WO2024043506A1 - 단백질 추출물을 포함하는 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재 - Google Patents

단백질 추출물을 포함하는 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재 Download PDF

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김창환
김영환
안혁주
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Definitions

  • This invention relates to a hydrogel-based wound dressing material containing protein extract, Polyethylene Glycol, White Petrolatum, 1,2-Hexanediol, and Ethylhexylglycerin.
  • a topical wound coating material that contains (Ethylhexylglycerin), Sodium Hyaluronate, Protein Extract and purified water, maintains almost the same viscosity as room temperature even at a temperature similar to body temperature, and has excellent wound healing effect, and a method of manufacturing the same. It's about.
  • Human skin tissue is largely divided into three parts, consisting of the epidermis layer, which forms the outermost layer of the skin, the dermis layer, and the subcutaneous tissue, which are the layers below.
  • the epidermal layer contains epithelial cells, melinin cells, immune cells, etc. differentiated into several layers from the basement membrane that allows the epidermal layer and dermal layer to be tightly combined, and the dermal layer below the epidermal layer mainly contains fibroblasts and secretions from these cells. It contains several extracellular substances (extracellular matrix).
  • wound healing is complex and occurs little by little in stages over time.
  • the extracellular matrix is remodeled as three stages overlap: the hemostatic and inflammatory stage, the proliferative stage, and the maturation stage.
  • the ground substance is a substance that fills the space between the connective fibers of the dermis. It exists as a mucopolysaccharide, retains a large amount of moisture, and is composed of glycosamino glycans such as hyaluronic acid and chondroitin sulfate.
  • proteoglycan is a hydrophilic carbohydrate protein complex and is known to be composed of a jelly-like substance.
  • wound dressings covering materials
  • dry dressings include bandages (Daeil Band or other bands) and ointments (Fucidin, Madecassol, etc.). Bands serve to cover the wound without any special therapeutic effect, and ointments serve to treat the wound with antibiotics or steroids.
  • the ingredients are added to help the wound heal quickly and prevent further infection.
  • wet dressing materials using hydrocolloid, alginate, foam, and hydrogel have been used.
  • gelatin is a natural polymer that is widely used in many wound dressings due to its excellent biocompatibility, biodegradability, and high hygroscopicity, and the ability to provide a moist environment to the skin when a wound occurs.
  • Hydrogel has a three-dimensional hydrophilic polymer network structure using water as a dispersion medium, can absorb a large amount of moisture, and has flexibility like natural tissue, so it is widely used in wound dressings.
  • a protein extract obtained through a multi-step decellularization process is included.
  • the aim is to provide a hydrogel-based wound covering material.
  • the hydrogel-based topical wound coating material includes polyethylene glycol (PEG, Polyethylene Glycol), white petrolatum, 1,2-hexanediol, and ethylhexylglycerin. Contains Ethylhexylglycerin, Sodium Hyaluronate, Protein Extract, and purified water.
  • PEG polyethylene glycol
  • white petrolatum 1,2-hexanediol
  • ethylhexylglycerin Contains Ethylhexylglycerin, Sodium Hyaluronate, Protein Extract, and purified water.
  • the hydrogel-based topical wound coating material includes 11 to 95 wt% of polyethylene glycol, 0.5 to 10 wt% of white petrolatum, 0.1 to 10 wt% of 1,2-hexanediol, It is preferable to include 0.01 to 10 wt% of ethylhexylglycerin, 0.001 to 10 wt% of sodium hyaluronate, 0.01 to 10 wt% of protein extract, and the remaining amount of purified water.
  • the polyethylene glycol (PEG) used at this time is preferably a mixture of PEG with a weight average molecular weight of 400 and PEG with a weight average molecular weight of 4,000 in a weight ratio of about 2.2:1, and is safe for humans at room temperature storage.
  • PEG polyethylene glycol
  • hydrogel-based topical wound dressings contain protein extracts including collagen and elastin, so they have excellent effects on wound healing, re-epitherialization, and angiogenesis. .
  • hydrogel-based topical wound dressing replaces the 1,2-hexanediol and ethylhexylglycerin with gluconate chlorhexidine, acetate chlorhexidine, hydrochloride chlorhexidine, Silver sulfadiazine, povidone iodine, benzalkonium chloride, furazine, idocaine, hexachlorophen, chlorotetracycline, neomycin, penicillin, gentamicin, gentamicin sulfate, acrinol, ciflofloxacin, chloride.
  • benzalkonium fucidic acid, neomycin sulfate, ofloxacin, and tobramycin are included in the same amount or in the range of 0.01 to 5 wt%.
  • the protein extract includes a pretreatment step of preparing and pretreating tissues of mammals other than humans; A first inactivation step of inactivating viruses contained in the pretreated tissue using alcohol; A decellularization step to remove cells from virus-inactivated tissue; and a second inactivation step of inactivating the virus contained in the decellularized tissue using acid, wherein the DNA content of the tissue that has undergone the second inactivation step is 50 ng/mg or less, It is preferable that the reduction rate (L) of the elastin content of the tissue that has undergone the pretreatment step to the second inactivation step is 20% or less.
  • the decellularization step includes a first decellularization step of removing cells from virus-inactivated tissue using an aqueous base solution; and a secondary decellularization step of removing cells by enzymatically treating the primary decellularized tissue.
  • the first decellularization step includes: a first decellularization step performed through a mixture of n-PrOH and NaOH; and a second decellularization step, performed with an aqueous sodium hydroxide solution of more than 0.05M and less than 0.2M.
  • the tissue is preferably one or more of mammalian-derived blood vessels, ligaments, and tendons, and the secondary decellularization step is more preferably performed using DNase.
  • the hydrogel-based topical wound dressing containing protein extract according to this invention does not cause toxicity problems in the human body, has excellent biocompatibility, and when the user applies it to wounded skin tissue, the viscosity changes according to temperature changes. It has the advantage of being convenient to use as no degradation occurs.
  • the protein extract obtained through multi-step decellularization and inactivation steps has excellent wound healing effects, re-epitherialization, and angiogenesis, making it suitable for wound treatment. It can be used as a useful wound dressing.
  • Figures 1 (A) and (B) are graphs showing the experimental results of Experimental Example 1, respectively.
  • Figure 2 is a graph showing the experimental results of Experimental Example 2.
  • Figures 3 (A) and (B) are graphs showing the experimental results of Experimental Example 3.
  • Figures 4 (A) and (B) are graphs showing the experimental results of Experimental Example 4.
  • Figure 5 is a table showing the experimental results of Experimental Example 5.
  • Figure 6 shows the results of measuring the basic physical properties of viscosity, storage modulus, and pH of the topical wound coating material according to Preparation Example 2.
  • Figure 7 shows the results of measuring cell proliferation rate using Cell Count Kit-8.
  • Figure 8 shows the results of measuring cell survival rate within the hydrogel using the Live/Dead assay kit (Invitrogen).
  • Figure 9 shows the results of scratch evaluation performed on the eluted culture medium.
  • Figure 10 schematically shows the acute wound animal model in which Experiment 8 was performed.
  • Figures 11 to 13 are a summary of the wound healing rate (%), re-epitherialization rate (%), or angiogenesis (%) results according to Experimental Example 8, respectively.
  • % used to indicate the concentration of a specific substance means (weight/weight)% for solid/solid, (weight/volume)% for solid/liquid, and liquid (weight/volume)%, unless otherwise specified.
  • /Liquid means (volume/volume)%.
  • mammal refers to mammals other than humans, and even if “mammals” are simply described without mention of excluding humans, it should be understood as mammals other than humans, and the expression “cells are removed” should be understood in a comprehensive sense that includes destruction or removal of DNA.
  • each step may be performed differently from the specified order unless the specific order is clearly stated in the context. That is, each step may be performed in the same order as specified, may be performed substantially simultaneously, or may be performed in the opposite order.
  • the hydrogel-based wound coating material containing protein extract relates to a composition that is effective in healing wounds when used on wounded skin tissue in an ointment formulation, and contains 11 to 95 wt% of polyethylene glycol (Polyethylene Glycol) , White Petrolatum 0.5 ⁇ 10wt%, 1,2-Hexanediol 0.1 ⁇ 10wt%, Ethylhexylglycerin 0.01 ⁇ 10wt%, Sodium Hyaluronate 0.001 ⁇ Contains 10 wt%, Protein Extract 0.01 ⁇ 10 wt%, and the remaining amount of purified water, maintains the same viscosity as at room temperature even at temperatures similar to body temperature, and provides a topical wound coating material with excellent wound healing, re-epithelialization, and blood vessel formation. can do.
  • polyethylene glycol Polyethylene Glycol
  • White Petrolatum 0.5 ⁇ 10wt%
  • Hydrogel refers to a three-dimensional network structure made by cross-linking hydrophilic polymers by covalent or non-covalent bonds. Due to the hydrophilic nature of the constituent material, it absorbs a large amount of water in an aqueous solution and in an aqueous environment and swells, but does not dissolve due to the cross-linked structure. It has properties. In addition, hydrogels with various shapes and properties can be created depending on the composition and manufacturing method, and can contain a large amount of moisture, so they have properties intermediate between liquid and solid.
  • the topical wound coating material of this invention which is implemented in an ointment formulation, is manufactured based on a hydrogel containing polyethylene glycol (PEG) as the main ingredient, unlike other existing white vaseline-based wound coating materials, and has excellent mechanical properties.
  • polyethylene glycol (PEG) uses a mixture of PEG with a weight average molecular weight of 400 and PEG with a weight average molecular weight of 4,000 in a weight ratio of about 2.2:1, or uses a mixture of PEG with a weight average molecular weight of 4,000 based on 100 wt% of the topical wound coating material. It can be used in the range of 10 to 95 wt% of PEG with a weight average molecular weight of 400 and 1 to 25 wt% of PEG with a weight average molecular weight of 4,000.
  • the topical wound coating material according to the present invention contains a protein extract including collagen and elastin in the range of about 0.01 to 10 wt%.
  • the protein extract is obtained through a multi-step decellularization process, and cells, crude fat, viruses, and other foreign substances in mammalian-derived tissues are effectively removed, and the loss of elastin is small during the decellularization process, resulting in re-epitherialization. and shows excellent effects in angiogenesis.
  • the topical wound dressing according to the present invention further includes white petrolatum, 1,2-hexanediol, ethylhexylglycerin, and sodium hyaluronate. It can act as a contact and preservative on the skin or wound area.
  • white petrolatum 1,2-hexanediol
  • ethylhexylglycerin ethylhexylglycerin
  • sodium hyaluronate a contact and preservative on the skin or wound area.
  • white petrolatum 0.5 to 10 wt% of white petrolatum and 0.1 to 1,2-hexanediol.
  • Ethylhexylglycerin 0.01 ⁇ 10wt%
  • Sodium Hyaluronate 0.001 ⁇ 10wt%, and the remaining amount of purified water may be mixed.
  • Hyaluronic acid is a type of polysaccharide in which repeating units composed of N-acetyl-glucosamine and D-glucuronic acid are linearly linked and is a biopolymer. Since it was first isolated from the liquid filling the eyeballs of animals, it has been It is known to be present in large quantities in the placenta, synovial fluid, pleural fluid, skin, and rooster's comb, and is also produced by Streptococcus genus microorganisms such as Streptococcus equi and Streptococcus zooepidemecus.
  • hyaluronic acid is widely used not only for cosmetic purposes such as cosmetic additives due to its excellent biocompatibility and high viscoelasticity in solution state, but also for various medical purposes such as ophthalmic surgical aids, joint function improvers, drug delivery substances, and eye drops.
  • hyaluronic acid itself is easily decomposed in vivo or under acid, alkali, etc. conditions, so its use is limited.
  • the hydrogel-based topical wound dressing according to the present invention contains chlorhexidine gluconate, chlorhexidine acetate, and chlorhexyhydrochloride instead of the previously mentioned 1,2-hexanediol and ethylhexylglycerin.
  • benzalkonium chloride fucidic acid, neomycin sulfate, ofloxacin, and tobramycin, or one or more selected from the group consisting of 1,2hexanediol and ethylhexylglycerin that can be used in the same amount. , it is also possible to include it in the range of about 0.01 to 5 wt% in the total composition.
  • the protein extract included in the topical wound dressing according to the present invention includes a preparatory step of preparing tissue from mammals other than humans; A pre-processing step of pre-treating the tissue; A first inactivation step of inactivating viruses contained in the pretreated tissue using alcohol; A first decellularization step in which cells are removed from the virus-inactivated tissue using an aqueous base solution; A second decellularization step in which cells are removed by enzymatically treating the first decellularized tissue; and a second inactivation step of inactivating the virus contained in the decellularized tissue using acid.
  • the DNA content of the tissue that has undergone the second inactivation step may be 50 ng/mg or less, preferably 20 ng/mg or less, 10 ng/mg or less, and more preferably 5 ng/mg or less.
  • the reduction rate (L) of the elastin content of the tissue that has undergone the pretreatment step to the second inactivation step is 20% or less.
  • the reduction rate (L) is defined by the following formula (1), where L 0 refers to the elastin content of the tissue in the preparation stage, and L f refers to the elastin content of the tissue that has undergone the second inactivation step. .
  • the preparation step is a step of preparing tissues of mammals other than humans.
  • the mammal may be a mammal other than a human, for example, a pig, horse, cow, sheep, etc.
  • the tissue may be any one or more of blood vessels, ligaments, and tendons derived from these mammals.
  • mammalian tissue is first collected.
  • the mammalian tissue collected in this way is prepared by removing useless tissue and blood adhering to the mammalian tissue in the preparation stage, washing, drying, and cutting.
