WO2021015588A1 - 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 생체적합성 하이드로겔 - Google Patents

히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 생체적합성 하이드로겔 Download PDF

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유정수
이웅희
김완욱
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Definitions

  • the present invention relates to a biocompatible hydrogel containing hyaluronic acid and polyethylene glycol, and more particularly, crosslinking between molecules and/or intramolecularly of hyaluronic acid and polyethylene glycol only by irradiation without the addition of a reactive group or a chemical crosslinking agent. It relates to a biocompatible hydrogel prepared by induction, a method for preparing the same, and a use thereof.
  • injection-type hydrogels are receiving a lot of interest in the medical field, and are expected to be widely used, such as systems for releasing bioactive substances from medical fillers, and organ/tissue regeneration using a three-dimensional structure.
  • This injection-type hydrogel has the advantage that it can be simply injected into the living body using a syringe or the like without a surgical procedure.
  • it In general, in the case of an injection-type hydrogel, it must be able to be implanted using a syringe because it has the same characteristics as a fluid outside the body, and must have fluidity for convenience of operation, and after injecting into the body, chemical crosslinking or physical The shape is not disturbed through crosslinking and must be gelled in one place. That is, after transplantation, a drug delivery system for sustained release of cells or drugs, a role as a support capable of maintaining cell growth, or maintaining a certain shape within the skin soft tissue must be able to exert a cosmetic effect.
  • hydrogels have generally been manufactured by crosslinking by adding chemical substances such as a crosslinking agent and/or a curing agent to a polymer material.
  • a crosslinking agent and/or a curing agent itself used in the crosslinking reaction is harmful to the living body, there is a problem that when the hydrogel manufactured using the crosslinking agent and/or the curing agent is used in the living body, it may cause a harmful action.
  • such hydrogels are unsuitable for use as medical and pharmaceutical materials, for example wound dressings, drug delivery carriers, contact lenses, cartilage, intestinal adhesion inhibitors, and the like.
  • a crosslinking agent and/or a curing agent since the residual crosslinking agent and/or curing agent in the hydrogel must be removed after the hydrogel is manufactured, the manufacturing process is complicated and the manufacturing cost is increased.
  • hydrogels derived from synthetic polymers are not suitable for use in medical applications in terms of biocompatibility and biodegradability, they can be used without crosslinking agents, curing agents, or organic solvents. There is a need to develop a hydrogel formed only by intra-molecular or inter-molecular cross-linking of compatible molecules.
  • hyaluronic acid is a biopolymer material as a kind of polysaccharide in which repeating units consisting of N-acetyl-glucosamine and D-glucuronic acid are linearly connected, and since it was first isolated from the liquid filling the eye of animals, animals It is known to exist a lot in the placenta, synovial fluid of joints, pleural fluid, skin, roosters, etc., and is also produced in Streptococcus genus microorganisms Streptococcus equi, Streptococcus zooepidemecus, etc.
  • Hyaluronic acid has excellent biocompatibility and high viscoelasticity in solution, and is widely used not only for cosmetic applications such as cosmetic additives, but also for various pharmaceutical applications such as ophthalmic surgical aids, joint function improving agents, drug delivery substances and eye drops.
  • hyaluronic acid itself is easily decomposed in vivo or under conditions such as acid and alkali, its use is very limited, so it is common to add a chemical crosslinking agent to the production of hyaluronic acid-based hydrogels (WO2013/055832 ).
  • biocompatible polymers such as carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydroxyethylcellulose, carboxymethylstarch, etc. can form gels by irradiation with radiation (Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B 208 (2003) 320-324, Carbohydrate Polymers 112 (2014) 412-415, Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B 211 (2003) 533-544, etc.), in the case of hyaluronic acid, molecular weight by irradiation Because the degradation reaction easily occurs, such as a decrease in the viscosity and a decrease in viscosity (Korean Patent Laid-Open Patent No.
  • the present inventors have conducted extensive research to provide a hyaluronic acid-based biocompatible hydrogel manufactured only by irradiation without using a chemical crosslinking agent or organic chemical substance, and as a result of using polyethylene glycol, another biocompatible polymer, In the case, it was discovered that hyaluronic acid-polyethylene glycol hydrogel exhibiting various physical properties under specific production conditions could be prepared, and the present invention was completed.
  • an object of the present invention is an inter-molecular cross-linking, intra-molecular cross-linking, or inter-molecular and molecular cross-linking of hyaluronic acid and polyethylene glycol (PEG). It is to provide a hydrogel formed only by intra-crosslinking.
  • Another object of the present invention is inter-molecular cross-linking, intra-molecular cross-linking, of hyaluronic acid and polyethylene glycol (PEG), including the following steps, Or it is to provide a method for producing a hydrogel formed only by crosslinking between molecules and molecules: (a) preparing a solution by adding hyaluronic acid and polyethylene glycol to water; (b) inducing crosslinking of the material by irradiating the solution produced in step (a) with radiation.
  • Another object of the present invention is to provide a cell delivery system, a drug delivery system, an anti-adhesion agent, a cell support, a dental filler, an orthopedic filler, a wound covering agent, or a skin filler comprising the hydrogel.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for applying the skin to a wound site comprising the hydrogel as an active ingredient.
  • composition for applying the skin to the wound area consisting essentially of the hydrogel.
  • Another object of the present invention is to provide the use of the hydrogel for preparing a formulation for skin application to a wound area.
  • Another object of the present invention is to provide a method for treating a wound area by applying an effective amount of a composition containing the hydrogel as an active ingredient to the skin of an individual in need thereof.
  • the present invention provides inter-molecular cross-linking and intra-molecular cross-linking of hyaluronic acid and polyethylene glycol (PEG). Or, it provides a hydrogel formed only by cross-linking between molecules and within molecules.
  • PEG polyethylene glycol
  • the present invention includes the following steps, inter-molecular cross-linking of hyaluronic acid and polyethylene glycol (PEG), intra-molecular cross-linking (intra- Molecular cross-linking), or a method for producing a hydrogel formed only by cross-linking between molecules and molecules is provided: (a) preparing a solution by adding hyaluronic acid and polyethylene glycol to water; (b) inducing crosslinking of the material by irradiating the solution produced in step (a) with radiation.
  • PEG polyethylene glycol
  • intra-molecular cross-linking intra-molecular cross-linking
  • a hydrogel formed only by cross-linking between molecules and molecules is provided: (a) preparing a solution by adding hyaluronic acid and polyethylene glycol to water; (b) inducing crosslinking of the material by irradiating the solution produced in step (a) with radiation.
  • the present invention provides a cell delivery system, a drug delivery system, an anti-adhesion agent, a cell support, a dental filler, an orthopedic filler, a wound coating agent, or a skin filler including the hydrogel.
  • the present invention provides a composition for applying the skin to a wound site comprising the hydrogel as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for applying the skin to the wound area consisting of the hydrogel.
  • the present invention provides a composition for applying the skin to the wound area consisting essentially of the hydrogel.
  • the present invention provides the use of the hydrogel for preparing a formulation for skin application to a wound area.
  • the present invention provides a method of treating a wound area by applying an effective amount of a composition containing the hydrogel as an active ingredient to the skin of an individual in need thereof.
  • the present invention provides only inter-molecular cross-linking, intra-molecular cross-linking, or intermolecular and intramolecular cross-linking of hyaluronic acid and polyethylene glycol (PEG).
  • the formed hydrogel is provided.
  • a crosslinking agent is generally used to induce crosslinking of the polymer.
  • the crosslinking agent may be incorporated inside the hydrogel because the crosslinking agent mediates the binding between the polymers or within the polymer, and the concentration of the crosslinking agent is high and remains in the reactant in an active state. There may be, or there may be a problem in that there is an unreacted product remaining after the reaction, so that a purification process must be performed during the hydrogel manufacturing process.
  • the crosslinking agent remaining in the hydrogel may cause various side effects after administration into the body.
  • the present inventors have confirmed that the intermolecular or intramolecular crosslinking of hyaluronic acid and/or polyethylene glycol is induced by irradiating an electron beam to a mixture of hyaluronic acid and polyethylene glycol under certain conditions to form a hydrogel.
  • Biocompatibility in the broad sense means that both the desired function and safety for the living body are combined
  • biocompatibility in the narrow sense means that the biocompatibility in the narrow sense means that there is no toxicity and sterilization is possible.
  • the biocompatible hydrogel of the present invention is formed only by intermolecular or intramolecular crosslinking of hyaluronic acid and/or polyethylene glycol, the above problems of hyaluronic acid-based hydrogel prepared according to a conventional method There is no advantage in that the biocompatibility described above is very excellent.
  • any organic solvent is not used in the process of manufacturing the hydrogel of the present invention and can be manufactured by irradiating an electron beam in an aqueous solution state, contamination or complicated processes that may occur during the manufacturing process are not required. Also very useful.
  • the hydrogel provided by the present invention does not contain any functional groups additionally introduced into hyaluronic acid and polyethylene glycol, and any crosslinking agents other than hyaluronic acid and polyethylene glycol directly participate in or mediate crosslinking. It is characterized by not doing.
  • Hyaluronic acid which is the raw material of the biocompatible hydrogel in the present invention, has a very high utility value as a carrier for drugs, etc. due to the multifunctional functional groups present in its chemical structure, as well as biocompatibility and biodegradability ( Because of its physicochemical properties such as biodegradability), it has better applicability than synthetic polymers in the medical field (Materials Science and Engineering C 68 (2016) 964-981).
  • the hyaluronic acid means hyaluronic acid, a hyaluronic acid salt, or a mixture of hyaluronic acid and hyaluronic acid salt.
  • the hyaluronic acid salt may be at least one selected from the group consisting of sodium hyaluronate, potassium hyaluronate, calcium hyaluronate, magnesium hyaluronate, zinc hyaluronate, cobalt hyaluronate, and tetrabutyl ammonium hyaluronate, but is not limited thereto. .
  • the polyethylene glycol has many advantages in the field of drug delivery and tissue engineering, and typically has high solubility in organic solvents, is non-toxic, and exhibits excellent biocompatibility because there is no rejection reaction to immune action. It can be enclosed and released, and is used in the pharmaceutical formulation industry as a material approved for use by the US Food and Drug Administration for human use.
  • polyethylene glycol has been widely applied as a biomaterial because it improves the biocompatibility of polymers used for blood contact among hydrophilic polymers and has the greatest inhibitory effect on protein adsorption [J. H. Lee, J. Kopecek, and J. D. Andrade, J. Biomed. Mater. Res., 23 (1989) 351].
  • step (b) inducing crosslinking of the material by irradiating the solution produced in step (a) with radiation.
  • the present inventors have established conditions for producing a hydrogel consisting only of intramolecular crosslinking and/or intramolecular crosslinking of hyaluronic acid and polyethylene glycol through radiation irradiation through various examples.
  • a combination of various conditions is very important in order to induce intermolecular crosslinking and/or intramolecular crosslinking of hyaluronic acid and polyethylene glycol using irradiation to produce a hydrogel.
