KR20190096946A - 지방 세포에 활성인 신규 조성물 - Google Patents

지방 세포에 활성인 신규 조성물 Download PDF

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KR20190096946A
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aqueous
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프레데릭 베르타이나
알렉상드르 게리
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바이오시스 파마슈티칼스
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Abstract

본 발명은 수성 키토산 조성물로서, 지방 세포의 부피 및/또는 수를 증가시키기 위해 사용되는, 상기 조성물의 전체 중량에 대하여 키토산 0.1 중량% 내지 5 중량%을 포함하는 수성 키토산 조성물에 관한 것이다.

Description

지방 세포에 활성인 신규 조성물
본 발명은 인간 및 선택적으로는 동물에 있어서 피부, 재생 의학 및 수복 수술(reparatory surgery), 특히 피부 노화방지를 위한 화장품 필러, 바이오물질, 생리학적 재건 물질에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 구체적으로는 지방 세포를 목표로 하는 수성 키토산 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 청구대상은 피부과용 또는 화장품용 조성물로서 또는 의료 기기로서, 유리하게는 생체흡수성 임플란트(bioresorbable implant)로서 사용하기 위한 상기 조성물이다.
특히 인간에 주사될 수 있는 다양한 필러 제품들이 이미 알려져 있다.
콜라겐은 오랫동안 얼굴, 특히 라인(line) 및 주름을 위한 또는 입술 보정을 위한 필러 제품으로 선택된 제품이었다. 하지만, 히알루론산이 출시된 이후로는 히알루론산이 가장 많이 사용되고 있다. 이는 콜라겐의 동물성 기원 (소 또는 돼지)와 관련하여 안전성 문제가 있고, 그의 생체분해성이 지나치게 빠르다는 판단도 더해있다. 히알루론산의 직접 주사는 생체적합성(biocompatibility) 때문에 가벼운(minor) 염증 반응과 관련된 즉각적인 필링의 효과를 갖는 이점이 있다. 그러나, 주사된 제품의 수명이 가교결합된 히알루론산의 이용에 의해 연장될 수 있는 경우에도 상기 제품의 주입은 빠른 생분해성을 갖고, 이로 인해 불만족스러운 제품이 된다. 그럼에도 불구하고, 미용 의약 및 수술에서 현재 가장 많이 사용되는 제품은 일반적으로 12개월 미만의 수명을 가지는 흡수성 제품들이다. 또한, 생체흡수에 수 년이 걸릴 수 있다는 점에서 "영구적"이라 지칭되는 제품을 또한 시중에서 찾을 수 있다. 이들 제품들은, 그 중에서도, 합성 또는 생합성 폴리머, 예를 들어 아크릴계 유도체(acrylic derivatives) 및 폴리아크릴아마이드(polyacrylamides)를 함유하고, 이들은 필링 수명이 긴 원인이 되는 유의한 섬유질 캡슐화(fibrous encapsulation)를 일으킨다. 그러나, 상기 조직에 주사된 제품의 지속성은 장기적인 혹은 지속적인 염증 현상에서 합병증, 예를 들면 주사 수 개월후, 또는 심지어는 수 년 후에 염증성 육아종(inflammatory granulomas), 낭포의 형성과 같은 위험성이 발생시킨다.
다른 합성 제품이 유리한 대안이 된다: 이는 PLA (폴리락트산)으로, 그의 생분해가 다른 천연 폴리머, 예를 들어 콜라겐 또는 히알루론산보다 더 느린 폴리머이다. 상기 필링은 주사후 최대 2년동안 지속되는 것으로 생각된다. 이들 제품들은 특히, New-Fill® (또는 Sculptra®) 상품명으로 시판된다. 이 기술과 관련된 주요 문제는 그 필링 효과가 8주 후에만 가시화된다는 것으로, 이는 환자들에게 완벽한 만족을 제공하지 못한다. 또한, 비-분해성 제품의 사용에서 관찰되는 섬유화는 장기적인 미적 효과 측면에서 큰 관심을 끌었고, 따라서, "반-영구적"으로 지칭되는 필러 제품이 개발되었으며, 이들은 이종의(heterogeneous) "입자-벡터(particle-vector)" 조성물을 통해 전-섬유(pro-fibrotic) 효과를 갖는 동시에 생분해성을 유지한다. 예로 히알루론산 중에 TCP (트리칼슘 포스페이트) 입자의 분산액을 제공하는 Atlean® 제품, 및 카복시메틸 셀룰로오즈 겔 중에 칼슘 하이드록시아파타이트 입자의 분산액을 제공하는 Radiesse® 제품이 언급될 수 있다. 모든 경우에, 상기 벡터 겔은 즉각적인 필링의 미적 효과를 제공하는 동시에, 상기 입자는 장기적인 효과를 보증하는 섬유증을 서서히 야기시킨다. 이들 제품의 이점은, 상기 이중 작용 메카니즘(기계적 및 조직 유도)과는 별도로, 이들이 결국에는 완전히 재흡수된다는 것이다.