  • the mammalian tissue prepared in this way can be stored frozen and thawed and used when required for work.
  • the preparation step may be a step of removing and preparing the frozen tissue raw material.
  • the mammalian tissue prepared in the preparation step is pretreated through a pretreatment step.
  • This step is to wash the mammalian tissue. If the mammalian tissue is frozen, it can be thawed, washed, and cut through this step.
  • distilled water, purified water, saline water, etc. can be used as washing water, and distilled water can be preferably used. Physical agitation may occur from this stage until the second inactivation stage.
  • the mammalian tissue prepared through this pretreatment step goes through a first inactivation step, a first decellularization step, a second decellularization step, and a second inactivation step to remove cells, crude fat, viruses, and other substances that can cause immune and foreign body reactions. Foreign matter can be removed.
  • Decellularization through this multi-step reaction significantly improves the decellularization efficiency and foreign matter removal efficiency at each step, increasing the amount of tissue processed at one time and shortening the processing time, resulting in the productivity of the decellularized protein extract. And the effect of improving the yield can be obtained.
  • the first inactivation step is a step of inactivating the virus contained in the pretreated tissue using alcohol.
  • This step is performed to more effectively remove cells, crude fat, and foreign substances in the primary and secondary decellularization steps by first inactivating viruses in the tissue before decellularizing the tissue.
  • the alcohol used in this step may be n-propanol, and in order to achieve the virus inactivation effect, it is preferable that an aqueous solution of n-propanol at a concentration of 50 to 90% is used, and more preferably, an aqueous solution of n-propanol at a concentration of 65 to 80% is used. An aqueous propanol solution may be used.
  • n-propanol is used as an alcohol for virus inactivation.
  • the tissue becomes softer. If the tissue is soft, the treatment solution penetrates into the tissue better, so virus inactivation and decellularization can be performed uniformly throughout. As a result, Inactivation and decellularization processing efficiency can be improved, more uniform tissues can be obtained, and the quality and reliability of the finally obtained decellularized protein extract can be improved.
  • ethanol which is generally used to inactivate viruses
  • it has the characteristic of fixing and hardening the mammalian tissue to be decellularized. If ethanol is used instead of n-propanol in this step of the invention, the tissue becomes hard and hardens in the subsequent steps. This is undesirable because it reduces the efficiency of the process of loosening the tissue and improving the penetration of the treatment material.
  • n-propanol is preferably used in the first inactivation step.
  • the pretreated tissue may be treated at 10 to 25 parts by weight, preferably 20 to 25 parts by weight, based on 100 parts by weight of the propanol aqueous solution.
  • the first decellularization step is a step of removing cells by treating the virus-inactivated tissue with an aqueous base solution after going through the first inactivation step.
  • This step includes a first decellularization step in which the tissue is treated using a mixture of an aqueous base solution and an alcohol; and a second decellularization step of treating the tissue using an aqueous base solution.
  • the base aqueous solution is an aqueous sodium hydroxide solution
  • the alcohol is preferably n-propanol.
  • the first decellularization step is performed by treating the tissue with a mixture of n-propanol and sodium hydroxide
  • the second step is performed by treating the tissue with a mixture of n-propanol and sodium hydroxide.
  • the decellularization step is performed by treating the tissue with an aqueous sodium hydroxide solution.
  • the tissue may be treated at 10 to 25 parts by weight, preferably 20 to 25 parts by weight, based on 100 parts by weight of the treatment solution, which is close to twice the conventional treatment capacity. , Because effective decellularization is possible through the multi-step method of the invention, it has the effect of sufficiently processing twice the amount of tissue compared to the existing method.
  • the first decellularization step is a step of treating the virus-inactivated tissue with a mixture of n-propanol and sodium hydroxide.
  • the crude fat and sodium hydroxide in the tissue undergo a saponification reaction, and the crude fat is separated and removed from the tissue.
  • n-propanol promotes this saponification reaction and acts to coagulate the products of the saponification reaction with each other, so that the crude fat is separated and removed more quickly. Ensures efficient separation and removal from tissue.
  • the treatment time for treating the tissue with a mixture of n-propanol and sodium hydroxide may be 10 to 48 hours, preferably 15 to 40 hours, and more preferably 18 to 28 hours, and the treatment temperature is 0 to 30 ° C. It may be preferably 10 to 28°C, more preferably 18 to 25°C. When treated in this temperature range and for the above time, sufficient crude fat removal efficiency can be obtained without significant damage to the tissue structure or loss of elastin.
  • the mixture of n-propanol and sodium hydroxide may have a n-propanol concentration of 50 to 95%, preferably 60 to 90%, and more preferably 65 to 85%, and the sodium hydroxide concentration may be greater than 0.05M and 0.2M. It may be an aqueous solution less than .
  • concentration ranges are those that can minimize tissue damage in the first decellularization step and at the same time allow foreign substances such as crude fat to be effectively removed.
  • concentration of sodium hydroxide is below the above range, the first decellularization step Treatment efficiency decreases, and if it is outside the above range, there is a problem that the tissue structure itself collapses and dissolves. Therefore, it is preferable to use an aqueous solution of n-propanol and sodium hydroxide in the above-mentioned concentration range.
  • the second decellularization step is a step in which the tissue that has undergone the first decellularization step is treated with an aqueous base solution to soften the tissue, thereby loosening the structure of the tissue and simultaneously causing a decellularization reaction.
  • Crude fat and various foreign substances contained in the tissue act as a kind of physical and chemical barrier in the decellularization reaction. Since the tissue has previously gone through the first decellularization step and the crude fat and various foreign substances have been removed, the second decellularization step The decellularization reaction can be achieved more effectively.
  • the treatment time for treating the tissue with the aqueous base solution may be 10 to 48 hours, preferably 15 to 40 hours, and more preferably 18 to 28 hours, and the treatment temperature may be 0 to 30° C., preferably 10 to 10 hours. It may be ⁇ 28°C, more preferably 18 ⁇ 25°C, and when treated for the above time in this temperature range, the tissue structure is sufficiently loosely deformed without collapse of the tissue structure or loss of elastin, and an appropriate decellularization reaction can be achieved. there is.
  • the aqueous base solution used as the treatment solution may be an aqueous sodium hydroxide solution, and the concentration of sodium hydroxide contained in the aqueous sodium hydroxide solution may be greater than 0.05M and less than 0.2M. If the concentration of sodium hydroxide is 0.05M or less, the tissue structure is not sufficiently loosened, which reduces the decellularization efficiency in the second decellularization step described later. If the concentration is 0.2M or more, some tissues are loosened in this step. It is preferable to use an aqueous sodium hydroxide solution of the above-mentioned concentration because it may disintegrate or dissolve, resulting in a significant decrease in final yield and loss of elastin.
  • a second decellularization step using enzymes is performed, and a neutralization step and a washing step may be performed between these two steps.
  • the neutralization step is a step of treating the sodium hydroxide used in the first decellularization step with an acidic aqueous solution.
  • the type of acidic aqueous solution used at this time is, for example, at least one of hydrochloric acid, sulfuric acid, acetic acid, and peracetic acid.
  • An acidic aqueous solution containing this may be used, but is not limited thereto, and its concentration may also be appropriately adjusted and used according to the working environment or conditions.
  • the washing step is performed to prevent a decrease in enzyme reactivity due to residues during enzyme treatment in the secondary decellularization step, which is a subsequent process.
  • a buffer solution can be used as a washing solution in the washing step, for example.
  • a PBS (Phosphate buffered saline) solution may be used, but is not limited thereto.
  • the second decellularization step is a step of removing cells by treating the first decellularized tissue with an enzyme, and removing the DNA in the first decellularized tissue by treating the first decellularized tissue with a DNA decomposition enzyme. This is the step.
  • the tissue can be treated with 10 to 25 parts by weight, preferably 20 to 25 parts by weight, based on 100 parts by weight of the treatment solution containing the DNA degrading enzyme, which is about twice as much as before, as described above.
  • this is an achievable treatment capacity due to the increased treatment efficiency achieved by the multi-step decellularization process of the invention.
  • the treatment time for treating the tissue with a DNA decomposing enzyme may be 10 to 35 hours, preferably 18 to 30 hours, and the treatment temperature is preferably 30 to 45°C. It may be 35-42°C.
  • the concentration of DNA decomposition enzyme contained in the treatment solution is 0.0001 to 0.005 wt%, which is several to hundreds of times lower than the concentration of DNA decomposition enzyme that has been used in conventional similar technologies.
  • the first decellularized tissue of this invention goes through the first decellularization step to remove foreign substances, including crude fat, in the tissue, and the structure of the tissue becomes loose. If DNA degrading enzyme is introduced in this state, the DNA degrading enzyme can very easily penetrate into the tissue structure. Accordingly, even if a low concentration of DNA degrading enzyme is used, at least the same or better DNA removal efficiency can be secured. In the present invention, a low concentration of DNA decomposing enzyme as described above can be used.
  • the concentration of DNA degrading enzyme is less than the above range, the DNA decomposition efficiency decreases, so it is preferable to use it at a concentration of 0.0001% or more. If it exceeds the above range, the DNA decomposition efficiency decreases compared to the amount of added DNA decomposition enzyme. Since the degree of improvement is extremely small and thus uneconomical, it is preferable to use DNA degrading enzymes in the above-mentioned concentration range.
  • the tissue decellularized through the second decellularization step undergoes a second inactivation step to further remove viruses.
  • An additional decolorization step and/or a degreasing step may be performed between these two steps.
  • the decolorization step is a step of removing the color of the tissue, and can be performed, for example, by treating the tissue with hydrogen peroxide.
  • the degreasing step is a step of further removing lipids contained in the tissue, for example, a ketone solution, Preferably, it can be performed using an acetone solution.
  • a second inactivation step is performed to further inactivate the virus contained in the tissue that has undergone the second decellularization step.
  • This step uses acid to inactivate the virus in the tissue, specifically treating the tissue with a mixture of organic acid and alcohol.
  • the organic acid used at this time may be peroxyacetic acid, which is an oxidizing agent and can inactivate the virus by causing unspecified free radical damage to the virus.
  • Peracetic acid used in this step can be used at a concentration of 0.05 to 1%.
  • the alcohol used in this step may be a lower alcohol with 1 to 4 carbon atoms, such as methanol, ethanol, or propanol, and is preferably ethanol. It is preferable to use ethanol because it performs the function of inactivating viruses and fixing the tissue structure to make the tissue hard.
  • the virus is finally inactivated, crude fat and DNA are removed, and a protein extract containing various extracellular matrix components, including elastin, can be obtained.
  • the DNA content contained in the protein extract obtained in this way is 50 ng/mg or less, preferably 20 ng/mg or less, 10 ng/mg or less, and more preferably 5 ng/mg or less, so it has a very low DNA content, preventing immunity or various foreign substances. Reaction triggers can be minimized.
  • the protein extract has the advantage of having effects such as wound healing and scar inhibition by elastin due to its very low elastin content reduced through the pretreatment step to the second inactivation step.
  • the reduction rate (L) of the elastin content of the tissue that has gone through the pretreatment step to the second inactivation step is 20% or less. This numerical value is very low compared to when the conventional decellularization method is applied, the reduction rate (L) of the elastin content is very high at over 50%.
  • washing can be performed using a buffer solution, distilled water, etc.
  • packaging is performed to prevent contamination and facilitate handling when storing or transporting the protein extract. It may also be packaged in a preservative solution.
  • Sterilization is performed to remove additional contamination that occurs after the second inactivation step.
  • electron beam irradiation or radiation irradiation may be performed for sterilization, but is not limited thereto.
  • Processing refers to processing the protein extract into a usable form. For example, methods such as drying, powdering, and solutioning may be applied. Processed in this way, it can be used in forms such as bio ink or injection. It is not limited to this and can be used in various forms.
  • the manufacturing method includes a preparation step of preparing tissues of mammals other than humans; A pre-processing step of pre-treating the tissue; A first inactivation step of inactivating viruses contained in the pretreated tissue using alcohol; A first decellularization step in which cells are removed from the virus-inactivated tissue using an aqueous base solution; A second decellularization step in which cells are removed by enzymatically treating the first decellularized tissue; and a second inactivation step of inactivating the virus contained in the decellularized tissue using acid.
  • the DNA content of the tissue that has gone through the second inactivation step may be 50 ng/mg or less, and the reduction rate (L) of the elastin content of the tissue that has gone through the pretreatment step to the second inactivation step may be 20% or less.
  • the reduction rate (L) of the elastin content of the tissue is defined by the following equation (1), where L 0 is the elastin content of the tissue in the preparation stage, and L f is the elastin content of the tissue that has undergone the second inactivation step.
  • the preparation step is a step of preparing tissues of mammals other than humans.
  • the mammal may be a mammal other than a human, for example, a pig, horse, cow, sheep, etc.
  • the tissue may be any one or more of blood vessels, ligaments, and tendons derived from these mammals.
  • the pretreatment step is a step of washing the mammalian tissue prepared in the preparation step. If necessary, the tissue can be cut to an appropriate size at this step. If frozen tissue is previously prepared, thawing is performed at this step. You can.
  • the first inactivation step is a step of inactivating the virus contained in the pretreated tissue using alcohol.
  • alcohol Generally, ethanol is used to inactivate the virus, but in this invention, n-propanol is used. This is because ethanol fixes the tissue tightly and reduces the softening efficiency in the subsequent step, while n-propanol makes the tissue soft and improves the softening efficiency in the subsequent step.
  • the first decellularization step is a step of removing cells by treating the virus-inactivated tissue with an aqueous base solution after going through the first inactivation step.
  • This step includes a first decellularization step in which the tissue is treated using a mixture of an aqueous base solution and an alcohol; and a second decellularization step of treating the tissue using an aqueous base solution.
