KR20240028210A - 단백질 추출물을 포함하는 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재 - Google Patents
단백질 추출물을 포함하는 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재 Download PDFInfo
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Abstract
이건 발명은, 단백질 추출물을 포함하는 하이드로겔 기반의 창상 피복재에 관한 것으로, 폴리에틸렌 글리콜, 백색 바세린, 1,2헥산디올, 에틸헥실글리세린, 히알루론산나트륨, 단백질 추출물 및 정제수를 포함하며, 체온과 유사한 온도에서도 상온에서와 동일한 점도를 유지하여 사용에 편리하고, 상처 치유율, 재상피화율 및 혈관 형성이 우수한 효과가 존재한다.
Description
이건 발명은, 단백질 추출물을 포함하는 하이드로겔 기반의 창상 피복재에 관한 것으로, 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol), 백색 바세린(White Petrolatum), 1,2헥산디올(1,2-hexandiol), 에틸헥실글리세린(Ethylhexylglycerin), 히알루론산나트륨(Sodium Hyaluronate), 단백질 추출물(Protein Extract) 및 정제수를 포함하며, 체온과 유사한 온도에서도 상온과 거의 동일한 점도를 유지하고, 창상 치유 효과가 우수한 국소 창상 피복재 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
사람의 피부조직은 크게 세 부분으로 구분되는데, 피부의 가장 바깥쪽을 이루는 표피층, 그 아래층인 진피층 및 피하조직으로 이루어진다. 이중에서 표피층은 표피층과 진피층이 단단하게 결합할 수 있도록 하는 기저막으로부터 여러 층으로 분화된 상피세포와 그 밖에 멜리닌세포, 면역세포를 포함하며, 표피층 아래의 진피층은 주로 섬유아세포와 이 세포가 분비하는 여러 세포밖물질(extracelluar matrix)을 포함한다.
일반적으로 창상 치유(wound healing)는 복합적이며, 시간에 따라 단계별로 조금씩 이루어진다. 지혈 및 염증 단계, 증식성 단계, 성숙단계로 3단계가 중첩되면서 세포외기질(extracellular matrix)이 재형성된다.
상처가 발생한 초기에는, 염증과 기저층의 반응으로 응혈이 형성된다. 기저물질은 진피의 결합 섬유 사이를 채우고 있는 물질로 점액성 뮤코다당체로 존재하며 다량의 수분을 보유하고 히알루론산, 콘트로이친 황산 등의 글리코스아미노 글리칸으로 구성되어 있다. 특히, 프로테오글리칸은 친수성 탄수화물 단백질 복합체이며 젤리와 같은 물질로 구성되는 것으로 알려져 있다.
통상 창상 드레싱(피복재)은 상처부위의 습기 유지에 따라 건조드레싱과 습윤(보습)드레싱으로 분류된다. 건조드레싱으로는, 밴드류(대일밴드 또는 기타 밴드류)와 연고류(후시딘, 마데카솔 등)를 들 수 있는데, 밴드류는 특별한 치료효과 없이 상처를 감싸주는 역할을 하고, 연고류는 항생제나 스테로이드 등 치료성분을 넣어 상처를 빨리 아물게 하고 추가 감염을 막아주는 역할을 수행한다.
그러나, 건조드레싱의 경우에는 피나 진물 등의 분비물이 말라 없어지면서 상처치유 세포까지 없어져 흉터를 남기고, 밴드를 제거할 때 딱지가 함께 떨어져 2차 손상의 위험이 높아진다. 한편, 연고류에 들어 있는 항생제 역시 상처치유 세포까지 영향을 받아 자가 치료효과가 그리 높지 않다.
이러한 건조드레싱의 단점을 보완하기 위해 하이드로콜로이드 (hydrocolloid), 알지네이트(alginate), 폼(foam)과 하이드로겔(hydrogel)을 이용한 습윤 드레싱재가 사용되어 왔다. 습윤드레싱 성분 중 젤라틴은 천연고분자로써 뛰어난 생체적합성과 생분해성, 높은 흡습성을 지녀 상처 발생 시 피부에 습윤환경을 제공할 수 있다는 장점 때문에 많은 창상피복재에 널리 사용되고 있으며, 하이드로겔(hydrogel)은 물을 분산 매체로 하는 삼차원 친수성 고분자 망상 구조를 가지므로, 다량의 수분을 흡수할 수 있고, 천연 조직과 같은 유연성을 가지고 있어 창상 피복재에 널리 사용되고 있다.
하지만, 하이드로겔 패치의 경우 물성이 열약하며, 특히 콜라겐을 주재료로 사용하여 만든 하이드로겔의 경우에는 인장강도가 0.01 ~ 0.05 MPa 수준으로 매우 열악한 기계적 물성을 갖는 문제점이 여전히 존재한다.
이에, 이건 발명에서는 기존의 창상 피복재(습윤 드레싱)가 갖는 문제점을 효과적으로 해결하고, 사용자가 사용하기에 편리하고, 상처 회복 효과가 우수한 창상 피복재를 제공하기 위하여, 다단계 탈세포화 과정을 거쳐 얻어진 단백질 추출물을 포함하는 하이드로겔 기반의 창상 피복재를 제공하고자 한다.
이건 발명의 일 실시형태에 따른 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재는, 폴리에틸렌 글리콜(PEG, Polyethylene Glycol), 백색 바세린(White Petrolatum), 1,2헥산디올(1,2-hexandiol), 에틸헥실글리세린(Ethylhexylglycerin), 히알루론산나트륨(Sodium Hyaluronate), 단백질 추출물(Protein Extract) 및 정제수를 포함한다.
상기 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재는, 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol) 11~95wt%, 백색 바세린(White Petrolatum) 0.5~10wt%, 1,2헥산디올(1,2-hexandiol) 0.1~10wt%, 에틸헥실글리세린(Ethylhexylglycerin) 0.01~10wt%, 히알루론산나트륨(Sodium Hyaluronate) 0.001~10wt%, 단백질 추출물(Protein Extract) 0.01~10wt% 및 잔량의 정제수를 포함하는 것이 바람직하다.
이때 사용되는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은, 중량평균 분자량이 400인 PEG와 중량평균 분자량이 4,000인 PEG가 약 2.2:1의 중량비로 혼합된 혼합물이 사용되는 것이 바람직하고, 상온의 보관 온도에서 사람의 체온까지의 온도 변화에 따라, 연고 제형인 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재의 점도가 거의 변화하지 않아, 25℃에서 측정된 점도와 35℃에서 측정된 점도가 실질적으로 동일하다.
또한, 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재는, 콜라겐과 엘라스틴을 포함하는 단백질 추출물을 포함하므로, 상처 치유(wound healing), 재상피화(re-epitherialization) 및 혈관 형성(angiogenesis)에 있어 우수한 효과가 존재한다.
아울러, 이건 발명에 따른 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재는, 상기 1,2헥산디올과 에틸헥실글리세린을 대체하여, 글루코네이트 클로로헥시딘, 아세테이트 클로로헥시딘, 하이드로클로라이드 클로로헥시딘, 실버술파다이아진, 포비돈 아이오딘, 벤즈알코니움 클로라이드, 퓨라진, 아이도카인, 헥사클로로펜, 클로로테트라사이클린, 네오마이신, 페니실린, 젠타마이신, 젠타마이신설페이트, 아크리놀, 시플로플록사신, 염화벤잘코늄, 후시딘산, 네오마이신황산염, 오플록사신 및 토브라마이신으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상이 동일한 양 혹은 0.01~5wt%의 범위로 포함되는 것도 가능하다.
상기 단백질 추출물은, 사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하여 전처리하는 전처리 단계; 알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제1 불활성화 단계; 바이러스 불활성화된 조직으로부터 세포를 제거하는 탈세포화 단계; 및 산(acid)을 사용하여 탈세포화된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제2 불활성화 단계;를 거쳐 제조되며,상기 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 DNA 함량은 50ng/mg 이하이고, 상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 20% 이하인 것이 바람직하다.
상기 탈세포화 단계는, 바이러스 불활성화된 조직으로부터 염기 수용액을 사용하여 세포를 제거하는 1차 탈세포화 단계; 및 1차 탈세포화된 조직을 효소처리하여 세포를 제거하는 2차 탈세포화 단계;를 포함할 수 있다.
이때 상기 1차 탈세포화 단계는, n-PrOH과 NaOH의 혼합물을 통해 수행되는 제1 탈세포화 단계; 및 0.05M 초과 0.2M 미만의 수산화나트륨 수용액으로 수행되는, 제2 탈세포화 단계;를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 조직은, 포유류 유래 혈관, 인대 및 건 중 어느 하나 이상인 것이 바람직하고, 상기 2차 탈세포화 단계는, DNase를 사용하여 수행되는 것이 더욱 바람직하다.
이건 발명에 따른 단백질 추출물을 포함하는 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복제는, 인체 내 독성문제가 발생하지 않고, 생체적합성이 우수하며, 사용자가 상처난 피부 조직에 도포할 경우, 온도 변화에 따른 점도의 저하가 발생하지 않아 사용에 편리한 장점이 있다.
