CN101507837A - 生物植入材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生物植入材料及其制备方法，该方法包括以下步骤：(i)用酒精处理源自动物或人的组织；(ii)使所述的组织在溶剂中与选自分散酶、DNA酶、RNA酶和胃蛋白酶的酶接触；(iii)用碱溶液处理由步骤(ii)获得的组织；以及(iv)用酸溶液处理由步骤(iii)获得的组织。

Description

生物植入材料及其制备方法
发明领域
本发明涉及一种生物植入材料及其制备方法。
发明背景
生物植入材料是用化学药品处理来自人和动物的组织获得的针对缺损组织或器官的可植入医用假体和人造组织，它包括心脏瓣膜、血液、韧带、脑膜的替代品以及用于医治太阳灼伤的创伤敷料等。
皮肤是人体的主要器官，它能防止体液外流，保护身体免受诸如细菌等外在有害物质的侵害以及发挥体温调节功能。倘若皮肤被太阳灼伤，体液会外流，皮肤暴露于外在有害物质会引发感染，因此受损伤的皮肤必须尽可能免受外在有害物质侵害。因此，用于保护缺损皮肤的创伤敷料必须具有阻止外在有害物质、保护缺损皮肤以及维持适当的透水性等功能。
通常，诸如聚醚聚氨酯和多聚-L-亮氨酸聚合物等合成大分子材料被广泛地用作创伤敷料的材料。然而，合成大分子材料只是替代人体组织的外源物质，缺乏相应的生物功能。因此，有关新生物材料制备方法的研究已广泛开展，而这种新生物材料源自组织，用于人体植入，兼有生物亲和性以及生物包容性。上述研究已有相关报道，例如，利用牛胞衣作为人体植入的生物材料来治疗太阳灼伤，可以减少炎症，提高治愈效果；牛胞衣也可用作创伤敷料或修复缺损膀胱的替代品。
然而，在临床上使用牛胞衣作为人体植入的生物材料，必须去除来自牛的免疫原组分和病毒以确保安全。
在一篇商业文章中提到，将猪下小肠粘膜去除免疫原组分并用过乙酸灭活病毒后可作为人体植入的生物材料，用作创伤敷料或修复缺损软组织的替代品。虽然这一生物材料已有相当广泛的应用，然而由于体内钙化作用，它的寿命很短。
此外，Ginger A.Abraham的公开号为2006/0024380的美国专利披露了一种用酸、碱、螯合物和盐去除免疫原组分的方法。然而，此方法由于在碱处理时碱浓度过高(pH 12)从而会诱发诸如胶原蛋白等蛋白的修饰，且由于未用酶消化细胞基质，很难去除实质层等复杂结构中的细胞。
因此，人们需要一种改良的用于人体植入的生物材料，其完全去除免疫原组分来阻止炎症反应和病毒等感染源引起的感染，且抑制体内的钙化作用从而可长期植入体内。
相应地，本发明者发明了一种皮肤替代品，它是由胞衣和胶原海绵制成，具有治愈伤口效果(参见，韩国专利No.644078)。本发明者还发明了一种改良的用于人体植入的生物材料制备方法，该方法具有灭活病毒等感染源，抑制体内钙化作用和拥有生物包容性等特征。
发明概述
因此，本发明的一个目的提供一种生物植入材料及其制备方法。
依照本发明的一个方面，提供了一种生物植入材料及其制备方法，其包括以下步骤：
(i)用酒精处理源自动物或人的组织；
(ii)使所述的组织在溶剂中与选自分散酶、DNA酶、RNA酶和胃蛋白酶的酶接触；
(iii)用碱溶液处理由步骤(ii)获得的组织；以及
(iv)用酸溶液处理由步骤(iii)获得的组织。
附图说明
下面结合附图对本发明的上述及其他目的和特点进行具体的说明，图示如下：
图1a是牛胞衣组织的masson三色染色的显微照片；
图1b是在实施例1中制备的胞衣植入材料的masson三色染色的显微照片；
图2a和2b分别为将例1中制备的胞衣植入材料应用于几内亚猪组织2周和4周后用苏木素和曙红染色(H&E)处理的显微照片；
图3a和3b分别为将SurgisisTM应用几内亚猪组织2周和4周后用苏木素和曙红染色(H&E)处理的显微照片；
图4a是用浸有1N NaOH的滤纸处理的狗模型的眼睛；
图4b是用碱灼伤的模型狗的角膜；
图4c显示用生理盐水清洗模型狗的眼睛以去除残留的NaOH；
图5a是未经任何治疗的碱灼伤组织在灼伤6天后的苏木素和曙红染色(H&E)的显微照片；
