KR20210012957A - 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 생체적합성 하이드로겔 - Google Patents

Abstract

본 발명은 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 생체적합성 하이드로겔에 관한 것으로, 보다 상세하게는 반응기, 화학 가교제 등의 첨가 없이 방사선 조사만으로 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜의 분자 간 및/또는 분자 내 가교결합을 유도하여 제조된 생체적합성 하이드로겔, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 하이드로겔은 전자빔을 통해 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜의 분자 간 및/또는 분자 내 가교결합을 유도함으로써 제조되기 때문에, 유기용매 또는 가교제의 혼입에 따른 인체 내 독성문제가 발생할 염려가 전혀 없고, 그 제조과정 중 별도의 정제과정이 필요치 않아 짧은 시간의 전자빔 조사만으로 대량 생산이 가능하여 생산성 측면에서도 매우 우수하다. 또한, 본 발명의 하이드로겔은 생체적합성이 매우 우수하기 때문에 세포전달체, 약물전달체, 유착방지제, 세포지지체, 치과용 충전제, 정형외과용 충전제, 창상피복제 또는 피부 충전제 등의 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 생체적합성 하이드로겔{Biocompatible hydrogel comprising hyaluronic acid and polyethylene glycol}

본 발명은 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 생체적합성 하이드로겔에 관한 것으로, 보다 상세하게는 반응기, 화학 가교제 등의 첨가 없이 방사선 조사만으로 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜의 분자 간 및/또는 분자 내 가교결합을 유도하여 제조된 생체적합성 하이드로겔, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

최근 주입형 하이드로겔은 의료분야에서 많은 관심을 받고 있는데, 의료용 충전제로부터 생리활성 물질의 방출 시스템, 삼차원 구조를 이용한 기관/조직재생 등 폭넓게 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 이러한 주입형 하이드로겔은 외과적인 수술과정 없이 주사기 등을 사용하여 간단하게 생체 내에 주입될 수 있다는 장점을 가지고 있다. 일반적으로 주입형 하이드로겔의 경우 체외에서는 유체와 같은 특성을 가지고 있어 주사기를 사용하여 이식이 가능하여야 하고, 조작의 편리성을 위한 유동성을 지녀야 하며, 체내에 주입하고 난 뒤 화학적인 가교나 물리적인 가교를 통해 그 형태가 흐트러지지 않고, 한 곳에서 겔화(gelation) 되어야 한다. 즉, 이식 후에는 세포나 약물의 지속적인 방출을 위한 약물전달시스템, 세포의 성장을 유지할 수 있는 지지체로서의 역할, 또는 피부 연조직 내에서 일정한 형태를 유지하여 미용 효과를 발휘할 수 있어야 한다.

한편, 이러한 하이드로겔은 일반적으로 고분자 물질에 가교제 및/또는 경화제 등의 화학물질을 첨가하여 가교하는 방법으로 제조되어 왔다. 그러나, 상기 가교반응에 사용되는 가교제 및/또는 경화제 자체가 생체에 유해하므로 이러한 가교제 및/또는 경화제를 사용하여 제조된 하이드로겔이 생체에 사용되는 경우에 유해한 작용을 일으킬 수 있는 문제가 있다. 특히, 이러한 하이드로겔은 의료 및 제약용 재료, 예를들어, 상처용 드레싱(wound dressings), 약물 전달 캐리어(drug delivery carrier), 콘택트 렌즈, 연골, 장 유착 방지제 등으로 사용하기 부적합하다. 또한, 가교제 및/또는 경화제가 사용되는 경우에는 하이드로겔 제조 후에 하이드로겔 내의 잔류 가교제 및/또는 경화제를 제거하여야 하므로 제조공정이 복잡할 뿐만 아니라 제조 비용이 상승되는 문제가 있다.

이에, 가교제 및/또는 경화제를 사용하지 않고도 고분자 유래 하이드로겔을 제조하기 위한 노력이 계속되고 있으며, 이러한 노력의 성과로 합성 고분자(synthetic polymer)에 방사선을 조사함으로써 하이드로겔을 제조한 성과가 보고된 바 있다.

하지만, 합성 고분자(synthetic polymer) 유래의 하이드로겔은 생체적합성(biocompatibility) 및 생분해성(biodegradable) 측면에서 의약학적인 용도로 활용되기에는 적합하지 않기 때문에, 가교제, 경화제, 유기용매 등을 사용하지 않고도 생체적합성 분자의 분자 내(intra-molecular) 또는 분자 간(inter-molecular) 가교결합에 의해서만 형성된 하이드로겔의 개발이 요구되고 있다.

한편, 히알루론산은 N-아세틸-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 구성된 반복단위가 선형으로 연결되어 있는 다당류의 일종으로서 생체고분자 물질이며, 동물의 안구를 채우고 있는 액체에서 처음으로 분리된[Meyer K. et al.,Journal of Biology and Chemistry 107 629-34 (1934)] 이래, 동물의 태반, 관절의 윤활액 (synovial fluid), 늑막액 (pleural fluid), 피부, 수탉의 벼슬 등에 많이 존재하는 것으로 알려져 있고, Streptococcus 속 미생물 Streptococcus equi, Streptococcus zooepidemecus 등에서도 생산된다.

히알루론산은 생체적합성이 우수하고 용액상태에서 높은 점탄성의 특성으로 화장품 첨가제 등의 화장품 용도뿐만 아니라 안과용 수술보조제, 관절기능 개선제, 약물전달 물질 및 점안제 등의 다양한 의약 용도에 대해서도 널리 사용되고 있다. 하지만, 히알루론산 자체만으로는 생체내 (in vivo) 또는 산, 알칼리 등의 조건에서 쉽게 분해되어 사용이 매우 제한적이기 때문에, 히알루론산 기반의 하이드로겔 제조에는 화학 가교제가 첨가되는 것이 일반적이다(WO2013/055832).

특히, 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 카르복시메틸스타치 등과 같은 생체적합성 고분자들은 방사선을 조사하여 겔을 형성할 수 있다는 것이 당업계에 잘 공지되어 있는 반면에(Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B 208 (2003) 320-324, Carbohydrate Polymers 112 (2014) 412-415, Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B 211 (2003) 533-544, Carbohydrate Polymers 55 (2004) 139-147, Carbohydrate Polymers 58 (2004) 109-113, Radiation Physics and Chemistry 81 (2012) 906-912 등), 히알루론산의 경우에는 방사선 조사에 의해 분자량이 작아지고, 점도가 감소되는 등 분해(degradation) 반응이 쉽게 일어나기 때문에(Journal of Radiation Industry 5 (2011) 159-164, Carbohydrate Polymers 79 (2010) 1080-1085, 한국 공개특허 제10-2008-0086016호 등), 방사선 조사를 통해 제조된 히알루론산 기반의 하이드로겔, 즉, 화학 가교제, 유기화학물질 등이 첨가되지 않고 방사선 조사만으로 제조된 히알루론산 기반의 하이드로겔은 아직까지 제공이 되고 있지 않다.

이에, 본 발명자는 화학 가교제, 유기화학물질 등을 사용하지 않고 방사선 조사만으로 제조된 히알루론산 기반의 생체적합성 하이드로겔을 제공하고자 예의 연구를 거듭한 결과, 또 다른 생체적합성 고분자인 폴리에틸렌글리콜을 함께 이용할 경우 특정 제조 조건에서 다양한 물성을 나타내는 히알루론산-폴리에틸렌글리콜 하이드로겔을 제조할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)의 분자 간 가교결합(inter-molecular cross-linking), 분자 내 가교결합(intra-molecular cross-linking), 또는 분자 간 및 분자 내 가교결합만으로 형성된 하이드로겔을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 하기 단계를 포함하는, 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)의 분자 간 가교결합(inter-molecular cross-linking), 분자 내 가교결합(intra-molecular cross-linking), 또는 분자 간 및 분자 내 가교결합만으로 형성된 하이드로겔의 제조방법을 제공하는 것이다: (a) 물에 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜을 첨가하여 용액을 제조하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 생성된 용액에 방사선을 조사하여 상기 물질의 가교결합을 유도하는 단계.