또한, 다단계 탈세포화 및 불활성화 단계를 거쳐 얻어지는 단백질 추출물을 포함하여, 상처 치유(wound healing) 효과, 재상피화(re-epitherialization) 및 혈관 형성(angiogenesis)이 우수한 효과가 존재하므로, 창상 치료를 위한 유용한 창상 피복재로 사용될 수 있다.
도 1(A) 및 1(B)는 실험예 1의 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 2는 실험예 2의 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 3(A) 및 3(B)는 실험예 3의 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 4(A) 및 4(B)는 실험예 4의 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 5는 실험예 5의 실험 결과를 도시한 표이다.
도 6은 제조예 2에 따른 국소 창상 피복재의 기초 물성인 점도, 스토리지 모듈러스 및 pH를 측정한 결과이다.
도 7은 Cell Count Kit-8을 사용한 세포 증식률 측정 결과이다.
도 8은 Live/Dead assay kit(Invitrogen)를 사용하여 하이드로겔 내에서 세포 생존률을 측정한 결과이다.
도 9는 용출된 배양액 상에서 수행되는 스크래치 평가 결과이다.
도 10은 실험예 8이 수행된 급성 창상 동물 모델을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 11 내지 도 13은 각각 실험예 8에 따른 상처 치유율 (wound healing rate, %), 재상피화율 (re-epitherialization rate, %) 또는 혈관 형성 (angiogenesis, %) 결과를 정리한 결과이다.
도 2는 실험예 2의 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 3(A) 및 3(B)는 실험예 3의 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 4(A) 및 4(B)는 실험예 4의 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 5는 실험예 5의 실험 결과를 도시한 표이다.
도 6은 제조예 2에 따른 국소 창상 피복재의 기초 물성인 점도, 스토리지 모듈러스 및 pH를 측정한 결과이다.
도 7은 Cell Count Kit-8을 사용한 세포 증식률 측정 결과이다.
도 8은 Live/Dead assay kit(Invitrogen)를 사용하여 하이드로겔 내에서 세포 생존률을 측정한 결과이다.
도 9는 용출된 배양액 상에서 수행되는 스크래치 평가 결과이다.
도 10은 실험예 8이 수행된 급성 창상 동물 모델을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 11 내지 도 13은 각각 실험예 8에 따른 상처 치유율 (wound healing rate, %), 재상피화율 (re-epitherialization rate, %) 또는 혈관 형성 (angiogenesis, %) 결과를 정리한 결과이다.
이하에서 이건 발명의 바람직한 실시예를 통해 보다 상세히 설명하기에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정하여 해석되어서는 아니 되며, 이건 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 함을 밝혀둔다.
본 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함” 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 전체에서, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%”는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%를 의미한다.
또한, 본 명세서 전체에서 "포유류"는 사람을 제외한 포유류를 의미하는 것으로, 사람을 제외한다는 언급 없이 단순히 "포유류"라고 기재되어 있더라도 사람을 제외한 포유류로 이해되어야 하며, "세포가 제거된다"라는 표현은 DNA가 파괴되거나 제거되는 것을 포함하는 포괄적인 의미로 이해되어야 한다.
또한, 각 단계들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않는 이상 명기된 순서와 다르게 실시될 수 있다. 즉, 각 단계들은 명기된 순서와 동일하게 실시될 수도 있고 실질적으로 동시에 실시될 수도 있으며 반대의 순서대로 실시될 수도 있다.
또한, 달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 이건 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가지며, 상충되는 경우에는, 정의를 포함하는 본 명세서의 기재가 우선할 것이다.
이건 발명의 일 실시형태에 따른 단백질 추출물을 포함하는 하이드로겔 기반의 창상 피복재는, 연고 제형으로 상처난 피부 조직에 사용되어 창상 치유에 효과적인 조성물에 관한 것으로, 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol) 11~95wt%, 백색 바세린(White Petrolatum) 0.5~10wt%, 1,2헥산디올(1,2-hexandiol) 0.1~10wt%, 에틸헥실글리세린(Ethylhexylglycerin) 0.01~10wt%, 히알루론산나트륨(Sodium Hyaluronate) 0.001~10wt%, 단백질 추출물(Protein Extract) 0.01~10wt% 및 잔량의 정제수를 포함하며, 체온과 유사한 온도에서도 상온에서와 동일한 점도를 유지하고, 상처 치유, 재상피화 및 혈관 형성이 우수한 국소 창상 피복재를 제공할 수 있다.
하이드로겔은 친수성 고분자가 공유 또는 비공유 결합으로 가교되어 만들어진 3차원 망상구조물을 의미하며, 구성 물질의 친수성으로 인해 수용액 내 및 수성 환경 하에서 많은 양의 물을 흡수하며 팽윤하지만 가교 구조에 의해 용해되지 않는 성질을 갖는다. 또한 구성 성분과 제조 방법에 따라 다양한 형태와 성질을 가진 하이드로겔이 만들어질 수 있으며, 다량의 수분을 함유할 수 있어 액체와 고체의 중간성질을 갖는다.
연고제형으로 구현되는 이건 발명의 국소 창상 피복재는, 백색 바세린 계열의 기존 다른 창상 피복재와는 달리, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 주성분으로 하는 하이드로겔 기반으로 제조되어, 기계적 물성이 우수하다. 특히, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은, 중량평균 분자량이 400인 PEG와 중량평균 분자량이 4,000인 PEG가 약 2.2:1의 중량비로 혼합된 혼합물을 사용하거나, 국소 창상 피복재 100wt%를 기준으로 중량평균 분자량이 400인 PEG 10~95wt%와 중량평균 분자량이 4,000인 PEG 1~25wt%의 범위로 사용될 수 있다.
이렇게 서로 다른 분자량을 갖는 PEG 혼합물을 사용함으로써, 연고 제형으로 사용되는 국소 창상 피복제의 기계적 물성이 우수할 뿐만 아니라, 상온의 보관 온도(약 25℃)에서의 점도와, 국소 창상 피복재가 사용되는 피부의 온도(약 36℃)에서의 점도가 거의 변화없이 실질적으로 동일하므로, 사용자가 상처가 난 부위에 이건 출원발명에 따른 국소 창상 피복제를 사용하였을 때, 쉽게 흘러내리지 않고 성처 주위에 고정됨으로써, 사용자의 편의성이 향상되는 장점이 존재한다.
또한, 상처 회복 효과를 더욱 향상시키기 위해, 이건 발명에 따른 국소 창상 피복재는, 콜라겐과 엘라스틴을 포함하는 단백질 추출물을 약 0.01~10wt%의 범위로 포함한다. 상기 단백질 추출물은 다단계 방식의 탈세포 과정을 거쳐 얻어지는 것으로, 포유류 유래 조직 내 세포, 조지방, 바이러스 및 기타 이물질이 효과적으로 제거되고, 탈세포 과정 중 엘라스틴 손실이 적으므로, 재상피화(re-epitherialization) 및 혈관 형성(angiogenesis)에 있어서 우수한 효과를 보여준다.
이외에 이건 발명에 따른 국소 창상 피복재는, 백색 바세린(White Petrolatum), 1,2헥산디올(1,2-hexandiol), 에틸헥실글리세린(Ethylhexylglycerin) 및 히알루론산나트륨(Sodium Hyaluronate)를 추가로 더 포함할 수 있는데, 피부 혹은 창상 부위에서 접촉 및 보존제 역할을 수행하게 된다. 바람직하게는, 앞서 언급된 폴리에틸렌글리콜 11~95wt%과 단백질 추출물 0.01~10wt%의 혼합물에, 백색 바세린(White Petrolatum) 0.5~10wt%, 1,2헥산디올(1,2-hexandiol) 0.1~10wt%, 에틸헥실글리세린(Ethylhexylglycerin) 0.01~10wt%, 히알루론산나트륨(Sodium Hyaluronate) 0.001~10wt%, 및 잔량의 정제수가 혼합될 수 있다.
히알루론산은 N-아세틸-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 구성된 반복단위가 선형으로 연결되어 있는 다당류의 일종으로서 생체고분자 물질이며, 동물의 안구를 채우고 있는 액체에서 처음으로 분리된 이후로, 동물의 태반, 관절의 윤활액 (synovial fluid), 늑막액 (pleural fluid), 피부, 수탉의 벼슬 등에 많이 존재하는 것으로 알려져 있으며, Streptococcus 속 미생물 Streptococcus equi, Streptococcus zooepidemecus 등에서도 생산된다.
상기 히알루론산은 생체적합성이 우수하고 용액상태에서 높은 점탄성의 특성으로 화장품 첨가제 등의 화장품 용도뿐만 아니라 안과용 수술보조제, 관절기능 개선제, 약물전달 물질 및 점안제 등의 다양한 의약 용도에 대해서도 널리 사용되고 있다. 하지만, 히알루론산 자체만으로는 생체내 (in vivo) 또는 산, 알칼리 등의 조건에서 쉽게 분해되어 사용이 제한적이다.