图5b是将例6中制备的加固胞衣植入材料应用于碱灼伤组织中，图5b是施用后6天的苏木素和曙红染色(H&E)的显微照片；
具体实施方式
在步骤(i)中，用酒精处理源自动物或人的组织以去掉脂肪、灭活病毒和抑制体内钙化作用。
组织可以是源自动物或人的心脏瓣膜、下小肠粘膜、血管、韧带、皮肤、骨头、筋膜和胞衣，优选是牛的筋膜和胞衣、猪的主动脉瓣、下小肠粘膜、心脏瓣膜，更优选地为牛的胞衣。
用于处理上述组织的酒精为80-95％(优选95％)v/v的酒精，该酒精处理的组织在4-10℃存放12小时以去掉组织中的脂肪(第一次处理)。然后，再用40％-80％酒精v/v(优选70％)处理该组织，并在4-10℃存放12小时以灭活病毒，抑制引发体内钙化作用的物质(第二次处理)。
在步骤(ii)中，由步骤(i)获得的组织用酶溶液消化以去除碱性成分和残余脂肪。
酶选自胰蛋白酶，DNAse酶，RNAse酶和胃蛋白酶，优选使用0.02-0.2％重量/体积的胰蛋白酶。用于该反应的溶液可进一步包括0.01-0.5％乙二胺四乙酸(EDTA)和0.05-5％氯化钠，酶反应的温度范围25℃-40℃(优选为37℃)，作用时间是10分钟-2小时(优选为1小时)。
此外，在进行步骤(ii)之前，可以用pH范围是9.0-11.4，含有0.01-0.5％乙二胺四乙酸(EDTA)和0.05-5％氯化钠的溶液预处理由步骤(i)获得的组织，这样可以去除可溶性的碱性杂质。
在步骤(iii)中，用碱溶液处理由步骤(ii)获得的组织，这样可以去除免疫原成分。
碱溶液可以由EDTA和氯化钠组成，它的pH范围是9.0-11.4，优选pH 11.0。
在步骤(iv)中，用酸溶液处理由步骤(iii)获得的组织。
酸溶液包含0.02-2％EDTA和盐酸，它的pH范围是1.7-2.3，优选pH 2。
在步骤(iii)或(iv)中，用氢氧化钠调pH达到11.5或盐酸调pH低于1.7都会引起组织修饰。
此外，可以将至少两片由步骤(iv)获得的生物植入材料放入2个模子中使每片生物植入材料吸附在模子上，再经过冷冻干燥和交联反应的处理，这样可以得到一种加固的生物植入材料，它比由步骤(iv)获得的生物植入材料在物质密度和机械强度方面具有更加牢固的特性。具体地，制备这种加固的生物植入材料可以将至少两片由步骤(iv)获得的生物植入材料放入2个由铜或铝制成的模子中，这种模子具有孔径大小为1-10cm的孔；施压将生物植入材料压向模子，压力范围是1-20mb，再经过冷冻干燥处理4至72小时(优选18小时)，温度范围是-20至-130℃(优选-40℃)，最后是常规的交联反应。
实施常规的交联反应可以有如下处理方法：用0.25％的戊二醛(GAD)处理；用33mM的1，3-碳二亚胺，6mM的N-羟基丁二酰亚胺和90％丙酮混合物处理；用33mM的1，3-碳二亚胺，6mM的N-羟基丁二酰亚胺和40％乙醇混合物处理；或UV交联和热交联(DHT)。
Ginger A.Abraham等的美国专利文献No.2003/0130747披露了一种用层流干燥来制备生物材料的方法。这种方法会造成组织收缩，原因在于水汽蒸发可在组织和水分子之间引发表面张力。与此相反，本发明所用的冷冻干燥方法能够抑制组织修饰，使组织维持一种理想的正常形式。
另外，Tooru Yui等的美国专利文献No.5,876,451披露了一种在胞衣中插入用胶原或明胶包被的网来制备生物材料的方法。这种方法可以提高整体的机械强度，但会降低长期使用的耐受力，原因在于组织和网之间的结合力比较弱。与此相反，本发明所用的冷冻干燥方法通过使用模子来加强组织之间的聚合性，进而提高了其长期使用的耐受力。
依照本发明所述的生物植入材料具有以下特征：
(a)提供了可以吸附活的上皮细胞、内皮细胞和神经细胞的整个基质；
(b)植入后没有体内免疫排斥反应，
(c)植入后没有体内钙化作用；
(d)胶原比例至少是95％，
(e)所制备的生物植入材料可以用作创伤敷料，角膜上皮的替代品，加固软组织的植入体，重构腹膜的植入体，脑膜的替代品，耳鼓膜的替代品，重建膀胱的替代品，粘附保护剂或治疗尿失禁的植入体。