  • the aqueous base solution is an aqueous sodium hydroxide solution
  • the alcohol is preferably n-propanol.
  • the first decellularization step is a step of treating the virus-inactivated tissue with a mixture of n-propanol and sodium hydroxide. Through this step, crude fat and foreign substances in the tissue are removed and the tissue is partially softened.
  • the second decellularization step is a step of treating the tissue with an aqueous sodium hydroxide solution. In this step, tissue softening and decellularization reaction occur simultaneously. This effect can be further improved by removing foreign substances containing crude fat.
  • sodium hydroxide may be included at a concentration of more than 0.05M and less than 0.2M, which is desirable to prevent tissue disintegration or dissolution while sufficiently causing saponification and softening reactions by sodium hydroxide. This is the concentration range.
  • the neutralization step is a step of treating with an acidic aqueous solution to neutralize the sodium hydroxide used in the first decellularization step, and the washing step prevents a decrease in enzyme reactivity due to residues during enzyme treatment in the subsequent second decellularization step. This is a step taken to do this.
  • the second decellularization step is a step in which the first decellularized tissue is treated with DNA decomposition enzyme to remove DNA in the tissue.
  • the first decellularized tissue of this invention goes through the first decellularization step to remove foreign substances, including crude fat, in the tissue, and the structure of the tissue becomes loose. If DNA degrading enzyme is introduced in this state, the DNA degrading enzyme can very easily penetrate into the tissue structure. Accordingly, even if a low concentration of DNA degrading enzyme is used, at least the same or better DNA removal efficiency can be secured. In the invention, DNA degrading enzyme is used at a low concentration of 0.0001 to 0.005 wt%.
  • DNA degrading enzyme If the concentration of DNA degrading enzyme is less than the above range, DNA decomposition efficiency decreases, and if it exceeds the above range, the degree of improvement in DNA decomposition efficiency is extremely small compared to the amount of added DNA decomposing enzyme, making it uneconomical. It is preferable to use DNA degrading enzymes in a range of concentrations.
  • the tissue decellularized through the second decellularization step undergoes a second inactivation step to further remove viruses.
  • An additional decolorization step and/or a degreasing step may be performed between these two steps.
  • the decolorization step is a step of removing the color of the tissue, and can be performed, for example, by treating the tissue with hydrogen peroxide.
  • the degreasing step is a step of further removing lipids contained in the tissue, for example, a ketone solution, Preferably, it can be performed using an acetone solution.
  • a second inactivation step is performed to further inactivate the virus contained in the tissue that has undergone the second decellularization step.
  • This step is to treat the tissue with a mixture of organic acid and alcohol. Peracetic acid can be used as the organic acid and ethanol can be used as the alcohol. By treating the tissue using this mixed solution, the virus in the tissue can be effectively removed. there is.
  • the virus is finally inactivated, crude fat and DNA are removed, and a protein extract containing various extracellular matrix components, including elastin, can be produced.
  • the DNA content contained in the protein extract obtained in this way is 50 ng/mg or less, preferably 20 ng/mg or less, 10 ng/mg or less, and more preferably 5 ng/mg or less, so it has a very low DNA content, preventing immunity or various foreign substances. Reaction triggers can be minimized.
  • the protein extract has the advantage of having effects such as wound healing and scar inhibition by elastin due to its very low elastin content reduced through the pretreatment step to the second inactivation step.
  • the reduction rate (L) of the elastin content of the tissue that has gone through the pretreatment step to the second inactivation step is 20% or less. This numerical value is very low compared to when the conventional decellularization method is applied, the reduction rate (L) of the elastin content is very high at over 50%.
  • washing can be performed using a buffer solution, distilled water, etc.
  • packaging is performed to prevent contamination and facilitate handling when storing or transporting the protein extract
  • sterilization is performed to prevent additional contamination that occurs after the second inactivation step. This is done to remove .
  • Processing refers to processing the protein extract into a usable form. For example, methods such as drying, powdering, and solutioning may be applied. Processed in this way, it can be used in forms such as bio ink or injection. It is not limited to this and can be used in various forms.
  • a porcine heart-connected aorta that was washed, dried, cut, and frozen was prepared, thawed, washed with distilled water, and cut into 50 ⁇ 50 mm pieces to prepare raw tissue specimens.
  • the first decellularization step was performed by stirring for 24 hours at a temperature of 20°C and a stirring speed of 150 RPM.
  • the tissue specimen that had undergone the second decellularization step was immersed in an aqueous acetic acid solution, neutralized by stirring, and then washed with a PBS solution.
  • tissue specimen was placed in a treatment solution containing DNase at a concentration of 0.00011 wt% and stirred at a stirring speed of 150 RPM for 23 hours at a temperature of 37°C to perform a second decellularization step.
  • Tissue specimens on which the second decellularization step was completed were decolorized by treatment in 3% hydrogen peroxide solution at 20°C for 1 hour, and degreased by treatment in 20% acetone aqueous solution at 20°C for 1 hour.
  • tissue specimen was immersed in a mixed solution containing 70% n-propanol in distilled water and 0.2% peroxyacetic acid, and treated at 20°C for 4 and a half hours to perform a second inactivation step. did.
  • tissue specimen that had gone through all of the above treatment processes was washed with a PBS solution and distilled water to prepare a protein extract included in the topical wound dressing material of the present invention.
  • a multi-step decellularized protein extract was prepared using the same method as Preparation Example 1, but when the first, second, and second decellularization steps were sequentially performed, tissue specimens were collected immediately after each step and the amount was calculated per 1 mg of tissue specimen. The contained elastin content was measured, and the results are shown in Figure 1(A). In addition, the elastin content of the original tissue was measured in the preparation stage, and the elastin content at the time each step was performed was expressed as a percentage relative to the elastin content of the original tissue, as shown in Figure 1(B).
  • process 1 refers to the first decellularization step
  • process 2 refers to the second decellularization step
  • step 3 refers to the second decellularization step.
  • the elastin content was tested according to the protocol of the analysis kit using the Fastin Elastin Assay kit F2000 (manufacturer: Biocolor), and then the elastin was analyzed at an absorbance of 513 mm using a multimode plate reader Victor NivoTM (manufacturer: Perkin Elmer). And the elastin content was measured by comparing it with the standard material.
  • a multi-step decellularized protein extract was prepared using the same method as Preparation Example 1, but omitting only one step each of the first, second, and second decellularization steps, and collecting tissue specimens that had undergone the final process to obtain 1 mg of tissue specimen.
  • the content of elastin included in the sugar was measured, and the elastin content of the original tissue was measured in the same manner in the preparation stage, and then the L value was calculated and the results are summarized in Table 1.
  • the elastin content contained in the protein extract obtained by omitting each step was calculated as a percentage relative to the elastin content of the original tissue, and the results are shown in Figure 2.
  • Elastin content was measured in the same manner as in Experimental Example 1, and in Table 1 and Figure 2, process 1 refers to the first decellularization step, step 2 refers to the second decellularization step, and step 3 refers to the second decellularization step.
  • the experiment was performed in the same manner as in Experimental Example 1, but the DNA content, not the elastin content, was measured after each step.
  • DNA content was tested according to the protocol of the analysis kit using the Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA Assay kits and dsDNA Reagents (manufacturer: Invitrogen), and then using a multimode plate reader Victor NivoTM (manufacturer: Perkin Elmer).
  • the DNA content was measured at an absorbance of 480 to 520 mm.
  • the DNA content of the protein extract prepared was tested in the same manner as in Experimental Example 2, but each step was omitted, and the DNA content was measured in the same manner as in Experimental Example 3.
  • a multi-step decellularized protein extract was prepared using the same method as Preparation Example 1, but in the first decellularization step, the concentration of sodium hydroxide contained in the treatment solution was changed to 0.005M, 0.1M, 0.2M, and 0.3M. The tissue was processed.
  • the first decellularization step in order to obtain a protein extract with excellent yield and sufficient removal of DNA in the tissue as tissue disintegration or dissolution does not occur in the first decellularization step, the first decellularization step, especially the second decellularization step It was confirmed that the concentration of NaOH contained in the treatment solution was greater than 0.05M and less than 0.2M.
  • a multi-stage decellularized protein extract was prepared using the same method as Preparation Example 1, but in the first decellularization step, when the concentration of sodium hydroxide contained in the treatment solution was 0.005M and 0.1M, the concentration of Dnase was adjusted to 0.0001 to 0.003. After processing the tissue by changing wt%, the DNA content ratio and yield of the protein extract of each protein extract finally obtained were calculated, and the results are listed in Table 2.
  • the concentration of NaOH is 0.05M
  • the DNA removal efficiency appears to be significantly lower than when it is 0.1M. Therefore, it can be seen that it is preferable that the concentration of NaOH in the treatment solution used in the first decellularization step exceeds 0.05M. there is.
  • a topical wound coating material was prepared by mixing 55 g of PEG with a molecular weight of 400, 25 g of PEG with a molecular weight of 4,000, 0.35 g of the protein extract according to Preparation Example 1, 1,2 hexanediol, ethylhexylglycerin, and sodium hyaluronate with 4 g and 7.65 g of purified water, respectively. Manufactured. The results of measuring the basic physical properties of viscosity, storage modulus, and pH of the topical wound dressing prepared in this way are summarized in Figure 6.
  • the topical clear coating agent according to Preparation Example 2 is similar to existing commercialized products of other companies (E product and T product). However, as the shear rate increased, the shear viscosity decreased, showing a typical shear thinning phenomenon. However, as confirmed in Figure 6(B), the storage modulus values were lower than those of the E and T products. It was confirmed to have the highest value in the temperature range. This is believed to be because the topical wound coating according to Preparation Example 2 contains PEG with a relatively high molecular weight.
  • atelocollagen was mixed with the protein extract (0, 0.35, 1w/v% each) and fibroblast ( 1x105 cell/ml) obtained in Preparation Example 1, and then gelated at 37°C for 30 minutes. A hydrogel sample was produced.
  • Cell Count Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Japan) was used to measure cell proliferation rate. Each hydrogel sample produced was cultured, and analysis was performed on days 0, 1, 4, 7, and 14 after culture. A 1:10 mixture of cck-8 solution and culture medium was sampled and treated, and the absorbance was measured at 450 nm for 2 hours at 37°C. The absorbance measured in this way was converted to the number of cells using a standard curve using cells, and the results are summarized in Figure 7.
  • the G2 and G3 samples containing protein extract showed an improved cell proliferation effect in all test sections (day 1 to day 14) compared to the G1 sample not containing protein extract. .
  • the topical wound coating material according to Preparation Example 2 was applied to the local wound area formed in a rat and then protected using vaseline gauze (see Figure 10).
  • vaseline gauze see Figure 10
  • the same local wound was created and covered with vaseline gauze without any treatment and used as a control.
  • the wound healing rate shown in Figure 11 was determined by visual observation (photography) on the 13th day after treating the wound area of each treatment group to confirm that the wound area was still exposed. It was re-confirmed by touching the gauze to see if there was blood, and the area of the entire wound area and the area of the remaining unhealed area were image analyzed and calculated using Equation 4 below.
  • H&E-stained tissues were observed and analyzed, and the length of the entire wound area (defect length) and the length of the area where re-epithelialization had progressed (re-epitherilum length) were measured. Based on the measured length, it was calculated using Equation 5 below, and the results are shown in Figure 13 (B).
  • the topical wound coating material according to the present invention contains a protein extract obtained through a multi-step decellularization process, and, as expected from the in vitro results of Experimental Example 7, the actual acute wound dressing In animal models, it can be seen that significant wound healing rates, re-epithelialization rates, and angiogenic effects exist.
  • This invention relates to a hydrogel-based wound coating material containing protein extract obtained through a multi-step decellularization process, and includes polyethylene glycol (PEG), white petrolatum, and 1,2-hexanediol (1, It is possible to provide a hydrogel-based topical wound dressing material containing 2-Hexandiol, Ethylhexylglycerin, Sodium Hyaluronate, Protein Extract, and purified water, so it has industrial applicability. exist.
  • PEG polyethylene glycol
  • white petrolatum white petrolatum
  • 1,2-hexanediol 1,2-hexanediol

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Abstract

이건 발명은, 단백질 추출물을 포함하는 하이드로겔 기반의 창상 피복재에 관한 것으로, 폴리에틸렌 글리콜, 백색 바세린, 1,2헥산디올, 에틸헥실글리세린, 히알루론산나트륨, 단백질 추출물 및 정제수를 포함하며, 체온과 유사한 온도에서도 상온에서와 동일한 점도를 유지하여 사용에 편리하고, 상처 치유율, 재상피화율 및 혈관 형성이 우수한 효과가 존재한다.

Description

단백질 추출물을 포함하는 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재
이건 발명은, 단백질 추출물을 포함하는 하이드로겔 기반의 창상 피복재에 관한 것으로, 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol), 백색 바세린(White Petrolatum), 1,2-헥산디올(1,2-Hexandiol), 에틸헥실글리세린(Ethylhexylglycerin), 히알루론산나트륨(Sodium Hyaluronate), 단백질 추출물(Protein Extract) 및 정제수를 포함하며, 체온과 유사한 온도에서도 상온과 거의 동일한 점도를 유지하고, 창상 치유 효과가 우수한 국소 창상 피복재 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
사람의 피부조직은 크게 세 부분으로 구분되며, 피부의 가장 바깥쪽을 이루는 표피층, 그 아래층인 진피층 및 피하조직으로 이루어진다. 이중에서 표피층은, 표피층과 진피층이 단단하게 결합할 수 있도록 하는 기저막으로부터 여러 층으로 분화된 상피세포와 멜리닌세포, 면역세포 등을 포함하며, 표피층 아래의 진피층은 주로 섬유아세포와 이 세포가 분비하는 여러 세포밖물질(extracelluar matrix)을 포함한다.