이와 관련해서, 키토산은 이 분야에서 관심을 받아온 또 다른 분자이다. 이는, 키토산이 그의 독특한 생체모방성 화학 구조때문에 유기체에서 생물학적 환경을 위한 "유인물(decoy)"로서 행동하기 때문이다(A. Montembault, K. Tahiri, C. Korwin-Zmijowska, X, Chevalier, M. Corvol, A.Domard, Biochimie, 88 (2006), 551-64): 반면에, 이는 위험한 염증 반응을 야기하지 않는 것으로 충분히 "인식"되어 있으며, 또한, 지나치게 빨리 분해되지 않는다는 점에 대해서는 충분히 "인식되어 있지 않다".
상기 분자는 실제로, 연속된 N-아세틸-D-글루코사민 및 D-글루코사민 유닛으로 이루어져 있고, 전자는 세포외 매트릭스 분자의 구성성분(이 잔기는 예를 들면 히알루론산에서 발견된다)이고, 후자는 상기에는 존재하지 않으며, 따라서 키토산은 생물학적 관점에서는 분해되기가 더 어렵다. 또한, 키토산은 대식세포와 같은 몇몇 면역세포를 자극하는 것으로 문헌에서 알려져 있는데, 대식세포는 그의 존재하에 성장 인자의 양을 증가시킨다. 이들 성장 인자는 콜라겐 섬유소를 생산하는 세포인 섬유아세포의 증식 및 세포외 매트릭스의 생성을 촉진하는 생물학적 매개체이다. 따라서, 키토산은 섬유상 조직의 합성을 촉진하여, 장기적으로 "생물학적" 필링, 특히 인체 또는 얼굴에서의 피부 결함 또는 구멍(cavity), 예컨대 주름에 필링을 부여한다. 본 출원인은 전술한 출원에서 이미 키토산에 대해 면밀하게 검토하였으며, 이는 특허출원 WO 제2013/079646호의 청구대상이다.
전술한 진전에도 불구하고, 인간 및 선택적으로는 동물에 있어서 피부를 치료하고, 주름 및 라인의 필링 및 치료를 부여하며, 더욱 일반적으로는 노화-방지 작용 및/또는 생리학적인 피부 재건을 갖는 분자 및 수단이 여전히 필요하다. 또한, 수술 또는 질병에 따른 보다 큰 피부 함몰(skin depression)을 치료할 수 있는 상응하는 조성물이 당업자들에게 필요하다.
따라서, 완전히 놀랍게도, 본 출원인은, 현재까지 알려지지 않은 키토산의 특정한 수성 조성물이 사용될 때 피부 상에 예측하지 못한 추가적인 기술적 효과가 나타나는 것을 실현시켰다. 이는 보다 세심한 연구로 인해 키토산 용액이 상기 화합물의 특정 농도로 사용될 때 피부층에 존재하는 지방 세포에 대해 직접 작용하기 때문임을 밝혀내었다. 따라서, 이러한 치료를 받은 지방 세포는 제어된 방식으로 증식하고 팽윤하며, 주름 및 라인을 필링함으로써 피부가 탄력있게(firm)할 수 있거나 또는 피부 결함에 필링을 제공하게 하거나 또는 조직의 부피 재건을 가능하게 한다. 이러한 발견으로 인해, 본 출원인은 특히 지방 세포에 관심을 갖게 되었다. 따라서, 여러 논점이 출원인에 의해 밝혀졌다. 우선, 본 출원인은 다른 효과가 사라지지 않도록 하는 과도하게 높은 농도의 키토산이 지방 세포에 대해 독성일 수 있음을 인지하였다. 또한, 본 출원인은 수성 조성물 중 세포외 매트릭스 구성성분 적어도 1종이 존재하는 경우에 상기 지방 세포의 지방산 포획을 증가시킬 수 있음을 밝혀냈다. 생체내에서, 본 발명에 따른 키토산 조성물은 콜라겐 섬유소 합성을 유도한다. 본 출원인에 의해 취합된 정보에 따르면, 상기 세포외 매트릭스의 구성성분 (또는 대체물) 적어도 1종을 추가하면 키토산 작용을 강화시킬 수 있다.
따라서, 본 출원인은 피부(피하) 수준에서 지방 세포에 직접 작용하는 수성 조성물이 피부 치료 및 재건 수술 분야에서 당업계에 독창적인 기술적 해결책을 추가할 수 있음을 제시한다.
본 발명의 청구대상은 수성 키토산 조성물로서, 지방 세포의 부피 및/또는 수를 증가시키기 위해 사용하기 위한, 상기 조성물의 전체 중량에 대하여 키토산 0.1 중량% 내지 5 중량%을 포함하는 수성 키토산 조성물에 관한 것이다.
특히, 이와 같이 수득된 지방 세포의 부피 및/또는 수의 증가는 피부 노화를 치료 또는 방지하기 위해, 주름과 같은 피부 결함에서의 필링을 위해 또는 피부 또는 피하 조직의 리페어(repair) 또는 재건을 위해 사용된다.
도 1a 및 도 1b은 3T3L1의 증식에 대한 효과를 보여준다.
도 2a, 도 2b 및 도 2c은 지방 세포 분화 동안에 3T3L1 세포에 의한 올레산 저장에 대한 키토산 농도의 영향을 보여준다.