下述实施例用于进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：胞衣植入材料的制备
自牛胎盘收集的牛胞衣样品低温保存于无菌生理盐水中并运至实验室。将500cm2的收集样品在冷藏室用1升95％的乙醇处理过夜，这样可去除牛胞衣样品中的脂肪。用1L纯净水清洗样品，共三次，每次10分钟；用刮刀剔除样品中的基质层。上述样品用1升70％的乙醇低温处理以灭活病毒，再加入1升EDTA/氯化钠溶液(pH 11)，其中该溶液含0.2％ EDTA和0.9％氯化钠，以150rpm搅拌1小时以去除可溶性碱性杂质(步骤(i))。然后，再用含0.05％胰蛋白酶，0.02％EDTA和0.9％氯化钠的溶液(pH 7.4)进行酶消化反应，该反应在37℃搅拌1小时(步骤(ii))。所获得的胞衣样品用1升70％的乙醇处理，150rpm搅拌1小时以去除残留脂肪，再用步骤(i)所使的碱溶液(pH11)处理，150rpm搅拌1小时(步骤(iii))。最后用含0.2％ EDTA的酸溶液(pH2)处理，150rpm搅拌1小时，使所得的胞衣样品膨胀，再用1L纯净水150rpm清洗样品，共三次，每次30分钟(步骤(iv))。
依照本发明制备所得的胞衣植入材料在包装后，可有选择地通过冷冻干燥或以25kGy的γ放射来灭菌消毒。
为了在组织学上确定上述制备所得的胞衣植入材料以彻底去除细胞，对未处理的和依本发明的方法处理的胞衣组织进行masson三色染色，结果分别如图1a和1b所示。如图1b所示，与未处理的胞衣组织相比，处理的胞衣组织在胞衣基膜内没有上皮细胞，在基质层亦无细胞。
实施例2：脂肪和修饰胶原蛋白的含量
测定下述三种方法的效果，即实施例1方法，依照Ginger A.Abraham(美国公开专利No.2006/0024380)的方法(条件A)和依照Tooru Yui等(美国专利No.5,876,451)的方法(条件B)。根据条件A和B所建立的方法详述如下。
在条件A中，源自牛胎盘的胞衣基质被去除。每100cm2样品加入1升的0.1M EDTA/10mM NaOH溶液，200rpm搅拌18小时，再加入1升的1M HCl/10mM NaOH溶液，200rpm搅拌8小时。所得样品用1升的1M NaCl/10mM磷酸缓冲液(PBS)处理，搅拌18小时，在其中加入1L的10mM PBS搅拌2小时，在无菌纯净水中200rpm进一步搅拌1小时。
在条件B中，源自牛胎盘的胞衣基质被去除。样品用纯净水彻底清洗以去除类似酪蛋白的基质，加入2.5g叠氮化钠，0.5g无花果蛋白酶和5升0.2M PBS溶液，该溶液含有0.9％ NaCl(pH 7)；室温放置24小时后再用纯净水彻底清洗。然后样品被置于由丙烯制成，由夹子固定的2个框架中超声处理15分钟，再加入0.1％苯扎氯铵溶液。
为了测定实施例1，条件A和条件B方法的效果，测定了脂肪含量和修饰胶原蛋白含量。
脂肪会引起体内钙化作用，脂肪含量测定方法为硫-磷酸-香兰素反应(sulfo-phospho-vanillin reaction)(参见，[J.Microbiologicalmethod.55，411-418(2003)]).在每个试管中加入1mg样品和2ml硫磺酸，加热至100℃，然后再冷却；加入5mL磷酸香兰素，37℃搅拌15分钟。在530nm检测样品的光密度。结果如表1所示。
表1 脂肪含量
 
实施例1 条件A 条件B
脂肪含量 0.04％ 0.24％ 0.25％
如表1所示，依本发明所得的胞衣植入材料其脂肪含量最低。
另外，修饰胶原蛋白含量测定方法为红外光谱。在仪器中应用一个反射附件ATR进行红外光谱测定，排除干扰后确定基线。检测修饰胶原蛋白含量的波长范围是600-1cm至1800-1cm，确定在1450-1cm峰强度和1235-1cm峰强度的相对比率，结果如表2所示(参见，[I.V.Yannas，J.Macromol.Sci，Rev.Macromol.Chem.，7，49(1972)])。