한편, 이건 발명에 따른 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재에는, 앞서 언급된 1,2헥산디올과 에틸헥실글리세린을 대신하여, 글루코네이트 클로로헥시딘, 아세테이트 클로로헥시딘, 하이드로클로라이드 클로로헥시딘, 실버술파다이아진, 포비돈 아이오딘, 벤즈알코니움 클로라이드, 퓨라진, 아이도카인, 헥사클로로펜, 클로로테트라사이클린, 네오마이신, 페니실린, 젠타마이신, 젠타마이신설페이트, 아크리놀, 시플로플록사신, 염화벤잘코늄, 후시딘산, 네오마이신황산염, 오플록사신 및 토브라마이신으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을, 사용될 수 있는 1,2헥산디올 및 에틸헥실글리세린과 동일한 양의 범위로 사용되거나, 전체 조성에서 약 0.01~5 wt%의 범위로 포함되는 것도 가능하다.
이하에서는 다단계 탈세포화 과정을 통해 얻어지는 상기 단백질 추출물 성분에 대하여 좀 더 구체적으로 설명하고자 한다.
이건 발명에 따른 국소 창상 피복재에 포함되는 단백질 추출물은, 사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하는 준비 단계; 상기 조직을 전처리하는 전처리 단계; 알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제1 불활성화 단계; 바이러스 불활성화된 조직에서 염기 수용액을 사용하여 세포를 제거하는 1차 탈세포화 단계; 1차 탈세포화된 조직을 효소처리하여 세포를 제거하는 2차 탈세포화 단계; 및 산(acid)을 사용하여 탈세포화된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제2 불활성화 단계;를 거쳐 얻어질 수 있다.
이때, 상기 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 DNA 함량은 50ng/mg 이하이고, 바람직하게는 20ng/mg 이하, 10ng/mg 이하, 더욱 바람직하게는 5 ng/mg 이하일 수 있다. 또한, 상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L) 이 20% 이하이다.
여기서, 감소율(L)은, 하기의 수식 (1)로 정의되며, 이때 L0는 준비 단계에서 조직의 엘라스틴 함량을 의미하고, Lf는 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량을 의미한다.
먼저, 상기 준비 단계는 사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하는 단계이다. 여기서 포유류는 사람을 제외한 포유류로, 예를 들어, 돼지, 말, 소, 양 등일 수 있고, 상기 조직은 이러한 포유류 유래 혈관, 인대 및 건 중 어느 하나 이상일 수 있다.
다단계 탈세포화된 단백질 추출물를 제조하기 위해 먼저 포유류의 조직이 채취된다. 이렇게 채취된 포유류의 조직은, 준비 단계에서 포유류 조직에 달라붙어 있는 쓸모없는 조직 및 혈액이 제거되고, 세척, 건조 및 절삭되어 준비된다. 이렇게 준비된 포유류의 조직은 냉동상태로 보관될 수 있으며, 작업이 요구될 때 해동되어 사용될 수 있다. 냉동상태의 조직 원료를 사용하는 경우, 준비 단계는 냉동상태의 조직 원료를 꺼내어 준비하는 단계일 수 있다.
다음으로, 준비 단계에서 준비된 포유류의 조직은 전처리 단계를 통해 전처리된다.
이 단계는 포유류의 조직을 세척하는 단계로, 포유류의 조직이 냉동상태인 경우에는 이 단계를 통해 해동, 세척 및 절삭될 수 있다. 이 단계에서는 세척수로 증류수, 정제수, 식염수 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 증류수가 사용될 수 있다. 이 단계부터 제2 불활성화 단계까지 물리적 교반이 이루어질 수 있다.
이렇게 전처리 단계를 통해 준비된 포유류의 조직은 제1 불활성화 단계, 1차 탈세포화 단계, 2차 탈세포화 단계 및 제2 불활성화 단계를 거치며 면역 및 이물 반응을 유발할 수 있는 세포, 조지방, 바이러스 및 기타 이물질이 제거될 수 있다. 이와 같이 다단계 반응을 통해 탈세포화됨으로써 각 단계에서의 탈세포 효율, 이물질 제거 효율이 현저히 향상되므로 한 번에 처리되는 조직의 양이 증가하고, 처리 시간이 짧아져 결과적으로 탈세포화된 단백질 추출물의 생산성 및 수득률이 향상되는 효과를 얻을 수 있다.
먼저, 상기 제1 불활성화 단계는 알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화 하는 단계이다.
이 단계는, 조직을 탈세포처리하기 전에 먼저 조직 내 바이러스를 일차적으로 불활성화시킴으로써 1차 및 2차 탈세포화 단계에서 세포, 조지방 및 이물질을 보다 효과적으로 제거하기 위해 수행된다.
이 단계에서 사용되는 알코올은 n-프로판올일 수 있으며, 바이러스 불활성화 효과를 얻기 위해 50~90% 농도의 n-프로판올 수용액이 사용되는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 65~80% 농도의 n-프로판올 수용액이 사용될 수 있다.
상기 제1 불활성화 단계에서는, 바이러스 불활성화를 위한 알코올로 n-프로판올을 사용한다. 이와 같이 바이러스 불활성화를 위해 n-프로판올이 사용되는 경우에는 조직이 보다 부드러워지는데, 조직이 부드러우면 조직 내로 처리액이 보다 잘 침투하므로 바이러스 불활성화 및 탈세포화가 전체적으로 균일하게 수행될 수 있다 결과적으로 불활성화, 탈세포화 처리 효율이 향상되고 보다 균일한 조직을 수득할 수 있으며, 최종적으로 얻어진 탈세포화된 단백질 추출물의 품질 및 신뢰성이 향상될 수 있다.
일반적으로 바이러스 불활성화를 위해 사용되는 에탄올이 사용될 경우, 탈세포화될 포유류의 조직을 고정하여 경화시키는 특징이 있는데, 이건 발명의 이 단계에서 n-프로판올 대신에 에탄올이 사용될 경우, 조직이 단단해져 후속 단계에서 조직을 느슨하게 하여 처리 물질의 침투력을 향상시키는 공정의 효율이 저하되므로 바람직하지 않다.
또한, iso-프로판올의 경우에는 바이러스 불활성화 효과가 낮으므로, 제1 불활성화 단계에서 iso-프로판올을 사용할 경우에는, 충분한 바이러스 불활성화 효과가 얻어지지 않아, 후속되는 1차 및 2차 탈세포화 단계에서 탈세포 효율이 감소하므로, 제1 불활성화 단계에서는 n-프로판올이 사용되는 것이 바람직하다.
이 단계에서 프로판올 수용액 100 중량부에 대하여 전처리된 조직은 10~25 중량부, 바람직하게는 20~25 중량부로 처리될 수 있다.
상기 1차 탈세포화 단계는 제1 불활성화 단계를 거쳐 바이러스 불활성화된 조직에 염기 수용액을 처리하여 세포를 제거하는 단계이다.
이 단계는 먼저 염기 수용액과 알코올의 혼합물을 사용하여 조직을 처리하는 제1 탈세포화 단계; 및 염기 수용액을 사용하여 조직을 처리하는 제2 탈세포화 단계를 포함한다. 여기서 염기 수용액은 수산화나트륨 수용액이고, 알코올은 n-프로판올이 사용되는 것이 바람직하며, 이 경우, 제1 탈세포화 단계는 n-프로판올과 수산화나트륨의 혼합물에 조직을 처리하여 수행되는 단계이고, 제2 탈세포화 단계는 수산화나트륨 수용액에 조직을 처리하여 수행되는 단계이다.
이와 같이 탈세포화 단계가 두 단계에 거쳐서 수행되면, 먼저 제1 탈세포화 단계를 통해 탈세포 제거 뿐만 아니라 조지방 등의 이물질이 제거되어, 제2 탈세포화 단계에서 보다 효과적인 탈세포 과정이 이루어진다.
제1 및 제2 탈세포화 단계 각각에서, 처리 용액 100 중량부에 대하여 조직은 10~25 중량부, 바람직하게는 20~25 중량부로 처리될 수 있으며, 이는 종래 처리 용량의 약 두 배에 가까운 것으로, 이건 발명의 다단계 방식을 통해 효과적인 탈세포 처리가 가능하기 때문에 이와 같이 기존에 비해 두 배 용량의 조직을 충분히 처리할 수 있는 효과가 있다.
구체적으로, 제1 탈세포화 단계는 바이러스 불활성화된 조직을 n-프로판올과 수산화나트륨의 혼합물에 처리하는 단계이다. 이 단계에서 조직 내 조지방과 수산화나트륨이 비누화 반응을 하여, 조지방이 조직으로부터 분리, 제거되는데, 이때 n-프로판올은 이러한 비누화 반응을 촉진시키고 비누화 반응의 생성물을 서로 응집시키는 작용을하여 조지방이 보다 빠르고 효율적으로 조직으로부터 분리, 제거되도록 한다.