도 3은 콜라겐 및 피브로넥틴과 결합된 키토산을 포함하는 배합물 및 키토산 조성물에서 3T3L1s의 지방소립(n > 10000)의 분포를 보여준다.
즉, 본 발명의 청구대상은 지방 세포의 부피 및/또는 수를 증가시키기 위해 상기 조성물의 전체 중량에 대해 키토산 0.1 중량% 내지 5 중량%을 포함하는 수성 키토산 조성물의 용도이다.
이는, 본 발명에 따른 주사 또는 임플란트 도입이 상기 조성물의 원래 부피에 의해 피부 또는 피하 수준에서의 부피를 실제로 필링하는 사실과는 별개로, 본 발명에 따른 조성물이 상기 조성물 주위의 지방 세포에 작용함으로써 국소적인 팽윤을 야기하기 때문이다. 따라서, 본 발명에 따른 수성 조성물이 주름 또는 라인과 같은 신체 또는 얼굴에 있는 구멍을 필링하기 위해, 얼굴 또는 인체의 부피를 새롭게 형성 또는 증가시키기 위해, 또는 피부를 치유하기 위해 사용될 수 있다.
지방 세포는 상기 지방 조직에 존재하는 동물세포인 것으로 통상적으로 알려져 있으며, 지방 저장에 특화되어 있다. 또한, 지방 세포는 내장 조직(visceral tissue) 및 하피(hypodermis)에 함유되어 있는데, 하피는 피부의 심부층으로, 지방조직을 다소 함유하며, 진피 및 그 아래에 위치한 유동성 구조물(장기, 근육 등)간의 계면으로 작용한다. 따라서, 상기 피하 지방 세포는 피부 표면으로부터 깊이 몇 밀리 내지 몇 센티까지의 다양한 깊이에 위치한다. 바람직하게, 본 발명 관련하여 "지방 세포"는 인간의 지방 세포를 의미한다.
본 발명의 청구대상은 또한 지방 세포의 부피 및/또는 수를 증가시키기 위한 피부과적 조성물 또는 의료 기기로서, 유리하게는 생체흡수성 또는 부분적 생체흡수성 임플란트로서 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 수성 조성물에 관한 것이다.
"생체흡수성(bioresorbable)" 또는 "생체흡수(bioresorption)"는 주사된 제품이 전체 또는 거의 전체가 분해되는 생분해를 의미한다. 유리하게, 본 발명에 따르면, 상기 수성 조성물은 양호한 생체적합성을 갖고 생체흡수성이다. 특히, 본 발명에 따른 제품은 장기간 필링 효과와 같은 장기 효과를 위해 가교결합된 히알루론산 유형의 히알루론산 기반의 제품보다 더 긴 생체흡수 지속기간을 갖는다.
본 발명의 또 다른 청구대상은 조성물의 전체 중량에 대해 키토산 0.1 중량% 내지 5 중량%를 포함하는 수성 키토산 조성물의 지방 세포에 대한 독성을 감소시키기 위해 세포외 매트릭스의 구성성분 적어도 1종 및/또는 세포외 매트릭스의 대체물 적어도 1종을 사용하는 것이다.
키토산
본 발명의 청구 대상은 수성 키토산 조성물이다.
"수성 조성물"은 물 적어도 1 중량%, 유리하게는 물 적어도 50 중량%, 더욱 더 유리하게는 물 적어도 80 중량%를 포함하는 조성물을 의미한다.
본 발명에서 일반적으로 %는, 구체적으로 명시되지 않은 경우에, 해당 조성물의 전체 중량에 대한 중량%에 해당한다.
바람직하게, 본 발명에 따른 키토산의 수용성 조성물은 8.5 미만의 pH, 유리하게는 4 내지 7.6의 pH를 갖는다. 그러나, 생리학적 pH(6.8 내지 7.4)에 있는 조직에 상기 키토산 조성물을 직접 주사하고자 할 때에는 주사된 배합물의 산성도로 인한 조직 괴사를 피하기 위해 가능한 한 생리학적 pH에 근접한 pH를 갖는 조성물을 사용하는 것이 바람직할 것이다. 본 발명에 따른 특정 실시양태에서, 상기 용액의 pH는 5.5 이상이고, 유리하게는 5.5 내지 7.5, 바람직하게는 6.2 내지 6.8 이다.
본 발명에 따른 수성 조성물은 유리하게는 키토산 수용액, 겔화 키토산 수용액 또는 수성 키토산 겔이다.
"용액"은, 본 발명의 의미 내에서, 겔화된 조성물과 반대되게, 액체 형태의 조성물을 의미한다. 용액은 적어도 2종의 화합물을 함유하는 액상(liquid phase)을 갖는다. "수용액"은 물 적어도 1 중량%, 유리하게는 물 적어도 50 중량%, 더욱 더 유리하게는 물 적어도 80 중량%을 포함한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 수용액은 선택적으로 다른 화합물과 함께 주로 물을 포함한다. 유리하게, 본 발명에 따른 수용액은 키토산 수용액이다.