  • the hydrogel was not formed at all when the molecular weight/concentration of hyaluronic acid, the molecular weight/concentration of polyethylene glycol, the energy irradiation amount, and the energy intensity did not satisfy certain conditions.
  • polyethylene glycol having a molecular weight of 2 to 50 kDa may be used, and polyethylene glycol having a molecular weight of 2 to 50 kDa may be used, and polyethylene glycol having a molecular weight of 3 to 35 kDa may be used.
  • polyethylene glycol having a molecular weight of 2 to 50 kDa may be used, and polyethylene glycol having a molecular weight of 3 to 35 kDa may be used.
  • polyethylene glycol may be added to water at a concentration of 0.6 to 3% (w/v), and preferably in water at a concentration of 0.8 to 2% (w/v). It may be added, more preferably 0.8 to 1.5% (w/v) may be added to water, most preferably 0.9 to 1.2% (w/v) may be added to water .
  • the molecular weight of hyaluronic acid used in the step (a) of the present invention and the concentration of hyaluronic acid in the aqueous solution are not particularly limited, but hyaluronic acid having a molecular weight of 50 to 3000 kDa may be used, preferably hyaluronic acid of 70 to 2700 kDa. Ronic acid may be used, and hyaluronic acid of 100 to 2500 kDa most preferably may be used.
  • the concentration (w/v) of polyethylene glycol in step (a) may be the same as or greater than the concentration of hyaluronic acid (w/v).
  • step (b) of the present invention the solution produced in step (a) is irradiated with radiation to induce crosslinking of the material.
  • the hydrogel formed by the irradiation of the radiation has the advantage that there is no problem of residual toxicity present in the hydrogel manufactured by a chemical method, and a sterilization effect can be obtained simultaneously with crosslinking.
  • the radiation used may be at least one selected from the group consisting of gamma rays, ultraviolet rays, X-rays, and electron rays, and preferably electron rays.
  • the radiation dose and/or energy intensity of the radiation irradiated to form the hydrogel in step (b) is the molecular weight/concentration of hyaluronic acid and polyethylene glycol used in step (a). It was confirmed that it may vary depending on the molecular weight/concentration of. In addition, even under the conditions under which the hydrogel is formed, it was confirmed that the physical properties of the hydrogel are changed according to the irradiation dose and/or energy intensity of the irradiated radiation. It has been confirmed that the harder the hydrogel is formed as the radiation dose increases within a certain range, but if it exceeds a certain range, the crosslinking inside the hydrogel is partially cut, resulting in a reduced degree of rigidity. It was confirmed that this formation was formed.
  • the irradiation amount and energy intensity of the radiation irradiated in the step (b) of the present invention are not particularly limited, but the irradiation amount of the radiation may be preferably 2 to 500 kGy, more preferably 5 to 300 kGy. May be, and most preferably 5 to 200kGy.
  • the energy intensity of the radiation may be 0.5 to 20 Mev, preferably 1 to 10 Mev, even more preferably 1 to 5 Mev, and most preferably 1 to 2.5 Mev.
  • the present invention also includes the following steps, inter-molecular cross-linking, intra-molecular cross-linking, of hyaluronic acid and polyethylene glycol (PEG), Alternatively, it provides a method of preparing a hydrogel formed only by crosslinking between molecules and in molecules:
  • step (b) inducing crosslinking of the material by irradiating the solution produced in step (a) with radiation.
  • the present invention also provides a cell delivery system, a drug delivery system, an anti-adhesion agent, a cell support, a dental filler, an orthopedic filler, a wound covering agent (sheet type, gel type, spray type, cream type, etc.) or a skin filler including the hydrogel. to provide.
  • Biocompatible hydrogels are used in various applications such as cell delivery system, drug delivery system, anti-adhesion agent, cell support, dental filler, orthopedic filler, wound coating (sheet type, gel type, spray type, cream type, etc.) or skin filler. It is being utilized, and since research on this is also being actively conducted in the art, it is obvious to those skilled in the art that the hydrogel provided by the present invention can also be utilized for the above purpose.
  • the hydrogel provided by the present invention has excellent properties of maintaining its volume and shape in the body for a certain period of time, and thus it has been confirmed that it can be utilized as a skin filler.
  • the hydrogel of the present invention is preferably injected into the dermis layer in the skin to improve wrinkles, improve lip contours, improve acne scars, and are usefully used as skin fillers, such as for filling in skin depressions and/or scars. Can be.
  • the cell delivery system, drug delivery system, anti-adhesion agent, cell support, dental filler, orthopedic filler, wound coating agent (sheet type, gel type, spray type, cream type, etc.) or skin filler provided in the present invention are in addition to the hydrogel.
  • Various conventional additives may further be included.
  • the types of these additives are not particularly limited, but for example, dyes, coloring pigments, vegetable oils, thickeners, pH adjusters, osmotic pressure adjusters, vitamins, antioxidants, inorganic salts, preservatives, solubilizers, isotonic agents, suspending agents, emulsifiers. , Stabilizers, anesthetics, etc. may be included.
  • the present invention provides a composition for applying the skin to a wound area comprising the hydrogel as an active ingredient.
  • The'wound' of the present invention means a state in which the continuity of the tissue is destroyed by external pressure. Wounds include abrasions, bruises, lacerations, and cuts caused by blades.
  • composition for applying the skin to the wound area may additionally contain known drugs, disinfectants, etc. that can help heal the wound, and formulated as a wound coating agent and used as a sheet type, gel type, spray type, or cream type wound coating agent. have.
  • the composition for applying the skin to the wound area may include the hydrogel of the present invention without limitation, but is preferably prepared using hyaluronic acid having a molecular weight of 500 kDa or more, and most preferably a molecular weight of 1000 kDa or more. Hydrogel may be included.
  • the composition for applying the skin to the wound area may include the hydrogel of the present invention without limitation, but preferably the concentration ratio of hyaluronic acid and polyethylene glycol (w/v) is 1: 1 To 4, preferably 1: 1 to 3, most preferably 1: 1 to 2 It may be characterized in that the hydrogel is included.
  • the present invention provides the use of the hydrogel for preparing a formulation for skin application to a wound site.
  • the present invention provides a method of treating a wound site by applying an effective amount of a composition containing the hydrogel as an active ingredient to the skin of an individual in need thereof.
  • The'effective amount' of the present invention refers to an amount showing an effect of improving, treating, detecting, diagnosing, or inhibiting wound progression when administered to an individual, and the'individual' refers to an animal, preferably a mammal, In particular, it may be an animal, including humans, and may be cells, tissues, organs, etc. derived from animals. The individual may be a patient in need of the effect.
  • The'treatment' of the present invention generically refers to improving the wound site or symptoms caused by the wound, which may include curing the wound, substantially preventing, or improving the condition, and from the disease It includes, but is not limited to, alleviating, curing, or preventing one symptom or most symptoms resulting from it.
  • the term “comprising” is used with the same meaning as “including” or “characterized by”, and in the composition or method according to the present invention, specifically mentioned It does not exclude additional components or method steps that have not been made.
  • the term “consisting of” means excluding additional elements, steps, or ingredients that are not separately described.
  • the term “essentially consisting of” means that, in the scope of a composition or method, it is possible to include substances or steps that do not substantially affect their basic properties in addition to the substances or steps described.
  • the hydrogel of the present invention is manufactured by inducing inter- and/or intra-molecular cross-linking of hyaluronic acid and polyethylene glycol through an electron beam, there is no fear of toxicity in the human body due to the incorporation of an organic solvent or a cross-linking agent, Since a separate purification process is not required during the manufacturing process, mass production is possible with only a short time of electron beam irradiation, which is very excellent in terms of productivity.
  • the hydrogel of the present invention has excellent biocompatibility, it is very useful for the development of cell carriers, drug carriers, anti-adhesion agents, cell supports, dental fillers, orthopedic fillers, wound coating agents or skin fillers. Can be.
  • FIG. 1 is a view of visual observation of whether or not hydrogel is formed according to concentrations of 100kDa hyaluronic acid (HA) and 3kDa PEG and by electron beam irradiation dose (Y: hydrogel formation / N: hydrogel formation).
  • HA hyaluronic acid
  • FIG. 2 is a view of visual observation of whether or not hydrogel is formed according to concentrations of 100kDa HA and 10kDa PEG and radiation dose of electron beams (Y: hydrogel formation / N: hydrogel formation).
  • FIG. 3 is a visual observation of whether or not a hydrogel was formed according to concentrations of 100kDa HA and 20kDa PEG and dose of electron beam irradiation (Y: hydrogel formation / N: hydrogel formation)
  • FIG. 4 is a visual observation of whether or not a hydrogel was formed according to concentrations of 100kDa HA and 35kDa PEG and dose of electron beam irradiation (Y: hydrogel formation / N: hydrogel formation)
  • 6 to 9 are diagrams in which pore sizes of the hydrogel formed under the indicated conditions are observed with a scanning electron microscope.
  • 10 is a result of evaluating the absorption rate for each solvent of a hydrogel made by irradiating an electron beam of 100 kGy to 1% 100 kDa HA and 1% 20 kDa PEG.
  • FIG. 11 is a view showing an experimental method for visually observing the degree of decomposition after a hydrogel formed under the indicated conditions is inserted into the abdominal cavity of an animal and left for 1 week.
  • FIG. 12 is a diagram illustrating the degree of decomposition with the naked eye after inserting the hydrogel formed under the indicated conditions into the abdominal cavity of an animal and leaving it for 1 week.
  • 13 to 22 are results of visual observation of the possibility of utilization as a filler in vivo by observing the degree of maintenance of the shape according to the passage of time after injecting the hydrogel formed under the indicated conditions into the glabellar or back of an animal.
  • FIG. 23 is a diagram illustrating visual observation of an HA-PEG hydrogel sheet formed under indicated conditions to evaluate the efficacy as a wound coating agent.
  • 25 is a graph showing the result of measuring the area of the wound over time after dressing the HA-PEG hydrogel wound coating according to the present invention on the wound area of the wound animal model.
  • 26 is a result of measuring the thickness of the healed skin after healing the wound by dressing the wound area of the wound animal model with the HA-PEG hydrogel wound coating according to the present invention.
  • Example 1 hyaluronic acid (HA) through electron beam irradiation- Polyethylene glycol (PEG) Hydrogel Produce
  • the present inventors conducted experiments under various conditions below to prepare an HA-PEG composite hydrogel only by irradiation with electron beams without addition of a crosslinking agent.
  • the case where the hydrogel is formed is indicated by Y, and the case where the hydrogel is not formed is indicated by N.
  • the hydrogel was also expressed as a bulk gel.
  • the hydrogel began to be made from 50kGy of the electron beam irradiation dose, and it was confirmed that the lower the hyaluronic acid concentration, the better the gel was made.
  • the hydrogel was made even at 100 kGy, but the tendency to make a gel with a slightly higher viscosity than the hydrogel made at 50 and 200 kGy was also confirmed through photographs of the gels corresponding to each condition (FIG. 1). Through this part, it was confirmed that the crosslinking increased as the electron beam irradiation dose vaguely increased, so that a harder gel was not made.