이때 n-프로판올과 수산화나트륨의 혼합물에 조직을 처리하는 처리 시간은 10~48시간, 바람직하게는 15~40시간, 더욱 바람직하게는 18~28시간 일 수 있고, 처리 온도는 0~30℃, 바람직하게는 10~28℃, 더욱 바람직하게는 18~25℃일 수 있다. 이러한 온도 범위에서 상기 시간동안 처리될 때 조직 구조의 큰 손상이나 엘라스틴의 손실 없이 충분한 조지방 제거 효율을 얻을 수 있다.
상기 n-프로판올과 수산화나트륨의 혼합물은 n-프로판올의 농도 50~95%, 바람직하게는 60~90%, 더욱 바람직하게는 65~85%일 수 있으며, 수산화나트륨의 농도 0.05M 초과 및 0.2M 미만인 수용액일 수 있다. 이들 농도 범위는 제1 탈세포화 단계에서 조직 손상을 최소화할 수 있고, 동시에 조지방 등의 이물질이 효과적으로 제거될 수 있는 농도 범위로, 특히 수산화나트륨의 농도가 상기 범위 미만인 경우에는 1차 탈세포화 단계의 처리 효율이 감소하고, 상기 범위를 벗어나는 경우에는 조직 구조 자체가 붕괴되어 용해되는 문제가 있으므로, 상술한 농도 범위의 n-프로판올, 수산화나트륨 수용액을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 제2 탈세포화 단계는 제1 탈세포화 단계를 거친 조직을 염기 수용액에 처리하여 조직을 연화시킴으로써 조직의 구조를 느슨하게 하면서, 동시에 탈세포 반응이 일어나는 단계이다. 조직에 포함되어 있는 조지방이나 각종 이물질은 탈세포 반응에 있어 일종의 물리, 화학적인 장벽으로 작용하는데, 앞서 조직이 제1 탈세포화 단계를 거쳐 조지방이나 각종 이물질이 제거된 상태이기 때문에 제2 탈세포화 단계에서 탈세포 반응이 보다 효과적으로 이루어질 수 있다.
이 단계에서 조직을 염기 수용액에 처리하는 처리 시간은 10~48시간, 바람직하게는 15~40시간, 더욱 바람직하게는 18~28시간 일 수 있고, 처리 온도는 0~30℃, 바람직하게는 10~28℃, 더욱 바람직하게는 18~25℃일 수 있으며, 이러한 온도 범위에서 상기 시간동안 처리될 때 조직 구조의 붕괴, 엘라스틴의 손실 없이 조직 구조가 충분히 느슨하게 변형되고, 적절한 탈세포화 반응이 이루어질 수 있다.
이때 처리액으로 사용되는 염기 수용액은 수산화나트륨 수용액일 수 있으며 수산화나트륨 수용액에 포함된 수산화나트륨의 농도는 0.05M 초과 및 0.2M 미만일 수 있다. 수산화나트륨의 농도가 0.05M 이하인 경우에는 조직 구조가 충분히 느슨해지지 않아 후술될 2차 탈세포화 단계에서의 탈세포 효율이 떨어지는 문제가 있고, 0.2M 이상인 경우에는 본 단계에서 일부 조직이 느슨해지는 수준을 넘어서 와해되거나 용해되어 최종 수율이 현저히 떨어지고, 엘라스틴이 손실될 수 있으므로 상술한 농도의 수산화나트륨 수용액을 사용하는 것이 바람직하다.
1차 탈세포화 단계 이후에 효소를 이용한 2차 탈세포화 단계가 수행되는데, 이 두 단계 사이에 중화단계 및 세척단계가 수행될 수 있다.
중화단계는 1차 탈세포화 단계에서 사용된 수산화나트륨을 중화하기 위해 산성수용액으로 처리하는 단계로, 이때 사용되는 산성수용액의 종류로 예를 들어, 염산, 황산, 아세트산, 퍼아세트산 중 적어도 어느 하나 이상이 포함된 산성수용액이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 이들의 농도 또한 작업 환경이나 조건에 맞추어 적절히 조절되어 사용될 수 있다.
세척단계는 후속 공정인 2차 탈세포화 단계에서 효소처리할 때 잔류물로 인한 효소 반응성 저하를 방지하기 위해 수행되는 단계로, 세척단계에서 사용되는 세척액으로는 버퍼용액이 사용될 수 있으며, 예를 들어 PBS(Phosphate buffered saline) 용액이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 2차 탈세포화 단계는, 1차 탈세포화된 조직을 효소처리하여 세포를 제거하는 단계로, 1차 탈세포화된 조직에 DNA 분해효소를 처리하여 1차 탈세포화된 조직 내의 DNA를 제거하는 단계이다.
이 단계에서 DNA 분해효소가 포함된 처리 용액 100 중량부에 대하여 조직은 10~25 중량부, 바람직하게는 20~25 중량부로 처리될 수 있으며, 이는 앞서 설명한 바와 같이 기존에 비해 약 두 배에 가까운 처리 용량으로, 이건 발명의 다단계 탈세포 처리 과정에 의해 처리 효율이 증가하기 때문에 달성 가능한 처리 용량이다.
이 단계에서 효소 활성 및 충분한 DNA 분해 효율을 얻기 위해 조직을 DNA 분해효소로 처리하는 처리 시간은 10~35시간, 바람직하게는 18~30시간일 수 있고, 처리 온도는 30~45℃ 바람직하게는 35~42℃일 수 있다.
이건 발명에서 처리 용액에 포함되는 DNA 분해효소의 농도는 0.0001~0.005wt%이며, 이는 통상 종래의 유사 기술에서 사용되어 왔던 DNA 분해효소 농도에 비해 수 배 ~ 수백 배 낮은 농도이다. 이건 발명의 1차 탈세포화된 조직은, 1차 탈세포화 단계를 거치며 조직 내 조지방을 포함한 이물질이 제거되고, 조직의 구조가 느슨해지게 된다. 이 상태에서 DNA 분해효소가 투입되면 조직 구조 내부로 DNA 분해효소가 매우 용이하게 침투할 수 있으며, 이에 따라 저농도의 DNA 분해효소를 사용하더라도 최소 동일하거나 더 우수한 DNA 제거 효율을 확보할 수 있으므로, 이건 발명에서는 상기와 같은 저농도의 DNA 분해효소를 사용할 수 있다.
그러나, DNA 분해효소의 농도가 상기 범위 미만인 경우에는 DNA 분해 효율이 감소하므로 0.0001% 이상의 농도로 사용되는 것이 바람직하고, 상기 범위를 초과하는 경우에는 추가되는 DNA 분해효소의 양에 비해 DNA 분해효율이 향상되는 정도가 극히 미미하므로 비경제적이기 때문에, 상술한 농도 범위의 DNA 분해효소를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 2차 탈세포화 단계를 거쳐 탈세포화된 조직은 제2 불활성화 단계를 거치며 추가적인 바이러스의 제거가 이루어지는데, 이 두 단계 사이에 추가적으로 탈색단계 및/또는 탈지단계가 수행될 수 있다. 탈색 단계는 조직의 색을 제거하는 단계로, 예를 들어 조직을 과산화수소수로 처리하여 수행될 수 있고, 탈지 단계는 조직 내에 포함된 지방질을 추가로 더 제거하는 단계로, 예를 들어 케톤 용액, 바람직하게는 아세톤 용액을 이용하여 수행될 수 있다.
이어서 2차 탈세포화 단계를 거친 조직 내에 포함된 바이러스를 추가적으로 더 불활성화하는 제2 불활성화 단계가 수행된다. 이 단계는 산을 사용하여 조직 내 바이러스를 불활성화하는 단계로, 구체적으로는 조직을 유기산과 알코올의 혼합물로 처리하는 단계이다.
이때 사용되는 유기산은 과산화아세트산이 사용될 수 있는데, 과산화아세트산은 산화제로, 바이러스의 불특정 자유 라디칼 손상을 유발하는 방식으로 바이러스를 불활성화할 수 있다. 이 단계에서 사용되는 과산화아세트산은 0.05~1% 농도로 사용될 수 있다.
또한 이 단계에서 사용되는 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올 등 탄소수 1~4의 저급 알코올일 수 있으며, 바람직하게는 에탄올일 수 있다. 에탄올은 바이러스를 불활성화하는 기능과 조직 구조를 고정하여 조직을 단단하게 만드는 기능을 수행하기 때문에 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다.
이러한 단계를 거쳐 최종적으로 바이러스가 불활성화되고, 조지방, DNA가 제거되며 엘라스틴을 포함한 각종 세포외기질 성분이 포함된 단백질 추출물이 얻어질 수 있다.
이렇게 얻어진 단백질 추출물에 포함된 DNA의 함량은 50ng/mg 이하이고, 바람직하게는 20ng/mg 이하, 10ng/mg 이하, 더욱 바람직하게는 5 ng/mg 이하로 매우 낮은 DNA 함량을 가져 면역이나 각종 이물 반응 유발이 최소화될 수 있다.
또한, 상기 단백질 추출물은 상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거치며 감소된 엘라스틴 함량이 매우 낮아 엘라스틴에 의한 상처 치유 및 흉터 억제 등의 효과를 갖는 장점이 있다. 구체적으로, 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 20% 이하이다. 이러한 수치값은 종래의 탈세포방식이 적용된 경우, 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 50% 이상으로 매우 높게 나타나는 것과 비교하여 매우 낮은 수치이다.