일반적으로 창상 치유(wound healing)는 복합적이며, 시간에 따라 단계별로 조금씩 이루어진다. 지혈 및 염증 단계, 증식성 단계, 성숙단계의 세가지 단계가 중첩되면서 세포외기질(extracellular matrix)이 재형성된다.
상처가 발생한 초기에는, 염증과 기저층의 반응으로 응혈이 형성된다. 기저물질은 진피의 결합 섬유 사이를 채우고 있는 물질로 점액성 뮤코다당체로 존재하며 다량의 수분을 보유하고 히알루론산, 콘트로이친 황산 등의 글리코스아미노 글리칸으로 구성되어 있다. 특히, 프로테오글리칸은 친수성 탄수화물 단백질 복합체이며 젤리와 같은 물질로 구성되는 것으로 알려져 있다.
통상 창상 드레싱(피복재)은 상처부위의 습기 유지에 따라 건조드레싱과 습윤(보습)드레싱으로 분류된다. 건조드레싱으로는, 밴드류(대일밴드 또는 기타 밴드류)와 연고류(후시딘, 마데카솔 등)를 들 수 있는데, 밴드류는 특별한 치료효과 없이 상처를 감싸주는 역할을 하고, 연고류는 항생제나 스테로이드 등 치료성분을 넣어 상처를 빨리 아물게 하고 추가 감염을 막아주는 역할을 수행한다.
그러나, 건조드레싱의 경우에는 피나 진물 등의 분비물이 말라 없어지면서 상처치유 세포까지 없어져 흉터를 남기고, 밴드를 제거할 때 딱지가 함께 떨어져 2차 손상의 위험이 높아진다. 한편, 연고류에 들어 있는 항생제 역시 상처치유 세포까지 영향을 받아 자가 치료효과가 그리 높지 않다.
이러한 건조드레싱의 단점을 보완하기 위해 하이드로콜로이드(hydrocolloid), 알지네이트(alginate), 폼(foam)과 하이드로겔(hydrogel)을 이용한 습윤 드레싱재가 사용되어 왔다. 습윤드레싱 성분 중 젤라틴은 천연고분자로써 뛰어난 생체적합성과 생분해성, 높은 흡습성을 지녀 상처 발생 시 피부에 습윤환경을 제공할 수 있다는 장점 때문에 많은 창상피복재에 널리 사용되고 있다. 하이드로겔(hydrogel)은 물을 분산 매체로 하는 삼차원 친수성 고분자 망상 구조를 가져 다량의 수분을 흡수할 수 있고, 천연 조직과 같은 유연성을 가지고 있어 창상 피복재에 널리 사용되고 있다.
하지만, 하이드로겔 패치의 경우 물성이 열약하며, 특히 콜라겐을 주재료로 사용하여 만든 하이드로겔의 경우에는 인장강도가 0.01 ~ 0.05 MPa 수준으로 매우 열악한 기계적 물성을 갖는 문제점이 여전히 존재한다.
이건 발명에서는 기존의 창상 피복재(습윤 드레싱)가 갖는 문제점을 효과적으로 해결하고, 사용자가 사용하기에 편리하며, 상처 회복 효과가 우수한 창상 피복재를 제공하기 위하여, 다단계 탈세포화 과정을 거쳐 얻어진 단백질 추출물을 포함하는 하이드로겔 기반의 창상 피복재를 제공하고자 한다.
이건 발명의 일 실시형태에 따른 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재는, 폴리에틸렌 글리콜(PEG, Polyethylene Glycol), 백색 바세린(White Petrolatum), 1,2-헥산디올(1,2-Hexandiol), 에틸헥실글리세린(Ethylhexylglycerin), 히알루론산나트륨(Sodium Hyaluronate), 단백질 추출물(Protein Extract) 및 정제수를 포함한다.
상기 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재는, 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol) 11~95wt%, 백색 바세린(White Petrolatum) 0.5~10wt%, 1,2-헥산디올(1,2-Hexandiol) 0.1~10wt%, 에틸헥실글리세린(Ethylhexylglycerin) 0.01~10wt%, 히알루론산나트륨(Sodium Hyaluronate) 0.001~10wt%, 단백질 추출물(Protein Extract) 0.01~10wt% 및 잔량의 정제수를 포함하는 것이 바람직하다.
이때 사용되는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은, 중량평균 분자량이 400인 PEG와 중량평균 분자량이 4,000인 PEG가 약 2.2:1의 중량비로 혼합된 혼합물이 사용되는 것이 바람직하고, 상온의 보관 온도에서 사람의 체온까지의 온도 변화에 따라, 연고 제형인 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재의 점도가 거의 변화하지 않아, 25℃에서 측정된 점도와 35℃에서 측정된 점도가 실질적으로 동일하다.
또한, 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재는, 콜라겐과 엘라스틴을 포함하는 단백질 추출물을 포함하므로, 상처 치유(wound healing), 재상피화(re-epitherialization) 및 혈관 형성(angiogenesis)에 있어 우수한 효과가 존재한다.
아울러, 이건 발명에 따른 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재는, 상기 1,2-헥산디올과 에틸헥실글리세린을 대체하여, 글루코네이트 클로로헥시딘, 아세테이트 클로로헥시딘, 하이드로클로라이드 클로로헥시딘, 실버술파다이아진, 포비돈 아이오딘, 벤즈알코니움 클로라이드, 퓨라진, 아이도카인, 헥사클로로펜, 클로로테트라사이클린, 네오마이신, 페니실린, 젠타마이신, 젠타마이신설페이트, 아크리놀, 시플로플록사신, 염화벤잘코늄, 후시딘산, 네오마이신황산염, 오플록사신 및 토브라마이신으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상이 동일한 양 혹은 0.01~5wt%의 범위로 포함되는 것도 가능하다.
상기 단백질 추출물은, 사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하여 전처리하는 전처리 단계; 알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제1 불활성화 단계; 바이러스 불활성화된 조직으로부터 세포를 제거하는 탈세포화 단계; 및 산(acid)을 사용하여 탈세포화된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제2 불활성화 단계;를 거쳐 제조되며,상기 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 DNA 함량은 50ng/mg 이하이고, 상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 20% 이하인 것이 바람직하다.
상기 탈세포화 단계는, 바이러스 불활성화된 조직으로부터 염기 수용액을 사용하여 세포를 제거하는 1차 탈세포화 단계; 및 1차 탈세포화된 조직을 효소처리하여 세포를 제거하는 2차 탈세포화 단계;를 포함할 수 있다.
이때 상기 1차 탈세포화 단계는, n-PrOH과 NaOH의 혼합물을 통해 수행되는 제1 탈세포화 단계; 및 0.05M 초과 0.2M 미만의 수산화나트륨 수용액으로 수행되는, 제2 탈세포화 단계;를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 조직은, 포유류 유래 혈관, 인대 및 건 중 어느 하나 이상인 것이 바람직하고, 상기 2차 탈세포화 단계는, DNase를 사용하여 수행되는 것이 더욱 바람직하다.
이건 발명에 따른 단백질 추출물을 포함하는 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복제는, 인체 내 독성문제가 발생하지 않고, 생체적합성이 우수하며, 사용자가 상처난 피부 조직에 도포할 경우, 온도 변화에 따른 점도의 저하가 발생하지 않아 사용에 편리한 장점이 있다.
또한, 다단계 탈세포화 및 불활성화 단계를 거쳐 얻어지는 단백질 추출물을 포함하여, 상처 치유(wound healing) 효과, 재상피화(re-epitherialization) 및 혈관 형성(angiogenesis)이 우수한 효과가 존재하므로, 창상 치료를 위한 유용한 창상 피복재로 사용될 수 있다.
도 1의 (A)와 (B)는 각각 실험예 1의 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 2는 실험예 2의 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 3의 (A)와 (B)는 실험예 3의 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 4의 (A)와 (B)는 실험예 4의 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 5는 실험예 5의 실험 결과를 도시한 표이다.
도 6은 제조예 2에 따른 국소 창상 피복재의 기초 물성인 점도, 스토리지 모듈러스 및 pH를 측정한 결과이다.
도 7은 Cell Count Kit-8을 사용한 세포 증식률 측정 결과이다.
도 8은 Live/Dead assay kit(Invitrogen)를 사용하여 하이드로겔 내에서 세포 생존률을 측정한 결과이다.
도 9는 용출된 배양액 상에서 수행되는 스크래치 평가 결과이다.
도 10은 실험예 8이 수행된 급성 창상 동물 모델을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 11 내지 도 13은 각각 실험예 8에 따른 상처 치유율 (wound healing rate, %), 재상피화율 (re-epitherialization rate, %) 또는 혈관 형성 (angiogenesis, %) 결과를 정리한 결과이다.
이하에서 이건 발명의 바람직한 실시예를 통해 보다 상세히 설명하기에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정하여 해석되어서는 아니 되며, 이건 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 함을 밝혀둔다.
본 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 전체에서, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%" 는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%를 의미한다.
또한, 본 명세서 전체에서 "포유류"는 사람을 제외한 포유류를 의미하는 것으로, 사람을 제외한다는 언급 없이 단순히 "포유류"라고 기재되어 있더라도 사람을 제외한 포유류로 이해되어야 하며, "세포가 제거된다"라는 표현은 DNA가 파괴되거나 제거되는 것을 포함하는 포괄적인 의미로 이해되어야 한다.
또한, 각 단계들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않는 이상 명기된 순서와 다르게 실시될 수 있다. 즉, 각 단계들은 명기된 순서와 동일하게 실시될 수도 있고 실질적으로 동시에 실시될 수도 있으며 반대의 순서대로 실시될 수도 있다.
또한, 달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 이건 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가지며, 상충되는 경우에는, 정의를 포함하는 본 명세서의 기재가 우선할 것이다.
이건 발명의 일 실시형태에 따른 단백질 추출물을 포함하는 하이드로겔 기반의 창상 피복재는, 연고 제형으로 상처난 피부 조직에 사용되어 창상 치유에 효과적인 조성물에 관한 것으로, 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol) 11~95wt%, 백색 바세린(White Petrolatum) 0.5~10wt%, 1,2-헥산디올(1,2-Hexandiol) 0.1~10wt%, 에틸헥실글리세린(Ethylhexylglycerin) 0.01~10wt%, 히알루론산나트륨(Sodium Hyaluronate) 0.001~10wt%, 단백질 추출물(Protein Extract) 0.01~10wt% 및 잔량의 정제수를 포함하며, 체온과 유사한 온도에서도 상온에서와 동일한 점도를 유지하고, 상처 치유, 재상피화 및 혈관 형성이 우수한 국소 창상 피복재를 제공할 수 있다.
하이드로겔은 친수성 고분자가 공유 또는 비공유 결합으로 가교되어 만들어진 3차원 망상구조물을 의미하며, 구성 물질의 친수성으로 인해 수용액 내 및 수성 환경 하에서 많은 양의 물을 흡수하며 팽윤하지만 가교 구조에 의해 용해되지 않는 성질을 갖는다. 또한 구성 성분과 제조 방법에 따라 다양한 형태와 성질을 가진 하이드로겔이 만들어질 수 있으며, 다량의 수분을 함유할 수 있어 액체와 고체의 중간성질을 갖는다.
연고제형으로 구현되는 이건 발명의 국소 창상 피복재는, 백색 바세린 계열의 기존 다른 창상 피복재와는 달리, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 주성분으로 하는 하이드로겔 기반으로 제조되어, 기계적 물성이 우수하다. 특히, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은, 중량평균 분자량이 400인 PEG와 중량평균 분자량이 4,000인 PEG가 약 2.2:1의 중량비로 혼합된 혼합물을 사용하거나, 국소 창상 피복재 100wt%를 기준으로 중량평균 분자량이 400인 PEG 10~95wt%와 중량평균 분자량이 4,000인 PEG 1~25wt%의 범위로 사용될 수 있다.
이렇게 서로 다른 분자량을 갖는 PEG 혼합물을 사용함으로써, 연고 제형으로 사용되는 국소 창상 피복제의 기계적 물성이 우수할 뿐만 아니라, 상온의 보관 온도(약 25℃)에서의 점도와, 국소 창상 피복재가 사용되는 피부의 온도(약 36℃)에서의 점도가 거의 변화없이 실질적으로 동일하므로, 사용자가 상처가 난 부위에 이건 출원발명에 따른 국소 창상 피복제를 사용하였을 때, 쉽게 흘러내리지 않고 성처 주위에 고정됨으로써, 사용자의 편의성이 향상되는 장점이 존재한다.
또한, 상처 회복 효과를 더욱 향상시키기 위해, 이건 발명에 따른 국소 창상 피복재는, 콜라겐과 엘라스틴을 포함하는 단백질 추출물을 약 0.01~10wt%의 범위로 포함한다. 상기 단백질 추출물은 다단계 방식의 탈세포 과정을 거쳐 얻어지는 것으로, 포유류 유래 조직 내 세포, 조지방, 바이러스 및 기타 이물질이 효과적으로 제거되어 있고, 탈세포 과정 중에서 엘라스틴의 손실이 적어, 재상피화(re-epitherialization) 및 혈관 형성(angiogenesis)에 있어서 우수한 효과를 보여준다.
