组样品1个，左侧背部皮下植入对照组样品1个，缝合皮肤切口。30天后，采用颈椎脱臼法对动物进行安乐死，取出移植物。小心除去移植物表面的宿主组织，生理盐水冲洗干净。冷冻干燥后称量干重，之后采用Fast in弹性蛋白试剂盒(Biocolor,UK)并按照其说明书进行弹性蛋白的定量表征。
对实施例1、实施例2、对照组1、对照组2和对照组3制得的材料分别进行弹性蛋白稳定性测试，结果如下表2所示。由表2可知，实施例组的弹性蛋白含量显著提高。
表2弹性蛋白含量表
弹性蛋白mg/mg组织
对照组1 0.233±0.096
对照组2 1.235±0.231
对照组3 0.451±0.0121
实施例1 2.362±0.236
实施例2 2.696±0.254
(3)抗钙化性能测试
已裁剪成1cm×1cm的试验组样品和对照组样品清洗好，向20天左右幼年SD大鼠大鼠腹腔注射3％戊巴比妥钠0.1mL进行麻醉，剃除脊柱两旁肌肉上的皮毛，碘酒和酒精常规消毒。右侧背部皮下植入试验组样品1个，左侧背部皮下植入对照组样品1个，缝合皮肤切口。30天后，采用颈椎脱臼法对动物进行安乐死，取出移植物。小心除去移植物表面的宿主组织，生理盐水冲洗干净。冷冻干燥后称量干重，之后采用6N浓盐酸在90摄氏度水浴锅中消解直到无可见固体颗粒，之后采用电感耦合等离子体发射光谱仪进行钙元素的定量分析。
对实施例1、实施例2、对照组1、对照组2和对照组3制得的材料分别进行抗钙化性能测试，结果如下表3所示。由表3可知，实施例组的挂钙量减少。
表3挂钙量含量表
挂钙量g/mg
对照组1 16.32±1.32
对照组2 3.21±0.56
对照组3 5.62±0.97
实施例1 0.23±0.06
实施例2 0.36±0.08
(4)单轴力学拉伸性能测试
采用万能试验机对生物瓣膜的生物力学性能进行评价。通过单轴拉伸实验测定生物瓣膜的断裂强度。将生物瓣膜切成3cm*22cm矩形样品，水合后使用测厚仪测试厚度。采取恒10mm/min速率模式进行样品拉伸，记录应力-应变曲线，用以材料的力学性能评价。
对实施例1、实施例2、对照组1、对照组2和对照组3制得的材料分别进行单轴力学拉伸性能测试，结果如下表4所示。由表4可知，实施例组的最大断裂力略优于对照组。
表4最大断裂力表
最大断裂力N
对照组1 3.5±1.1
对照组2 4.3±1.8
对照组3 9.6±1.6
实施例1 9.8±1.8
实施例2 10.5±2.1
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种碳二亚胺和多酚组合处理的生物瓣膜材料制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.裁剪鱼鳔并脱细胞，得到脱细胞的鱼鳔；
b.将步骤a所得脱细胞的鱼鳔浸泡在糖胺多糖酶抑制剂溶液中；
c.将上述浸泡后鱼鳔采用碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺和多酚化合物混合溶液进行交联固定；
d.将上述交联固定后的鱼鳔再次采用碳二亚胺以及N-羟基丁二酰亚胺混合溶液进行交联固定，然后漂洗，即得。
2.根据权利要求1所述的碳二亚胺和多酚组合处理的生物瓣膜材料制备方法，其特征在于：所述鱼鳔取自鲤鱼、草鱼、鲫鱼、鲢鱼、鳙鱼、鳊鱼、黄花鱼、鲟鱼、鲅鱼或石首鱼。
3.根据权利要求1所述的碳二亚胺和多酚组合处理的生物瓣膜材料制备方法，其特征在于，所述步骤a中脱细胞具体为：将鱼鳔放置于0.1-1wt％的十二烷基硫酸钠和0.1-1wt％的脱氧胆酸钠等体积混合的混合溶液中浸泡24-48h，然后在无菌PBS溶液中漂洗1-2d。
4.根据权利要求1所述的碳二亚胺和多酚组合处理的生物瓣膜材料制备方法，其特征在于，所述步骤b中糖胺多糖酶抑制剂包括：新霉素、硫酸新霉素、芹菜素、山奈酚和毛蕊花糖中的至少一种；所述糖胺多糖酶浸泡具体为：将脱细胞的鱼鳔浸泡于1-100mM糖胺多糖酶抑制剂的PBS溶液中1-24h。
5.根据权利要求1所述的碳二亚胺和多酚组合处理的生物瓣膜材料制备方法，其特征在于，所述步骤c中碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺以及多酚化合物混合溶液进行交联固定具体为：将浸泡后鱼鳔浸泡在等体积混合的碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺以及姜黄素/原花青素的乙醇和水混合pH缓冲溶液中24-48h；其中碳二亚胺浓度为10-50mM，N-羟基丁二酰亚胺浓度为1-20mM，姜黄素的浓度为1-100mM，原花青素的浓度为1-10mg/mL。
6.根据权利要求1所述的碳二亚胺和多酚组合处理的生物瓣膜材料制备方法，其特征在于，所述步骤d中碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺混合溶液进行交联固定具体为：将交联固定后的鱼鳔浸泡在等体积混合的10-50mM碳二亚胺和1-20mM N-羟基丁二酰亚胺的水混合pH缓冲溶液中24-48h。
7.权利要求1-6中任一项所述的制备方法制备得到的生物瓣膜材料。
8.根据权利要求7所述的生物瓣膜材料的保存方法，其特征在于：采用抑菌溶剂保存或采用醇溶液脱水干燥后保存。
9.根据权利要求8所述的生物瓣膜材料的保存方法，其特征在于，所述抑菌溶剂保存具体为：将生物瓣膜材料浸泡于20-100vt％的异丙醇水溶液中保存。
10.根据权利要求8所述的生物瓣膜材料的保存方法，其特征在于，所述醇溶液脱水干燥后保存具体为：将生物瓣膜材料浸泡于10-30vt％甘油与70-90vt％乙醇等体积混合的混合溶液或10-30vt％甘油、35-45vt％乙醇与35-45vt％异丙醇等体积混合的混合溶液中4-24h，干燥，即可。
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