한편, 제2 불활성화 단계 이후에는 세척, 포장, 멸균, 가공 등의 단계가 추가적으로 더 수행될 수 있다. 세척은 버퍼 용액, 증류수 등을 이용하여 수행될 수 있고, 포장은 상기 단백질 추출물을 보관이나 이송할 때의 오염을 방지하고 취급이 용이하도록 수행되며, 포장시 보존액에 담긴 상태로 포장될 수도 있다.
멸균은 제2 불활성화 단계 이후에 발생되는 추가적인 오염을 제거하기 위해 수행되며, 멸균을 위해 예를 들어, 전자선 조사 또는 방사선 조사가 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
가공은 상기 단백질 추출물을 활용 가능한 형태로 가공하는 것으로, 예를 들어, 건조, 분말화, 용액화 등의 방식이 적용될 수 있는데, 이와 같이 가공되어 바이오 잉크나 주사제 등과 같은 형태로 활용이 가능하며, 이에 제한되지 않고 다양한 형태로도 활용될 수 있다.
한편, 이러한 단백질 추출물의 제조 방법에 대하여 좀 더 구체적으로 설명하면 다음과 같으며, 앞서 이미 설명한 것과 중복되는 부분은 생략한다.
상기 제조 방법은, 사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하는 준비 단계; 상기 조직을 전처리하는 전처리 단계; 알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제1 불활성화 단계; 바이러스 불활성화된 조직에서 염기 수용액을 사용하여 세포를 제거하는 1차 탈세포화 단계; 1차 탈세포화된 조직을 효소처리하여 세포를 제거하는 2차 탈세포화 단계; 및 산(acid)을 사용하여 탈세포화된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제2 불활성화 단계;를 포함한다.
이때, 상기 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 DNA 함량은 50ng/mg 이하이고, 상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L) 이 20% 이하일 수 있다.
여기서, 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L)은 하기 수식 (1)로 정의되고, L0는 준비 단계에서 조직의 엘라스틴 함량이며, Lf는 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량이다.
먼저, 상기 준비 단계는 사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하는 단계이다. 여기서 포유류는 사람을 제외한 포유류로, 예를 들어, 돼지, 말, 소, 양 등일 수 있고, 상기 조직은 이러한 포유류 유래 혈관, 인대 및 건 중 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 전처리 단계는 준비 단계에서 준비된 포유류의 조직을 세척하는 단계로, 필요에 따라서는 이 단계에서 조직이 적당한 크기로 절단될 수 있으며, 앞서 냉동 상태의 조직이 준비되는 경우에는 이 단계에서 해동이 이루어질 수 있다.
상기 제1 불활성화 단계는 알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화 하는 단계로, 일반적으로 바이러스 불활성화를 위해 에탄올을 사용하나, 이건 발명에서는 n-프로판올을 사용한다. 이는 에탄올이 조직을 단단하게 고정시켜 후속 단계에서의 연화 효율을 저하시키는 반면, n-프로판올의 경우에는 조직을 부드럽게 만들어 후속 단계에서의 연화 효율을 향상시키기 때문이다.
상기 1차 탈세포화 단계는 제1 불활성화 단계를 거쳐 바이러스 불활성화된 조직에 염기 수용액을 처리하여 세포를 제거하는 단계이다. 이 단계는 먼저 염기 수용액과 알코올의 혼합물을 사용하여 조직을 처리하는 제1 탈세포화 단계; 및 염기 수용액을 사용하여 조직을 처리하는 제2 탈세포화 단계;를 포함한다.
여기서 염기 수용액은 수산화나트륨 수용액이고, 알코올은 n-프로판올이 사용되는 것이 바람직하다.
구체적으로, 제1 탈세포화 단계는 바이러스 불활성화된 조직을 n-프로판올과 수산화나트륨의 혼합물에 처리하는 단계로, 이 단계를 거쳐 조직 내 조지방 및 이물질이 제거되며 조직이 일부 연화된다. 제2 탈세포화 단계는 수산화나트륨 수용액에 조직을 처리하는 단계로, 이 단계에서 조직의 연화와 동시에 탈세포 반응이 일어나는데, 앞서 조지방이 포함된 이물질이 제거되어 이러한 효과가 보다 향상될 수 있다.
제1 및 제2 탈세포화 단계에서 수산화나트륨은 0.05M 초과 및 0.2M 미만의 농도로 포함될 수 있는데, 이는 수산화나트륨에 의한 비누화, 연화 반응이 충분히 일어나면서, 조직의 와해나 용해를 방지하기 위한 바람직한 농도범위이다.
다음으로, 1차 탈세포화 단계 이후에 효소를 이용한 2차 탈세포화 단계가 수행되는데, 이 두 단계 사이에 중화단계 및 세척단계가 수행될 수 있다. 중화단계는 1차 탈세포화 단계에서 사용된 수산화나트륨을 중화하기 위해 산성수용액으로 처리하는 단계이고, 세척단계는 후속 공정인 2차 탈세포화 단계에서 효소처리할 때 잔류물로 인한 효소 반응성 저하를 방지하기 위해 수행되는 단계이다.
상기 2차 탈세포화 단계는, 1차 탈세포화된 조직을 DNA 분해효소처리하여 조직 내 DNA를 제거하는 단계이다. 이건 발명의 1차 탈세포화된 조직은, 1차 탈세포화 단계를 거치며 조직 내 조지방을 포함한 이물질이 제거되고, 조직의 구조가 느슨해지게 된다. 이 상태에서 DNA 분해효소가 투입되면 조직 구조 내부로 DNA 분해효소가 매우 용이하게 침투할 수 있으며, 이에 따라 저농도의 DNA 분해효소를 사용하더라도 최소 동일하거나 더 우수한 DNA 제거 효율을 확보할 수 있으므로, 이건 발명에서는 DNA 분해효소를 0.0001~0.005wt%의 저농도로 사용한다. DNA 분해효소의 농도가 상기 범위 미만인 경우에는 DNA 분해 효율이 떨어지고, 상기 범위를 초과하는 경우에는 추가되는 DNA 분해효소의 양에 비해 DNA 분해효율이 향상되는 정도가 극히 미미하므로 비경제적이기 때문에, 상술한 농도 범위의 DNA 분해효소를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 2차 탈세포화 단계를 거쳐 탈세포화된 조직은 제2 불활성화 단계를 거치며 추가적인 바이러스의 제거가 이루어지는데, 이 두 단계 사이에 추가적으로 탈색단계 및/또는 탈지단계가 수행될 수 있다. 탈색 단계는 조직의 색을 제거하는 단계로, 예를 들어 조직을 과산화수소수로 처리하여 수행될 수 있고, 탈지 단계는 조직 내에 포함된 지방질을 추가로 더 제거하는 단계로, 예를 들어 케톤 용액, 바람직하게는 아세톤 용액을 이용하여 수행될 수 있다.
이어서 2차 탈세포화 단계를 거친 조직 내에 포함된 바이러스를 추가적으로 더 불활성화하는 제2 불활성화 단계가 수행된다. 이 단계는 조직을 유기산과 알코올의 혼합물로 처리하는 단계로, 유기산으로는 과산화아세트산이, 알코올로는 에탄올이 사용될 수 있으며, 이러한 혼합 용액을 이용하여 조직을 처리함으로써 조직 내 바이러스가 효과적으로 제거될 수 있다.
이러한 단계를 거쳐 최종적으로 바이러스가 불활성화되고, 조지방, DNA가 제거되며 엘라스틴을 포함한 각종 세포외기질 성분이 포함된 단백질 추출물을 제조할 수 있다.
이렇게 얻어진 단백질 추출물에 포함된 DNA의 함량은 50ng/mg 이하이고, 바람직하게는 20ng/mg 이하, 10ng/mg 이하, 더욱 바람직하게는 5 ng/mg 이하로 매우 낮은 DNA 함량을 가져 면역이나 각종 이물 반응 유발이 최소화될 수 있다.
또한, 상기 단백질 추출물은 상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거치며 감소된 엘라스틴 함량이 매우 낮아 엘라스틴에 의한 상처 치유 및 흉터 억제 등의 효과를 갖는 장점이 있다. 구체적으로, 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 20% 이하이다. 이러한 수치값은 종래의 탈세포방식이 적용된 경우, 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 50% 이상으로 매우 높게 나타나는 것과 비교하여 매우 낮은 수치이다.
한편, 제2 불활성화 단계 이후에는 세척, 포장, 멸균, 가공 등의 단계가 추가적으로 더 수행될 수 있다. 세척은 버퍼 용액, 증류수 등을 이용하여 수행될 수 있고, 포장은 상기 단백질 추출물를 보관이나 이송할 때의 오염을 방지하고 취급이 용이하도록 수행되며, 멸균은 제2 불활성화 단계 이후에 발생되는 추가적인 오염을 제거하기 위해 수행된다.