이외에 이건 발명에 따른 국소 창상 피복재는, 백색 바세린(White Petrolatum), 1,2-헥산디올(1,2-Hexandiol), 에틸헥실글리세린(Ethylhexylglycerin) 및 히알루론산나트륨(Sodium Hyaluronate)를 추가로 더 포함할 수 있는데, 피부 혹은 창상 부위에서 접촉 및 보존제 역할을 수행하게 된다. 바람직하게는, 앞서 언급된 폴리에틸렌글리콜 11~95wt%과 단백질 추출물 0.01~10wt%의 혼합물에, 백색 바세린(White Petrolatum) 0.5~10wt%, 1,2-헥산디올(1,2-Hexandiol) 0.1~10wt%, 에틸헥실글리세린(Ethylhexylglycerin) 0.01~10wt%, 히알루론산나트륨(Sodium Hyaluronate) 0.001~10wt%, 및 잔량의 정제수가 혼합될 수 있다.
히알루론산은, N-아세틸-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 구성된 반복단위가 선형으로 연결되어 있는 다당류의 일종으로서 생체고분자 물질이며, 동물의 안구를 채우고 있는 액체에서 처음으로 분리된 이후로, 동물의 태반, 관절의 윤활액 (synovial fluid), 늑막액 (pleural fluid), 피부, 수탉의 벼슬 등에 많이 존재하는 것으로 알려져 있으며, Streptococcus 속 미생물 Streptococcus equi, Streptococcus zooepidemecus 등에서도 생산된다.
상기 히알루론산은 생체적합성이 우수하고 용액상태에서 높은 점탄성의 특성으로 화장품 첨가제 등의 화장품 용도뿐만 아니라 안과용 수술보조제, 관절기능 개선제, 약물전달 물질 및 점안제 등의 다양한 의약 용도에 대해서도 널리 사용되고 있다. 하지만, 히알루론산 자체만으로는 생체내 (in vivo) 또는 산, 알칼리 등의 조건에서 쉽게 분해되어 사용이 제한적이다.
한편, 이건 발명에 따른 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재에는, 앞서 언급된 1,2-헥산디올과 에틸헥실글리세린을 대신하여, 글루코네이트 클로로헥시딘, 아세테이트 클로로헥시딘, 하이드로클로라이드 클로로헥시딘, 실버술파다이아진, 포비돈 아이오딘, 벤즈알코니움 클로라이드, 퓨라진, 아이도카인, 헥사클로로펜, 클로로테트라사이클린, 네오마이신, 페니실린, 젠타마이신, 젠타마이신설페이트, 아크리놀, 시플로플록사신, 염화벤잘코늄, 후시딘산, 네오마이신황산염, 오플록사신 및 토브라마이신으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을, 사용될 수 있는 1,2헥산디올 및 에틸헥실글리세린과 동일한 양의 범위로 사용되거나, 전체 조성에서 약 0.01~5 wt%의 범위로 포함되는 것도 가능하다.
이하에서는 다단계 탈세포화 과정을 통해 얻어지는 상기 단백질 추출물 성분에 대하여 좀 더 구체적으로 설명하고자 한다.
이건 발명에 따른 국소 창상 피복재에 포함되는 단백질 추출물은, 사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하는 준비 단계; 상기 조직을 전처리하는 전처리 단계; 알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제1 불활성화 단계; 바이러스 불활성화된 조직에서 염기 수용액을 사용하여 세포를 제거하는 1차 탈세포화 단계; 1차 탈세포화된 조직을 효소처리하여 세포를 제거하는 2차 탈세포화 단계; 및 산(acid)을 사용하여 탈세포화된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제2 불활성화 단계;를 거쳐 얻어질 수 있다.
이때, 상기 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 DNA 함량은 50ng/mg 이하이고, 바람직하게는 20ng/mg 이하, 10ng/mg 이하, 더욱 바람직하게는 5 ng/mg 이하일 수 있다. 또한, 상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L) 이 20% 이하이다.
여기서, 감소율(L)은, 하기의 수식 (1)로 정의되며, 이때 L0는 준비 단계에서 조직의 엘라스틴 함량을 의미하고, Lf는 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량을 의미한다.
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먼저, 상기 준비 단계는 사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하는 단계이다. 여기서 포유류는 사람을 제외한 포유류로, 예를 들어, 돼지, 말, 소, 양 등일 수 있고, 상기 조직은 이러한 포유류 유래 혈관, 인대 및 건 중 어느 하나 이상일 수 있다.
다단계 탈세포화된 단백질 추출물를 제조하기 위해 먼저 포유류의 조직이 채취된다. 이렇게 채취된 포유류의 조직은, 준비 단계에서 포유류 조직에 달라붙어 있는 쓸모없는 조직 및 혈액이 제거되고, 세척, 건조 및 절삭되어 준비된다. 이렇게 준비된 포유류의 조직은 냉동상태로 보관될 수 있으며, 작업이 요구될 때 해동되어 사용될 수 있다. 냉동상태의 조직 원료를 사용하는 경우, 준비 단계는 냉동상태의 조직 원료를 꺼내어 준비하는 단계일 수 있다.
다음으로, 준비 단계에서 준비된 포유류의 조직은 전처리 단계를 통해 전처리된다.
이 단계는 포유류의 조직을 세척하는 단계로, 포유류의 조직이 냉동상태인 경우에는 이 단계를 통해 해동, 세척 및 절삭될 수 있다. 이 단계에서는 세척수로 증류수, 정제수, 식염수 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 증류수가 사용될 수 있다. 이 단계부터 제2 불활성화 단계까지 물리적 교반이 이루어질 수 있다.
이렇게 전처리 단계를 통해 준비된 포유류의 조직은 제1 불활성화 단계, 1차 탈세포화 단계, 2차 탈세포화 단계 및 제2 불활성화 단계를 거치며 면역 및 이물 반응을 유발할 수 있는 세포, 조지방, 바이러스 및 기타 이물질이 제거될 수 있다. 이와 같이 다단계 반응을 통해 탈세포화됨으로써 각 단계에서의 탈세포 효율, 이물질 제거 효율이 현저히 향상되므로 한 번에 처리되는 조직의 양이 증가하고, 처리 시간이 짧아져 결과적으로 탈세포화된 단백질 추출물의 생산성 및 수득률이 향상되는 효과를 얻을 수 있다.
먼저, 상기 제1 불활성화 단계는 알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화 하는 단계이다.
이 단계는, 조직을 탈세포처리하기 전에 먼저 조직 내 바이러스를 일차적으로 불활성화시킴으로써 1차 및 2차 탈세포화 단계에서 세포, 조지방 및 이물질을 보다 효과적으로 제거하기 위해 수행된다.
이 단계에서 사용되는 알코올은 n-프로판올일 수 있으며, 바이러스 불활성화 효과를 얻기 위해 50~90% 농도의 n-프로판올 수용액이 사용되는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 65~80% 농도의 n-프로판올 수용액이 사용될 수 있다.
상기 제1 불활성화 단계에서는, 바이러스 불활성화를 위한 알코올로 n-프로판올을 사용한다. 이와 같이 바이러스 불활성화를 위해 n-프로판올이 사용되는 경우에는 조직이 보다 부드러워지는데, 조직이 부드러우면 조직 내로 처리액이 보다 잘 침투하므로 바이러스 불활성화 및 탈세포화가 전체적으로 균일하게 수행될 수 있다 결과적으로 불활성화, 탈세포화 처리 효율이 향상되고 보다 균일한 조직을 수득할 수 있으며, 최종적으로 얻어진 탈세포화된 단백질 추출물의 품질 및 신뢰성이 향상될 수 있다.
일반적으로 바이러스 불활성화를 위해 사용되는 에탄올이 사용될 경우, 탈세포화될 포유류의 조직을 고정하여 경화시키는 특징이 있는데, 이건 발명의 이 단계에서 n-프로판올 대신에 에탄올이 사용될 경우, 조직이 단단해져 후속 단계에서 조직을 느슨하게 하여 처리 물질의 침투력을 향상시키는 공정의 효율이 저하되므로 바람직하지 않다.
또한, iso-프로판올의 경우에는 바이러스 불활성화 효과가 낮으므로, 제1 불활성화 단계에서 iso-프로판올을 사용할 경우에는, 충분한 바이러스 불활성화 효과가 얻어지지 않아, 후속되는 1차 및 2차 탈세포화 단계에서 탈세포 효율이 감소하므로, 제1 불활성화 단계에서는 n-프로판올이 사용되는 것이 바람직하다.
이 단계에서 프로판올 수용액 100 중량부에 대하여 전처리된 조직은 10~25 중량부, 바람직하게는 20~25 중량부로 처리될 수 있다.
상기 1차 탈세포화 단계는 제1 불활성화 단계를 거쳐 바이러스 불활성화된 조직에 염기 수용액을 처리하여 세포를 제거하는 단계이다.
이 단계는 먼저 염기 수용액과 알코올의 혼합물을 사용하여 조직을 처리하는 제1 탈세포화 단계; 및 염기 수용액을 사용하여 조직을 처리하는 제2 탈세포화 단계를 포함한다. 여기서 염기 수용액은 수산화나트륨 수용액이고, 알코올은 n-프로판올이 사용되는 것이 바람직하며, 이 경우, 제1 탈세포화 단계는 n-프로판올과 수산화나트륨의 혼합물에 조직을 처리하여 수행되는 단계이고, 제2 탈세포화 단계는 수산화나트륨 수용액에 조직을 처리하여 수행되는 단계이다.
이와 같이 탈세포화 단계가 두 단계에 거쳐서 수행되면, 먼저 제1 탈세포화 단계를 통해 탈세포 제거 뿐만 아니라 조지방 등의 이물질이 제거되어, 제2 탈세포화 단계에서 보다 효과적인 탈세포 과정이 이루어진다.
제1 및 제2 탈세포화 단계 각각에서, 처리 용액 100 중량부에 대하여 조직은 10~25 중량부, 바람직하게는 20~25 중량부로 처리될 수 있으며, 이는 종래 처리 용량의 약 두 배에 가까운 것으로, 이건 발명의 다단계 방식을 통해 효과적인 탈세포 처리가 가능하기 때문에 이와 같이 기존에 비해 두 배 용량의 조직을 충분히 처리할 수 있는 효과가 있다.
구체적으로, 제1 탈세포화 단계는 바이러스 불활성화된 조직을 n-프로판올과 수산화나트륨의 혼합물에 처리하는 단계이다. 이 단계에서 조직 내 조지방과 수산화나트륨이 비누화 반응을 하여, 조지방이 조직으로부터 분리, 제거되는데, 이때 n-프로판올은 이러한 비누화 반응을 촉진시키고 비누화 반응의 생성물을 서로 응집시키는 작용을하여 조지방이 보다 빠르고 효율적으로 조직으로부터 분리, 제거되도록 한다.
이때 n-프로판올과 수산화나트륨의 혼합물에 조직을 처리하는 처리 시간은 10~48시간, 바람직하게는 15~40시간, 더욱 바람직하게는 18~28시간 일 수 있고, 처리 온도는 0~30℃, 바람직하게는 10~28℃, 더욱 바람직하게는 18~25℃일 수 있다. 이러한 온도 범위에서 상기 시간동안 처리될 때 조직 구조의 큰 손상이나 엘라스틴의 손실 없이 충분한 조지방 제거 효율을 얻을 수 있다.
상기 n-프로판올과 수산화나트륨의 혼합물은 n-프로판올의 농도 50~95%, 바람직하게는 60~90%, 더욱 바람직하게는 65~85%일 수 있으며, 수산화나트륨의 농도 0.05M 초과 및 0.2M 미만인 수용액일 수 있다. 이들 농도 범위는 제1 탈세포화 단계에서 조직 손상을 최소화할 수 있고, 동시에 조지방 등의 이물질이 효과적으로 제거될 수 있는 농도 범위로, 특히 수산화나트륨의 농도가 상기 범위 미만인 경우에는 1차 탈세포화 단계의 처리 효율이 감소하고, 상기 범위를 벗어나는 경우에는 조직 구조 자체가 붕괴되어 용해되는 문제가 있으므로, 상술한 농도 범위의 n-프로판올, 수산화나트륨 수용액을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 제2 탈세포화 단계는 제1 탈세포화 단계를 거친 조직을 염기 수용액에 처리하여 조직을 연화시킴으로써 조직의 구조를 느슨하게 하면서, 동시에 탈세포 반응이 일어나는 단계이다. 조직에 포함되어 있는 조지방이나 각종 이물질은 탈세포 반응에 있어 일종의 물리, 화학적인 장벽으로 작용하는데, 앞서 조직이 제1 탈세포화 단계를 거쳐 조지방이나 각종 이물질이 제거된 상태이기 때문에 제2 탈세포화 단계에서 탈세포 반응이 보다 효과적으로 이루어질 수 있다.
이 단계에서 조직을 염기 수용액에 처리하는 처리 시간은 10~48시간, 바람직하게는 15~40시간, 더욱 바람직하게는 18~28시간 일 수 있고, 처리 온도는 0~30℃, 바람직하게는 10~28℃, 더욱 바람직하게는 18~25℃일 수 있으며, 이러한 온도 범위에서 상기 시간동안 처리될 때 조직 구조의 붕괴, 엘라스틴의 손실 없이 조직 구조가 충분히 느슨하게 변형되고, 적절한 탈세포화 반응이 이루어질 수 있다.
이때 처리액으로 사용되는 염기 수용액은 수산화나트륨 수용액일 수 있으며 수산화나트륨 수용액에 포함된 수산화나트륨의 농도는 0.05M 초과 및 0.2M 미만일 수 있다. 수산화나트륨의 농도가 0.05M 이하인 경우에는 조직 구조가 충분히 느슨해지지 않아 후술될 2차 탈세포화 단계에서의 탈세포 효율이 떨어지는 문제가 있고, 0.2M 이상인 경우에는 본 단계에서 일부 조직이 느슨해지는 수준을 넘어서 와해되거나 용해되어 최종 수율이 현저히 떨어지고, 엘라스틴이 손실될 수 있으므로 상술한 농도의 수산화나트륨 수용액을 사용하는 것이 바람직하다.