유리하게, 본 발명에 따른 수용액은 균질한 키토산 수용액이다. "균질한 키토산 수용액"은, 본 발명의 의미 내에서, 모든 키토산 폴리머가 가용화되고 상기 용액이 액상의 현탁액 중에 임의의 고형 키토산 입자를 함유하지 않음을 의미한다. 이렇게 형성된 수용액은 적어도 전술한 비율의 물 및 키토산을, 선택적으로 다른 화합물과 함께 포함한다. 본 발명에 따른 균질한 키토산 수용액은 전형적으로 투명하다.
본 발명에 따른 수성 치토산 조성물은 겔을 형성하는 데 사용될 수 있다.
"겔" 관련하여, 겔은 손실 모듈러스보다 큰 저장 모듈로스를 갖는 물체(body)인 것으로 받아들여질 수 있다 [cf. H.H. Winter, F. Chambon, Analysis of linear viscoelasticity of a crosslinking polymer at the gel point, J.Rheol., 30 (1986), pp. 367-382]. 상기 물체의 안정성과 일체성(integrity)은 비-공유 상호작용(물리적 겔) 또는 공유 화학적 가교결합(화학 겔)에 의해 유지된다.
상기 겔은 예를 들어 pH 또는 온도의 변화에 의해 당업계에 알려진 임의의 기법에 의해 형성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 수성 조성물은 pH 6 내지 9, 유리하게는 pH 6.5 내지 8.5, 더욱 유리하게는 pH 7 내지 8 에서 겔화된다.
바람직하게, 상기 키토산 수용액(균질 여부 불문)을 먼저 준비한 후에 겔화한다.
"겔화" 수성 키토산 조성물 또는 용액은, 본 발명과 관련하여, 상기에서 정의된 수성 키토산 조성물 또는 용액을 의미하며, 특히 생물학적 매개체 내로 주사ㄷ될 때 수성 키토산 겔을 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 하나의 청구 대상은 전술한 바와 같은 수성 조성물 또는 용액으로부터 수득된 겔에 관한 것이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 겔은 본원에 기재된 바와 같은 조성물에 혼입되기 전에 형성된다.
본 발명에 따른 또 다른 특정 실시양태에서, 상기 겔은 조성물에 혼입된 후에 형성된다. 이는 상기 pH를 변경함(생리학적 pH, 즉 pH 6.8 내지 7.8, 바람직하게는 pH 7.4 ± 0.2로 변화시킴)으로써 수행될 수 있다.
특히 유리하게, 본 발명에 따른 수성 조성물은 전형적으로 피내, 피하 또는 복강내 주사에 의해 인체 또는 동물 체내에 주사될 수 있다. 상기 조성물은 무균 주사기와 같은 주사기에 포장될 수 있다.
따라서, 상기 수성 조성물은 양호한 주사성(주사기 바늘을 통한 만족스러운 흐름)과 주사 용이성을 제공하기에 적합한 점도를 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 수성 조성물은 예를 들어 고압살균(autoclaving)에 의해 주사 전에 무균화된다.
따라서 발명에 따른 조성물은 피내 주사에 의해 또는 피하 또는 복강내 주사주사에 의해 투여될 수 있도록 배합될 수 있다.
피내 주사는 표피 바로 아래에 위치한 피부 진피에 화합물을 투여하는 것이다. 피하주사는 해당 분자를 주사하기 위해 피부의 피하층 내로 바늘을 도입하는 것으로 이루어진다. 복강내 주사는 복강내 복막 위에, 즉 내장지방 조직에 위치한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 수성 조성물은 피부 함몰(skin depression)을 치료하기 위한 임플란트에 함유되거나 또는 상기 임플란트로 이루어진다. 이는 적은 부피(즉, 상기 조성물의 밀도에 따라 약 5 g에 해당하는 5 mL 이하)의 피부 함몰의 경우일 수 있고, 그렇지 않으면 적은 부피의 주사에 의해서는 필링이 이루어질 수 없다. 이는 예를 들어, 사고 또는 질병 이후에(예: 유방성형술, 급성 지방이영양증(lipodystrophy), 급성 지방이상증, 소아마비염 이후의 필링 치료) 수복 수술에서 장기 또는 조직의 절제를 필링하는 경우이다.
본 발명의 특정 특징에 따르면, 상기 키토산 조성물은 한번 주사되면 전형적으로 수 주 내지 수 개월, 예를 들어 약 3 내지 4주부터 최대 12 내지 18개월의 긴 재흡수 시간을 갖는다. 본 발명에 따른 수성 조성물로 이루어지거나 또는 상기 수성 조성물을 함유하는 제품 또는 바이오물질은 식품 산업 및 치유 드레싱 업계에서 잘 알려진 키토산의 세균- 및 정진균성(fungistatic) 특징으로부터 이익을 갖는다. 상기 특성은 제품의 저장을 용이하게 하며, 전술한 다른 제품의 장기적 염증 현상 또는 주사와 관련된 감염 위험을 제한하는데 도움이 된다. 함몰의 필링 또는 부피 재건을 위해 본 발명에서 사용되는 천연 분자(콜라겐, 히알루론산)와 비교할 때, 키토산은 상기 특성을 갖는 유일 물질이다. 또한, 본 발명에 따른 수성 조성물로 이루어지거나 또는 상기 수성 조성물을 함유하는 제품 또는 바이오물질은 유리하게는 즉각적인 효과적인 생물학적 필링을 제공한다. 또한, 키토산은 자연 메카니즘을 자극함으로써 콜라겐 합성을 촉진하고 주름과 같은 피부 결함을 필링할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 수성 조성물은 유리하게, 주사 후에 결정질 키토산 입자를 형성할 수 있다. 이는, 이러한 방식으로 WO 제2013/07964호에 이미 기재된 효과가 본 발명에 관련된 효과와 함께 누적되기 때문이다.