  • the gel was not made under all conditions using 0.5% PEG, and under the conditions using 1% PEG, the same tendency was observed that the hydrogel was made from 100 kGy at both 1 MeV and 2.5 MeV. .
  • Example 2 HA-PEG formed through electron beam irradiation Hydrogel Observation of pores and confirmation of water retention
  • hyaluronic acid-PEG hydrogel made through electron beam irradiation a hydrogel sample was freeze-dried, cut in half with a blade, coated with Osmium, and holed through a scanning electron microscope (SEM). I checked the size and thickness of.
  • SEM scanning electron microscope
  • a hyaluronic acid-PEG hydrogel made by irradiating 100kGy and 200kGy in 1% 35kDa PEG mixed with 1% 100kDa hyaluronic acid was confirmed.
  • freeze-dried as the electron beam irradiation dose increased. It was confirmed that the thickness of the sample became thinner, the size of the hole was also reduced, and the thickness of the films forming the hole was not significantly different (FIG. 8).
  • the weight of the hyaluronic acid-PEG hydrogel reached the maximum within 5 minutes so that the hyaluronic acid-PEG hydrogel absorbed most of the solvents quickly, but the difference occurred according to the type of solvent.It was confirmed that the highest swelling was achieved in water than other solvents. Then, it was confirmed that the swelling ability of the hyaluronic acid-PEG hydrogel was high in the water base solvent in the order of physiological saline and PBS. This result is predicted as a result due to the excellent water retention ability of hyaluronic acid contained in the hyaluronic acid-PEG hydrogel (FIG. 10).
  • Example 3 HA-PEG Hydrogel Check the degree of degradation in vivo
  • Example 4 Confirmation of the possibility of utilization of HA-PEG hydrogel as a filler in vivo
  • 1% 100kDa hyaluronic acid, 1% 20kDa PEG, 1% 100kDa hyaluronic acid and 1% 35kDa PEG were irradiated with 200kGy electron beams, and the resulting hydrogel was injected to the left and right of the forehead of SD-rat, respectively.
  • the filler efficacy experiment was also conducted using a hyaluronic acid-PEG hydrogel produced when the concentration of hyaluronic acid used in the electron beam irradiation experiment and the molecular weight of PEG were different. Hydrogels made by irradiating electron beams of 100kGy and 200kGy to 0.1% or 0.5% 100kDa hyaluronic acid and 1% 3kDa PEG were injected into the foreheads of two SD-rats, respectively, but their efficacy as a filler was insufficient. It was confirmed that the volume was rapidly decreased, and it was confirmed that almost no volume remained after 14 days. Therefore, it was confirmed that an appropriate concentration of hyaluronic acid used in the electron beam irradiation experiment was required (FIG. 17).
  • a wound test model was first made. After making each wound on both the left and right sides of BALB/c nude mice using an 8 mm diameter biopsy punch, put 4 types of HA-PEG hydrogel samples on the wound, dress with tape, and then hydrolyze every 3 days. The gel sample was replaced and the size of the wound was monitored for 13 days (FIG. 23). In the comparative experiment on the efficacy of wound coating, the experiment was conducted with the control group, which was not treated with anything, as a control group.
  • HA promotes the formation of a structural skeleton through the interaction of Fibrin and Thrombus in the initial inflammatory reaction caused by the wound, and facilitates the movement of cells essential for wound healing. It was judged that this result was made because it formed a network in the granulation tissue to induce cell proliferation and organization of cells, and helped keratinocytes, which are the core cells that make up the epidermis, to grow well.
  • the hydrogel of the present invention is manufactured by inducing inter- and/or intra-molecular cross-linking of hyaluronic acid and polyethylene glycol through an electron beam, there is no fear of toxicity in the human body due to the incorporation of an organic solvent or a cross-linking agent, Since a separate purification process is not required during the manufacturing process, mass production is possible with only a short time of electron beam irradiation, which is very excellent in terms of productivity.
  • the hydrogel of the present invention has excellent biocompatibility, it is very useful for the development of cell carriers, drug carriers, anti-adhesion agents, cell supports, dental fillers, orthopedic fillers, wound coating agents or skin fillers. It can be used, so it has very high industrial availability.

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Abstract

본 발명은 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 생체적합성 하이드로겔에 관한 것으로, 보다 상세하게는 반응기, 화학 가교제 등의 첨가 없이 방사선 조사만으로 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜의 분자 간 및/또는 분자 내 가교결합을 유도하여 제조된 생체적합성 하이드로겔, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 생체적합성 하이드로겔
본 출원은 2019년 7월 24일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2019-0089858호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 생체적합성 하이드로겔에 관한 것으로, 보다 상세하게는 반응기, 화학 가교제 등의 첨가 없이 방사선 조사만으로 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜의 분자 간 및/또는 분자 내 가교결합을 유도하여 제조된 생체적합성 하이드로겔, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
최근 주입형 하이드로겔은 의료분야에서 많은 관심을 받고 있는데, 의료용 충전제로부터 생리활성 물질의 방출 시스템, 삼차원 구조를 이용한 기관/조직재생 등 폭넓게 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 이러한 주입형 하이드로겔은 외과적인 수술과정 없이 주사기 등을 사용하여 간단하게 생체 내에 주입될 수 있다는 장점을 가지고 있다. 일반적으로 주입형 하이드로겔의 경우 체외에서는 유체와 같은 특성을 가지고 있어 주사기를 사용하여 이식이 가능하여야 하고, 조작의 편리성을 위한 유동성을 지녀야 하며, 체내에 주입하고 난 뒤 화학적인 가교나 물리적인 가교를 통해 그 형태가 흐트러지지 않고, 한 곳에서 겔화(gelation) 되어야 한다. 즉, 이식 후에는 세포나 약물의 지속적인 방출을 위한 약물전달시스템, 세포의 성장을 유지할 수 있는 지지체로서의 역할, 또는 피부 연조직 내에서 일정한 형태를 유지하여 미용 효과를 발휘할 수 있어야 한다.
한편, 이러한 하이드로겔은 일반적으로 고분자 물질에 가교제 및/또는 경화제 등의 화학물질을 첨가하여 가교하는 방법으로 제조되어 왔다. 그러나, 상기 가교반응에 사용되는 가교제 및/또는 경화제 자체가 생체에 유해하므로 이러한 가교제 및/또는 경화제를 사용하여 제조된 하이드로겔이 생체에 사용되는 경우에 유해한 작용을 일으킬 수 있는 문제가 있다. 특히, 이러한 하이드로겔은 의료 및 제약용 재료, 예를들어, 상처용 드레싱(wound dressings), 약물 전달 캐리어(drug delivery carrier), 콘택트 렌즈, 연골, 장 유착 방지제 등으로 사용하기 부적합하다. 또한, 가교제 및/또는 경화제가 사용되는 경우에는 하이드로겔 제조 후에 하이드로겔 내의 잔류 가교제 및/또는 경화제를 제거하여야 하므로 제조공정이 복잡할 뿐만 아니라 제조 비용이 상승되는 문제가 있다.
이에, 가교제 및/또는 경화제를 사용하지 않고도 고분자 유래 하이드로겔을 제조하기 위한 노력이 계속되고 있으며, 이러한 노력의 성과로 합성 고분자(synthetic polymer)에 방사선을 조사함으로써 하이드로겔을 제조한 성과가 보고된 바 있다.
하지만, 합성 고분자(synthetic polymer) 유래의 하이드로겔은 생체적합성(biocompatibility) 및 생분해성(biodegradable) 측면에서 의약학적인 용도로 활용되기에는 적합하지 않기 때문에, 가교제, 경화제, 유기용매 등을 사용하지 않고도 생체적합성 분자의 분자 내(intra-molecular) 또는 분자 간(inter-molecular) 가교결합에 의해서만 형성된 하이드로겔의 개발이 요구되고 있다.
한편, 히알루론산은 N-아세틸-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 구성된 반복단위가 선형으로 연결되어 있는 다당류의 일종으로서 생체고분자 물질이며, 동물의 안구를 채우고 있는 액체에서 처음으로 분리된 이래, 동물의 태반, 관절의 윤활액 (synovial fluid), 늑막액 (pleural fluid), 피부, 수탉의 벼슬 등에 많이 존재하는 것으로 알려져있고, Streptococcus 속 미생물 Streptococcus equi, Streptococcus zooepidemecus 등에서도 생산된다.
히알루론산은 생체적합성이 우수하고 용액상태에서 높은 점탄성의 특성으로 화장품 첨가제 등의 화장품 용도뿐만 아니라 안과용 수술보조제, 관절기능 개선제, 약물전달 물질 및 점안제 등의 다양한 의약 용도에 대해서도 널리 사용되고 있다. 하지만, 히알루론산 자체만으로는 생체내 (in vivo) 또는 산, 알칼리 등의 조건에서 쉽게 분해되어 사용이 매우 제한적이기 때문에, 히알루론산 기반의 하이드로겔 제조에는 화학 가교제가 첨가되는 것이 일반적이다(WO2013/055832).
특히, 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 카르복시메틸스타치 등과 같은 생체적합성 고분자들은 방사선을 조사하여 겔을 형성할 수 있다는 것이 당업계에 잘 공지되어 있는 반면에(Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B 208 (2003) 320-324, Carbohydrate Polymers 112 (2014) 412-415, Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B 211 (2003) 533-544, 등), 히알루론산의 경우에는 방사선 조사에 의해 분자량이 작아지고, 점도가 감소되는 등 분해(degradation) 반응이 쉽게 일어나기 때문에(한국 공개특허 제10-2008-0086016호 등), 방사선 조사를 통해 제조된 히알루론산 기반의 하이드로겔, 즉, 화학 가교제, 유기화학물질 등이 첨가되지 않고 방사선 조사만으로 제조된 히알루론산 기반의 하이드로겔은 아직까지 제공이 되고 있지 않다.
이에, 본 발명자는 화학 가교제, 유기화학물질 등을 사용하지 않고 방사선 조사만으로 제조된 히알루론산 기반의 생체적합성 하이드로겔을 제공하고자 예의 연구를 거듭한 결과, 또 다른 생체적합성 고분자인 폴리에틸렌글리콜을 함께 이용할 경우 특정 제조 조건에서 다양한 물성을 나타내는 히알루론산-폴리에틸렌글리콜 하이드로겔을 제조할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)의 분자 간 가교결합(inter-molecular cross-linking), 분자 내 가교결합(intra-molecular cross-linking), 또는 분자 간 및 분자 내 가교결합만으로 형성된 하이드로겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 하기 단계를 포함하는, 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)의 분자 간 가교결합(inter-molecular cross-linking), 분자 내 가교결합(intra-molecular cross-linking), 또는 분자 간 및 분자 내 가교결합만으로 형성된 하이드로겔의 제조방법을 제공하는 것이다: (a) 물에 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜을 첨가하여 용액을 제조하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 생성된 용액에 방사선을 조사하여 상기 물질의 가교결합을 유도하는 단계.