본 발명의 다른 목적은 상기 하이드로겔을 포함하는 세포전달체, 약물전달체, 유착방지제, 세포지지체, 치과용 충전제, 정형외과용 충전제, 창상피복제 또는 피부 충전제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 하이드로겔을 유효성분으로 포함하는 창상부위의 피부 도포용 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)의 분자 간 가교결합(inter-molecular cross-linking), 분자 내 가교결합(intra-molecular cross-linking), 또는 분자 간 및 분자 내 가교결합만으로 형성된 하이드로겔을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)의 분자 간 가교결합(inter-molecular cross-linking), 분자 내 가교결합(intra-molecular cross-linking), 또는 분자 간 및 분자 내 가교결합만으로 형성된 하이드로겔의 제조방법을 제공한다: (a) 물에 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜을 첨가하여 용액을 제조하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 생성된 용액에 방사선을 조사하여 상기 물질의 가교결합을 유도하는 단계.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 하이드로겔을 포함하는 세포전달체, 약물전달체, 유착방지제, 세포지지체, 치과용 충전제, 정형외과용 충전제, 창상피복제 또는 피부 충전제를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 하이드로겔을 유효성분으로 포함하는 창상부위의 피부 도포용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)의 분자 간 가교결합(inter-molecular cross-linking), 분자 내 가교결합(intra-molecular cross-linking), 또는 분자 간 및 분자 내 가교결합만으로 형성된 하이드로겔을 제공한다.

고분자를 이용하여 하이드로겔을 제조하는 방법에는 고분자의 가교결합을 유도하기 위하여 가교제가 이용이 되는 것이 일반적이다. 가교제를 이용하여 고분자의 가교결합을 유도하는 방법의 경우, 가교제가 고분자 간 또는 고분자 내의 결합을 매개하기 때문에 가교제가 하이드로겔 내부에 혼입되어 있을 수 있고, 가교제의 농도가 높아 활성상태로 반응물에 남아 있을 수 있거나, 또는 반응 후 남아 있는 미반응물이 존재하여 하이드로겔 제조공정 중 정제과정을 필수적으로 거쳐야 한다는 문제점이 있을 수 있다. 또한, 하이드로겔 내에 잔존하는 가교제는 체내에 투여된 후 여러 가지 부작용을 야기할 수 있다. 그러나, 본 발명자는 특정한 조건에서 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜의 혼합물에 전자빔을 조사함으로써 히알루론산 및/또는 폴리에틸렌글리콜의 분자간 또는 분자 내 가교결합이 유도되어 하이드로겔이 형성되는 것을 확인하였다. 분자 내부에 가교제나 물리적 가교를 위해 추가적으로 넣어준 금속 양이온과 같은 외부물질이 포함이 되어 있지 않고 오로지 히알루론산 및/또는 폴리에틸렌글리콜 자체의 결합에 의해서만 형성된 하이드로겔은 종래 보고된 바 없는 것으로 본 발명자가 본 발명을 통해 최초로 공개하는 것이다.

한편, 고분자 재료뿐만 아니라 모든 의료용 재료는 생체적합성을 반드시 필요로 하며, 이러한 생체적합성은 두 가지 면에서 의미를 구분할 수 있다. 넓은 의미의 생체적합성은 목적하는 기능과 생체에 대한 안전성을 겸비한 것을 말하며, 좁은 의미의 생체적합성은 생체에 대한 생물학적 안전성, 즉 독성이 없으며 멸균 가능한 것을 의미한다.

그런데, 본 발명의 상기 생체적합성 하이드로겔은 히알루론산 및/또는 폴리에틸렌글리콜의 분자 간 또는 분자 내 가교결합에 의해서만 형성이 되기 때문에 종래 방법에 따라 제조된 히알루론산 기반의 하이드로겔이 갖고 있는 상기 문제점들이 없고 전술한 생체적합성이 매우 우수하다는 장점이 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 하이드로겔을 제조하는 과정에서 일체의 유기용매가 사용되지 않고 수용액 상태에서 전자빔을 조사함으로써 제조가 가능하기 때문에, 제조과정에서 발생할 수 있는 오염이나 복잡한 공정이 요구되지 않아 산업적으로도 매우 활용도가 크다.

즉, 본 발명에서 제공하는 상기 하이드로겔은 히알루론산과 폴리에틸렌글리콜에 추가로 도입한 어떠한 기능기(functional group)도 결합되어 있지 않으며, 히알루론산과 폴리에틸렌글리콜 외에 어떠한 가교제도 가교결합에 직접 참여하거나 매개하고 있지 않은 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 생체적합성 하이드로겔의 원료가 되는 히알루론산은 이의 화학구조 내에 존재하는 다 기능성 기능기로 인해 약물 등의 담체(carrier)로서 활용가치가 매우 높을 뿐만 아니라, 생체적합성(biocompatibility) 및 생분해성(biodegradability) 등과 같은 물리화학적 특성으로 인해 의약학분야에서 합성 고분자보다 활용가능성이 더 우수하다(Materials Science and Engineering C 68 (2016) 964-981).

본 발명에서 상기 히알루론산은 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산과 히알루론산 염의 혼합물을 모두 포함하는 의미이다. 상기 히알루론산 염은 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 및 히알루론산 테트라부틸 암모늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 폴리에틸렌글리콜은 약물 전달 분야 및 조직공학에서 많은 장점을 가지고 있으며, 대표적으로 유기 용매에 높은 용해도를 가지며 비독성이고 면역 작용에 거부반응이 없어 뛰어난 생체적합성을 나타내며 약물 전달체로서 약물을 쉽게 포접, 방출할 수 있으며, 인체 내 사용에 있어서 미국 식품 의약 안전청에서 사용이 승인된 재료로서 제약 제제 산업에서 사용되고 있다. 또한, 폴리에틸렌글리콜은 친수성 고분자들 중에서 혈액 접촉에 사용되는 고분자의 생체적합성을 향상시키고 단백질 흡착 억제 효과가 가장 크기 때문에 생체 재료로서 많은 응용이 이루어지고 있다[J. H. Lee, J. Kopecek, and J. D. Andrade, J. Biomed. Mater. Res., 23 (1989) 351].

본 발명이 제공하는 상기 하이드로겔은 특히 하기 단계를 포함하는 방법에 의해서 제조된 것이 특징일 수 있다:

(a) 물에 히알루론산 및 폴리에틸린글리콜을 첨가하여 용액을 제조하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 생성된 용액에 방사선을 조사하여 상기 물질의 가교결합을 유도하는 단계.

본 발명자는 다양한 실시예를 통해서 방사선 조사를 통해 히알루론산과 폴리에틸렌글리콜의 분자 간 가교결합 및/또는 분자 내 가교결합만으로 이루어진 하이드로겔 제조조건을 확립하였다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 방사선 조사를 이용해 히알루론산과 폴리에틸렌글리콜의 분자 간 가교결합 및/또는 분자 내 가교결합을 유도하여 하이드로겔을 생성하기 위해서는 다양한 조건들의 조합이 매우 중요하다는 것이 확인되었다. 구체적으로, 히알루론산의 분자량/농도, 폴리에틸렌글리콜의 분자량/농도, 에너지 조사량 및 에너지 세기가 특정 조건을 만족하지 않을 경우 하이드로겔이 전혀 형성이 되지 않는다는 것이 확인되었다. 또한, 이들 조건들의 적절한 조절을 통하여 다양한 물성을 나타내는 하이드로겔의 제조도 가능하다는 것이 확인되었다.