1차 탈세포화 단계 이후에 효소를 이용한 2차 탈세포화 단계가 수행되는데, 이 두 단계 사이에 중화단계 및 세척단계가 수행될 수 있다.
중화단계는 1차 탈세포화 단계에서 사용된 수산화나트륨을 중화하기 위해 산성수용액으로 처리하는 단계로, 이때 사용되는 산성수용액의 종류로 예를 들어, 염산, 황산, 아세트산, 퍼아세트산 중 적어도 어느 하나 이상이 포함된 산성수용액이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 이들의 농도 또한 작업 환경이나 조건에 맞추어 적절히 조절되어 사용될 수 있다.
세척단계는 후속 공정인 2차 탈세포화 단계에서 효소처리할 때 잔류물로 인한 효소 반응성 저하를 방지하기 위해 수행되는 단계로, 세척단계에서 사용되는 세척액으로는 버퍼용액이 사용될 수 있으며, 예를 들어 PBS(Phosphate buffered saline) 용액이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 2차 탈세포화 단계는, 1차 탈세포화된 조직을 효소처리하여 세포를 제거하는 단계로, 1차 탈세포화된 조직에 DNA 분해효소를 처리하여 1차 탈세포화된 조직 내의 DNA를 제거하는 단계이다.
이 단계에서 DNA 분해효소가 포함된 처리 용액 100 중량부에 대하여 조직은 10~25 중량부, 바람직하게는 20~25 중량부로 처리될 수 있으며, 이는 앞서 설명한 바와 같이 기존에 비해 약 두 배에 가까운 처리 용량으로, 이건 발명의 다단계 탈세포 처리 과정에 의해 처리 효율이 증가하기 때문에 달성 가능한 처리 용량이다.
이 단계에서 효소 활성 및 충분한 DNA 분해 효율을 얻기 위해 조직을 DNA 분해효소로 처리하는 처리 시간은 10~35시간, 바람직하게는 18~30시간일 수 있고, 처리 온도는 30~45℃ 바람직하게는 35~42℃일 수 있다.
이건 발명에서 처리 용액에 포함되는 DNA 분해효소의 농도는 0.0001~0.005wt%이며, 이는 통상 종래의 유사 기술에서 사용되어 왔던 DNA 분해효소 농도에 비해 수 배 ~ 수백 배 낮은 농도이다. 이건 발명의 1차 탈세포화된 조직은, 1차 탈세포화 단계를 거치며 조직 내 조지방을 포함한 이물질이 제거되고, 조직의 구조가 느슨해지게 된다. 이 상태에서 DNA 분해효소가 투입되면 조직 구조 내부로 DNA 분해효소가 매우 용이하게 침투할 수 있으며, 이에 따라 저농도의 DNA 분해효소를 사용하더라도 최소 동일하거나 더 우수한 DNA 제거 효율을 확보할 수 있으므로, 이건 발명에서는 상기와 같은 저농도의 DNA 분해효소를 사용할 수 있다.
그러나, DNA 분해효소의 농도가 상기 범위 미만인 경우에는 DNA 분해 효율이 감소하므로 0.0001% 이상의 농도로 사용되는 것이 바람직하고, 상기 범위를 초과하는 경우에는 추가되는 DNA 분해효소의 양에 비해 DNA 분해효율이 향상되는 정도가 극히 미미하므로 비경제적이기 때문에, 상술한 농도 범위의 DNA 분해효소를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 2차 탈세포화 단계를 거쳐 탈세포화된 조직은 제2 불활성화 단계를 거치며 추가적인 바이러스의 제거가 이루어지는데, 이 두 단계 사이에 추가적으로 탈색단계 및/또는 탈지단계가 수행될 수 있다. 탈색 단계는 조직의 색을 제거하는 단계로, 예를 들어 조직을 과산화수소수로 처리하여 수행될 수 있고, 탈지 단계는 조직 내에 포함된 지방질을 추가로 더 제거하는 단계로, 예를 들어 케톤 용액, 바람직하게는 아세톤 용액을 이용하여 수행될 수 있다.
이어서 2차 탈세포화 단계를 거친 조직 내에 포함된 바이러스를 추가적으로 더 불활성화하는 제2 불활성화 단계가 수행된다. 이 단계는 산을 사용하여 조직 내 바이러스를 불활성화하는 단계로, 구체적으로는 조직을 유기산과 알코올의 혼합물로 처리하는 단계이다.
이때 사용되는 유기산은 과산화아세트산이 사용될 수 있는데, 과산화아세트산은 산화제로, 바이러스의 불특정 자유 라디칼 손상을 유발하는 방식으로 바이러스를 불활성화할 수 있다. 이 단계에서 사용되는 과산화아세트산은 0.05~1% 농도로 사용될 수 있다.
또한 이 단계에서 사용되는 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올 등 탄소수 1~4의 저급 알코올일 수 있으며, 바람직하게는 에탄올일 수 있다. 에탄올은 바이러스를 불활성화하는 기능과 조직 구조를 고정하여 조직을 단단하게 만드는 기능을 수행하기 때문에 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다.
이러한 단계를 거쳐 최종적으로 바이러스가 불활성화되고, 조지방, DNA가 제거되며 엘라스틴을 포함한 각종 세포외기질 성분이 포함된 단백질 추출물이 얻어질 수 있다.
이렇게 얻어진 단백질 추출물에 포함된 DNA의 함량은 50ng/mg 이하이고, 바람직하게는 20ng/mg 이하, 10ng/mg 이하, 더욱 바람직하게는 5 ng/mg 이하로 매우 낮은 DNA 함량을 가져 면역이나 각종 이물 반응 유발이 최소화될 수 있다.
또한, 상기 단백질 추출물은 상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거치며 감소된 엘라스틴 함량이 매우 낮아 엘라스틴에 의한 상처 치유 및 흉터 억제 등의 효과를 갖는 장점이 있다. 구체적으로, 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 20% 이하이다. 이러한 수치값은 종래의 탈세포방식이 적용된 경우, 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 50% 이상으로 매우 높게 나타나는 것과 비교하여 매우 낮은 수치이다.
한편, 제2 불활성화 단계 이후에는 세척, 포장, 멸균, 가공 등의 단계가 추가적으로 더 수행될 수 있다. 세척은 버퍼 용액, 증류수 등을 이용하여 수행될 수 있고, 포장은 상기 단백질 추출물을 보관이나 이송할 때의 오염을 방지하고 취급이 용이하도록 수행되며, 포장시 보존액에 담긴 상태로 포장될 수도 있다.
멸균은 제2 불활성화 단계 이후에 발생되는 추가적인 오염을 제거하기 위해 수행되며, 멸균을 위해 예를 들어, 전자선 조사 또는 방사선 조사가 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
가공은 상기 단백질 추출물을 활용 가능한 형태로 가공하는 것으로, 예를 들어, 건조, 분말화, 용액화 등의 방식이 적용될 수 있는데, 이와 같이 가공되어 바이오 잉크나 주사제 등과 같은 형태로 활용이 가능하며, 이에 제한되지 않고 다양한 형태로도 활용될 수 있다.
한편, 이러한 단백질 추출물의 제조 방법에 대하여 좀 더 구체적으로 설명하면 다음과 같으며, 앞서 이미 설명한 것과 중복되는 부분은 생략한다.
상기 제조 방법은, 사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하는 준비 단계; 상기 조직을 전처리하는 전처리 단계; 알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제1 불활성화 단계; 바이러스 불활성화된 조직에서 염기 수용액을 사용하여 세포를 제거하는 1차 탈세포화 단계; 1차 탈세포화된 조직을 효소처리하여 세포를 제거하는 2차 탈세포화 단계; 및 산(acid)을 사용하여 탈세포화된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제2 불활성화 단계;를 포함한다.
이때, 상기 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 DNA 함량은 50ng/mg 이하이고, 상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L) 이 20% 이하일 수 있다.
여기서, 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L)은 하기 수식 (1)로 정의되고, L0는 준비 단계에서 조직의 엘라스틴 함량이며, Lf는 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량이다.
Figure PCTKR2023009483-appb-img-000002
먼저, 상기 준비 단계는 사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하는 단계이다. 여기서 포유류는 사람을 제외한 포유류로, 예를 들어, 돼지, 말, 소, 양 등일 수 있고, 상기 조직은 이러한 포유류 유래 혈관, 인대 및 건 중 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 전처리 단계는 준비 단계에서 준비된 포유류의 조직을 세척하는 단계로, 필요에 따라서는 이 단계에서 조직이 적당한 크기로 절단될 수 있으며, 앞서 냉동 상태의 조직이 준비되는 경우에는 이 단계에서 해동이 이루어질 수 있다.
상기 제1 불활성화 단계는 알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화 하는 단계로, 일반적으로 바이러스 불활성화를 위해 에탄올을 사용하나, 이건 발명에서는 n-프로판올을 사용한다. 이는 에탄올이 조직을 단단하게 고정시켜 후속 단계에서의 연화 효율을 저하시키는 반면, n-프로판올의 경우에는 조직을 부드럽게 만들어 후속 단계에서의 연화 효율을 향상시키기 때문이다.
상기 1차 탈세포화 단계는 제1 불활성화 단계를 거쳐 바이러스 불활성화된 조직에 염기 수용액을 처리하여 세포를 제거하는 단계이다. 이 단계는 먼저 염기 수용액과 알코올의 혼합물을 사용하여 조직을 처리하는 제1 탈세포화 단계; 및 염기 수용액을 사용하여 조직을 처리하는 제2 탈세포화 단계;를 포함한다.
여기서 염기 수용액은 수산화나트륨 수용액이고, 알코올은 n-프로판올이 사용되는 것이 바람직하다.
구체적으로, 제1 탈세포화 단계는 바이러스 불활성화된 조직을 n-프로판올과 수산화나트륨의 혼합물에 처리하는 단계로, 이 단계를 거쳐 조직 내 조지방 및 이물질이 제거되며 조직이 일부 연화된다. 제2 탈세포화 단계는 수산화나트륨 수용액에 조직을 처리하는 단계로, 이 단계에서 조직의 연화와 동시에 탈세포 반응이 일어나는데, 앞서 조지방이 포함된 이물질이 제거되어 이러한 효과가 보다 향상될 수 있다.
제1 및 제2 탈세포화 단계에서 수산화나트륨은 0.05M 초과 및 0.2M 미만의 농도로 포함될 수 있는데, 이는 수산화나트륨에 의한 비누화, 연화 반응이 충분히 일어나면서, 조직의 와해나 용해를 방지하기 위한 바람직한 농도범위이다.
다음으로, 1차 탈세포화 단계 이후에 효소를 이용한 2차 탈세포화 단계가 수행되는데, 이 두 단계 사이에 중화단계 및 세척단계가 수행될 수 있다. 중화단계는 1차 탈세포화 단계에서 사용된 수산화나트륨을 중화하기 위해 산성수용액으로 처리하는 단계이고, 세척단계는 후속 공정인 2차 탈세포화 단계에서 효소처리할 때 잔류물로 인한 효소 반응성 저하를 방지하기 위해 수행되는 단계이다.
상기 2차 탈세포화 단계는, 1차 탈세포화된 조직을 DNA 분해효소처리하여 조직 내 DNA를 제거하는 단계이다. 이건 발명의 1차 탈세포화된 조직은, 1차 탈세포화 단계를 거치며 조직 내 조지방을 포함한 이물질이 제거되고, 조직의 구조가 느슨해지게 된다. 이 상태에서 DNA 분해효소가 투입되면 조직 구조 내부로 DNA 분해효소가 매우 용이하게 침투할 수 있으며, 이에 따라 저농도의 DNA 분해효소를 사용하더라도 최소 동일하거나 더 우수한 DNA 제거 효율을 확보할 수 있으므로, 이건 발명에서는 DNA 분해효소를 0.0001~0.005wt%의 저농도로 사용한다. DNA 분해효소의 농도가 상기 범위 미만인 경우에는 DNA 분해 효율이 떨어지고, 상기 범위를 초과하는 경우에는 추가되는 DNA 분해효소의 양에 비해 DNA 분해효율이 향상되는 정도가 극히 미미하므로 비경제적이기 때문에, 상술한 농도 범위의 DNA 분해효소를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 2차 탈세포화 단계를 거쳐 탈세포화된 조직은 제2 불활성화 단계를 거치며 추가적인 바이러스의 제거가 이루어지는데, 이 두 단계 사이에 추가적으로 탈색단계 및/또는 탈지단계가 수행될 수 있다. 탈색 단계는 조직의 색을 제거하는 단계로, 예를 들어 조직을 과산화수소수로 처리하여 수행될 수 있고, 탈지 단계는 조직 내에 포함된 지방질을 추가로 더 제거하는 단계로, 예를 들어 케톤 용액, 바람직하게는 아세톤 용액을 이용하여 수행될 수 있다.
이어서 2차 탈세포화 단계를 거친 조직 내에 포함된 바이러스를 추가적으로 더 불활성화하는 제2 불활성화 단계가 수행된다. 이 단계는 조직을 유기산과 알코올의 혼합물로 처리하는 단계로, 유기산으로는 과산화아세트산이, 알코올로는 에탄올이 사용될 수 있으며, 이러한 혼합 용액을 이용하여 조직을 처리함으로써 조직 내 바이러스가 효과적으로 제거될 수 있다.
이러한 단계를 거쳐 최종적으로 바이러스가 불활성화되고, 조지방, DNA가 제거되며 엘라스틴을 포함한 각종 세포외기질 성분이 포함된 단백질 추출물을 제조할 수 있다.