본 발명의 다른 목적은 상기 하이드로겔을 포함하는 세포전달체, 약물전달체, 유착방지제, 세포지지체, 치과용 충전제, 정형외과용 충전제, 창상피복제 또는 피부 충전제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 하이드로겔을 유효성분으로 포함하는 창상부위의 피부 도포용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 상기 하이드로겔로 이루어지는 창상부위의 피부 도포용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 상기 하이드로겔로 필수적으로 이루어지는 창상부위의 피부 도포용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 창상부위의 피부 도포용 제제를 제조하기 위한 상기 하이드로겔의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 하이드로겔을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체의 피부에 도포하여 창상부위를 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)의 분자 간 가교결합(inter-molecular cross-linking), 분자 내 가교결합(intra-molecular cross-linking), 또는 분자 간 및 분자 내 가교결합만으로 형성된 하이드로겔을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)의 분자 간 가교결합(inter-molecular cross-linking), 분자 내 가교결합(intra-molecular cross-linking), 또는 분자 간 및 분자 내 가교결합만으로 형성된 하이드로겔의 제조방법을 제공한다: (a) 물에 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜을 첨가하여 용액을 제조하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 생성된 용액에 방사선을 조사하여 상기 물질의 가교결합을 유도하는 단계.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 하이드로겔을 포함하는 세포전달체, 약물전달체, 유착방지제, 세포지지체, 치과용 충전제, 정형외과용 충전제, 창상피복제 또는 피부 충전제를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 하이드로겔을 유효성분으로 포함하는 창상부위의 피부 도포용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 하이드로겔로 이루어지는 창상부위의 피부 도포용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 하이드로겔로 필수적으로 이루어지는 창상부위의 피부 도포용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 창상부위의 피부 도포용 제제를 제조하기 위한 상기 하이드로겔의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 하이드로겔을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체의 피부에 도포하여 창상부위를 치료하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)의 분자 간 가교결합(inter-molecular cross-linking), 분자 내 가교결합(intra-molecular cross-linking), 또는 분자 간 및 분자 내 가교결합만으로 형성된 하이드로겔을 제공한다.
고분자를 이용하여 하이드로겔을 제조하는 방법에는 고분자의 가교결합을 유도하기 위하여 가교제가 이용이 되는 것이 일반적이다. 가교제를 이용하여 고분자의 가교결합을 유도하는 방법의 경우, 가교제가 고분자 간 또는 고분자 내의 결합을 매개하기 때문에 가교제가 하이드로겔 내부에 혼입되어 있을 수 있고, 가교제의 농도가 높아 활성상태로 반응물에 남아 있을 수 있거나, 또는 반응 후 남아 있는 미반응물이 존재하여 하이드로겔 제조공정 중 정제과정을 필수적으로 거쳐야 한다는 문제점이 있을 수 있다. 또한, 하이드로겔 내에 잔존하는 가교제는 체내에 투여된 후 여러 가지 부작용을 야기할 수 있다. 그러나, 본 발명자는 특정한 조건에서 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜의 혼합물에 전자빔을 조사함으로써 히알루론산 및/또는 폴리에틸렌글리콜의 분자간 또는 분자 내 가교결합이 유도되어 하이드로겔이 형성되는 것을 확인하였다. 분자 내부에 가교제나 물리적 가교를 위해 추가적으로 넣어준 금속 양이온과 같은 외부물질이 포함이 되어 있지 않고 오로지 히알루론산 및/또는 폴리에틸렌글리콜 자체의 결합에 의해서만 형성된 하이드로겔은 종래 보고된 바 없는 것으로 본 발명자가 본 발명을 통해 최초로 공개하는 것이다.
한편, 고분자 재료뿐만 아니라 모든 의료용 재료는 생체적합성을 반드시 필요로 하며, 이러한 생체적합성은 두 가지 면에서 의미를 구분할 수 있다. 넓은 의미의 생체적합성은 목적하는 기능과 생체에 대한 안전성을 겸비한 것을 말하며, 좁은 의미의 생체적합성은 생체에 대한 생물학적 안전성, 즉 독성이 없으며 멸균 가능한 것을 의미한다.
그런데, 본 발명의 상기 생체적합성 하이드로겔은 히알루론산 및/또는 폴리에틸렌글리콜의 분자 간 또는 분자 내 가교결합에 의해서만 형성이 되기 때문에 종래 방법에 따라 제조된 히알루론산 기반의 하이드로겔이 갖고 있는 상기 문제점들이 없고 전술한 생체적합성이 매우 우수하다는 장점이 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 하이드로겔을 제조하는 과정에서 일체의 유기용매가 사용되지 않고 수용액 상태에서 전자빔을 조사함으로써 제조가 가능하기 때문에, 제조과정에서 발생할 수 있는 오염이나 복잡한 공정이 요구되지 않아 산업적으로도 매우 활용도가 크다.
즉, 본 발명에서 제공하는 상기 하이드로겔은 히알루론산과 폴리에틸렌글리콜에 추가로 도입한 어떠한 기능기(functional group)도 결합되어 있지 않으며, 히알루론산과 폴리에틸렌글리콜 외에 어떠한 가교제도 가교결합에 직접 참여하거나 매개하고 있지 않은 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 생체적합성 하이드로겔의 원료가 되는 히알루론산은 이의 화학구조 내에 존재하는 다 기능성 기능기로 인해 약물 등의 담체(carrier)로서 활용가치가 매우 높을 뿐만 아니라, 생체적합성(biocompatibility) 및 생분해성(biodegradability) 등과 같은 물리화학적 특성으로 인해 의약학분야에서 합성 고분자보다 활용가능성이 더 우수하다(Materials Science and Engineering C 68 (2016) 964-981).
본 발명에서 상기 히알루론산은 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산과 히알루론산 염의 혼합물을 모두 포함하는 의미이다. 상기 히알루론산 염은 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 및 히알루론산 테트라부틸 암모늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 폴리에틸렌글리콜은 약물 전달 분야 및 조직공학에서 많은 장점을 가지고 있으며, 대표적으로 유기 용매에 높은 용해도를 가지며 비독성이고 면역 작용에 거부반응이 없어 뛰어난 생체적합성을 나타내며 약물 전달체로서 약물을 쉽게 포접, 방출할 수 있으며, 인체 내 사용에 있어서 미국 식품 의약 안전청에서 사용이 승인된 재료로서 제약 제제 산업에서 사용되고 있다. 또한, 폴리에틸렌글리콜은 친수성 고분자들 중에서 혈액 접촉에 사용되는 고분자의 생체적합성을 향상시키고 단백질 흡착 억제 효과가 가장 크기 때문에 생체 재료로서 많은 응용이 이루어지고 있다[J. H. Lee, J. Kopecek, and J. D. Andrade, J. Biomed. Mater. Res., 23 (1989) 351].
본 발명이 제공하는 상기 하이드로겔은 특히 하기 단계를 포함하는 방법에 의해서 제조된 것이 특징일 수 있다:
(a) 물에 히알루론산 및 폴리에틸린글리콜을 첨가하여 용액을 제조하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 생성된 용액에 방사선을 조사하여 상기 물질의 가교결합을 유도하는 단계.
본 발명자는 다양한 실시예를 통해서 방사선 조사를 통해 히알루론산과 폴리에틸렌글리콜의 분자 간 가교결합 및/또는 분자 내 가교결합만으로 이루어진 하이드로겔 제조조건을 확립하였다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 방사선 조사를 이용해 히알루론산과 폴리에틸렌글리콜의 분자 간 가교결합 및/또는 분자 내 가교결합을 유도하여 하이드로겔을 생성하기 위해서는 다양한 조건들의 조합이 매우 중요하다는 것이 확인되었다. 구체적으로, 히알루론산의 분자량/농도, 폴리에틸렌글리콜의 분자량/농도, 에너지 조사량 및 에너지 세기가 특정 조건을 만족하지 않을 경우 하이드로겔이 전혀 형성이 되지 않는다는 것이 확인되었다. 또한, 이들 조건들의 적절한 조절을 통하여 다양한 물성을 나타내는 하이드로겔의 제조도 가능하다는 것이 확인되었다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 분자량이 2 내지 50kDa인 폴리에틸렌글리콜이 0.6 내지 3%(w/v)의 농도로 물에 첨가가 된 경우에는, 함께 첨가되는 히알루론산의 농도 및 분자량과 관계없이 방사선 조사량과 세기의 조절의 통해서 다양한 물성의 하이드로겔이 형성이 되는 것이 확인되었다.
특히, 하이드로겔 제조에 사용된 폴리에틸렌글리콜의 분자량이 증가할수록 더 낮은 방사선 조사량 조건에서도 하이드로겔이 생성되는 경향성이 확인되었으며, 조사되는 방사선 에너지의 세기가 커질수록 더 낮은 농도의 폴리에틸렌글리콜 수용액 조건에서도 하이드로겔이 형성이 되는 것으로 확인이 되었다.
따라서, 본 발명의 상기 (a) 단계에서는 분자량이 2 내지 50kDa인 폴리에틸렌글리콜이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 3 내지 40kDa인 폴리에틸렌글리콜이 사용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 3 내지 35kDa인 폴리에틸렌글리콜이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 (a) 단계에서는 폴리에틸렌글리콜은 0.6 내지 3%(w/v)의 농도로 물에 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 0.8 내지 2%(w/v)의 농도로 물에 첨가될 수 있으며, 더 바람직하게는 0.8 내지 1.5%(w/v)의 농도로 물에 첨가될 수 있으며, 가장 바람직하게는 0.9 내지 1.2%(w/v)의 농도로 물에 첨가될 수 있다.
따라서, 본 발명의 상기 (a) 단계에서 사용되는 히알루론산의 분자량 및 수용액 내 히알루론산의 농도는 특별히 제한되는 것은 아니나 분자량 50 내지 3000kDa인 히알루론산이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 70 내지 2700kDa인 히알루론산이 사용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 100 내지 2500kDa인 히알루론산이 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 양태에서, 상기 (a) 단계에서 폴리에틸렌글리콜의 농도(w/v)는 히알루론산의 농도(w/v)와 동일하거나 큰 것을 특징으로 할 수 있다.
한편, 본 발명의 상기 (b) 단계에서는 상기 (a) 단계에서 생성된 용액에 방사선을 조사하여 상기 물질의 가교결합을 유도하는 단계이다.
상기 방사선 조사에 의해 성형되는 상기 하이드로겔은 화학적 방법에 의해 제조되는 하이드로겔에 존재하는 잔류 독성의 문제가 없고, 가교와 동시에 멸균효과를 얻을 수 있다는 장점이 있다. 이때, 사용되는 방사선은 감마선, 자외선, X-ray 및 전자선으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 전자선일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 (b) 단계에서 하이드로겔을 형성하기 위해 조사되는 방사선의 조사선량 및/또는 에너지 세기는 상기 (a) 단계에서 사용된 히알루론산의 분자량/농도 및 폴리에틸렌글리콜의 분자량/농도에 따라 달라질 수 있음이 확인되었다. 또한, 하이드로겔이 형성되는 조건이라고 하더라도 조사되는 방사선의 조사선량 및/또는 에너지 세기에 따라서 하이드로겔의 물성이 달라진다는 것이 확인되었다. 일정한 범위 내에서 방사선 조사선량이 증가할수록 더 단단한 성질의 하이드로겔이 형성이 되는 것으로 확인이 되었으나, 일정한 범위를 초과할 경우에는 오히려 하이드로겔 내부의 가교결합이 일부 절단되어 단단함 정도가 감소된 하이드로겔이 형성이 되는 것으로 확인이 되었다.