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 분자량이 2 내지 50kDa인 폴리에틸렌글리콜이 0.6 내지 3%(w/v)의 농도로 물에 첨가가 된 경우에는, 함께 첨가되는 히알루론산의 농도 및 분자량과 관계없이 방사선 조사량과 세기의 조절의 통해서 다양한 물성의 하이드로겔이 형성이 되는 것이 확인되었다.

특히, 하이드로겔 제조에 사용된 폴리에틸렌글리콜의 분자량이 증가할수록 더 낮은 방사선 조사량 조건에서도 하이드로겔이 생성되는 경향성이 확인되었으며, 조사되는 방사선 에너지의 세기가 커질수록 더 낮은 농도의 폴리에틸렌글리콜 수용액 조건에서도 하이드로겔이 형성이 되는 것으로 확인이 되었다.

따라서, 본 발명의 상기 (a) 단계에서는 분자량이 2 내지 50kDa인 폴리에틸렌글리콜이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 3 내지 40kDa인 폴리에틸렌글리콜이 사용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 3 내지 35kDa인 폴리에틸렌글리콜이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 (a) 단계에서는 폴리에틸렌글리콜은 0.6 내지 3%(w/v)의 농도로 물에 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 0.8 내지 2%(w/v)의 농도로 물에 첨가될 수 있으며, 더 바람직하게는 0.8 내지 1.5%(w/v)의 농도로 물에 첨가될 수 있으며, 가장 바람직하게는 0.9 내지 1.2%(w/v)의 농도로 물에 첨가될 수 있다.

따라서, 본 발명의 상기 (a) 단계에서 사용되는 히알루론산의 분자량 및 수용액 내 히알루론산의 농도는 특별히 제한되는 것은 아니나 분자량 50 내지 3000kDa인 히알루론산이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 70 내지 2700kDa인 히알루론산이 사용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 100 내지 2500kDa인 히알루론산이 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 양태에서, 상기 (a) 단계에서 폴리에틸렌글리콜의 농도(w/v)는 히알루론산의 농도(w/v)와 동일하거나 큰 것을 특징으로 할 수 있다.

한편, 본 발명의 상기 (b) 단계에서는 상기 (a) 단계에서 생성된 용액에 방사선을 조사하여 상기 물질의 가교결합을 유도하는 단계이다.

상기 방사선 조사에 의해 성형되는 상기 하이드로겔은 화학적 방법에 의해 제조되는 하이드로겔에 존재하는 잔류 독성의 문제가 없고, 가교와 동시에 멸균효과를 얻을 수 있다는 장점이 있다. 이때, 사용되는 방사선은 감마선, 자외선, X-ray 및 전자선으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 전자선일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 (b) 단계에서 하이드로겔을 형성하기 위해 조사되는 방사선의 조사선량 및/또는 에너지 세기는 상기 (a) 단계에서 사용된 히알루론산의 분자량/농도 및 폴리에틸렌글리콜의 분자량/농도에 따라 달라질 수 있음이 확인되었다. 또한, 하이드로겔이 형성되는 조건이라고 하더라도 조사되는 방사선의 조사선량 및/또는 에너지 세기에 따라서 하이드로겔의 물성이 달라진다는 것이 확인되었다. 일정한 범위 내에서 방사선 조사선량이 증가할수록 더 단단한 성질의 하이드로겔이 형성이 되는 것으로 확인이 되었으나, 일정한 범위를 초과할 경우에는 오히려 하이드로겔 내부의 가교결합이 일부 절단되어 단단함 정도가 감소된 하이드로겔이 형성이 되는 것으로 확인이 되었다.

본 발명의 상기 (b) 단계에서 조사되는 방사선의 조사량 및 에너지 세기는 그 범위가 특별히 제한되는 것은 아니지만, 상기 방사선의 조사량은 바람직하게는 2 내지 500kGy 일 수 있으며, 더 바람직하게는 5 내지 300kGy일 수 있으며, 가장 바람직하게는 5 내지 200kGy일 수 있다. 또한, 상기 방사선의 에너지 세기는 0.5 내지 20Mev일 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 10Mev일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 1 내지 5Mev일 수 있으며, 가장 바람직하게는 1 내지 2.5Mev일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 하이드로겔을 제조하기 위한 구체적인 제조 조건, 즉, 히알루론산의 분자량/농도, 폴리에틸렌글리콜의 분자량/농도, 방사선 조사량 및 방사선 에너지 세기 조합의 실제적인 예시는 본원발명의 실시예에 구체적으로 제시되어 있다.

본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 히알루론산 및 폴리에틸린글리콜(polyethylene glycol, PEG)의 분자 간 가교결합(inter-molecular cross-linking), 분자 내 가교결합(intra-molecular cross-linking), 또는 분자 간 및 분자 내 가교결합만으로 형성된 하이드로겔의 제조방법을 제공한다:

(a) 물에 히알루론산 및 폴리에틸린글리콜을 첨가하여 용액을 제조하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 생성된 용액에 방사선을 조사하여 상기 물질의 가교결합을 유도하는 단계.

상기 제조방법의 각 단계에 대한 구체적인 설명은 전술한 바가 동일하게 적용될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 하이드로겔을 포함하는 세포전달체, 약물전달체, 유착방지제, 세포지지체, 치과용 충전제, 정형외과용 충전제, 창상피복제(시트형, 겔형, 스프레이형, 크림형 등) 또는 피부 충전제를 제공한다.

본 발명에서는 목적하는 용도에 따라 전술한 범위 내에서 제조조건을 변경함으로써 다양한 물성을 만족하는 하이드로겔을 제공할 수 있기 때문에 점탄성 및 생체 내 분해기간이 각 용도에 적합한 하이드로겔을 제공할 수 있다. 또한, 제조과정 중 일체의 화학 가교제 및 유기화학물질이 사용되지 않기 때문에 생체적합성이 매우 우수하여 다양한 용도에 활용이 될 수 있다.

생체적합성 하이드로겔은 세포전달체, 약물전달체, 유착방지제, 세포지지체, 치과용 충전제, 정형외과용 충전제, 창상피복제(시트형, 겔형, 스프레이형, 크림형 등) 또는 피부 충전제 등의 용도로 다양하게 활용이 되고 있으며, 이에 대한 연구도 당업계에서 활발하게 진행이 되고 있기 때문에 본 발명에서 제공하는 하이드로겔도 상기 용도로 활용이 될 수 있음은 통상의 기술자에게 자명한 것이다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 하이드로겔은 체내에서 일정한 기간 동안 그 부피와 형상을 유지하는 특성이 매우 우수하여 피부 충전제로서의 활용 가능성이 확인된 바 있다.

따라서, 본 발명의 하이드로겔은 바람직하게는 피부 내 dermis 층에 주입되어 주름을 개선하거나, 입술 윤곽 개선, 여드름 흉터 개선, 피부 함몰 부위 및/또는 흉터를 채우기 위한 용도 등 피부 충전제로서 유용하게 활용이 될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 세포전달체, 약물전달체, 유착방지제, 세포지지체, 치과용 충전제, 정형외과용 충전제, 창상피복제(시트형, 겔형, 스프레이형, 크림형 등) 또는 피부 충전제는 상기 하이드로겔 외에도 다양한 통상의 첨가물을 추가로 포함할 수 있다. 이들 첨가물은 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어, 염료, 착색 안료, 식물성 오일, 증점제, pH 조절제, 삼투압 조절제, 비타민, 항산화제, 무기염, 방부제, 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 마취제 등이 포함될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 하이드로겔을 유효성분으로 포함하는 창상부위의 피부 도포용 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 '창상 (wound)'이란 외부의 압력에 의하여 조직의 연속성이 파괴되는 상태를 의미한다. 창상에는 찰과상, 타박상, 열상, 칼날에 의한 절창 등이 포함된다.