키토산
본 발명에 따른 조성물은 키토산 적어도 1종을 포함한다.
키토산은 바이오매스에 셀룰로오스만큼 널리 분포하는 다당류인 키틴(chitin)의 N-디아세틸화(N-deacetylation)에 의해 일반적으로 수득되는 아미노-다당류이다. 키틴은, 특히, 절지동물 껍질, 두족류 내골격, 및 균류, 효모 또는 조류의 세포벽에 존재한다. 유리하게, 본 발명에 따르면, 키토산은 동물 공급원, 예를 들면 게, 새우 또는 오징어 타입의 갑각류 동물, 또는 식물성 공급원, 예를 들면 균류 또는 조류에서 유래하는 천연 제품이다. 키토산 및 키틴은 2-아세트아미도-2-디옥시-D-글루칸 및 2-아미노-2-디옥시-D-글루칸 각각의 선형 코폴리머이다. N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine, GlcNAc) 및 D-글루코사민(D-glucosamine, GlcN)) 유닛이 보다 통상적으로 지칭되는 것이고, 글리코사이드 β(1→4) 결합에 의해 결합된다. 키틴 및 키토산은 아세틸화도(DA)로도 지칭되는, 상기 코폴리머 내에 존재하는 GlcNAc 유닛의 몰분율(%로 표기)에 의해 구별된다.
키토산 및 키틴의 화학 구조식은 아세틸화도(DA)에 따라 하기에 개략적으로 도시되어 있다:
Figure pct00001
상기 DA는 하기 식으로 계산되되, nGlcNAc = 아세틸화된 유닛의 개수이고, nGlcN = 탈아세틸화된 유닛의 개수이다:
Figure pct00002
상기 DA는 현재 시행중인 기준에 따라 측정되어야 한다(즉, "Standard Guide for Characterization and Testing of Chitosan Salts as Starting Materials Intended for Use in Biomedical and Tissue-Engineered Medical Product Applications, Book of Standards Volume: volume 13.01; ASTM-F2103").
유리하게, 본 발명에 따르면, 키토산은 아세틸화도(DA) 30 % 미만, 더욱 더 유리하게는 20 % 이하, 예를 들면 15 % 미만을 갖는다. 바람직하게, 본 발명에 따른 키토산은 아세틸화도(DA) 15 % 이하, 유리하게는 10 % 미만, 더욱 유리하게는 8 % 미만, 더욱 더 유리하게는 5 % 미만을 갖는다. 더욱 더 바람직하게, 본 발명에 따른 키토산은 아세틸화도(DA) 4 % 이하, 유리하게는 3 % 미만, 더욱 유리하게는 2 % 미만, 더욱 더 유리하게는 1 % 미만을 갖는다. 예를 들면, 본 발명에 따른 키토산은 아세틸화도(DA) 1 % 내지 20 %, 유리하게는 2 % 내지 15 %, 유리하게는 1 % 내지 10 %, 예를 들어 4 % 내지 8 %를 갖는다.
아세틸화도는 바람직하게는 문헌 "Physico-chemical studies of the gelation of chitosan in a hydroalcoholic medium" A. Montembault, C. Viton, A. Domard, Biomaterials, 26(8), 933-943, 2005)에 기재된 방법에 따라 측정된다.
본 발명의 용액에서 사용되는 키토산은 바람직하게는 중량평균분자량("Physico-chemical studies of the gelation of chitosan in a hydroalcoholic medium" A. Montembault, C. Viton, A. Domard, Biomaterials, 26(8), 933-943, 2005에 기술된 방법에 따라 무균화 이전에 측정됨) 100,000 내지 1,500,000 g/mol, 유리하게는 200,000 내지 1,000,000 g/mol, 더욱 유리하게는 250,000 내지 500,000 g/mol, 더욱 더 유리하게는 300,000 내지 400,000 g/mol을 갖는다.
무균화 이후에, 상기 키토산은 전형적으로 중량평균분자량 80,000 내지 1,000,000 g/mol, 유리하게는 120,000 내지 300,000 g/mol을 갖는다,
통상적으로, 몰 질량 100,000 내지 1,000,000 g.mol- 1 을 갖는 키토산은 또한 그의 점도를 특징으로 할 수 있다(통상적으로 25℃에서 1 % 아세트산 수용액 중 1 % 농도). 이러한 점을 고려할 때, 키토산의 몰 질량은 또한 5 Pa.s 내지 20 Pa.s 의 점도로 한정될 수 있다.