본 발명의 상기 (b) 단계에서 조사되는 방사선의 조사량 및 에너지 세기는 그 범위가 특별히 제한되는 것은 아니지만, 상기 방사선의 조사량은 바람직하게는 2 내지 500kGy 일 수 있으며, 더 바람직하게는 5 내지 300kGy일 수 있으며, 가장 바람직하게는 5 내지 200kGy일 수 있다. 또한, 상기 방사선의 에너지 세기는 0.5 내지 20Mev일 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 10Mev일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 1 내지 5Mev일 수 있으며, 가장 바람직하게는 1 내지 2.5Mev일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 하이드로겔을 제조하기 위한 구체적인 제조 조건, 즉, 히알루론산의 분자량/농도, 폴리에틸렌글리콜의 분자량/농도, 방사선 조사량 및 방사선 에너지 세기 조합의 실제적인 예시는 본원발명의 실시예에 구체적으로 제시되어 있다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 히알루론산 및 폴리에틸린글리콜(polyethylene glycol, PEG)의 분자 간 가교결합(inter-molecular cross-linking), 분자 내 가교결합(intra-molecular cross-linking), 또는 분자 간 및 분자 내 가교결합만으로 형성된 하이드로겔의 제조방법을 제공한다:
(a) 물에 히알루론산 및 폴리에틸린글리콜을 첨가하여 용액을 제조하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 생성된 용액에 방사선을 조사하여 상기 물질의 가교결합을 유도하는 단계.
상기 제조방법의 각 단계에 대한 구체적인 설명은 전술한 바가 동일하게 적용될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 하이드로겔을 포함하는 세포전달체, 약물전달체, 유착방지제, 세포지지체, 치과용 충전제, 정형외과용 충전제, 창상피복제(시트형, 겔형, 스프레이형, 크림형 등) 또는 피부 충전제를 제공한다.
본 발명에서는 목적하는 용도에 따라 전술한 범위 내에서 제조조건을 변경함으로써 다양한 물성을 만족하는 하이드로겔을 제공할 수 있기 때문에 점탄성 및 생체 내 분해기간이 각 용도에 적합한 하이드로겔을 제공할 수 있다. 또한, 제조과정 중 일체의 화학 가교제 및 유기화학물질이 사용되지 않기 때문에 생체적합성이 매우 우수하여 다양한 용도에 활용이 될 수 있다.
생체적합성 하이드로겔은 세포전달체, 약물전달체, 유착방지제, 세포지지체, 치과용 충전제, 정형외과용 충전제, 창상피복제(시트형, 겔형, 스프레이형, 크림형 등) 또는 피부 충전제 등의 용도로 다양하게 활용이 되고 있으며, 이에 대한 연구도 당업계에서 활발하게 진행이 되고 있기 때문에 본 발명에서 제공하는 하이드로겔도 상기 용도로 활용이 될 수 있음은 통상의 기술자에게 자명한 것이다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 하이드로겔은 체내에서 일정한 기간 동안 그 부피와 형상을 유지하는 특성이 매우 우수하여 피부 충전제로서의 활용 가능성이 확인된 바 있다.
따라서, 본 발명의 하이드로겔은 바람직하게는 피부 내 dermis 층에 주입되어 주름을 개선하거나, 입술 윤곽 개선, 여드름 흉터 개선, 피부 함몰 부위 및/또는 흉터를 채우기 위한 용도 등 피부 충전제로서 유용하게 활용이 될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 세포전달체, 약물전달체, 유착방지제, 세포지지체, 치과용 충전제, 정형외과용 충전제, 창상피복제(시트형, 겔형, 스프레이형, 크림형 등) 또는 피부 충전제는 상기 하이드로겔 외에도 다양한 통상의 첨가물을 추가로 포함할 수 있다. 이들 첨가물은 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어, 염료, 착색 안료, 식물성 오일, 증점제, pH 조절제, 삼투압 조절제, 비타민, 항산화제, 무기염, 방부제, 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 마취제 등이 포함될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 하이드로겔을 유효성분으로 포함하는 창상부위의 피부 도포용 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 '창상 (wound)'이란 외부의 압력에 의하여 조직의 연속성이 파괴되는 상태를 의미한다. 창상에는 찰과상, 타박상, 열상, 칼날에 의한 절창 등이 포함된다.
상기 창상부위의 피부 도포용 조성물에는 상처의 치유를 도울 수 있는 공지된 약물, 소독제 등이 추가로 포함될 수 있고, 창상피복제로 제제화되어 시트형, 겔형, 스프레이형 또는 크림형 창상피복제로 활용이 될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 창상부위의 피부 도포용 조성물에는 전술한 본 발명의 하이드로겔이 제한없이 포함될 수 있으나, 바람직하게는 분자량 500kDa 이상, 가장 바람직하게는 분자량 1000kDa 이상의 히알루론산을 이용하여 제조된 하이드로겔이 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 창상부위의 피부 도포용 조성물에는 전술한 본 발명의 하이드로겔이 제한없이 포함될 수 있으나, 바람직하게는 히알루론산과 폴리에틸렌글리콜의 농도비(w/v)가 1: 1 내지 4, 바람직하게는 1: 1 내지 3, 가장 바람직하게는 1: 1 내지 2인 하이드로겔이 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 창상부위의 피부 도포용 제제를 제조하기 위한 상기 하이드로겔의 용도를 제공한다.
본 발명은 상기 하이드로겔을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체의 피부에 도포하여 창상부위를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 '유효량'이란 개체에게 투여하였을 때, 창상의 개선, 치료, 검출, 진단 또는 창상 진행의 억제 또는 감소 효과를 나타내는 양을 말하며, 상기 '개체'란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자(patient) 일 수 있다.
본 발명의 상기 '치료'는 창상부위 또는 창상으로 인한 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고, 이는 상기 창상을 치유하거나, 실질적으로 예방하거나, 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며, 상기 질환으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나, 치유하거나 예방하는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "을 포함하는(comprising)"이란 "함유하는(including)" 또는 "특징으로 하는(characterized by)"과 동일한 의미로 사용되며, 본 발명에 따른 조성물 또는 방법에 있어서, 구체적으로 언급되지 않은 추가적인 구성 성분 또는 방법의 단계 등을 배제하지 않는다. 또한 용어 "로 이루어지는(consisting of)"이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 "필수적으로 이루어지는(essentially consisting of)"이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 물질 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계 등을 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 하이드로겔은 전자빔을 통해 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜의 분자 간 및/또는 분자 내 가교결합을 유도함으로써 제조되기 때문에, 유기용매 또는 가교제의 혼입에 따른 인체 내 독성문제가 발생할 염려가 전혀 없고, 그 제조과정 중 별도의 정제과정이 필요치 않아 짧은 시간의 전자빔 조사만으로 대량 생산이 가능하여 생산성 측면에서도 매우 우수하다. 또한, 본 발명의 하이드로겔은 생체적합성이 매우 우수하기 때문에 세포전달체, 약물전달체, 유착방지제, 세포지지체, 치과용 충전제, 정형외과용 충전제, 창상피복제 또는 피부 충전제 등의 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 100kDa 히알루론산(HA) 및 3kDa PEG의 농도별 및 전자선 조사선량별 하이드로겔 형성 여부를 육안으로 관찰한 도면이다(Y: 하이드로겔 형성 / N: 하이드로겔 형성되지 않음).
도 2는 100kDa HA 및 10kDa PEG의 농도별 및 전자선 조사선량별 하이드로겔 형성 여부를 육안으로 관찰한 도면이다(Y: 하이드로겔 형성 / N: 하이드로겔 형성되지 않음).
도 3은 100kDa HA 및 20kDa PEG의 농도별 및 전자선 조사선량별 하이드로겔 형성 여부를 육안으로 관찰한 도면이다(Y: 하이드로겔 형성 / N: 하이드로겔 형성되지 않음)
도 4는 100kDa HA 및 35kDa PEG의 농도별 및 전자선 조사선량별 하이드로겔 형성 여부를 육안으로 관찰한 도면이다(Y: 하이드로겔 형성 / N: 하이드로겔 형성되지 않음)
도 5는 본 발명의 방법을 대량생산에 적용하였을 때에도 하이드로겔이 형성되는지 여부를 확인한 결과이다.
도 6 내지 도 9는 표시된 조건에서 형성된 하이드로겔의 공극 크기를 주사전자현미경으로 관찰한 도면이다.
도 10은 1% 100kDa의 HA과 1% 20kDa의 PEG에 100kGy의 전자선을 조사하여 만들어진 하이드로겔의 각 용매에 대한 흡수율을 평가한 결과이다.
도 11은 표시된 조건에서 형성된 하이드로겔을 동물의 복강에 삽입하여 1 주간 방치한 후 분해된 정도를 육안으로 관찰하기 위한 실험 방법을 나타낸 도면이다.
도 12은 표시된 조건에서 형성된 하이드로겔을 동물의 복강에 삽입하여 1 주간 방치한 후 분해된 정도를 육안으로 관찰한 도면이다.
도 13 내지 도 22는 표시된 조건에서 형성된 하이드로겔을 동물의 미간 또는 등에 주입한 후 기간의 경과에 따른 형태 유지 정도를 관찰함으로써 생체 내 필러로서의 활용 가능성을 육안으로 관찰한 결과이다.
도 23은 창상피복제로서의 효능을 평가하기 위해 표시된 조건에서 형성된 HA-PEG 하이드로겔 시트를 육안으로 관찰한 도면이다.
도 24는 창상 동물모델의 상처 부위에 본 발명에 따른 HA-PEG 하이드로겔 창상피복제를 드레싱한 후 시간의 경과에 따라 상처의 치유 정도를 육안으로 관찰한 결과이다.
도 25는 창상 동물모델의 상처 부위에 본 발명에 따른 HA-PEG 하이드로겔 창상피복제를 드레싱한 후 시간의 경과에 따라 상처의 면적을 측정하여 그래프로 나타낸 결과이다.
도 26은 창상 동물모델의 상처 부위에 본 발명에 따른 HA-PEG 하이드로겔 창상피복제를 드레싱하여 상처를 치유한 후, 치유된 피부의 두께를 측정한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 전자선 조사를 통한 히알루론산(HA)- 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 하이드로겔(hydrogel)의 제조
본 발명자는 가교제의 첨가 없이 전자선 조사만으로 HA-PEG 복합 하이드로겔을 제조하고자 이하 다양한 조건에서 실험을 진행하였다. 이하, 실시예 결과에서 하이드로겔이 형성된 경우를 Y로 표시하였으며, 하이드로겔이 형성되지 않은 경우를 N로 표시하였다. 또한, 하이드로겔을 벌크겔(Bulk gel)로도 표현하였다.