상기 창상부위의 피부 도포용 조성물에는 상처의 치유를 도울 수 있는 공지된 약물, 소독제 등이 추가로 포함될 수 있고, 창상피복제로 제제화되어 시트형, 겔형, 스프레이형 또는 크림형 창상피복제로 활용이 될 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 창상부위의 피부 도포용 조성물에는 전술한 본 발명의 하이드로겔이 제한없이 포함될 수 있으나, 바람직하게는 분자량 500kDa 이상, 가장 바람직하게는 분자량 1000kDa 이상의 히알루론산을 이용하여 제조된 하이드로겔이 포함될 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 창상부위의 피부 도포용 조성물에는 전술한 본 발명의 하이드로겔이 제한없이 포함될 수 있으나, 바람직하게는 히알루론산과 폴리에틸렌글리콜의 농도비(w/v)가 1: 1 내지 4, 바람직하게는 1: 1 내지 3, 가장 바람직하게는 1: 1 내지 2인 하이드로겔이 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 하이드로겔은 전자빔을 통해 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜의 분자 간 및/또는 분자 내 가교결합을 유도함으로써 제조되기 때문에, 유기용매 또는 가교제의 혼입에 따른 인체 내 독성문제가 발생할 염려가 전혀 없고, 그 제조과정 중 별도의 정제과정이 필요치 않아 짧은 시간의 전자빔 조사만으로 대량 생산이 가능하여 생산성 측면에서도 매우 우수하다. 또한, 본 발명의 하이드로겔은 생체적합성이 매우 우수하기 때문에 세포전달체, 약물전달체, 유착방지제, 세포지지체, 치과용 충전제, 정형외과용 충전제, 창상피복제 또는 피부 충전제 등의 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 100kDa HA 및 3kDa PEG의 농도별 및 전자선 조사선량별 하이드로겔 형성 여부를 육안으로 관찰한 도면이다(Y: 하이드로겔 형성 / N: 하이드로겔 형성되지 않음).
도 2는 100kDa HA 및 10kDa PEG의 농도별 및 전자선 조사선량별 하이드로겔 형성 여부를 육안으로 관찰한 도면이다(Y: 하이드로겔 형성 / N: 하이드로겔 형성되지 않음).
도 3은 100kDa HA 및 20kDa PEG의 농도별 및 전자선 조사선량별 하이드로겔 형성 여부를 육안으로 관찰한 도면이다(Y: 하이드로겔 형성 / N: 하이드로겔 형성되지 않음)
도 4는 100kDa HA 및 35kDa PEG의 농도별 및 전자선 조사선량별 하이드로겔 형성 여부를 육안으로 관찰한 도면이다(Y: 하이드로겔 형성 / N: 하이드로겔 형성되지 않음)
도 5는 본 발명의 방법을 대량생산에 적용하였을 때에도 하이드로겔이 형성되는지 여부를 확인한 결과이다.
도 6 내지 도 9는 표시된 조건에서 형성된 하이드로겔의 공극 크기를 주사전자현미경으로 관찰한 도면이다.
도 10은 1% 100kDa의 HA과 1% 20kDa의 PEG에 100kGy의 전자선을 조사하여 만들어진 하이드로겔의 각 용매에 대한 흡수율을 평가한 결과이다.
도 11은 표시된 조건에서 형성된 하이드로겔을 동물의 복강에 삽입하여 1 주간 방치한 후 분해된 정도를 육안으로 관찰하기 위한 실험 방법을 나타낸 도면이다.
도 12은 표시된 조건에서 형성된 하이드로겔을 동물의 복강에 삽입하여 1 주간 방치한 후 분해된 정도를 육안으로 관찰한 도면이다.
도 13 내지 도 22는 표시된 조건에서 형성된 하이드로겔을 동물의 미간 또는 등에 주입한 후 기간의 경과에 따른 형태 유지 정도를 관찰함으로써 생체 내 필러로서의 활용 가능성을 육안으로 관찰한 결과이다.
도 23은 창상피복제로서의 효능을 평가하기 위해 표시된 조건에서 형성된 HA-PEG 하이드로겔 시트를 육안으로 관찰한 도면이다.
도 24는 창상 동물모델의 상처 부위에 본 발명에 따른 HA-PEG 하이드로겔 창상피복제를 드레싱한 후 시간의 경과에 따라 상처의 치유 정도를 육안으로 관찰한 결과이다.
도 25는 창상 동물모델의 상처 부위에 본 발명에 따른 HA-PEG 하이드로겔 창상피복제를 드레싱한 후 시간의 경과에 따라 상처의 면적을 측정하여 그래프로 나타낸 결과이다.
도 26은 창상 동물모델의 상처 부위에 본 발명에 따른 HA-PEG 하이드로겔 창상피복제를 드레싱하여 상처를 치유한 후, 치유된 피부의 두께를 측정한 결과이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 전자선 조사를 통한 히알루론산(HA)-폴리에틸렌글리콜(PEG) 하이드로겔(hydrogel)의 제조

본 발명자는 가교제의 첨가 없이 전자선 조사만으로 HA-PEG 복합 하이드로겔을 제조하고자 이하 다양한 조건에서 실험을 진행하였다. 이하, 실시예 결과에서 하이드로겔이 형성된 경우를 Y로 표시하였으며, 하이드로겔이 형성되지 않은 경우를 N로 표시하였다. 또한, 하이드로겔을 벌크겔(Bulk gel)로도 표현하였다.

먼저 100kDa의 히알루론산과 0.6kDa ~ 35kDa의 PEG가 혼합된 조건에서 각각의 농도 및 전자선 조사선량에 따른 결과는 아래의 표와 사진으로 그 결과를 정리할 수 있다.

0.6kDa과 1kDa의 PEG에서는 실험을 진행한 모든 조건에서 Gel이 만들어지지 않음을 확인하였다.

3kDa의 PEG를 이용한 실험에서는 전자선 조사선량이 50kGy부터 하이드로겔이 만들어지기 시작하였고, 히알루론산의 농도가 낮을수록 Gel이 더 잘 만들어지는 경향성을 확인하였다. 100kGy에서도 하이드로겔이 만들어졌으나 50, 200kGy에서 만들어지는 하이드로겔보다는 다소 더 점도가 높은 겔이 만들어지는 경향성 역시 각 조건에 해당하는 겔의 사진들을 통해서 확인할 수 있었다(도 1). 이와 같은 부분을 통하여 전자선 조사선량이 막연하게 증가함에 따라 가교결합이 증가하여 더 단단한 Gel이 만들어지지는 않는다는 사실을 확인할 수 있었다.

10kDa의 PEG를 이용한 실험에서도 히알루론산의 농도가 낮을수록 더 낮은 전자선 조사선량(10kGy)에서 하이드로겔이 만들어지기 시작함을 확인할 수 있었고, 50, 100kGy에서는 하이드로겔이 만들어지나 200kGy에서는 다소 경도가 낮은 하이드로겔이 만들어지기에 전자선 조사선량이 증가함에 따라 막연히 가교결합이 증가하여 단단한 하이드로겔이 만들어지는 것이 아님을 다시 한 번 더 확인할 수 있었다.