表2 修饰胶原蛋白的含量
 
实施例1 条件A 条件B
1235-1cm/1450-1cm 0.04％ 0.24％ 0.25％
如表2所示，依本发明所得的胞衣植入材料其胶原蛋白表现出最好的螺旋结构。条件A对样品过碱性处理(pH 12)和条件B对样品的超声处理都会引发胶原蛋白的修饰。
此外，用高效液相层析(HPLC)进行氨基酸分析显示，实施例1所制备的胞衣植入材料中胶原蛋白的百分比至少是95％。
实施例3：豚鼠皮下植入的生物包容性试验
有关炎症细胞的发炎程度和体内钙化作用是通过豚鼠皮下注射试验进行检测的。操作步骤是在不同的豚鼠分别皮下植入实施例1所制备的胞衣植入材料和SurgisisTM(Cook Inc.美国)，然后比较上述不同处理的豚鼠组织。2周和4周后，来自不同处理的豚鼠组织用福尔马林固定，清洗或用parapins包被。将上述处理的组织切成5μm厚，再用苏木素和曙红染色(H&E)，通过光学显微镜观察。2周和4周后，皮下植入实施例1所制备的胞衣植入材料的组织的H&E染色的显微照片分别如图2a和2b所示，2周和4周后，用SurgisisTM处理的组织的H&E染色的显微照片分别如图3a和3b所示。
如图2a所示，用胞衣植入材料处理的组织周围显示有纤维原细胞渗透。另外，如图2b所示，有纤维原细胞的缓慢渗透以及新胶原蛋白的形成。然而4周后，没有观察到炎症反应和体内钙化作用，因此，本发明的胞衣植入材料具有生物包容性。
相反，如图3a所示用SurgisisTM(Cook Inc.，美国)处理的组织周围显示用淋巴细胞的强烈渗透。一般而言，淋巴细胞与免疫反应相关，因此这一现象表明在用SurgisisTM处理的组织中存在免疫原物质。如图3b所示，淋巴细胞相关的免疫反应有很大幅度的降低，但处理的组织周围没有纤维原细胞的渗透，而在处理组织的许多区域出现体内钙化作用，因此，上述现象表明SurgisisTM不具有作为长期生物植入材料所必备的生物包容性。
实施例4：病毒灭活实验
依照本发明在临床上使用胞衣植入材料，必须对源自动物组织相关病毒保证安全，因此下述操作步骤是依照EN12442的要求所采用的本发明的方法，用于证实病毒的灭活。
为了达到FDA和ISO设定的要求，选择牛疱疹病毒(BHV，ATCC VR-188)，牛病毒性腹泻病毒(BVDV，ATCC VR-534)，副流感病毒3(PI 3，ATCC VR-281)和牛细小病毒(BPV，ATCCVR-767)验证病毒灭活效果。用70％乙醇处理实施例1步骤(i)中的组织，在上述病毒的储存溶液范围内让每种溶液在4℃放置1小时，6小时和12小时，然后再测定病毒的灭活效果。结果显示，对样品进行70％乙醇处理后没有发现任何病毒，所有病毒均已灭活。因此实施例1中70％乙醇处理的操作步骤对病毒的灭活非常有效。
另外，包装后的胞衣材料的病毒灭活和γ放射消毒，结果如表3所示。
表3 病毒灭活实验
Figure A200810167475D00121
Figure A200810167475D00131
实施例5：结构蛋白和生长激素含量
为了检测失去的有效的伤口愈合成分，分别对处理前和处理后的上皮生长因子和IV型胶原蛋白的含量进行定量分析。上皮生长因子和IV型胶原蛋白的定量分析(R&D system Minneapolis，MN，USA)是通过酶联免疫吸收反应(ELISA)来检测的，这过程包括用PBS提取每个样品，15,000rpm离心5分钟，然后回收上清。DNA定量分析是将25mg的干燥样品溶于200μl的组织裂解缓冲溶液中，再用AccuPrep基因组DNA提取试剂盒(Bioneer，Korea)提取DNA，最后用UV光度计测定DNA含量。
处理前和处理后上皮生长因子，IV型胶原蛋白和DNA含量检测结果如表4所示。
表4 上皮生长因子和IV型胶原蛋白和DNA含量
 
处理前含量 处理后含量
上皮生长因子(pg/mg) 1.66 0.86
IV型胶原蛋白(pg/mg) 2.93 2.84
DNA(μg/mg) 6.89 0.01