먼저 100kDa의 히알루론산과 0.6kDa ~ 35kDa의 PEG가 혼합된 조건에서 각각의 농도 및 전자선 조사선량에 따른 결과는 아래의 표와 사진으로 그 결과를 정리할 수 있다.
0.6kDa과 1kDa의 PEG에서는 실험을 진행한 모든 조건에서 Gel이 만들어지지 않음을 확인하였다.
Figure PCTKR2020009788-appb-img-000001
3kDa의 PEG를 이용한 실험에서는 전자선 조사선량이 50kGy부터 하이드로겔이 만들어지기 시작하였고, 히알루론산의 농도가 낮을수록 Gel이 더 잘 만들어지는 경향성을 확인하였다. 100kGy에서도 하이드로겔이 만들어졌으나 50, 200kGy에서 만들어지는 하이드로겔보다는 다소 더 점도가 높은 겔이 만들어지는 경향성 역시 각 조건에 해당하는 겔의 사진들을 통해서 확인할 수 있었다(도 1). 이와 같은 부분을 통하여 전자선 조사선량이 막연하게 증가함에 따라 가교결합이 증가하여 더 단단한 Gel이 만들어지지는 않는다는 사실을 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2020009788-appb-img-000002
10kDa의 PEG를 이용한 실험에서도 히알루론산의 농도가 낮을수록 더 낮은 전자선 조사선량(10kGy)에서 하이드로겔이 만들어지기 시작함을 확인할 수 있었고, 50, 100kGy에서는 하이드로겔이 만들어지나 200kGy에서는 다소 경도가 낮은 하이드로겔이 만들어지기에 전자선 조사선량이 증가함에 따라 막연히 가교결합이 증가하여 단단한 하이드로겔이 만들어지는 것이 아님을 다시 한 번 더 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2020009788-appb-img-000003
20kDa의 PEG를 이용한 실험에서는 히알루론산의 농도가 0.1%일때 5kGy 조사선량에서부터 경도가 다소 약하나 하이드로겔이 만들어지기 시작하였다. 또한 50, 100kGy에서는 하이드로겔이 만들어지나 200kGy에서는 다소 경도가 낮은 하이드로겔이 만들어지기에 10kDa PEG를 이용한 실험에 대한 결과와 동일한 경향성을 확인하였다(도 3).
Figure PCTKR2020009788-appb-img-000004
35kDa의 PEG를 이용한 실험에서도 20kDa의 PEG에 대한 결과와 마찬가지로 히알루론산의 농도가 0.1%일때 5kGy 조사선량에서부터 하이드로겔이 만들어지기 시작하였다.
히알루론산의 농도가 0.1%, 0.5%일 때 50, 100kGy에서는 경도가 단단한 하이드로겔이 만들어지나 200kGy에서는 경도가 약한 하이드로겔이 만들어짐을 확인하였다.
Figure PCTKR2020009788-appb-img-000005
한편, 일부 Gel이 잘 만들어지는 조건들을 선별하여 대량의 Gel을 한 번에 합성하는 실험도 진행하였고, 동일한 특성을 지닌 Gel을 소량이 아닌 대량으로도 손쉽게 합성할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 5).
앞서서는 1%로 농도를 고정한 채 서로 다른 분자량(0.6~35kDa)의 PEG와 함께 0.1, 0.5, 1%농도의 100kDa의 히알루론산이 혼합된 조건에서 실험을 진행하였으나 이번에는 반대로 100kDa 히알루론산의 농도를 1%로 고정한 채 분자량이 서로 다른 PEG의 농도를 0.1, 0.5, 1%로 바꿔가며 각 조건에서 Gel의 형성을 확인하는 실험을 진행하였다.
먼저 0.6kDa과 1kDa의 PEG에서는 실험을 진행한 모든 조건에서 Gel이 만들어지지 않음을 확인하였다.
Figure PCTKR2020009788-appb-img-000006
3kDa의 PEG를 이용한 실험에서는 1% 농도의 PEG가 함께 혼합된 조건에서만 Gel이 형성되었고, 그 중 100kGy와 200kGy 조사선량이 가해진 조건에서만 하이드로겔이 만들어짐을 확인하였다.
Figure PCTKR2020009788-appb-img-000007
10kDa의 PEG에서도 1% 농도의 PEG가 함께 혼합된 조건에서만 Gel이 형성되었고, 50, 100kGy로 조사된 샘플은 하이드로겔로 만들어졌으나 200kGy가 조사된 샘플은 경도가 다소 약한 하이드로겔이 만들어짐을 확인하였다.
Figure PCTKR2020009788-appb-img-000008
20kDa의 PEG에서도 1% PEG와 함께 혼합된 조건 중에서 50, 100kGy로 조사된 샘플은 하이드로겔로 만들어졌으나 200kGy가 조사된 샘플은 경도가 다소 약한 하이드로겔이 만들어짐을 확인하였으며, 10kDa PEG를 이용한 실험에 대한 결과와 동일한 경향성을 확인해볼 수 있었다.
Figure PCTKR2020009788-appb-img-000009
35kDa의 PEG에서도 1% PEG와 함께 혼합된 조건 중에서 10kGy가 조사된 샘플에서부터 경도가 다소 약한 하이드로겔이 만들어짐을 확인하였고, 50, 100kGy로 조사된 샘플은 하이드로겔로 만들어졌으나 200kGy가 조사된 샘플은 마찬가지로 경도가 다소 약한 하이드로겔이 만들어짐을 확인할 수 있었다.
이와 같은 결과를 정리해보면 1%의 100kDa 히알루론산과 혼합된 조건에서 전자선 조사를 통한 Gel 형성에는 PEG의 분자량에 따른 차이가 발생되나 그 보다 PEG의 농도가 1%임이 매우 중요한 요건임을 확인할 수 있었고, 10kDa 이상의 PEG가 혼합된 조건에서 200kGy에서는 하이드로겔의 경도가 다소 감소됨을 확인하였기에 전자선 조사선량이 증가함에 따라 막연히 가교결합이 증가하여 더 단단한 하이드로겔이 만들어지는 것이 아님을 다시 한 번 더 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2020009788-appb-img-000010
다음으로는 전자선 조사 에너지를 비교해보는 실험을 진행해보았다. 지금까지는 모두 전자선 조사에너지를 1 MeV로 고정하여 실험을 진행하였는데, 이를 2.5 MeV로 변경하고 그 이외의 조건을 동일하게 유지한 전자선 조사조건에서 Gel의 형성에 어떠한 차이를 나타내는지 확인해보기 위한 실험을 진행하였다.
먼저 0.6kDa PEG에서는 실험을 진행한 모든 조건에서 Gel이 만들어지지 않음을 확인하였다.
Figure PCTKR2020009788-appb-img-000011
다음으로 1kDa의 PEG를 이용한 실험에서 전자선 조사에너지 세기에 따른 차이를 확인해볼 수 있었는데, 1 MeV에서와 다르게 2.5 MeV에서 1% 농도의 1kDa PEG에 300kGy의 전자선 조사 시에 하이드로겔이 만들어짐을 확인하였다.
Figure PCTKR2020009788-appb-img-000012
3kDa의 PEG를 이용한 실험에서는 0.5% PEG를 활용한 모든 조건에서 Gel이 만들어지지 않았고, 1% PEG를 활용한 조건에서는 1 MeV와 2.5 MeV에서 모두 100kGy에서부터 하이드로겔이 만들어지는 동일한 경향성을 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2020009788-appb-img-000013
10kDa의 PEG를 이용한 실험에서도 0.5% PEG를 활용한 모든 조건에서 Gel이 만들어지지 않았고, 1% PEG를 활용한 조건에서는 1 MeV와 2.5 MeV에서 모두 50kGy에서부터 하이드로겔이 만들어지는 동일한 경향성을 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2020009788-appb-img-000014
20kDa의 PEG를 이용한 실험에서도 마찬가지로 0.5% PEG를 활용한 모든 조건에서 Gel이 만들어지지 않았으나, 1% PEG를 활용한 조건에서는 전자선 조사에너지 세기에 따른 차이를 확인해볼 수 있었는데, 1 MeV와는 다르게 2.5 MeV에서는 10kGy에서부터 하이드로겔이 만들어지는 차이를 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2020009788-appb-img-000015
35kDa의 PEG를 이용한 실험에서도 동일하게 0.5% PEG를 활용한 모든 조건에서 Gel이 만들어지지 않았으며, 1% PEG를 활용한 조건에서는 1 Mev와 2.5 MeV에서 모두 10kGy에서부터 하이드로겔이 만들어졌다. 그러나 2.5 MeV를 이용한 200, 300kGy에서 만들어지는 하이드로겔이 1MeV에서 만들어지는 하이드로겔 보다는 다소 더 경도가 있음을 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2020009788-appb-img-000016
위와 같은 결과들을 정리해보면 전자선 조사에너지의 세기가 증가함에 따라 더 샘플 깊숙하게 에너지가 전달됨으로써 더 Gel 형성이 용이하게 이루어진 것으로 예측해볼 수 있었다.
다음으로 분자량이 더 큰 2500kDa 히알루론산 1%를 이용하여 서로 다른 농도의 PEG와 혼합된 조건에서 5~200kGy 조사선량 범위에서 전자선 조사 실험을 진행하였다.
0.6kDa과 1kDa의 PEG에서는 실험을 진행한 모든 조건에서 Gel이 만들어지지 않음을 확인하였다.
Figure PCTKR2020009788-appb-img-000017
3kDa의 PEG를 이용한 실험에서는 1% PEG가 혼합되고 100kGy 조사된 조건에서 하이드로겔이 만들어짐을 확인하였고, 반면에 200kGy가 조사되었을 때에는 그 단단함이 다소 묽어진 하이드로겔이 만들어짐을 확인하였다. 전자선 조사선량이 증가한다고 하여 가교결합이 더 증가하여 단단한 하이드로겔이 만들어지지는 않음을 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2020009788-appb-img-000018
10kDa의 PEG에서도 1% PEG가 혼합된 조건에서만 Gel이 만들어졌지만, 앞서와는 다르게 50kGy 조사된 조건에서부터 하이드로겔이 만들어짐을 확인하였고, 100kGy와 200kGy에서도 모두 하이드로겔이 만들어짐을 확인하였다.
Figure PCTKR2020009788-appb-img-000019
20kDa의 PEG에서도 10kDa의 PEG가 혼합된 조건에서와 동일한 경향성으로 1%의 20kDa의 PEG가 혼합되고 50kGy 조사된 조건에서부터 하이드로겔이 만들어짐을 확인하였고, 100kGy와 200kGy에서도 모두 하이드로겔이 만들어짐을 확인하였다. 10kDa과 20kDa의 PEG는 전자선 조사실험 조건에서 큰 차이를 나타내지 않음을 확인하였다.