상기 조성물의 점도는 25℃ 에서 DHR1 레오미터 (TA 인더스트리) 및 40 mm 평면 형태에서 0.01 내지 1 s- 1 의 인가 전단 속도에 의한 동적 모드에 따라 측정된다.
바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 용액에서 사용되는 키토산은 화학적으로 개질되지 않고, 특히, 중성에 근접한 pH 값(6.2 내지 7.2)에서 수용액에서의 용해도를 증가시키기 위해 그래프트되지 않는다. 이러한 측면에서 WO 제03/042250호 또는 JP-H02-69502호, 문헌 "Synthesis and characterization of sugar-bearing chitosan derivatives: aqueous solubility and biodegradability", Jae Hyung Park et al., Biomacromolecules 2003, 4, 1087-1091, 및 문헌 "Water solubility of partially N-acetylated chitosans as a function of pH: effect of chemical composition and depolymerization" Varum K. M. et al., Carbohydrate polymers 25 (1994), 65-70에서 사용되는 키토산과 구별된다.
본 실시양태에서, 상기 다른 키토산은 가교결합된 키토산 입자 형태로 존재할 수 있다.
특정 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 높은 아세틸화도, 특히 20 % 초과, 더욱 구체적으로는 40 % 내지 60 %의 아세틸화도를 갖는 키토산을 갖지 않는다.
또 다른 특정 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 부가적인 올리고머, 특히 낮은 평균 분자량, 특히 20,000 g/mol 미만의 평균 분자량을 갖는 키토산 올리고머를 갖지 않는다.
높은 아세틸화도를 갖는 키토산 또는 추가적인 올리고머를 "갖지 않는"은, 본 발명의 의미 내에서, 상기 수성 키토산 조성물이 상기 화합물 1 중량% 미만, 특히 0.5 중량% 미만을 포함하고, 더욱 바람직하게 상기 화합물을 함유하지 않음을 의미한다.
분산제
키토산 외에도, 본 발명에 따른 수성 조성물은 키토산 분산제 적어도 1종을 포함할 수 있다. 이러한 유형의 분산제는 당업계에 매우 잘 알려져 있고, 예를 들어 만니톨, 글리세롤, 소르비톨 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다.
완충제
본 발명에 따른 조성물은 생리학적 pH에 놓이도록 하기 위해 pH 완충제를 포함할 수 있다. 상기 목적에 통상적으로 사용되는 임의의 pH 완충제, 예를 들어, PBS(포스페이트 완충제 식염수)가 사용될 수 있다.
염
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 염화나트륨 또는 염화칼륨과 같은 염, 또는 상기 조성물의 삼투성을 조정하기 위해 유리하게 허용될 수 있는 임의의 다른 부형제를 포함한다. 염화나트륨 또는 염화칼륨과 같은 염의 첨가가 동위원소 용액을 얻는데 유리할 수 있다. 본 발명의 특정 특징에 따르면, 상기 조성물은 또한 알려진 치료 활성을 갖는 화합물 적어도 1종을 또한 포함할 수 있다.
부가적인 화합물 또는 부형제
본 발명에 따른 수성 키토산 조성물은 또한 약학적으로, 피부과적으로 및/또는 화장품용으로 허용되는 화합물 또는 부형제 적어도 1종을 포함할 수 있다.
활성 제제
또한, 본 발명에 따른 조성물은 진통 화합물, 국소 마취제, 예를 들면, 리도카인, 메피바카인, 부피바카인 또는 로피바카인, 혈관형성 화합물, 또는 성장 인자 또는 생활성 올리고당 유형의 활성 화합물과 같은 활성 화합물 적어도 1종을 포함할 수 있다.
세포외 매트릭스의 화합물 또는 대체물
특정 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 세포외 매트릭스의 화합물 또는 대체물을 포함할 수 있다.
"세포외 매트릭스"는 전형적으로 결합조직 및 다른 조직의 세포외 거대분자모두를 지칭한다. 본 발명에 따른 세포외 매트릭스의 일 화합물은 유리하게는, 예를 들어 1000 달톤(Da) 보다 큰 크기, 또는 5000 Da 보다 큰 크기를 갖는 유기 폴리머이다. 유리하게, 본 발명에 따른 세포외 매트릭스의 유기 폴리머는 단백질, 글루코사이드, 프로테오글루코사이드 또는 당단백질 성질의 것일 수 있다. 전형적으로, 상기 세포외 매트릭스의 유기 폴리머는 콜라겐, 히알루론산 또는 피브로넥틴일 수 있다. "세포외 매트릭스의 대체물"은 비-유비쿼터스 화합물(즉, 이 기능에 대해 인간에게서는 자연적으로 발견되지 않는 것)로, 세포외 매트릭스의 역할을 할 수 있는 것이다. 이러한 유형의 화합물이 당업계에 알려져 있다(Jayakumar, R., Menon, D., Manzoor, K., Nair, S. V., & Tamura, H. (2010). Biomedical applications of chitin and chitosan based nanomaterials - A short review. Carbohydrate Polymers, 82(2), 227-232).
상기 세포외 매트릭스의 화합물은 바람직하게는 단백질, 글리코사미노글리칸 및 이들의 혼합물로부터 선택된다.