가공은 상기 단백질 추출물을 활용 가능한 형태로 가공하는 것으로, 예를 들어, 건조, 분말화, 용액화 등의 방식이 적용될 수 있는데, 이와 같이 가공되어 바이오 잉크나 주사제 등과 같은 형태로 활용이 가능하며, 이에 제한되지 않고 다양한 형태로도 활용될 수 있다.
이하에서는, 이건 발명의 일 실시예를 통해 이건 발명의 구체적인 작용과 효과를 설명하고자 한다. 다만, 이는 이건 발명의 바람직한 예시로서 제시된 것으로, 실시예에 따라 이건 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아니다.
[제조예 1]
1. 준비 및 전처리 단계
먼저, 세척, 건조, 절삭 및 냉동 보관된 돼지 심장 연결 대동맥을 준비하고, 해동한 뒤 증류수를 이용하여 세척한 후 50×50mm 크기로 절단하여 원료 조직 시편을 준비하였다.
2. 제1 불활성화 단계
다음으로, 70% n-프로판올 1L에 원료 조직 시편 250g을 투입하고 온도 20℃, 교반 속도 150RPM으로 24시간 교반하여 제1 불활성화 단계를 수행하였다.
3-1. 1차 탈세포화 단계(제1 탈세포화 단계)
이어서, 증류수에 n-프로판올이 70%의 농도로 포함되고, 수산화나트륨 0.1M의 농도로 포함된 혼합용액을 준비하고, 상기 혼합용액 100 중량부에 대하여 상기 원료 조직 시편이 23 중량부로 포함되도록 혼합한 뒤 온도 20℃, 교반 속도 150RPM으로 24시간 교반하여 제1 탈세포화 단계를 수행하였다.
3-2. 1차 탈세포화 단계(제2 탈세포화 단계)
다음으로, 미리 준비된 0.1M의 수산화나트륨 수용액 100 중량부에 대하여 제1 탈세포화 단계를 거친 조직 시편이 24 중량부로 포함되도록 혼합한 뒤, 앞 단계와 동일한 조건에서 24시간 동안 교반하여 제2 탈세포화 단계를 수행하였다.
계속해서 상기 제2 탈세포화 단계를 거친 조직 시편을 아세트산 수용액에 침지하고 교반하여 중화한 뒤, PBS 용액으로 세척하였다.
4. 2차 탈세포화 단계
이어서, DNase가 0.00011wt%의 농도로 포함된 처리 용액에 상기 조직 시편을 투입하고 온도 37℃에서 23시간 동안 150RPM의 교반 속도로 교반하여 2차 탈세포화 단계를 수행하였다. 2차 탈세포화 단계가 완료된 조직시편을 20℃의 3% 과산화수소수에 1시간동안 처리하여 탈색하고, 20℃의 20% 아세톤 수용액에 1시간동안 처리하여 탈지처리하였다.
5. 제2 불활성화 단계
이어서, 상기 조직 시편을 증류수에 n-프로판올이 70%의 농도로 포함되고, 0.2%의 과산화아세트산이 포함된 혼합용액에 침지하고, 20℃에서 4시간 반 동안 처리하여 제2 불활성화 단계를 수행하였다.
마지막으로, 상기 처리 과정을 모두 거친 조직 시편을 PBS 용액 및 증류수로 세척하여 이건 발명의 국소 창상 피복재에 포함되는 단백질 추출물을 준비하였다.
[실험예 1]
제조예 1과 동일한 방법을 이용하여 다단계 탈세포화된 단백질 추출물을 제조하되, 제1, 제2 및 2차 탈세포화 단계를 순차적으로 거칠 때 각 단계가 수행된 직후 조직 시편을 채취하여 조직 시편 1mg당 포함된 엘라스틴 함량을 측정하고, 그 결과를 도 1(A)에 나타내었다. 또한 준비 단계에서 원조직의 엘라스틴 함량을 측정하여, 원조직의 엘라스틴 함량에 대하여 각 단계가 수행된 시점에서의 엘라스틴 함량을 백분율로 나타내어 도 1(B)에 도시하였다.
도 1(A) 및 도 1(B)에서 1공정은 제1 탈세포화 단계, 2공정은 제2 탈세포화 단계, 3공정은 2차 탈세포화 단계를 의미한다.
엘라스틴 함량은, 분석 키트 Fastin Elastin Assay kit F2000(제조사: Biocolor)를 이용하여 분석 키트의 프로토콜에 따라 실험한 뒤, Multimode plate reader Victor Nivo™(제조사: Perkin Elmer)를 이용하여 흡광도 513mm에서 엘라스틴을 분석하고, 스탠다드 물질과 비교하여 엘라스틴 함량을 측정하였다.
도 1(A), 1(B)의 결과를 참조하면, 각 공정이 진행됨에 따라 엘라스틴 함량이 약간 손실되는 것을 확인할 수 있으나, 최종 단계가 완료된 시점에서 약 80% 이상의 엘라스틴이 남아있는 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 2]
제조예 1과 동일한 방법을 이용하여 다단계 탈세포화된 단백질 추출물을 제조하되, 제1, 제2 및 2차 탈세포화 단계를 각각 한 단계씩만 생략하고, 최종 공정까지 거친 조직 시편을 채취하여 조직 시편 1mg당 포함된 엘라스틴의 함량을 측정하고, 준비 단계에서 원조직의 엘라스틴 함량을 동일한 방법으로 측정한 뒤, L값을 계산하여 그 결과를 표 1에 정리하였다.
또한, 준비 단계에서 원조직의 엘라스틴 함량에 대하여 각 단계가 생략되어 얻어진 단백질 추출물에 포함된 엘라스틴 함량을 백분율로 계산하여 그 결과를 도 2에 도시하였다.
엘라스틴 함량은, 실험예 1과 동일한 방법으로 측정하였고, 표 1 및 도 2에서 1공정은 제1 탈세포화 단계, 2공정은 제2 탈세포화 단계, 3공정은 2차 탈세포화 단계를 의미한다.
| 모든 공정 진행 | 1공정 제외 | 2공정 제외 | 3공정 제외 | |
| L0(㎍/㎎) | 615.6 | |||
| Lf(㎍/㎎) | 514.9 | 503.5 | 507.8 | 519.1 |
| L(%) | 16.4 | 18.2 | 17.5 | 15.7 |
먼저 표 1을 살펴보면, 모든 공정을 진행하는 경우와, 하나의 공정을 생략하였을 때 모두 L값이 20% 이하로 나타나는 것을 확인할 수 있고, 도 2를 참조하면, 특정 공정을 생략하더라도 엘라스틴 함량이 크게 달라지지 않는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 이러한 실험 결과로부터 이건 발명의 일 실시예에 따른 공정 중 제1 탈세포화 단계, 제2 탈세포화 단계 및 2차 탈세포화 단계 중 어느 한 단계를 생략하더라도 엘라스틴 함량에는 크게 영향이 없는 것을 확인할 수 있다.
[실험예 3]
실험예 1과 동일한 방법으로 실험하되, 각 단계 수행 후 엘라스틴 함량이 아닌 DNA 함량을 측정하였다. DNA 함량은, 분석 키트 Quant-iT™ PicoGreen™ dsDNA Assay kits and dsDNA Reagents(제조사: Invitrogen)를 이용하여 분석 키트의 프로토콜에 따라 실험한 뒤, Multimode plate reader Victor Nivo™(제조사: Perkin Elmer)를 이용하여 흡광도 480~520mm에서 DNA 함량을 측정하였다.
각 단계 수행 후 조직 1mg당 DNA 함량은 도 3(A)에 도시하였고, 원조직의 DNA 함량 대비 각 단계 수행 후 조직의 DNA 함량은 도 3(B)에 백분율값으로 도시하였다. 이때, 도 3(A) 및 도 3(B)에서 1공정은 제1 탈세포화 단계, 2공정은 제2 탈세포화 단계, 3공정은 2차 탈세포화 단계를 의미한다.
도 3(A) 및 도 3(B)를 참조하면, 제1 탈세포화 단계, 제2 탈세포화 단계 및 2차 탈세포화 단계를 모두 거친 뒤 대부분의 DNA가 제거되는 것을 확인할 수 있다.
[실험예 4]
실험예 2와 동일한 방법으로 실험하되, 각각 하나씩 단계가 생략되어 제조된 단백질 추출물의 DNA 함량을 실험예 3과 동일한 방법으로 측정하였다.
각 단계가 생략되어 얻어진 단백질 추출물 1mg당 DNA 함량은 도 4(A)에 도시하였고, 원조직의 DNA 함량 대비 각 단계가 생략되어 얻어진 조직의 DNA 함량은 도 4(B)에 백분율값으로 도시하였다. 이때, 도 4(A) 및 도 4(B)에서 1공정은 제1 탈세포화 단계, 2공정은 제2 탈세포화 단계, 3공정은 2차 탈세포화 단계를 의미한다.