Figure PCTKR2020009788-appb-img-000020
35kDa의 PEG에서도 10kDa, 20kDa PEG에서의 결과와 유사하나 1%의 PEG가 혼합되어 10kGy이 조사된 조건에서부터 하이드로겔이 만들어지기 시작하였다. 따라서 혼합되는 PEG의 분자량이 증가함에 따라 더 낮은 전자선 조사선량에서부터 Gel이 만들어지기 시작함을 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2020009788-appb-img-000021
이와 같은 결과를 정리해보았을 때, 전반적으로 100kDa 히알루론산을 이용한 결과와 경향성은 거의 동일함을 확인할 수 있었고, 분자량이 훨씬 더 큰 2500kDa 히알루론산을 이용하더라도 1%의 PEG가 혼합된 조건에서만 Gel이 형성됨을 확인할 수 있었다. 또한 혼합되는 PEG의 분자량이 증가함에 따라 더 낮은 전자선 조사선량에서부터 Gel이 만들어지기 시작함 역시 확인할 수 있었다. 또한 3kDa의 PEG를 이용한 실험에서 100kGy 조사된 조건에서 하이드로겔이 만들어졌으나, 200kGy가 조사되었을 때에는 그 단단함이 다소 묽어진 하이드로겔이 만들어짐을 확인함으로써 앞선 실험들과 동일하게 단순히 전자선 조사선량이 증가함에 따라 가교결합이 증가하여 더 단단한 하이드로겔이 만들어지지는 않음을 다시 한 번 더 확인할 수 있었다.
실시예 2: 전자선 조사를 통해 형성된 HA-PEG 하이드로겔의 공극(pore) 관찰 및 수분 보유량 확인
전자선 조사를 통하여 만들어진 히알루론산-PEG 하이드로겔의 Pore size를 확인해보기 위하여 하이드로겔 샘플을 동결건조 진행하였고, Blade를 이용하여 절반으로 절단한 후 Osmium으로 코팅한 후 주사전자현미경 (SEM)을 통하여 구멍의 크기 및 두께를 확인해보았다. 주사전자현미경을 통한 분석실험에는 1% 100kDa의 히알루론산과 함께 1% 10kDa PEG, 20kDa PEG, 35kDa PEG에 100kGy, 200kGy를 조사하여 만들어진 히알루론산-PEG 하이드로겔을 사용하였다.
먼저 주사전자현미경을 통하여 1% 100kDa의 히알루론산과 혼합된 1% 10kDa PEG에 100kGy, 200kGy를 조사하여 만들어진 히알루론산-PEG 하이드로겔을 살펴보았을 때, 전자선 조사선량이 증가함에 따라 동결건조를 통하여 만들어진 샘플의 두께가 다소 더 얇아짐을 확인할 수 있었고, 구멍의 크기나 구멍을 형성하는 막들의 두께에는 큰 차이가 나타나지 않음을 확인할 수 있었다(도 6).
다음으로 1% 100kDa의 히알루론산과 혼합된 1% 20kDa PEG에 100kGy, 200kGy를 조사하여 만들어진 히알루론산-PEG 하이드로겔을 살펴보았고, 전자선 조사선량이 증가함에 따라 동결건조를 통하여 만들어진 샘플의 두께가 더 얇아짐을 한 번 더 확인해볼 수 있었다. 구멍의 크기도 다소 감소하고 구멍을 형성하는 막들의 두께는 다소 더 두꺼워짐을 확인하였다(도 7).
마지막으로 1% 100kDa의 히알루론산과 혼합된 1% 35kDa PEG에 100kGy, 200kGy를 조사하여 만들어진 히알루론산-PEG 하이드로겔을 확인하였고, 20kDa PEG에 대한 결과와 마찬가지로 전자선 조사선량이 증가함에 따라 동결건조된 샘플의 두께가 더 얇아짐을 확인해볼 수 있었고, 구멍의 크기도 감소하며 구멍을 형성하는 막들의 두께는 큰 차이가 나타나지 않음을 확인하였다(도 8).
다음으로는 동결건조를 진행하는 샘플의 양을 충분히 사용하여 그 두께를 충분히 두껍게 만든 다음 동일한 샘플에 대하여 동일한 방법을 통하여 주사전자현미경을 통하여 히알루론산과 함께 혼합되는 PEG의 분자량과 전자선 조사선량에 따른 차이를 확인해보기 위한 실험을 진행해보았다. 그 결과 혼합되는 PEG의 분자량이 증가할수록 구멍의 크기는 증가하는 경향성을 확인할 수 있었고, 또한 전자선 조사선량이 증가함에 따라 구멍의 크기는 감소하는 경향성을 뚜렷하게 확인할 수 있었다(도 9).
다음으로는 히알루론산-PEG 하이드로겔이 용매를 어느 정도 머금을 수 있는지 (Swelling)를 그 정도를 확인해보기 위한 실험을 진행해보았고, 1% 100kDa의 히알루론산과 1% 20kDa의 PEG에 100kGy의 전자선을 조사하여 만들어진 하이드로겔을 동결건조하여 동일한 크기로 일치시킨 후, 물, 생리식염수, PBS, DMSO, MeOH, DMF, EtOH, THF와 같은 여러 종류의 용매에 넣어 시간에 따라 각 용매를 어느 정도 머금게 되는지 그 크기 및 무게를 10시간까지 모니터링 해보았다. 그 결과 히알루론산-PEG 하이드로겔이 대부분의 용매를 빠르게 흡수하게 5분이내에 그 무게가 최대치에 도달하였으나 용매의 종류에 따라 그 차이가 발생하였는데, 다른 용매들보다 물에서 가장 높은 Swelling이 이루어짐을 확인할 수 있었고, 그 다음으로 생리식염수, PBS 순으로 Water base의 용매에서 히알루론산-PEG 하이드로겔의 Swelling 능력이 높게 나타남을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 히알루론산-PEG 하이드로겔에 포함된 히알루론산의 뛰어난 수분보유능력으로부터 기인한 결과로 예측되어진다(도 10).
실시예 3: HA-PEG 하이드로겔의 생체 내 분해도 확인
다음으로는 히알루론산-PEG 하이드로겔이 체내에서 분해되는 정도를 확인해보기 위한 실험을 진행해보았고, 1% 100kDa의 히알루론산과 1% 20kDa의 PEG, 1% 100kDa의 히알루론산과 1% 35kDa의 PEG에 100kGy의 전자선을 조사하여 만들어진 하이드로겔 2개를 가로, 세로 각각 1 cm로 절단한 후 C57BL/6J 마우스의 복강에 삽입하여 1 주일 후에 개복하여 분해된 정도를 확인해보았다(도 11).
그 결과 히알루론산과 함께 혼합된 PEG의 분자량에 따라 다소 분해된 정도가 다름을 확인해볼 수 있었다. 1 주일 후 삽입하였던 히알루론산-PEG 하이드로겔을 꺼내어 확인해보았을 때, 35kDa의 PEG와 혼합된 히알루론산-PEG 하이드로겔보다 분자량이 조금 더 작은 20kDa의 PEG와 혼합된 히알루론산-PEG 하이드로겔이 다소 더 빠르게 분해되어 그 크기가 감소되었음을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과를 통하여 히알루론산-PEG의 하이드로겔에 혼합된 PEG의 분자량이 작을수록 체내에서 더 빠르게 분해되는 경향성을 보일 것으로 예측해볼 수 있었다(도 12).
실시예 4: HA-PEG 하이드로겔의 생체 내 필러로서의 활용 가능성 확인
전자선 조사를 통하여 합성된 히알루론산-PEG 하이드로겔을 필러로 활용하기 위한 효능평가를 진행하기 위해 SD-rat을 활용하여 동물모델을 제작하였다. 가스 마취하에 SD-rat의 미간 부분의 털을 깨끗하게 제모하고 왼쪽과 오른쪽에 전자선을 조사하여 만들어진 샘플 종류를 서로 달리하여 각각 50 μL씩 29G 주사기를 이용하여 주사한 후, 사진을 통하여 두 샘플간의 효능을 비교해보았다.
먼저 1% 100kDa의 히알루론산과 1% 20kDa의 PEG, 1% 100kDa의 히알루론산과 1% 35kDa의 PEG에 200kGy의 전자선을 조사하여 만들어진 하이드로겔을 SD-rat의 이마 왼쪽과 오른쪽에 각각 주사하였다.
14일까지 계속하여 두 샘플이 모두 남아서 볼륨이 유지되는 결과를 확인해볼 수 있었지만, 두 샘플간에 그 정도의 차이가 뚜렷하게 나타나지는 않았다. 따라서 히알루론산과 함께 혼합되는 PEG의 분자량이 20kDa과 35kDa의 범위에서 만들어지는 하이드로겔의 필러로써의 효능은 유사함을 확인할 수 있었다(도 13).
그런 다음으로는 동일한 샘플을 다른 SD-rat 이마부위에 주입하여 한 번 더 그 결과를 확인해보며 3주간 모니터링을 진행해보았다. 그 결과 앞선 실험에서와 동일하게 14일까지는 뚜렷하게 두 샘플 모두에서 뚜렷하게 볼륨이 유지되지만 3주가 되었을 때는 처음 주입할 때보다 볼륨이 많이 감소하여 사진으로는 다소 뚜렷한 관찰이 힘들었지만 손으로 만졌을 때는 두 샘플에서 모두 볼륨이 다소 남아있음을 확인할 수 있었다. 반복된 실험에서도 그 히알루론산-PEG 하이드로겔의 필러로써의 효능을 다시 한 번 더 확인해볼 수 있었다(도 14).
다음으로는 임상에서 실제로 필러로 활용되어지고 있는 Restylane 회사의 Skinboosters라는 제품과 1% 100kDa의 히알루론산과 1% 35kDa의 PEG에 200kGy의 전자선을 조사를 통해 만들어진 히알루론산-PEG 하이드로겔을 비교해보는 실험을 진행해보았다. 그 결과 시간이 지남에 따라 두 샘플 모두 볼륨 유지되는 정도가 서서히 감소됨을 확인할 수 있었고, 3주까지 모니터링을 진행하였을 때 두 샘플의 볼륨이 모두 유지되었다. 기존에 활용되고 있는 필러제품들의 종류와 목적에 따라 필러의 효능 및 지속성이 다소 차이가 나겠지만 실험에 활용된 Restylane 회사의 Skinboosters 제품의 효능과 유사한 필러 효능을 지니고 있음을 확인하였다(도 15).
다음으로는 전자선 조사선량을 200kGy가 아닌 300kGy로 증가한 조건에서 만들어진 히알루론산-PEG 하이드로겔을 활용하여 필러로써의 효능을 확인해보았고, 그 결과 처음 주입할 때보다 볼륨이 서서히 감소하였으나 3주까지 모니터링을 진행하였을 때 두 샘플의 볼륨이 모두 유지됨을 확인할 수 있었다. 그러나 전자선 조사선량에 따라 만들어지는 히알루론산-PEG 하이드로겔의 탄성 및 단단한 정도가 다소 다르기에 200kGy를 활용한 샘플과 비교해 300kGy를 활용한 샘플에서는 필러로써 활용하기에 다소 부드럽지 않은 그로 인해 주입이 다소 뻑뻑한 차이가 나타났고 주입된 필러의 모양이 매끄러운 둥근 형태가 아니라 다소 일그러짐을 확인하였다(도 16).