20kDa의 PEG를 이용한 실험에서는 히알루론산의 농도가 0.1%일때 5kGy 조사선량에서부터 경도가 다소 약하나 하이드로겔이 만들어지기 시작하였다. 또한 50, 100kGy에서는 하이드로겔이 만들어지나 200kGy에서는 다소 경도가 낮은 하이드로겔이 만들어지기에 10kDa PEG를 이용한 실험에 대한 결과와 동일한 경향성을 확인하였다(도 3).

35kDa의 PEG를 이용한 실험에서도 20kDa의 PEG에 대한 결과와 마찬가지로 히알루론산의 농도가 0.1%일때 5kGy 조사선량에서부터 하이드로겔이 만들어지기 시작하였다.

히알루론산의 농도가 0.1%, 0.5%일 때 50, 100kGy에서는 경도가 단단한 하이드로겔이 만들어지나 200kGy에서는 경도가 약한 하이드로겔이 만들어짐을 확인하였다.

한편, 일부 Gel이 잘 만들어지는 조건들을 선별하여 대량의 Gel을 한 번에 합성하는 실험도 진행하였고, 동일한 특성을 지닌 Gel을 소량이 아닌 대량으로도 손쉽게 합성할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 5).

앞서서는 1%로 농도를 고정한 채 서로 다른 분자량(0.6~35kDa)의 PEG와 함께 0.1, 0.5, 1%농도의 100kDa의 히알루론산이 혼합된 조건에서 실험을 진행하였으나 이번에는 반대로 100kDa 히알루론산의 농도를 1%로 고정한 채 분자량이 서로 다른 PEG의 농도를 0.1, 0.5, 1%로 바꿔가며 각 조건에서 Gel의 형성을 확인하는 실험을 진행하였다.

먼저 0.6kDa과 1kDa의 PEG에서는 실험을 진행한 모든 조건에서 Gel이 만들어지지 않음을 확인하였다.

3kDa의 PEG를 이용한 실험에서는 1% 농도의 PEG가 함께 혼합된 조건에서만 Gel이 형성되었고, 그 중 100kGy와 200kGy 조사선량이 가해진 조건에서만 하이드로겔이 만들어짐을 확인하였다.

10kDa의 PEG에서도 1% 농도의 PEG가 함께 혼합된 조건에서만 Gel이 형성되었고, 50, 100kGy로 조사된 샘플은 하이드로겔로 만들어졌으나 200kGy가 조사된 샘플은 경도가 다소 약한 하이드로겔이 만들어짐을 확인하였다.

20kDa의 PEG에서도 1% PEG와 함께 혼합된 조건 중에서 50, 100kGy로 조사된 샘플은 하이드로겔로 만들어졌으나 200kGy가 조사된 샘플은 경도가 다소 약한 하이드로겔이 만들어짐을 확인하였으며, 10kDa PEG를 이용한 실험에 대한 결과와 동일한 경향성을 확인해볼 수 있었다.

35kDa의 PEG에서도 1% PEG와 함께 혼합된 조건 중에서 10kGy가 조사된 샘플에서부터 경도가 다소 약한 하이드로겔이 만들어짐을 확인하였고, 50, 100kGy로 조사된 샘플은 하이드로겔로 만들어졌으나 200kGy가 조사된 샘플은 마찬가지로 경도가 다소 약한 하이드로겔이 만들어짐을 확인할 수 있었다.

이와 같은 결과를 정리해보면 1%의 100kDa 히알루론산과 혼합된 조건에서 전자선 조사를 통한 Gel 형성에는 PEG의 분자량에 따른 차이가 발생되나 그 보다 PEG의 농도가 1%임이 매우 중요한 요건임을 확인할 수 있었고, 10kDa 이상의 PEG가 혼합된 조건에서 200kGy에서는 하이드로겔의 경도가 다소 감소됨을 확인하였기에 전자선 조사선량이 증가함에 따라 막연히 가교결합이 증가하여 더 단단한 하이드로겔이 만들어지는 것이 아님을 다시 한 번 더 확인할 수 있었다.

다음으로는 전자선 조사 에너지를 비교해보는 실험을 진행해보았다. 지금까지는 모두 전자선 조사에너지를 1 MeV로 고정하여 실험을 진행하였는데, 이를 2.5 MeV로 변경하고 그 이외의 조건을 동일하게 유지한 전자선 조사조건에서 Gel의 형성에 어떠한 차이를 나타내는지 확인해보기 위한 실험을 진행하였다.

먼저 0.6kDa PEG에서는 실험을 진행한 모든 조건에서 Gel이 만들어지지 않음을 확인하였다.

다음으로 1kDa의 PEG를 이용한 실험에서 전자선 조사에너지 세기에 따른 차이를 확인해볼 수 있었는데, 1 MeV에서와 다르게 2.5 MeV에서 1% 농도의 1kDa PEG에 300kGy의 전자선 조사 시에 하이드로겔이 만들어짐을 확인하였다.

3kDa의 PEG를 이용한 실험에서는 0.5% PEG를 활용한 모든 조건에서 Gel이 만들어지지 않았고, 1% PEG를 활용한 조건에서는 1 MeV와 2.5 MeV에서 모두 100kGy에서부터 하이드로겔이 만들어지는 동일한 경향성을 확인할 수 있었다.

10kDa의 PEG를 이용한 실험에서도 0.5% PEG를 활용한 모든 조건에서 Gel이 만들어지지 않았고, 1% PEG를 활용한 조건에서는 1 MeV와 2.5 MeV에서 모두 50kGy에서부터 하이드로겔이 만들어지는 동일한 경향성을 확인할 수 있었다.

20kDa의 PEG를 이용한 실험에서도 마찬가지로 0.5% PEG를 활용한 모든 조건에서 Gel이 만들어지지 않았으나, 1% PEG를 활용한 조건에서는 전자선 조사에너지 세기에 따른 차이를 확인해볼 수 있었는데, 1 MeV와는 다르게 2.5 MeV에서는 10kGy에서부터 하이드로겔이 만들어지는 차이를 확인할 수 있었다.

35kDa의 PEG를 이용한 실험에서도 동일하게 0.5% PEG를 활용한 모든 조건에서 Gel이 만들어지지 않았으며, 1% PEG를 활용한 조건에서는 1 Mev와 2.5 MeV에서 모두 10kGy에서부터 하이드로겔이 만들어졌다. 그러나 2.5 MeV를 이용한 200, 300kGy에서 만들어지는 하이드로겔이 1MeV에서 만들어지는 하이드로겔 보다는 다소 더 경도가 있음을 확인할 수 있었다.

위와 같은 결과들을 정리해보면 전자선 조사에너지의 세기가 증가함에 따라 더 샘플 깊숙하게 에너지가 전달됨으로써 더 Gel 형성이 용이하게 이루어진 것으로 예측해볼 수 있었다.

다음으로 분자량이 더 큰 2500kDa 히알루론산 1%를 이용하여 서로 다른 농도의 PEG와 혼합된 조건에서 5~200kGy 조사선량 범위에서 전자선 조사 실험을 진행하였다.

0.6kDa과 1kDa의 PEG에서는 실험을 진행한 모든 조건에서 Gel이 만들어지지 않음을 확인하였다.

3kDa의 PEG를 이용한 실험에서는 1% PEG가 혼합되고 100kGy 조사된 조건에서 하이드로겔이 만들어짐을 확인하였고, 반면에 200kGy가 조사되었을 때에는 그 단단함이 다소 묽어진 하이드로겔이 만들어짐을 확인하였다. 전자선 조사선량이 증가한다고 하여 가교결합이 더 증가하여 단단한 하이드로겔이 만들어지지는 않음을 확인할 수 있었다.