도 4(A) 및 4(B)를 참조하면, 제1 탈세포화 단계, 제2 탈세포화 단계 및 2차 탈세포화 단계를 모두 거쳐야 DNA가 확실하게 제거되는 것을 확인할 수 있다. 특히, 제2 탈세포화 단계나 2차 탈세포화 단계가 생략되는 경우에는 DNA 제거 효율이 현저히 떨어지는 것을 알 수 있으므로, 상기 실험을 통해 각 단계를 모두 순차적으로 거치는 것이 DNA 제거에 있어서 보다 효과적인 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 5]
제조예 1과 동일한 방법을 이용하여 다단계 탈세포화된 단백질 추출물을 제조하되, 1차 탈세포화 단계에서 처리액에 포함되는 수산화나트륨의 농도를 0.005M, 0.1M, 0.2M, 0.3M로 변화시켜가며 조직을 처리하였다.
실험 중에 제2 탈세포화 단계(제2 공정) 처리 중 및 처리 후 조직의 상태를 촬영하여 도 5에 도시하였다. 또한, 최종적으로 얻어진 단백질 추출물 1mg에 포함되어 있는 DNA의 함량을 실험예 3과 동일한 방법으로 측정하고, 최초 투입된 조직의 함량에 대하여 최종적으로 얻어진 단백질 추출물의 함량을 백분율 값으로 나타내 단백질 추출물의 수득률을 계산하였으며, H&E 염색 사진을 촬영한 사진을 도 5에 도시하였다.
도 5를 참조하면, NaOH의 농도가 0.05M인 경우에는 수득률은 양호하나 DNA 함량이 높고, 조직 내에 제거되지 않은 세포핵이 존재하는 것으로 확인되어, 탈세포 효율이 낮은 것을 알 수 있다.
반면, 0.1M의 NaOH 로 처리된 경우에는 제2 탈세포화 단계에서 조직의 구조가 양호하게 유지되고, 최종 처리 후 DNA 함량이 0.6ng/mg으로 매우 낮으며, 수득률이 20.8%로 높게 나타나는 것을 확인할 수 있다.
0.2M의 NaOH 로 처리된 경우에는, DNA 함량이 낮으나, 1차 탈세포화 단계 중에 조직의 일부가 와해되어, 최종 수득률이 0.1M의 NaOH로 처리된 경우에 비해 절반도 안되는 것으로 나타났으며, 0.3M의 NaOH로 처리된 경우에는 조직이 거의 용해되는 것으로 나타나 조직 수득이 불가능한 것으로 나타났다.
따라서, 상기 실험 결과로부터 1차 탈세포화 단계에서 조직의 와해나 용해가 일어나지 않아 수득률이 우수하고, 조직 내 DNA가 충분히 제거된 단백질 추출물을 얻기 위해, 1차 탈세포화 단계, 특히 제2 탈세포화 단계에서 처리액에 포함되는 NaOH의 농도는 0.05M 초과 및 0.2M 미만인 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 6]
제조예 1과 동일한 방법을 이용하여 다단계 탈세포화된 단백질 추출물을 제조하되, 1차 탈세포화 단계에서 처리액에 포함되는 수산화나트륨의 농도가 0.005M, 0.1M인 경우에 Dnase의 농도를 0.0001~0.003wt%로 변화시켜가며 조직을 처리한 뒤, 최종적으로 얻어진 각 단백질 추출물의 DNA 함량비 및 단백질 추출물의 수득률을 계산하여 그 결과를 표 2에 기재하였다.
| NaOH 농도 | 0.05 | 0.1 | ||||
| DNase 농도(wt%) | 0.0028 | 0.0014 | 0.0007 | 0.0002 | 0.0002 | 0.0001 |
| DNA 농도(ng/mg) | 25.7 | 38.0 | 54.7 | 0.2 | 0.3 | 0.6 |
| 수득률(%) | 20.3 | 20.7 | 19.9 | 21.0 | 21.4 | 20.8 |
상기 표 2의 결과를 참조하면, NaOH의 농도가 일정한 경우, DNase의 농도가 증가할수록 최종 단백질 추출물 내의 DNA 농도가 낮아지는 것을 알 수 있다. 그러나, NaOH의 농도가 0.1M인 경우에 0.05M일때보다 수배 내지 수십배 낮은 농도의 DNase로 처리했음에도 불구하고 최종적으로 얻어진 단백질 추출물 내 DNA 농도가 오히려 더 낮았으며, 수득률의 차이는 유의미하지 않은 것을 확인할 수 있다.
NaOH의 농도가 0.05M인 경우, 0.1M인 경우에 비해 DNA 제거 효율이 현저히 떨어지는 것으로 나타나, 1차 탈세포화 단계에서 사용되는 처리액 내 NaOH의 농도는 0.05M을 초과하는 것이 바람직함을 알 수 있다.
[제조예 2]
분자량이 400인 PEG 55g, 4,000인 PEG 25g, 제조예 1에 따른 단백질 추출물 0.35g과 1,2헥산디올, 에틸헥실글리세린 및 히알루론산나트륨을 각 4g 및 7.65g의 정제수를 혼합하여 국소 창상 피복재를 제조하였다. 이렇게 제조된 국소 창상 피복재의 기초 물성인 점도와 스토리지 모듈러스 및 pH를 측정한 결과를 도 6에 정리하였다.
비교를 위해 기존의 상용화된 타사의 창상 피복제 E제품과 T제품을 사용하여 동일한 조건에서 기초 물성을 측정하였다.
도 6(A)의 전단 속도(shear rate)의 변화에 따른 점도 변화에서 확인되듯이, 제조예 2에 따른 국소 청상 피복제는, 기존의 상용화된 타사 제품들(E제품 및 T제품)과 유사하게 전단 속도가 증가함에 따라 전단 점도가 감소하는 전형적인 전단 박화(shear thining) 현상을 나타내었지만, 도 6(B)에서 확인되듯이, 저장 탄성율(storage modulus) 값은 E제품 및 T제품에 비해 모든 온도 범위에서 가장 높은 값을 갖는 것으로 확인되었다. 이는 제조예 2에 따른 국소 창상 피복제의 경우, 비교적 높은 분자량을 갖는 PEG가 포함되어 있기 때문인 것으로 판단된다.
특히 도 6(C)에서 확인되듯이, 상온(25℃)에서 측정된 점도 값과 체온과 유사한 온도인 35℃에서 측정된 점도를 비교해보면, 기존의 E제품과 T제품의 경우, 온도가 증가함에 따라 점도가 급격하게 감소하지만, 제조예 2의 국소 창상 피복재의 경우에는 거의 점도 변화 없이 실질적으로 동일한 점도값을 갖는 것을 알 수 있는데, 이는 저분자량 및 고분자량을 갖는 PEG가 혼합되어 안정적인 하이드로겔을 형성하기 때문인 것으로 파악된다.
도 6(D)의 pH 측정 결과에서는, 기존의 상용화된 제품들과 크게 차이 없이 중성 영역에 해당함을 알 수 있었다.
[실험예 7]
이건 발명의 국소 창상 피복재에 사용되는 단백질 추출물의 효과를 확인하기 위해 아래 표 3의 시험군을 사용하여 in vitro 시험을 수행하였다.
| Group | Hydrogel | Cell |
| G1 | atelocollagen | Fibroblast (Lonza) |
| G2 | Atelocollagen + 0.35% 단백질 추출물 | Fibroblast (Lonza) |
| G3 | Atelocollagen + 1% 단백질 추출물 | Fibroblast (Lonza) |
(1) Hydrogel 제작
상기 표 3에 제시된 것과 같이, atelocollagen에 제조예 1에서 얻어진 단백질 추출물(각 0, 0.35, 1w/v %) 및 fibroblast (1x105 cell/ml)를 혼합한 후, 37°C에서 30분간 gelation하여 hydrogel sample을 제작하였다.
(2) CCK-8 assay
세포 증식률을 측정하기 위해 Cell Count Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Japan)를 사용하였다. 제작된 각 hydrogel sample을 배양하였으며 배양 한 후 각 0, 1, 4, 7, 14일째에 분석을 진행하였다. cck-8 solution과 배양액을 1:10으로 혼합한 용액을 샘플링하여 처리한 후, 37℃에서 2시간 동안 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이렇게 측정된 흡광도는, 세포를 이용한 standard curve를 이용하여 세포 수로 환산되었으며, 그 결과를 도 7에 정리하였다.
상기 도 7의 결과에서 확인되듯이, 단백질 추출물이 포함된 G2 및 G3 시료들의 경우, 단백질 추출물이 포함되지 않은 G1 시료에 비해 모든 시험 구간(day 1 ~ day 14)에서 향상된 세포 증식 효과를 나타내었다.
(3) L/D staining
하이드로겔 내에서의 세포 생존률을 측정하기 위해, Live/Dead assay kit (Invitrogen)을 사용하여 G1 내지 G3에 대하여 실험을 진행하였다. 제작된 각 hydrogel sample을 배양 한 후, 0, 1, 4, 7, 14일 째에 분석을 진행하였으며, 2μM calcein AM과 4μM EthD-1이 포함된 배양액을 각 시점에 처리하여 형광 현미경을 이용해 관찰하였고(도 8(A) 참조), 세포 생존률은 아래의 수식 2에 따라 계산하여 도 8(B)로 정리하였다.