이렇게 얻어진 단백질 추출물에 포함된 DNA의 함량은 50ng/mg 이하이고, 바람직하게는 20ng/mg 이하, 10ng/mg 이하, 더욱 바람직하게는 5 ng/mg 이하로 매우 낮은 DNA 함량을 가져 면역이나 각종 이물 반응 유발이 최소화될 수 있다.
또한, 상기 단백질 추출물은 상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거치며 감소된 엘라스틴 함량이 매우 낮아 엘라스틴에 의한 상처 치유 및 흉터 억제 등의 효과를 갖는 장점이 있다. 구체적으로, 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 20% 이하이다. 이러한 수치값은 종래의 탈세포방식이 적용된 경우, 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 50% 이상으로 매우 높게 나타나는 것과 비교하여 매우 낮은 수치이다.
한편, 제2 불활성화 단계 이후에는 세척, 포장, 멸균, 가공 등의 단계가 추가적으로 더 수행될 수 있다. 세척은 버퍼 용액, 증류수 등을 이용하여 수행될 수 있고, 포장은 상기 단백질 추출물를 보관이나 이송할 때의 오염을 방지하고 취급이 용이하도록 수행되며, 멸균은 제2 불활성화 단계 이후에 발생되는 추가적인 오염을 제거하기 위해 수행된다.
가공은 상기 단백질 추출물을 활용 가능한 형태로 가공하는 것으로, 예를 들어, 건조, 분말화, 용액화 등의 방식이 적용될 수 있는데, 이와 같이 가공되어 바이오 잉크나 주사제 등과 같은 형태로 활용이 가능하며, 이에 제한되지 않고 다양한 형태로도 활용될 수 있다.
이하에서는, 이건 발명의 일 실시예를 통해 이건 발명의 구체적인 작용과 효과를 설명하고자 한다. 다만, 이는 이건 발명의 바람직한 예시로서 제시된 것으로, 실시예에 따라 이건 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아니다.
[제조예 1]
1. 준비 및 전처리 단계
먼저, 세척, 건조, 절삭 및 냉동 보관된 돼지 심장 연결 대동맥을 준비하고, 해동한 뒤 증류수를 이용하여 세척한 후 50×50mm 크기로 절단하여 원료 조직 시편을 준비하였다.
2. 제1 불활성화 단계
다음으로, 70% n-프로판올 1L에 원료 조직 시편 250g을 투입하고 온도 20℃, 교반 속도 150RPM으로 24시간 교반하여 제1 불활성화 단계를 수행하였다.
3-1. 1차 탈세포화 단계(제1 탈세포화 단계)
이어서, 증류수에 n-프로판올이 70%의 농도로 포함되고, 수산화나트륨 0.1M의 농도로 포함된 혼합용액을 준비하고, 상기 혼합용액 100 중량부에 대하여 상기 원료 조직 시편이 23 중량부로 포함되도록 혼합한 뒤 온도 20℃, 교반 속도 150RPM으로 24시간 교반하여 제1 탈세포화 단계를 수행하였다.
3-2. 1차 탈세포화 단계(제2 탈세포화 단계)
다음으로, 미리 준비된 0.1M의 수산화나트륨 수용액 100 중량부에 대하여 제1 탈세포화 단계를 거친 조직 시편이 24 중량부로 포함되도록 혼합한 뒤, 앞 단계와 동일한 조건에서 24시간 동안 교반하여 제2 탈세포화 단계를 수행하였다.
계속해서 상기 제2 탈세포화 단계를 거친 조직 시편을 아세트산 수용액에 침지하고 교반하여 중화한 뒤, PBS 용액으로 세척하였다.
4. 2차 탈세포화 단계
이어서, DNase가 0.00011wt%의 농도로 포함된 처리 용액에 상기 조직 시편을 투입하고 온도 37℃에서 23시간 동안 150RPM의 교반 속도로 교반하여 2차 탈세포화 단계를 수행하였다. 2차 탈세포화 단계가 완료된 조직시편을 20℃의 3% 과산화수소수에 1시간동안 처리하여 탈색하고, 20℃의 20% 아세톤 수용액에 1시간동안 처리하여 탈지처리하였다.
5. 제2 불활성화 단계
이어서, 상기 조직 시편을 증류수에 n-프로판올이 70%의 농도로 포함되고, 0.2%의 과산화아세트산이 포함된 혼합용액에 침지하고, 20℃에서 4시간 반 동안 처리하여 제2 불활성화 단계를 수행하였다.
마지막으로, 상기 처리 과정을 모두 거친 조직 시편을 PBS 용액 및 증류수로 세척하여 이건 발명의 국소 창상 피복재에 포함되는 단백질 추출물을 준비하였다.
[실험예 1]
제조예 1과 동일한 방법을 이용하여 다단계 탈세포화된 단백질 추출물을 제조하되, 제1, 제2 및 2차 탈세포화 단계를 순차적으로 거칠 때 각 단계가 수행된 직후 조직 시편을 채취하여 조직 시편 1mg당 포함된 엘라스틴 함량을 측정하고, 그 결과를 도 1(A)에 나타내었다. 또한 준비 단계에서 원조직의 엘라스틴 함량을 측정하여, 원조직의 엘라스틴 함량에 대하여 각 단계가 수행된 시점에서의 엘라스틴 함량을 백분율로 나타내어 도 1(B)에 도시하였다.
도 1(A) 및 도 1(B)에서 1공정은 제1 탈세포화 단계, 2공정은 제2 탈세포화 단계, 3공정은 2차 탈세포화 단계를 의미한다.
엘라스틴 함량은, 분석 키트 Fastin Elastin Assay kit F2000(제조사: Biocolor)를 이용하여 분석 키트의 프로토콜에 따라 실험한 뒤, Multimode plate reader Victor Nivo™(제조사: Perkin Elmer)를 이용하여 흡광도 513mm에서 엘라스틴을 분석하고, 스탠다드 물질과 비교하여 엘라스틴 함량을 측정하였다.
도 1(A), 1(B)의 결과를 참조하면, 각 공정이 진행됨에 따라 엘라스틴 함량이 약간 손실되는 것을 확인할 수 있으나, 최종 단계가 완료된 시점에서 약 80% 이상의 엘라스틴이 남아있는 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 2]
제조예 1과 동일한 방법을 이용하여 다단계 탈세포화된 단백질 추출물을 제조하되, 제1, 제2 및 2차 탈세포화 단계를 각각 한 단계씩만 생략하고, 최종 공정까지 거친 조직 시편을 채취하여 조직 시편 1mg당 포함된 엘라스틴의 함량을 측정하고, 준비 단계에서 원조직의 엘라스틴 함량을 동일한 방법으로 측정한 뒤, L값을 계산하여 그 결과를 표 1에 정리하였다.
또한, 준비 단계에서 원조직의 엘라스틴 함량에 대하여 각 단계가 생략되어 얻어진 단백질 추출물에 포함된 엘라스틴 함량을 백분율로 계산하여 그 결과를 도 2에 도시하였다.
엘라스틴 함량은, 실험예 1과 동일한 방법으로 측정하였고, 표 1 및 도 2에서 1공정은 제1 탈세포화 단계, 2공정은 제2 탈세포화 단계, 3공정은 2차 탈세포화 단계를 의미한다.
Figure PCTKR2023009483-appb-img-000003
먼저 표 1을 살펴보면, 모든 공정을 진행하는 경우와, 하나의 공정을 생략하였을 때 모두 L값이 20% 이하로 나타나는 것을 확인할 수 있고, 도 2를 참조하면, 특정 공정을 생략하더라도 엘라스틴 함량이 크게 달라지지 않는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 이러한 실험 결과로부터 이건 발명의 일 실시예에 따른 공정 중 제1 탈세포화 단계, 제2 탈세포화 단계 및 2차 탈세포화 단계 중 어느 한 단계를 생략하더라도 엘라스틴 함량에는 크게 영향이 없는 것을 확인할 수 있다.
[실험예 3]
실험예 1과 동일한 방법으로 실험하되, 각 단계 수행 후 엘라스틴 함량이 아닌 DNA 함량을 측정하였다. DNA 함량은, 분석 키트 Quant-iT™ PicoGreen™ dsDNA Assay kits and dsDNA Reagents(제조사: Invitrogen)를 이용하여 분석 키트의 프로토콜에 따라 실험한 뒤, Multimode plate reader Victor Nivo™(제조사: Perkin Elmer)를 이용하여 흡광도 480~520mm에서 DNA 함량을 측정하였다.
각 단계 수행 후 조직 1mg당 DNA 함량은 도 3(A)에 도시하였고, 원조직의 DNA 함량 대비 각 단계 수행 후 조직의 DNA 함량은 도 3(B)에 백분율값으로 도시하였다. 이때, 도 3(A) 및 도 3(B)에서 1공정은 제1 탈세포화 단계, 2공정은 제2 탈세포화 단계, 3공정은 2차 탈세포화 단계를 의미한다.
도 3(A) 및 도 3(B)를 참조하면, 제1 탈세포화 단계, 제2 탈세포화 단계 및 2차 탈세포화 단계를 모두 거친 뒤 대부분의 DNA가 제거되는 것을 확인할 수 있다.
[실험예 4]
실험예 2와 동일한 방법으로 실험하되, 각각 하나씩 단계가 생략되어 제조된 단백질 추출물의 DNA 함량을 실험예 3과 동일한 방법으로 측정하였다.
각 단계가 생략되어 얻어진 단백질 추출물 1mg당 DNA 함량은 도 4(A)에 도시하였고, 원조직의 DNA 함량 대비 각 단계가 생략되어 얻어진 조직의 DNA 함량은 도 4(B)에 백분율값으로 도시하였다. 이때, 도 4(A) 및 도 4(B)에서 1공정은 제1 탈세포화 단계, 2공정은 제2 탈세포화 단계, 3공정은 2차 탈세포화 단계를 의미한다.
도 4(A) 및 4(B)를 참조하면, 제1 탈세포화 단계, 제2 탈세포화 단계 및 2차 탈세포화 단계를 모두 거쳐야 DNA가 확실하게 제거되는 것을 확인할 수 있다. 특히, 제2 탈세포화 단계나 2차 탈세포화 단계가 생략되는 경우에는 DNA 제거 효율이 현저히 떨어지는 것을 알 수 있으므로, 상기 실험을 통해 각 단계를 모두 순차적으로 거치는 것이 DNA 제거에 있어서 보다 효과적인 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 5]
제조예 1과 동일한 방법을 이용하여 다단계 탈세포화된 단백질 추출물을 제조하되, 1차 탈세포화 단계에서 처리액에 포함되는 수산화나트륨의 농도를 0.005M, 0.1M, 0.2M, 0.3M로 변화시켜가며 조직을 처리하였다.
실험 중에 제2 탈세포화 단계(제2 공정) 처리 중 및 처리 후 조직의 상태를 촬영하여 도 5에 도시하였다. 또한, 최종적으로 얻어진 단백질 추출물 1mg에 포함되어 있는 DNA의 함량을 실험예 3과 동일한 방법으로 측정하고, 최초 투입된 조직의 함량에 대하여 최종적으로 얻어진 단백질 추출물의 함량을 백분율 값으로 나타내 단백질 추출물의 수득률을 계산하였으며, H&E 염색 사진을 촬영한 사진을 도 5에 도시하였다.
도 5를 참조하면, NaOH의 농도가 0.05M인 경우에는 수득률은 양호하나 DNA 함량이 높고, 조직 내에 제거되지 않은 세포핵이 존재하는 것으로 확인되어, 탈세포 효율이 낮은 것을 알 수 있다.
반면, 0.1M의 NaOH 로 처리된 경우에는 제2 탈세포화 단계에서 조직의 구조가 양호하게 유지되고, 최종 처리 후 DNA 함량이 0.6ng/mg으로 매우 낮으며, 수득률이 20.8%로 높게 나타나는 것을 확인할 수 있다.
0.2M의 NaOH 로 처리된 경우에는, DNA 함량이 낮으나, 1차 탈세포화 단계 중에 조직의 일부가 와해되어, 최종 수득률이 0.1M의 NaOH로 처리된 경우에 비해 절반도 안되는 것으로 나타났으며, 0.3M의 NaOH로 처리된 경우에는 조직이 거의 용해되는 것으로 나타나 조직 수득이 불가능한 것으로 나타났다.
따라서, 상기 실험 결과로부터 1차 탈세포화 단계에서 조직의 와해나 용해가 일어나지 않아 수득률이 우수하고, 조직 내 DNA가 충분히 제거된 단백질 추출물을 얻기 위해, 1차 탈세포화 단계, 특히 제2 탈세포화 단계에서 처리액에 포함되는 NaOH의 농도는 0.05M 초과 및 0.2M 미만인 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 6]
제조예 1과 동일한 방법을 이용하여 다단계 탈세포화된 단백질 추출물을 제조하되, 1차 탈세포화 단계에서 처리액에 포함되는 수산화나트륨의 농도가 0.005M, 0.1M인 경우에 Dnase의 농도를 0.0001~0.003wt%로 변화시켜가며 조직을 처리한 뒤, 최종적으로 얻어진 각 단백질 추출물의 DNA 함량비 및 단백질 추출물의 수득률을 계산하여 그 결과를 표 2에 기재하였다.