10kDa의 PEG에서도 1% PEG가 혼합된 조건에서만 Gel이 만들어졌지만, 앞서와는 다르게 50kGy 조사된 조건에서부터 하이드로겔이 만들어짐을 확인하였고, 100kGy와 200kGy에서도 모두 하이드로겔이 만들어짐을 확인하였다.

20kDa의 PEG에서도 10kDa의 PEG가 혼합된 조건에서와 동일한 경향성으로 1%의 20kDa의 PEG가 혼합되고 50kGy 조사된 조건에서부터 하이드로겔이 만들어짐을 확인하였고, 100kGy와 200kGy에서도 모두 하이드로겔이 만들어짐을 확인하였다. 10kDa과 20kDa의 PEG는 전자선 조사실험 조건에서 큰 차이를 나타나지 않음을 확인하였다.

35kDa의 PEG에서도 10kDa, 20kDa PEG에서의 결과와 유사하나 1%의 PEG가 혼합되어 10kGy이 조사된 조건에서부터 하이드로겔이 만들어지기 시작하였다. 따라서 혼합되는 PEG의 분자량이 증가함에 따라 더 낮은 전자선 조사선량에서부터 Gel이 만들어지기 시작함을 확인할 수 있었다.

이와 같은 결과를 정리해보았을 때, 전반적으로 100kDa 히알루론산을 이용한 결과와 경향성은 거의 동일함을 확인할 수 있었고, 분자량이 훨씬 더 큰 2500kDa 히알루론산을 이용하더라도 1%의 PEG가 혼합된 조건에서만 Gel이 형성됨을 확인할 수 있었다. 또한 혼합되는 PEG의 분자량이 증가함에 따라 더 낮은 전자선 조사선량에서부터 Gel이 만들어지기 시작함 역시 확인할 수 있었다. 또한 3kDa의 PEG를 이용한 실험에서 100kGy 조사된 조건에서 하이드로겔이 만들어졌으나, 200kGy가 조사되었을 때에는 그 단단함이 다소 묽어진 하이드로겔이 만들어짐을 확인함으로써 앞선 실험들과 동일하게 단순히 전자선 조사선량이 증가함에 따라 가교결합이 증가하여 더 단단한 하이드로겔이 만들어지지는 않음을 다시 한 번 더 확인할 수 있었다.

실시예 2: 전자선 조사를 통해 형성된 HA-PEG 하이드로겔의 공극(pore) 관찰 및 수분 보유량 확인

전자선 조사를 통하여 만들어진 히알루론산-PEG 하이드로겔의 Pore size를 확인해보기 위하여 하이드로겔 샘플을 동결건조 진행하였고, Blade를 이용하여 절반으로 절단한 후 Osmium으로 코팅한 후 주사전자현미경 (SEM)을 통하여 구멍의 크기 및 두께를 확인해보았다. 주사전자현미경을 통한 분석실험에는 1% 100kDa의 히알루론산과 함께 1% 10kDa PEG, 20kDa PEG, 35kDa PEG에 100kGy, 200kGy를 조사하여 만들어진 히알루론산-PEG 하이드로겔을 사용하였다.

먼저 주사전자현미경을 통하여 1% 100kDa의 히알루론산과 혼합된 1% 10kDa PEG에 100kGy, 200kGy를 조사하여 만들어진 히알루론산-PEG 하이드로겔을 살펴보았을 때, 전자선 조사선량이 증가함에 따라 동결건조를 통하여 만들어진 샘플의 두께가 다소 더 얇아짐을 확인할 수 있었고, 구멍의 크기나 구멍을 형성하는 막들의 두께에는 큰 차이가 나타나지 않음을 확인할 수 있었다(도 6).

다음으로 1% 100kDa의 히알루론산과 혼합된 1% 20kDa PEG에 100kGy, 200kGy를 조사하여 만들어진 히알루론산-PEG 하이드로겔을 살펴보았고, 전자선 조사선량이 증가함에 따라 동결건조를 통하여 만들어진 샘플의 두께가 더 얇아짐을 한 번 더 확인해볼 수 있었다. 구멍의 크기도 다소 감소하고 구멍을 형성하는 막들의 두께는 다소 더 두꺼워짐을 확인하였다(도 7).

마지막으로 1% 100kDa의 히알루론산과 혼합된 1% 35kDa PEG에 100kGy, 200kGy를 조사하여 만들어진 히알루론산-PEG 하이드로겔을 확인하였고, 20kDa PEG에 대한 결과와 마찬가지로 전자선 조사선량이 증가함에 따라 동결건조된 샘플의 두께가 더 얇아짐을 확인해볼 수 있었고, 구멍의 크기도 감소하며 구멍을 형성하는 막들의 두께는 큰 차이가 나타나지 않음을 확인하였다(도 8).

다음으로는 동결건조를 진행하는 샘플의 양을 충분히 사용하여 그 두께를 충분히 두껍게 만든 다음 동일한 샘플에 대하여 동일한 방법을 통하여 주사전자현미경을 통하여 히알루론산과 함께 혼합되는 PEG의 분자량과 전자선 조사선량에 따른 차이를 확인해보기 위한 실험을 진행해보았다. 그 결과 혼합되는 PEG의 분자량이 증가할수록 구멍의 크기는 증가하는 경향성을 확인할 수 있었고, 또한 전자선 조사선량이 증가함에 따라 구멍의 크기는 감소하는 경향성을 뚜렷하게 확인할 수 있었다(도 9).

다음으로는 히알루론산-PEG 하이드로겔이 용매를 어느 정도 머금을 수 있는지 (Swelling)를 그 정도를 확인해보기 위한 실험을 진행해보았고, 1% 100kDa의 히알루론산과 1% 20kDa의 PEG에 100kGy의 전자선을 조사하여 만들어진 하이드로겔을 동결건조하여 동일한 크기로 일치시킨 후, 물, 생리식염수, PBS, DMSO, MeOH, DMF, EtOH, THF와 같은 여러 종류의 용매에 넣어 시간에 따라 각 용매를 어느 정도 머금게 되는지 그 크기 및 무게를 10시간까지 모니터링 해보았다. 그 결과 히알루론산-PEG 하이드로겔이 대부분의 용매를 빠르게 흡수하게 5분이내에 그 무게가 최대치에 도달하였으나 용매의 종류에 따라 그 차이가 발생하였는데, 다른 용매들보다 물에서 가장 높은 Swelling이 이루어짐을 확인할 수 있었고, 그 다음으로 생리식염수, PBS 순으로 Water base의 용매에서 히알루론산-PEG 하이드로겔의 Swelling 능력이 높게 나타남을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 히알루론산-PEG 하이드로겔에 포함된 히알루론산의 뛰어난 수분보유능력으로부터 기인한 결과로 예측되어진다(도 10).

실시예 3: HA-PEG 하이드로겔의 생체 내 분해도 확인

다음으로는 히알루론산-PEG 하이드로겔이 체내에서 분해되는 정도를 확인해보기 위한 실험을 진행해보았고, 1% 100kDa의 히알루론산과 1% 20kDa의 PEG, 1% 100kDa의 히알루론산과 1% 35kDa의 PEG에 100kGy의 전자선을 조사하여 만들어진 하이드로겔 2개를 가로, 세로 각각 1 cm로 절단한 후 C57BL/6J 마우스의 복강에 삽입하여 1 주일 후에 개복하여 분해된 정도를 확인해보았다(도 11).