상기 단백질 및 그의 글리코실화된 유도체는 바람직하게는 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 라미닌 또는 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다.
상기 글리코사미노글리칸은 바람직하게는 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 헤파란 설페이트, 케라탄 설페이트 또는 이들 글리코사미노글리칸의 적어도 2종의 혼합물로부터 선택될 수 있다.
바람직한 실시양태에 따르면, 상기 세포외 매트릭스의 화합물은 단백질 및 그의 글리코실화된 유도체로부터 선택되고, 바람직하게는 콜라겐, 피브로넥틴, 및 콜라겐과 피브로넥틴의 혼합물로부터 선택된다.
세포외 매트릭스의 대체물은 그 부분에 대한 카르복시메틸 셀룰로오스, 키토산 에스테르, 키틴 에스테르 및 상기 세포외 매트릭스의 적어도 2종의 대체물의 혼합물로부터 선택될 수 있다.
바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 상기 세포외 매트릭스의 화합물 또는 대체물을 포함할 때, 부가적인 올리고머, 특히 낮은 평균 분자량을 갖는 키토산 올리고머, 특히 20,000 g/mol 미만의 평균 분자량을 갖는 키토산 올리고머를 갖지 않는다.
본 발명에 따른 수성 조성물은 바람직하게는 상기 조성물의 전체 중량에 대해, 세포외 매트릭스의 화합물 적어도 1종 및/또는 세포외 매트릭스의 대체물 5 중량% 미만, 특히 0.01 중량% 내지 5 중량%, 유리하게는 0.1 중량% 내지 4 중량%, 더욱 유리하게는 0.2 중량% 내지 3 중량%, 더욱 더 유리하게는 0.3 중량% 내지 2 중량%, 또는 심지어는 0.5 중량% 내지 1 중량%를 함유한다.
본 발명에 따른 균질 수성 키토산 조성물은, 세포외 매트릭스의 화합물 및/또는 세포외 매트릭스의 대체물을 포함할 때, 바람직하게 상기 수성 조성물의 전체 중량에 대해 키토산 5 중량% 이하, 유리하게는 상기 수성 조성물의 전체 중량에 대해 4 중량% 이하, 상기 수성 조성물의 전체 중량에 대해 키토산 3 중량% 이하, 심지어는 상기 수성 조성물의 전체 중량에 대해 키토산 2 중량% 이하의 양을 함유한다. 더욱 바람직하게, 본 발명에 따른 균질한 수성 키토산 조성물은, 세포외 매트릭스의 화합물 및/또는 세포외 매트릭스의 대체물을 포함할 때, 상기 수성 조성물의 전체 중량에 대해 키토산 0.1 중량% 내지 5 중량%, 유리하게는 0.5 중량% 내지 3.5 중량%, 특히 1 중량% 내지 2 중량%를 함유한다. 더욱 바람직하게, 본 발명에 따른 균질 수성 키토산 조성물은, 세포외 매트릭스의 화합물 및/또는 세포외 매트릭스의 대체물을 포함할 때, 상기 수성 조성물의 전체 중량에 대해 키토산 1.5 중량% 내지 2 중량%, 유리하게는 1.6 중량% 내지 1.9 중량%, 특히 1.7 중량% 내지 1.8 중량%를 함유한다. 더욱 더 바람직하게, 본 발명에 따른 균질 수성 키토산 조성물은, 세포외 매트릭스의 화합물 및/또는 세포외 매트릭스의 대체물을 포함할 때, 상기 수성 조성물의 전체 중량에 대해 키토산 2 중량% 미만, 유리하게는 1.9 중량% 미만, 특히 1.8 중량% 미만, 더욱 유리하게는 1.7 중량% 미만, 더욱 더 유리하게는 1.6 중량% 미만을 포함한다.
상기 조성물의 제조 방법
본 발명에 따른 수성 키토산 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 특히 하기의 연속 단계에 의해 준비될 수 있다:
a. 약산 또는 강산 및 이들의 혼합물과 같은 산을 첨가하여 물에 키토산을 용해시키되, 상기 약산은 유리하게는 아세트산, 글리콘산, 락트산 또는 글루탐산으로 이루어진 군으로부터 선택되고 상기 강산은 유리하게는 염산임,
b. 상기 세포외 매트릭스의 화합물 및/또는 대체물 적어도 1종이 적용될 수 있는 첨가, 및
c. pH 8.5 미만인 수성 조성물을 수득하기 위한 pH의 선택적인 재조정.
바람직하게, 분산제(만니톨, 글리세롤, 소르비톨 등) 적어도 1종이 상기 (a), (b) 또는 (c)의 단계 중 임의의 단계에서 또는 (a), (b) 또는 (c)의 단계 중 임의의 단계 이후에 첨가될 수 있는 경우에 첨가된다. 본 발명에 따른 특정 실시양태에서, 겔화된 수성 키토산 조성물은 상기에서 제시된 바와 같은 분산제를 첨가함으로써 분산될 수 있으며, 선택적으로 상기 수성 키토산 조성물의 겔의 기계적 파쇄 단계를 통해 분산될 수 있다. 수득된 상기 조성물은 모든 경우에 예를 들면 주사에 의해 투여될 수 있는 현탁액 또는 용액일 수 있고, 바람직하게 겔일 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 수성 조성물은 전술한 단계에 의해 수득될 수 있다.