(수식 2)
도 8(A)와 (B)의 결과에서 알 수 있듯이, 단백질 추출물이 포함된 시료의 하이드로겔 내 세포 생존율이 그렇지 않은 경우에 비해 상대적으로 높은 것을 알 수 있다.
(4) Scratch test
L929 cell을 2×105 cell/well의 농도로 6 well에서 배양한 후, pipette tip을 이용하여 well의 가운데를 가로지르는 scatch를 생성하였다. 이때 배양액은 2% FBS가 혼합된 α-MEM 배양액을 사용하였다. Scratch가 생성된 well에 하기 표 4와 같이 각각 용출된 배양액(각 물질이 4g/20ml 농도로 2% FBS(Fetal Bovine Serum)가 혼합된 α-MEM 배양액에 침지된 상태로 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 용출)을 처리하였으며, 각 용출액 상에서 cell을 배양하여 실험을 진행하였다. 배양 후 0, 12, 24시간 마다 scratch가 발생한 부분을 사진 촬영하여 scratch가 메워진 비율을 분석하였으며(도 9(A) 참조), Scratch가 메워진 비율(wound closure rate)은 아래의 수식 3으로 결정하여 도 9(B)에 정리하였다.
(수식 3)
| Group | 용출 물질 | 용출 비율 | 용출액 | 용출 조건 |
| Control | 배양액 | 4g / 20ml | α-MEM + 2% FBS | 37℃, 5% CO2 조건에서 24hr |
| 콜라겐 | 콜라겐 | |||
| 단백질 추출물 (제조예 1) |
단백질 추출물 |
도 9(A)와 (B)에서 확인되듯이, 제조예 1에서 제조된 단백질 추출물이 사용된 경우, 생성된 screatch가 비처리군인 control 및 단순한 콜라겐에 비해 효과적으로 메워졌음을 확인할 수 있었으며, 이는 이건 발명에 따른 단백질 추출물이 국소 창상에 효과적으로 작용할 수 있음을 의미한다.
[실험예 8]
이건 발명에 따른 국소 창상 피복제의 효과를 확인하기 위하여, 제조예 2에 따른 국소 창상 피복재를 쥐에 형성된 국소 창상 부위에 도포한 후, 바셀린 거즈를 사용하여 보호하였다(도 10 참조). 비교를 위해 동일한 국소 창상을 형성한 후, 아무런 처치를 하지 않고 바셀린 거즈를 덮어 control로 사용하였다.
이러한 급성 창상 동물 모델을 통해 상처 치유율(wound healing rate, %), 재상피화율(re-epitherialization rate, %) 및 혈관 형성(angiogenesis, %)을 다음의 식을 사용하여 결정하였으며, 도 11 내지 도 13에 각각의 사진과 그 결과를 도시하였다.
먼저 도 11에 제시된 상처치유율(Wound healing rate)은, 각 처리군의 창상 부위를 처리한 후, 13일차에 육안 관찰(사진 촬영)하여 상처부위가 여전히 노출되어 있는 부분을 확인하였다. 거즈를 접촉시켜 피가 묻어 나옴을 확인하여 재 확인하였으며, 전체 상처부위의 면적과 치유되지 않고 남았있는 부위의 면적을 이미지 분석하여 아래 수식 4로 계산하였다.
Wound healing rate (%) =
[(initial defect - remaining defect) / (initial defect)] × 100% (수식 4)
다음으로 시료를 채취하여 histological assay를 수행하였다. 재상피화 및 신생혈관 생성률을 분석을 위해 창상의 중앙부분 (도 12 (A)의 원모양 창상의 지름 부분)을 채취하여 paraffin block을 제작하였으며 이를 section하여 H&E 염색 (hematoxylin and eosin staining)을 진행하였다
H&E 염색된 조직을 관찰하여 분석하였으며 전체 창상 부분의 길이(defect length)와 재상피화가 진행된 부분의 길이(re-epitherilum length)를 측정하였다. 측정된 길이를 바탕으로 아래의 수식 5를 사용하여 계산하였으며, 그 결과는 도 13 (B)와 같다
Re-epithelium rate (%) =
[(re-epitherilum length) / (initial defect length)] × 100% (수식 5)
또한, 신생혈관의 생성 정도를 확인하기 위하여, H&E 염색된 조직을 관찰하여 단위 면적당 존재하는 혈관의 수를 counting하였다. 단위 면적당 counting된 혈관의 수는 정상 조직에 존재하는 혈관의 수와 비교하였으며 angiogenesis (%)는 아래의 수식 6으로 계산하였으며, 그 결과는 도 14(B)와 같다.
angiogenesis(%) =
[(number of regenerated blood vessel in regenerated area) / (number of blood vessel in normal tissue (skin dermis))] × 100% (수식 6)
도 11 내지 도 13에서 확인되듯이, 이건 발명에 따른 국소 창상 피복재는 다단계 탈세포화 과정을 거쳐 얻어지는 단백질 추출물을 포함하고 있어, 앞서 실험예 7의 in vitro 결과에서 예상된 것과 동일하게, 실제 급성 창상 동물 모델에서 현저한 상처 치유율, 재상피화율 및 혈관 형성 효과가 존재하는 것을 알 수 있다.
이건 발명은 상술한 특정의 실시예 및 설명에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 이건 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형 실시가 가능하며, 그와 같은 변형은 이건 발명의 보호 범위 내에 있게 된다.
Claims (11)
- 폴리에틸렌 글리콜(PEG, Polyethylene Glycol), 백색 바세린(White Petrolatum), 1,2헥산디올(1,2-hexandiol), 에틸헥실글리세린(Ethylhexylglycerin), 히알루론산나트륨(Sodium Hyaluronate), 단백질 추출물(Protein Extract) 및 정제수를 포함하는, 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재.
- 제1항에 있어서, 상기 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재는,
폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol) 11~95wt%, 백색 바세린(White Petrolatum) 0.5~10wt%, 1,2헥산디올(1,2-hexandiol) 0.1~10wt%, 에틸헥실글리세린(Ethylhexylglycerin) 0.01~10wt%, 히알루론산나트륨(Sodium Hyaluronate) 0.001~10wt%, 단백질 추출물(Protein Extract) 0.01~10wt% 및 잔량의 정제수를 포함하는, 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재. - 제1항에 있어서, 상기 단백질 추출물은,
사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하여 전처리하는 전처리 단계;
알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제1 불활성화 단계;
바이러스 불활성화된 조직으로부터 세포를 제거하는 탈세포화 단계; 및
산(acid)을 사용하여 탈세포화된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제2 불활성화 단계;를 거쳐 제조되며,
상기 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 DNA 함량은 50ng/mg 이하이고,
상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 20% 이하인 것을 특징으로 하는, 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재. - 제3항에 있어서, 상기 탈세포화단계는,
바이러스 불활성화된 조직으로부터 염기 수용액을 사용하여 세포를 제거하는 1차 탈세포화 단계; 및
1차 탈세포화된 조직을 효소처리하여 세포를 제거하는 2차 탈세포화 단계;를 포함하는, 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재. - 제4항에 있어서, 상기 1차 탈세포화 단계는,
n-PrOH과 NaOH의 혼합물을 통해 수행되는 제1 탈세포화 단계; 및 0.05M 초과 0.2M 미만의 수산화나트륨 수용액으로 수행되는, 제2 탈세포화 단계;를 포함하는, 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재. - 제3항에 있어서, 상기 조직은,
포유류 유래 혈관, 인대 및 건 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재. - 제4항에 있어서, 상기 2차 탈세포화 단계는,
DNase를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재. - 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은,
중량평균 분자량이 400인 PEG와 중량평균 분자량이 4,000인 PEG가 2.2:1의 중량비로 혼합된 혼합물인 것을 특징으로 하는, 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재. - 제1항에 있어서,
25℃에서 측정된 점도와 35℃에서 측정된 점도가 실질적으로 동일한 것을 특징으로 하는, 하이드로젤 기반의 국소 창상 피복재. - 제1항에 있어서,
상기 단백질 추출물은, 콜라겐과 엘라스틴을 포함하는 것을 특징으로 하는, 하이드로젤 기반의 국소 창상 피복재. - 제1항에 있어서,
상기 1,2헥산디올과 에틸헥실글리세린은, 글루코네이트 클로로헥시딘, 아세테이트 클로로헥시딘, 하이드로클로라이드 클로로헥시딘, 실버술파다이아진, 포비돈 아이오딘, 벤즈알코니움 클로라이드, 퓨라진, 아이도카인, 헥사클로로펜, 클로로테트라사이클린, 네오마이신, 페니실린, 젠타마이신, 젠타마이신설페이트, 아크리놀, 시플로플록사신, 염화벤잘코늄, 후시딘산, 네오마이신황산염, 오플록사신 및 토브라마이신으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상으로 대체되는 것을 특징으로 하는, 하이드로젤 기반의 국소 창상 피복재.
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Citations (1)
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