그 결과 히알루론산과 함께 혼합된 PEG의 분자량에 따라 다소 분해된 정도가 다름을 확인해볼 수 있었다. 1 주일 후 삽입하였던 히알루론산-PEG 하이드로겔을 꺼내어 확인해보았을 때, 35kDa의 PEG와 혼합된 히알루론산-PEG 하이드로겔보다 분자량이 조금 더 작은 20kDa의 PEG와 혼합된 히알루론산-PEG 하이드로겔이 다소 더 빠르게 분해되어 그 크기가 감소되었음을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과를 통하여 히알루론산-PEG의 하이드로겔에 혼합된 PEG의 분자량이 작을수록 체내에서 더 빠르게 분해되는 경향성을 보일 것으로 예측해볼 수 있었다(도 12).

실시예 4: HA-PEG 하이드로겔의 생체 내 필러로서의 활용 가능성 확인

전자선 조사를 통하여 합성된 히알루론산-PEG 하이드로겔을 필러로 활용하기 위한 효능평가를 진행하기 위해 SD-rat을 활용하여 동물모델을 제작하였다. 가스 마취하에 SD-rat의 미간 부분의 털을 깨끗하게 제모하고 왼쪽과 오른쪽에 전자선을 조사하여 만들어진 샘플 종류를 서로 달리하여 각각 50 μL씩 29G 주사기를 이용하여 주사한 후, 사진을 통하여 두 샘플간의 효능을 비교해보았다.

먼저 1% 100kDa의 히알루론산과 1% 20kDa의 PEG, 1% 100kDa의 히알루론산과 1% 35kDa의 PEG에 200kGy의 전자선을 조사하여 만들어진 하이드로겔을 SD-rat의 이마 왼쪽과 오른쪽에 각각 주사하였다.

14일까지 계속하여 두 샘플이 모두 남아서 볼륨이 유지되는 결과를 확인해볼 수 있었지만, 두 샘플간에 그 정도의 차이가 뚜렷하게 나타나지는 않았다. 따라서 히알루론산과 함께 혼합되는 PEG의 분자량이 20kDa과 35kDa의 범위에서 만들어지는 하이드로겔의 필러로써의 효능은 유사함을 확인할 수 있었다(도 13).

그런 다음으로는 동일한 샘플을 다른 SD-rat 이마부위에 주입하여 한 번 더 그 결과를 확인해보며 3주간 모니터링을 진행해보았다. 그 결과 앞선 실험에서와 동일하게 14일까지는 뚜렷하게 두 샘플 모두에서 뚜렷하게 볼륨이 유지되지만 3주가 되었을 때는 처음 주입할 때보다 볼륨이 많이 감소하여 사진으로는 다소 뚜렷한 관찰이 힘들었지만 손으로 만졌을 때는 두 샘플에서 모두 볼륨이 다소 남아있음을 확인할 수 있었다. 반복된 실험에서도 그 히알루론산-PEG 하이드로겔의 필러로써의 효능을 다시 한 번 더 확인해볼 수 있었다(도 14).

다음으로는 임상에서 실제로 필러로 활용되어지고 있는 Restylane 회사의 Skinboosters라는 제품과 1% 100kDa의 히알루론산과 1% 35kDa의 PEG에 200kGy의 전자선을 조사를 통해 만들어진 히알루론산-PEG 하이드로겔을 비교해보는 실험을 진행해보았다. 그 결과 시간이 지남에 따라 두 샘플 모두 볼륨 유지되는 정도가 서서히 감소됨을 확인할 수 있었고, 3주까지 모니터링을 진행하였을 때 두 샘플의 볼륨이 모두 유지되었다. 기존에 활용되고 있는 필러제품들의 종류와 목적에 따라 필러의 효능 및 지속성이 다소 차이가 나겠지만 실험에 활용된 Restylane 회사의 Skinboosters 제품의 효능과 유사한 필러 효능을 지니고 있음을 확인하였다(도 15).

다음으로는 전자선 조사선량을 200kGy가 아닌 300kGy로 증가한 조건에서 만들어진 히알루론산-PEG 하이드로겔을 활용하여 필러로써의 효능을 확인해보았고, 그 결과 처음 주입할 때보다 볼륨이 서서히 감소하였으나 3주까지 모니터링을 진행하였을 때 두 샘플의 볼륨이 모두 유지됨을 확인할 수 있었다. 그러나 전자선 조사선량에 따라 만들어지는 히알루론산-PEG 하이드로겔의 탄성 및 단단한 정도가 다소 다르기에 200kGy를 활용한 샘플과 비교해 300kGy를 활용한 샘플에서는 필러로써 활용하기에 다소 부드럽지 않은 그로 인해 주입이 다소 뻑뻑한 차이가 나타났고 주입된 필러의 모양이 매끄러운 둥근 형태가 아니라 다소 일그러짐을 확인하였다(도 16).

전자선 조사 실험에 활용되는 히알루론산의 농도 및 PEG의 분자량을 달리하였을 때 만들어지는 히알루론산-PEG 하이드로겔을 활용하여서도 필러 효능 실험을 진행해보았다. 0.1% 혹은 0.5% 100kDa의 히알루론산과 1% 3kDa의 PEG에 100kGy와 200kGy의 전자선을 조사하여 만들어진 하이드로겔을 2 마리의 SD-rat의 이마에 각각 주사하였으나 필러로써의 효능이 부족하여 주입한 후 빠르게 그 볼륨이 감소됨을 확인할 수 있었고, 14일이 지난 후에는 거의 볼륨이 남아있지 않음을 확인하였다. 따라서 전자선 조사 실험에서 활용되는 적절한 히알루론산의 농도가 필요함을 확인할 수 있었다(도 17).

또한 전자선 조사 실험에 활용되는 히알루론산의 분자량을 2500kDa으로 바꾸어서 실험을 진행하였을 때에도 히알루론산-PEG 하이드로겔을 합성할

수 있었고, 이를 활용하여 필러효능 실험을 진행해보았을 때, 3주까지 샘플들의 볼륨이 모두 유지되며 100kDa의 히알루론산을 이용하여 만들어진 히알루론산-PEG 하이드로겔에서의 결과와 거의 유사함을 확인하였다(도 18).

물론 2500kDa 히알루론산을 이용한 히알루론산-PEG 하이드로겔 합성에서는 전자선 조사선량으로 100kGy를 사용하였기에 200kGy를 활용한 100kDa 히알루론산 기반의 히알루론산-PEG 하이드로겔과 명확한 대조는 힘들겠지만, 분자량이 더 크기에 필러로써의 효능이 더욱 우수할 것으로 예상되는 2500kDa 기반의 히알루론산-PEG 하이드로겔 역시 필러로써 활용이 충분히 가능함을 확인할 수 있었다.

또한 전자선을 조사하지 않은 히알루론산 + PEG 샘플과 같은 경우에는 SD-rat 이마에 주입한 지 하루만 지나더라도 빠르게 그 볼륨이 사라짐을 확인할 수 있었기에 필러로 활용하기 위하여 전자선 조사과정이 히알루론산과 PEG간의 가교결합을 통한 하이드로겔 형성에 꼭 필요함을 확인할 수 있었다(도 19).

그 다음으로 50kGy의 전자선 조사선량으로 생성된 하이드로겔의 필러로서의 효능을 평가해 보았다.

가스 마취하에 SD-rat의 미간 부분의 털을 깨끗하게 제모하고 1% 2500kDa의 히알루론산과 1% 35kDa의 PEG에 50kGy의 전자선을 조사하여 만들어진 벌크겔을 SD-rat의 이마 왼편과 오른편에 모두 100 μL씩 29G 주사기를 이용하여 주사하였다. 이후 총 90일까지 필러가 주입된 양쪽의 부피를 사진과 캘리퍼(caliper)를 이용하여 관찰한 결과, 처음 주사한 이후 그 부피가 1.8배정도까지 증가한 후 점차 그 부피가 감소하였으나 90일이 지난 후에도 처음 주사할 때 부피의 35%정도의 부피를 유지하고 있음을 확인할 수 있었다(도 20).