如表4所示，像IV型胶原蛋白这种结构蛋白的结果保持完好，上皮生长因子的含量虽然损失近一半，但仍保留足够的量。作为免疫原成分的DNA在操作过程中近乎全部被去除。
实施例6：加固的胞衣植入材料
为了加固由实施例1制备的胞衣植入材料的物质密度和机械强度，将实施例1步骤(iii)中获得的胞衣植入材料放入2个由铝制成的模子中，这种模子具有孔径大小至少为5cm的孔，施压使之成类似三明治的形状，这样在铝模和组织中插入高密度的非织造用的聚乙烯。再将插入组织的模子-40℃冷冻18小时后进行冷冻干燥24小时。然后在真空1mtorr的条件下110℃处理48小时进行热交联反应。上述获得的加固胞衣植入材料与铝包装布一起打包，并用25kGy的放射剂量进行γ放射灭菌消毒。
实施例7：加固的胞衣植入材料的创伤治愈效果
为了测定加固胞衣植入材料对缺损的角膜上皮的伤口治愈效果，在模型狗的眼睛上放入一片浸有1N NaOH的滤纸以诱导碱灼伤。用1N NaOH处理的模型狗的图片如图4a所示。
一天后，用刀片和8mm的有柄环锯摘除受损的角膜上皮与基质。从模型狗的眼睛上拿掉浸有1N NaOH的滤纸以及缺损角膜的图片如图4b所示。用生理盐水清洗模型狗带有碱灼伤的眼睛以去除残留的NaOH，这一过程如图4c所示。
狗的一只眼睛(右眼)用实施例6制备的加固胞衣植入材料治疗，而另一只眼睛(左眼)作为对照不做任何处理。6天后，对使用加固胞衣植入材料部分进行组织学分析。结果如图5a所示，经治疗的右眼有很好的再生性，而经治疗的左眼出现异常的上皮化，众多的炎症细胞和纤维化细胞，结果如图5b所示。
虽然本发明详述了以上具体实施例，但对本发明的改变与变形都应属于本发明的权利要求的保护范围。

Claims (12)

1.一种生物植入材料的制备方法，其包括以下步骤：
(i)用酒精处理源自动物或人的组织；
(ii)使所述的组织在溶剂中与选自分散酶、DNA酶、RNA酶和胃蛋白酶的酶接触；
(iii)用碱溶液处理由步骤(ii)获得的组织；以及
(iv)用酸溶液处理由步骤(iii)获得的组织。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)包括包括用体积百分比80到95％的酒精第一次处理所述的组织，以及用体积百分比40到75％的酒精第二次处理所述的组织。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(ii)中所用的酶是胰蛋白酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所用的酶的浓度范围是0.02％-0.2％w/v。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(ii)中所用的溶剂还含有0.01％-0.5％乙二胺四乙酸(EDTA)和0.05％-5％的氯化钠。
6.根据权利要求1所述的方法，其中在进行步骤(ii)之前，用pH范围在9.0-11.4之间，含有0.01％-2％乙二胺四乙酸和0.05％-5％氯化钠的溶剂处理步骤(i)所获得的组织。
7.根据权利要求1所述的方法，所述碱溶液的pH范围是10.5-11.4。
8.根据权利要求1所述的方法，所述酸溶液的pH范围是1.7-2.3。
9.根据权利要求1所述的方法，所述的源自动物或人的组织心包膜、心脏瓣膜、下小肠粘膜、韧带、血管、皮肤、骨头、筋膜和胞衣。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(iv)获得的组织还进一步包括进行如下处理：将至少2片组织放入2个模子之间，使每片组织吸附在模子上，冷冻干燥后进行交联反应。
11.根据任一权利要求1-10的方法制备的生物植入材料。
12.根据权利要求11所述的生物植入材料，其用途为创伤敷料、角膜上皮替代品、加固软组织植入体、重构腹膜植入体、脑膜替代品、耳鼓膜替代品、重构膀胱替代品，粘附保护剂或治疗尿失禁的植入体。
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