전자선 조사 실험에 활용되는 히알루론산의 농도 및 PEG의 분자량을 달리하였을 때 만들어지는 히알루론산-PEG 하이드로겔을 활용하여서도 필러 효능 실험을 진행해보았다. 0.1% 혹은 0.5% 100kDa의 히알루론산과 1% 3kDa의 PEG에 100kGy와 200kGy의 전자선을 조사하여 만들어진 하이드로겔을 2 마리의 SD-rat의 이마에 각각 주사하였으나 필러로써의 효능이 부족하여 주입한 후 빠르게 그 볼륨이 감소됨을 확인할 수 있었고, 14일이 지난 후에는 거의 볼륨이 남아있지 않음을 확인하였다. 따라서 전자선 조사 실험에서 활용되는 적절한 히알루론산의 농도가 필요함을 확인할 수 있었다(도 17).
또한 전자선 조사 실험에 활용되는 히알루론산의 분자량을 2500kDa으로 바꾸어서 실험을 진행하였을 때에도 히알루론산-PEG 하이드로겔을 합성할 수 있었고, 이를 활용하여 필러효능 실험을 진행해보았을 때, 3주까지 샘플들의 볼륨이 모두 유지되며 100kDa의 히알루론산을 이용하여 만들어진 히알루론산-PEG 하이드로겔에서의 결과와 거의 유사함을 확인하였다(도 18).
물론 2500kDa 히알루론산을 이용한 히알루론산-PEG 하이드로겔 합성에서는 전자선 조사선량으로 100kGy를 사용하였기에 200kGy를 활용한 100kDa 히알루론산 기반의 히알루론산-PEG 하이드로겔과 명확한 대조는 힘들겠지만, 분자량이 더 크기에 필러로써의 효능이 더욱 우수할 것으로 예상되는 2500kDa 기반의 히알루론산-PEG 하이드로겔 역시 필러로써 활용이 충분히 가능함을 확인할 수 있었다.
또한 전자선을 조사하지 않은 히알루론산 + PEG 샘플과 같은 경우에는 SD-rat 이마에 주입한 지 하루만 지나더라도 빠르게 그 볼륨이 사라짐을 확인할 수 있었기에 필러로 활용하기 위하여 전자선 조사과정이 히알루론산과 PEG간의 가교결합을 통한 하이드로겔 형성에 꼭 필요함을 확인할 수 있었다(도 19).
그 다음으로 50kGy의 전자선 조사선량으로 생성된 하이드로겔의 필러로서의 효능을 평가해 보았다.
가스 마취하에 SD-rat의 미간 부분의 털을 깨끗하게 제모하고 1% 2500kDa의 히알루론산과 1% 35kDa의 PEG에 50kGy의 전자선을 조사하여 만들어진 벌크겔을 SD-rat의 이마 왼편과 오른편에 모두 100 μL씩 29G 주사기를 이용하여 주사하였다. 이후 총 90일까지 필러가 주입된 양쪽의 부피를 사진과 캘리퍼(caliper)를 이용하여 관찰한 결과, 처음 주사한 이후 그 부피가 1.8배정도까지 증가한 후 점차 그 부피가 감소하였으나 90일이 지난 후에도 처음 주사할 때 부피의 35%정도의 부피를 유지하고 있음을 확인할 수 있었다(도 20).
SD-rat 뿐만 아니라 C57BL 검정 마우스를 활용한 실험도 추가로 진행했다. 마우스 등 부분의 털을 깨끗하게 제모한 후 상기 제조한 벌크겔 샘플을 마우스 등 왼편과 오른편에 각각 100 μL씩 29G 주사기를 이용하여 주사하였다. 마찬가지로 90일 동안 모니터링을 진행한 결과, 90일이 지난 후에도 처음 주사할 때 부피의 59%정도의 부피를 유지하고 있음을 확인할 수 있었다(도 21).
추가로 임상에서 실제로 필러로 활용되고 있는 Restylane 회사의 Skinboosters라는 제품과 필러로서의 효능을 비교해보는 실험을 진행해보았다. BALB/c 마우스의 등쪽 부분의 털을 깨끗하게 제모한 후 제모한 등의 왼편에는 Restylane 회사 필러 제품을, 오른편에는 1% 2500kDa의 히알루론산과 1% 35kDa의 PEG에 50kGy의 전자선 조사를 통해 만들어진 벌크겔을 100 μL씩 주사하였다. 총 60일 동안 모니터링을 진행한 결과, 시간의 흐름에 따라 두 샘플 모두 볼륨이 서서히 감소됨을 확인할 수 있었고, 60일까지 두 샘플의 볼륨이 모두 유지됨을 사진을 통해서 확인할 수 있었다. 관찰 결과, 본 발명의 방법에 따라 제조된 벌크겔이 Restylane 회사의 제품보다 더 우수한 필러 효능을 나타내는 것으로 확인되었다(도 22).
실시예 5: HA-PEG 하이드로겔 창상피복제의 효능
본 발명에 따른 HA-PEG 하이드로겔의 창상피복재로써의 효능을 평가하기 위하여 먼저 창상실험 모델을 만들어주었다. 직경 8 mm biopsy punch를 이용해 BALB/c 누드 마우스 등 왼쪽과 오른쪽에 양쪽에 각각의 상처를 만든 후, 4 종류의 HA-PEG 하이드로겔 샘플을 상처 위에 올린 후 테이프로 드레싱해준 후, 3일마다 하이드로겔 샘플을 교체해주며 13일간 상처의 크기를 모니터링 하였다(도 23). 창상피복 효능 비교 실험에는 아무것도 처리하지 않은 Control 그룹을 대조군으로 두고 실험을 진행하였다.
3일 간격으로 하이드로겔 샘플을 교체해주며 상처의 크기를 확인하며 총 13일간 모니터링을 진행하였을 때, 각 실험그룹에서 상처치유 및 피부재생 정도를 관찰한 결과 HA-PEG #3과 HA-PEG #4의 하이드로겔을 처리한 그룹에서 상처치유 속도가 가장 빨랐고 13일차에 흉터의 크기가 작은 것을 확인할 수 있었다(도 24).
모니터링 기간 동안의 날짜별 각 그룹의 상처의 면적을 그래프로 정리해 보았을 때, 도 25에서 확인할 수 있는 바와 같이 HA-PEG #3과 HA-PEG #4의 하이드로겔을 처리한 그룹에서 Control 그룹 대비하여 13일차에 그 상처의 면적 및 흉터의 크기가 각각 1.65배, 2.3배 더 적게 남은 것을 확인할 수 있었다.
이와 같은 결과는, HA가 창상으로 인해 발생한 초기 염증반응에서 피브린(Fibrin) 과 혈병(Thrombus)과의 상호 작용을 통한 구조적 골격을 형성을 촉진하고 상처치료에 필수적인 세포의 이동을 용이하게 함과 동시에 육아조직 내에 망상구조(network)를 형성하여 세포의 증식 및 세포들의 조직화를 유도하며, 표피를 이루는 핵심적인 세포인 keratinocyte가 잘 자랄 수 있도록 도와주었기에 이와 같은 결과를 만들었다고 판단해볼 수 있었다.
상처면적 측정 이후 피부 조직을 적출하여 H&E staining을 통하여 피부조직의 두께를 측정해보았고, 그 결과 모든 HA-PEG 하이드로겔을 처리 그룹에서 Control 그룹 대비 더 얇은 피부두께를 확인할 수 있었는데, 피부의 두께가 두꺼울수록 콜라겐의 침착으로 인한 상처의 두께 및 형태가 불균일하게 나타나는 특성을 고려하였을 때 HA-PEG 하이드로겔이 피부의 콜라겐 침착을 막아 창상피복 효능을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 26).
본 발명의 하이드로겔은 전자빔을 통해 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜의 분자 간 및/또는 분자 내 가교결합을 유도함으로써 제조되기 때문에, 유기용매 또는 가교제의 혼입에 따른 인체 내 독성문제가 발생할 염려가 전혀 없고, 그 제조과정 중 별도의 정제과정이 필요치 않아 짧은 시간의 전자빔 조사만으로 대량 생산이 가능하여 생산성 측면에서도 매우 우수하다. 또한, 본 발명의 하이드로겔은 생체적합성이 매우 우수하기 때문에 세포전달체, 약물전달체, 유착방지제, 세포지지체, 치과용 충전제, 정형외과용 충전제, 창상피복제 또는 피부 충전제 등의 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.

Claims (14)

  1. 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)의 분자 간 가교결합(inter-molecular cross-linking), 분자 내 가교결합(intra-molecular cross-linking), 또는 분자 간 및 분자 내 가교결합만으로 형성된 하이드로겔.
  2. 제1항에 있어서, 상기 분자 간 가교결합 및 분자 내 가교결합은 방사선 조사에 의해 형성된 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
  3. 제2항에 있어서, 상기 방사선은 감마선, 자외선, X-ray 및 전자선으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
  4. 제1항에 있어서, 상기 하이드로겔은 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 하이드로겔:
    (a) 물에 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜을 첨가하여 용액을 제조하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 생성된 용액에 방사선을 조사하여 상기 물질의 가교결합을 유도하는 단계.
  5. 제4항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 분자량이 2 내지 50kDa이며, 0.6 내지 3%(w/v)의 농도로 물에 첨가되는 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
  6. 제4항에 있어서, 상기 히알루론산은 분자량이 50 내지 3000kDa이며, 0.05 내지 3%(w/v)의 농도로 물에 첨가되는 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
  7. 제4항에 있어서, 상기 방사선의 조사량은 2 내지 500kGy인 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
  8. 제4항에 있어서, 상기 방사선의 에너지 세기는 0.5 내지 20MeV인 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
  9. 하기 단계를 포함하는, 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)의 분자 간 가교결합(inter-molecular cross-linking), 분자 내 가교결합(intra-molecular cross-linking), 또는 분자 간 및 분자 내 가교결합만으로 형성된 하이드로겔의 제조방법:
    (a) 물에 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜을 첨가하여 용액을 제조하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 생성된 용액에 방사선을 조사하여 상기 물질의 가교결합을 유도하는 단계.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 하이드로겔을 포함하는 세포전달체, 약물전달체, 유착방지제, 세포지지체, 치과용 충전제, 정형외과용 충전제, 창상피복제 또는 피부 충전제.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 하이드로겔을 포함하는 시트형, 크림형, 겔형 또는 스프레이형의 창상피복제.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 하이드로겔을 유효성분으로 포함하는 창상 부위의 피부 도포용 조성물.
  13. 창상부위의 피부 도포용 제제를 제조하기 위한 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 하이드로겔의 용도.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 하이드로겔을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체의 피부에 도포하여 창상 부위를 치료하는 방법.
PCT/KR2020/009788 2019-07-24 2020-07-24 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 생체적합성 하이드로겔 WO2021015588A1 (ko)

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