SD-rat 뿐만 아니라 C57BL 검정 마우스를 활용한 실험도 추가로 진행했다. 마우스 등 부분의 털을 깨끗하게 제모한 후 상기 제조한 벌크겔 샘플을 마우스 등 왼편과 오른편에 각각 100 μL씩 29G 주사기를 이용하여 주사하였다. 마찬가지로 90일 동안 모니터링을 진행한 결과, 90일이 지난 후에도 처음 주사할 때 부피의 59%정도의 부피를 유지하고 있음을 확인할 수 있었다(도 21).

추가로 임상에서 실제로 필러로 활용되고 있는 Restylane 회사의 Skinboosters라는 제품과 필러로서의 효능을 비교해보는 실험을 진행해보았다. BALB/c 마우스의 등쪽 부분의 털을 깨끗하게 제모한 후 제모한 등의 왼편에는 Restylane 회사 필러 제품을, 오른편에는 1% 2500kDa의 히알루론산과 1% 35kDa의 PEG에 50kGy의 전자선 조사를 통해 만들어진 벌크겔을 100 μL씩 주사하였다. 총 60일 동안 모니터링을 진행한 결과, 시간의 흐름에 따라 두 샘플 모두 볼륨이 서서히 감소됨을 확인할 수 있었고, 60일까지 두 샘플의 볼륨이 모두 유지됨을 사진을 통해서 확인할 수 있었다. 관찰 결과, 본 발명의 방법에 따라 제조된 벌크겔이 Restylane 회사의 제품보다 더 우수한 필러 효능을 나타내는 것으로 확인되었다(도 22).

실시예 5: HA-PEG 하이드로겔 창상피복제의 효능

본 발명에 따른 HA-PEG 하이드로겔의 창상피복재로써의 효능을 평가하기 위하여 먼저 창상실험 모델을 만들어주었다. 직경 8 mm biopsy punch를 이용해 BALB/c 누드 마우스 등 왼쪽과 오른쪽에 양쪽에 각각의 상처를 만든 후, 4 종류의 HA-PEG 하이드로겔 샘플을 상처 위에 올린 후 테이프로 드레싱해준 후, 3일마다 하이드로겔 샘플을 교체해주며 13일간 상처의 크기를 모니터링 하였다(도 23). 창상피복 효능 비교 실험에는 아무것도 처리하지 않은 Control 그룹을 대조군으로 두고 실험을 진행하였다.

3일 간격으로 하이드로겔 샘플을 교체해주며 상처의 크기를 확인하며 총 13일간 모니터링을 진행하였을 때, 각 실험그룹에서 상처치유 및 피부재생 정도를 관찰한 결과 HA-PEG #3과 HA-PEG #4의 하이드로겔을 처리한 그룹에서 상처치유 속도가 가장 빨랐고 13일차에 흉터의 크기가 작은 것을 확인할 수 있었다(도 24).

모니터링 기간 동안의 날짜별 각 그룹의 상처의 면적을 그래프로 정리해 보았을 때, 도 25에서 확인할 수 있는 바와 같이 HA-PEG #3과 HA-PEG #4의 하이드로겔을 처리한 그룹에서 Control 그룹 대비하여 13일차에 그 상처의 면적 및 흉터의 크기가 각각 1.65배, 2.3배 더 적게 남은 것을 확인할 수 있었다.

이와 같은 결과는, HA가 창상으로 인해 발생한 초기 염증반응에서 피브린(Fibrin) 과 혈병(Thrombus)과의 상호 작용을 통한 구조적 골격을 형성을 촉진하고 상처치료에 필수적인 세포의 이동을 용이하게 함과 동시에 육아조직 내에 망상구조(network)를 형성하여 세포의 증식 및 세포들의 조직화를 유도하며, 표피를 이루는 핵심적인 세포인 keratinocyte가 잘 자랄 수 있도록 도와주었기에 이와 같은 결과를 만들었다고 판단해볼 수 있었다.

상처면적 측정 이후 피부 조직을 적출하여 H&E staining을 통하여 피부조직의 두께를 측정해보았고, 그 결과 모든 HA-PEG 하이드로겔을 처리한 그룹에서 Control 그룹 대비 더 얇은 피부두께를 확인할 수 있었는데, 피부의 두께가 두꺼울수록 콜라겐의 침착으로 인한 상처의 두께 및 형태가 불균일하게 나타나는 특성을 고려하였을 때 HA-PEG 하이드로겔이 피부의 콜라겐 침착을 막아 창상피복 효능을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 26).

본 발명의 하이드로겔은 전자빔을 통해 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜의 분자 간 및/또는 분자 내 가교결합을 유도함으로써 제조되기 때문에, 유기용매 또는 가교제의 혼입에 따른 인체 내 독성문제가 발생할 염려가 전혀 없고, 그 제조과정 중 별도의 정제과정이 필요치 않아 짧은 시간의 전자빔 조사만으로 대량 생산이 가능하여 생산성 측면에서도 매우 우수하다. 또한, 본 발명의 하이드로겔은 생체적합성이 매우 우수하기 때문에 세포전달체, 약물전달체, 유착방지제, 세포지지체, 치과용 충전제, 정형외과용 충전제, 창상피복제 또는 피부 충전제 등의 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.

Claims (12)

1. 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)의 분자 간 가교결합(inter-molecular cross-linking), 분자 내 가교결합(intra-molecular cross-linking), 또는 분자 간 및 분자 내 가교결합만으로 형성된 하이드로겔.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 분자 간 가교결합 및 분자 내 가교결합은 방사선 조사에 의해 형성된 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 방사선은 감마선, 자외선, X-ray 및 전자선으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 하이드로겔은 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 하이드로겔:
   (a) 물에 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜을 첨가하여 용액을 제조하는 단계;
   (b) 상기 (a) 단계에서 생성된 용액에 방사선을 조사하여 상기 물질의 가교결합을 유도하는 단계.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 분자량이 2 내지 50kDa이며, 0.6 내지 3%(w/v)의 농도로 물에 첨가되는 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
   
6. 제4항에 있어서, 상기 히알루론산은 분자량이 50 내지 3000kDa이며, 0.05 내지 3%(w/v)의 농도로 물에 첨가되는 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
   
7. 제4항에 있어서, 상기 방사선의 조사량은 2 내지 500kGy인 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
   
8. 제4항에 있어서, 상기 방사선의 에너지 세기는 0.5 내지 20MeV인 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
   
9. 하기 단계를 포함하는, 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)의 분자 간 가교결합(inter-molecular cross-linking), 분자 내 가교결합(intra-molecular cross-linking), 또는 분자 간 및 분자 내 가교결합만으로 형성된 하이드로겔의 제조방법:
   (a) 물에 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜을 첨가하여 용액을 제조하는 단계;
   (b) 상기 (a) 단계에서 생성된 용액에 방사선을 조사하여 상기 물질의 가교결합을 유도하는 단계.
   
10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 하이드로겔을 포함하는 세포전달체, 약물전달체, 유착방지제, 세포지지체, 치과용 충전제, 정형외과용 충전제, 창상피복제 또는 피부 충전제.
    
11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 하이드로겔을 포함하는 시트형, 크림형, 겔형 또는 스프레이형의 창상피복제.
    
12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 하이드로겔을 유효성분으로 포함하는 창상 부위의 피부 도포용 조성물.

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