Figure PCTKR2023009483-appb-img-000004
상기 표 2의 결과를 참조하면, NaOH의 농도가 일정한 경우, DNase의 농도가 증가할수록 최종 단백질 추출물 내의 DNA 농도가 낮아지는 것을 알 수 있다. 그러나, NaOH의 농도가 0.1M인 경우에 0.05M일때보다 수배 내지 수십배 낮은 농도의 DNase로 처리했음에도 불구하고 최종적으로 얻어진 단백질 추출물 내 DNA 농도가 오히려 더 낮았으며, 수득률의 차이는 유의미하지 않은 것을 확인할 수 있다.
NaOH의 농도가 0.05M인 경우, 0.1M인 경우에 비해 DNA 제거 효율이 현저히 떨어지는 것으로 나타나, 1차 탈세포화 단계에서 사용되는 처리액 내 NaOH의 농도는 0.05M을 초과하는 것이 바람직함을 알 수 있다.
[제조예 2]
분자량이 400인 PEG 55g, 4,000인 PEG 25g, 제조예 1에 따른 단백질 추출물 0.35g과 1,2헥산디올, 에틸헥실글리세린 및 히알루론산나트륨을 각 4g 및 7.65g의 정제수를 혼합하여 국소 창상 피복재를 제조하였다. 이렇게 제조된 국소 창상 피복재의 기초 물성인 점도와 스토리지 모듈러스 및 pH를 측정한 결과를 도 6에 정리하였다.
비교를 위해 기존의 상용화된 타사의 창상 피복제 E제품과 T제품을 사용하여 동일한 조건에서 기초 물성을 측정하였다.
도 6(A)의 전단 속도(shear rate)의 변화에 따른 점도 변화에서 확인되듯이, 제조예 2에 따른 국소 청상 피복제는, 기존의 상용화된 타사 제품들(E제품 및 T제품)과 유사하게 전단 속도가 증가함에 따라 전단 점도가 감소하는 전형적인 전단 박화(shear thining) 현상을 나타내었지만, 도 6(B)에서 확인되듯이, 저장 탄성율(storage modulus) 값은 E제품 및 T제품에 비해 모든 온도 범위에서 가장 높은 값을 갖는 것으로 확인되었다. 이는 제조예 2에 따른 국소 창상 피복제의 경우, 비교적 높은 분자량을 갖는 PEG가 포함되어 있기 때문인 것으로 판단된다.
특히 도 6(C)에서 확인되듯이, 상온(25℃)에서 측정된 점도 값과 체온과 유사한 온도인 35℃에서 측정된 점도를 비교해보면, 기존의 E제품과 T제품의 경우, 온도가 증가함에 따라 점도가 급격하게 감소하지만, 제조예 2의 국소 창상 피복재의 경우에는 거의 점도 변화 없이 실질적으로 동일한 점도값을 갖는 것을 알 수 있는데, 이는 저분자량 및 고분자량을 갖는 PEG가 혼합되어 안정적인 하이드로겔을 형성하기 때문인 것으로 파악된다.
도 6(D)의 pH 측정 결과에서는, 기존의 상용화된 제품들과 크게 차이 없이 중성 영역에 해당함을 알 수 있었다.
[실험예 7]
이건 발명의 국소 창상 피복재에 사용되는 단백질 추출물의 효과를 확인하기 위해 아래 표 3의 시험군을 사용하여 in vitro 시험을 수행하였다.
Figure PCTKR2023009483-appb-img-000005
(1) Hydrogel 제작
상기 표 3에 제시된 것과 같이, atelocollagen에 제조예 1에서 얻어진 단백질 추출물(각 0, 0.35, 1w/v %) 및 fibroblast (1x105 cell/ml)를 혼합한 후, 37°C에서 30분간 gelation하여 hydrogel sample을 제작하였다.
(2) CCK-8 assay
세포 증식률을 측정하기 위해 Cell Count Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Japan)를 사용하였다. 제작된 각 hydrogel sample을 배양하였으며 배양 한 후 각 0, 1, 4, 7, 14일째에 분석을 진행하였다. cck-8 solution과 배양액을 1:10으로 혼합한 용액을 샘플링하여 처리한 후, 37℃에서 2시간 동안 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이렇게 측정된 흡광도는, 세포를 이용한 standard curve를 이용하여 세포 수로 환산되었으며, 그 결과를 도 7에 정리하였다.
상기 도 7의 결과에서 확인되듯이, 단백질 추출물이 포함된 G2 및 G3 시료들의 경우, 단백질 추출물이 포함되지 않은 G1 시료에 비해 모든 시험 구간(day 1 ~ day 14)에서 향상된 세포 증식 효과를 나타내었다.
(3) L/D staining
하이드로겔 내에서의 세포 생존률을 측정하기 위해, Live/Dead assay kit (Invitrogen)을 사용하여 G1 내지 G3에 대하여 실험을 진행하였다. 제작된 각 hydrogel sample을 배양 한 후, 0, 1, 4, 7, 14일 째에 분석을 진행하였으며, 2μM calcein AM과 4μM EthD-1이 포함된 배양액을 각 시점에 처리하여 형광 현미경을 이용해 관찰하였고(도 8(A) 참조), 세포 생존률은 아래의 수식 2에 따라 계산하여 도 8(B)로 정리하였다.
Figure PCTKR2023009483-appb-img-000006
도 8(A)와 (B)의 결과에서 알 수 있듯이, 단백질 추출물이 포함된 시료의 하이드로겔 내 세포 생존율이 그렇지 않은 경우에 비해 상대적으로 높은 것을 알 수 있다.
(4) Scratch test
L929 cell을 2×105 cell/well의 농도로 6 well에서 배양한 후, pipette tip을 이용하여 well의 가운데를 가로지르는 scatch를 생성하였다. 이때 배양액은 2% FBS가 혼합된 α-MEM 배양액을 사용하였다. Scratch가 생성된 well에 하기 표 4와 같이 각각 용출된 배양액(각 물질이 4g/20ml 농도로 2% FBS(Fetal Bovine Serum)가 혼합된 α-MEM 배양액에 침지된 상태로 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 용출)을 처리하였으며, 각 용출액 상에서 cell을 배양하여 실험을 진행하였다. 배양 후 0, 12, 24시간 마다 scratch가 발생한 부분을 사진 촬영하여 scratch가 메워진 비율을 분석하였으며(도 9(A) 참조), Scratch가 메워진 비율(wound closure rate)은 아래의 수식 3으로 결정하여 도 9(B)에 정리하였다.
Figure PCTKR2023009483-appb-img-000007
Figure PCTKR2023009483-appb-img-000008
도 9(A)와 (B)에서 확인되듯이, 제조예 1에서 제조된 단백질 추출물이 사용된 경우, 생성된 screatch가 비처리군인 control 및 단순한 콜라겐에 비해 효과적으로 메워졌음을 확인할 수 있었으며, 이는 이건 발명에 따른 단백질 추출물이 국소 창상에 효과적으로 작용할 수 있음을 의미한다.
[실험예 8]
이건 발명에 따른 국소 창상 피복제의 효과를 확인하기 위하여, 제조예 2에 따른 국소 창상 피복재를 쥐에 형성된 국소 창상 부위에 도포한 후, 바셀린 거즈를 사용하여 보호하였다(도 10 참조). 비교를 위해 동일한 국소 창상을 형성한 후, 아무런 처치를 하지 않고 바셀린 거즈를 덮어 control로 사용하였다.
이러한 급성 창상 동물 모델을 통해 상처 치유율(wound healing rate, %), 재상피화율(re-epitherialization rate, %) 및 혈관 형성(angiogenesis, %)을 다음의 식을 사용하여 결정하였으며, 도 11 내지 도 13에 각각의 사진과 그 결과를 도시하였다.
먼저 도 11에 제시된 상처치유율(Wound healing rate)은, 각 처리군의 창상 부위를 처리한 후, 13일차에 육안 관찰(사진 촬영)하여 상처부위가 여전히 노출되어 있는 부분을 확인하였다. 거즈를 접촉시켜 피가 묻어 나옴을 확인하여 재 확인하였으며, 전체 상처부위의 면적과 치유되지 않고 남았있는 부위의 면적을 이미지 분석하여 아래 수식 4로 계산하였다.
Figure PCTKR2023009483-appb-img-000009
다음으로 시료를 채취하여 histological assay를 수행하였다. 재상피화 및 신생혈관 생성률을 분석을 위해 창상의 중앙부분 (도 12 (A)의 원모양 창상의 지름 부분)을 채취하여 paraffin block을 제작하였으며 이를 section하여 H&E 염색 (hematoxylin and eosin staining)을 진행하였다
H&E 염색된 조직을 관찰하여 분석하였으며 전체 창상 부분의 길이(defect length)와 재상피화가 진행된 부분의 길이(re-epitherilum length)를 측정하였다. 측정된 길이를 바탕으로 아래의 수식 5를 사용하여 계산하였으며, 그 결과는 도 13 (B)와 같다
Figure PCTKR2023009483-appb-img-000010
또한, 신생혈관의 생성 정도를 확인하기 위하여, H&E 염색된 조직을 관찰하여 단위 면적당 존재하는 혈관의 수를 counting하였다. 단위 면적당 counting된 혈관의 수는 정상 조직에 존재하는 혈관의 수와 비교하였으며 angiogenesis (%)는 아래의 수식 6으로 계산하였으며, 그 결과는 도 14(B)와 같다.
Figure PCTKR2023009483-appb-img-000011
도 11 내지 도 13에서 확인되듯이, 이건 발명에 따른 국소 창상 피복재는 다단계 탈세포화 과정을 거쳐 얻어지는 단백질 추출물을 포함하고 있어, 앞서 실험예 7의 in vitro 결과에서 예상된 것과 동일하게, 실제 급성 창상 동물 모델에서 현저한 상처 치유율, 재상피화율 및 혈관 형성 효과가 존재하는 것을 알 수 있다.
이건 발명은 상술한 특정의 실시예 및 설명에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 이건 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형 실시가 가능하며, 그와 같은 변형은 이건 발명의 보호 범위 내에 있게 된다.
이건 발명은 다단계 탈세포화 과정을 거쳐 얻어진 단백질 추출물을 포함하는 하이드로겔 기반의 창상 피복재에 관한 것으로, 폴리에틸렌 글리콜(PEG, Polyethylene Glycol), 백색 바세린(White Petrolatum), 1,2-헥산디올(1,2-Hexandiol), 에틸헥실글리세린(Ethylhexylglycerin), 히알루론산나트륨(Sodium Hyaluronate), 단백질 추출물(Protein Extract) 및 정제수를 포함하는, 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재를 제공할 수 있으므로, 산업상 이용가능성이 존재한다.

Claims (11)

  1. 폴리에틸렌 글리콜(PEG, Polyethylene Glycol), 백색 바세린(White Petrolatum), 1,2-헥산디올(1,2-Hexandiol), 에틸헥실글리세린(Ethylhexylglycerin), 히알루론산나트륨(Sodium Hyaluronate), 단백질 추출물(Protein Extract) 및 정제수를 포함하는, 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재는,
    폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol) 11~95wt%, 백색 바세린(White Petrolatum) 0.5~10wt%, 1,2-헥산디올(1,2-Hexandiol) 0.1~10wt%, 에틸헥실글리세린(Ethylhexylglycerin) 0.01~10wt%, 히알루론산나트륨(Sodium Hyaluronate) 0.001~10wt%, 단백질 추출물(Protein Extract) 0.01~10wt% 및 잔량의 정제수를 포함하는, 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단백질 추출물은,
    사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하여 전처리하는 전처리 단계;
    알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제1 불활성화 단계;
    바이러스 불활성화된 조직으로부터 세포를 제거하는 탈세포화 단계; 및 산(acid)을 사용하여 탈세포화된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제2 불활성화 단계;를 거쳐 제조되며,
    상기 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 DNA 함량은 50ng/mg 이하이고,
    상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 20% 이하인 것을 특징으로 하는, 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 탈세포화단계는,
    바이러스 불활성화된 조직으로부터 염기 수용액을 사용하여 세포를 제거하는 1차 탈세포화 단계; 및
    1차 탈세포화된 조직을 효소처리하여 세포를 제거하는 2차 탈세포화 단계;를 포함하는, 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 1차 탈세포화 단계는,
    n-PrOH과 NaOH의 혼합물을 통해 수행되는 제1 탈세포화 단계; 및
    0.05M 초과 0.2M 미만의 수산화나트륨 수용액으로 수행되는, 제2 탈세포화 단계;를 포함하는, 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 조직은, 포유류 유래 혈관, 인대 및 건 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 2차 탈세포화 단계는, DNase를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은, 중량평균 분자량이 400인 PEG와 중량평균 분자량이 4,000인 PEG가 2.2:1의 중량비로 혼합된 혼합물인 것을 특징으로 하는, 하이드로겔 기반의 국소 창상 피복재.
  9. 제1항에 있어서,
    25℃에서 측정된 점도와 35℃에서 측정된 점도가 실질적으로 동일한 것을 특징으로 하는, 하이드로젤 기반의 국소 창상 피복재.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 단백질 추출물은, 콜라겐과 엘라스틴을 포함하는 것을 특징으로 하는, 하이드로젤 기반의 국소 창상 피복재.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 1,2헥산디올과 에틸헥실글리세린은, 글루코네이트 클로로헥시딘, 아세테이트 클로로헥시딘, 하이드로클로라이드 클로로헥시딘, 실버술파다이아진, 포비돈 아이오딘, 벤즈알코니움 클로라이드, 퓨라진, 아이도카인, 헥사클로로펜, 클로로테트라사이클린, 네오마이신, 페니실린, 젠타마이신, 젠타마이신설페이트, 아크리놀, 시플로플록사신, 염화벤잘코늄, 후시딘산, 네오마이신황산염, 오플록사신 및 토브라마이신으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상으로 대체되는 것을 특징으로 하는, 하이드로젤 기반의 국소 창상 피복재.
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