상기 용액의 pH 제어는 상기에서 설명한 바와 같이 첫째로는 주사 후 조직의 산성 괴사를 방지하기 위해, 또한, 무균화 (예를 들면, 121 ℃에서 15분동안 고압살균에 의함)가 이용되는 경우에는 상기 조성물의 가수분해 및 키토산 분해를 방지하기 위해 매우 중요하다. 상기 pH는 필요시에, 전형적으로 소량인 중탄산나트륨 또는 PBS 완충제와 같은 화합물에 의해 재조정된다. 상기 pH는 pH 미터에 의해 유리하게 확인된다.
본 발명 관련하여, 상기 pH는 바람직하게는 투석(dialysis)을 통해 매우 서서히 조정될 수 있다.
투석은 용액에 있는 분자 및 이온의 막 분리를 위한 방법이다. 따라서, 본원에 있어서 본 발명에 따른 키토산 수용액은 상기 키토산 용액에 필요한 최종 pH (목표 pH)와 동일한 pH를 갖는 완충 용액, 즉 적어도 6.2 초과, 유리하게는 6.2 내지 7.2, 바람직하게는 6.25 내지 7.1의 pH를 갖는 완충 용액에 대해 투석될 수 있다. 상기 완충 용액이 상기 용액의 겔화 pH 보다 높은 pH (예: 7.5)를 갖는 경우, 상기 용액의 겔화를 방지하기 위해 투석이 모니터링되어야 한다.
상기 완충 용액은 예를 들어, 식염수 포스페이트 완충 용액(PBS, TBS, PBS-락트산), 트리스(트리스(하이드록시메틸)메틸아민), 4-2-하이드록시에틸-1-피페라진에탄설폰산 (HEPES), 2-{[트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}-에탄설폰산 (TES), 3-(N-모폴리노)프로판설폰산(MOPS), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)), MES (2-(N-모폴리노)에탄설폰산(PIPES), 염화나트륨 (NaCl)일 수 있다.
바람직한 실시양태에 따르면, 상기 완충 용액은 "산" 염 NaH2PO4, "염기성" 염 Na2HPO4 및 NaCl로 구성된 PBS(포스페이트 완충 식염수) 용액이다.
특정 실시양태에 따르면, 상기 완충제는 생리학적으로 허용가능하여, 즉, 본 발명에 따른 주사가능한 용액이 조직에 주사되었을 때 내성 또는 독성의 위험을 나타내지 않는다. 이러한 측면에서, 상기 완충제는 바람직하게는 글리세로포스페이트, 특히 β-글리세로포스페이트와 상이한데, 이들은 피부에 그다지 자극성이지는 않지만 조직에 주사될 때 석회화의 문제를 일으킨다.
본 발명의 특정 실시양태에 따르면, 상기 투석은 전술한 바와 같이 완충 용액에 대해 단일 조(single bath)에서 정적으로 수행될 수 있다. 상기 투석이 완충 용액에 대한 단일 조에서 정적으로 수행될 때, 상기 완충 용액은 상기 키토산 용액에 필요한 최종 pH와 동일한 pH(목표 pH), 예를 들어 6.5 내지 6.9를 갖는 것이 바람직하다.
보다 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 투석은 상기 키토산 용액에 필요한 최종 pH에 근접한 상이한 pH(목표 pH)를 갖는 완충 용액에 대해 연속적인 복수개의 조(bath)에서 정적으로 수행될 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 투석은 동적으로, 즉, 상기 키토산 수용액을 함유하는 투석 막으로 이루어진 1개 이상의 투석 포켓을 통해 pH의 점진적인 증가를 제공하는 용액 1종 이상을 연속 순환시킴으로써 수행된다. 이러한 유형의 투석은 예를 들어 출원인의 특허출원 WO 제2016/170284호에 기재되어 있다.
본 발명에 따른 특정 실시양태에서, 상기 키토산은 염산 유형의 강산을 사용하여 물에 용해된다. 이 경우, 상기 pH는 예를 들어 나트륨 또는 암모늄 바이카보네이트 유형의 화합물 또는 PBS에 의해 및/또는 예를 들어 NaOH 또는 KOH 유형의 염기에 의해 재조정된다(항상 pH가 8.5 미만, 바람직하게는 6.9 미만이 되도록 제어함).
본 발명에 따른 특정 실시양태에서 상기 용해 단계 동안에 상기 산은 상기 키토산의 용해에 필요한 양으로 첨가된다. 이러한 방식으로 일부 키토산, 예를 들어, 엄격하게 필요한 양의 산으로는 용해시키기 어려운 키토산에 대해 과량의 산을 사용할 수 있고, 이어서 상기 키토산은 예를 들어 암모니아를 사용하여 재침전된다. 과량의 암모니아 및 염을 제거하기 위한 일련의 세척 이후에, 건조 물질을 회수하기 위해 상기 키토산을 동결건조할 수 있다. 이로써 용해가 더 쉬워질 것이다.
본 발명에 따른 또 다른 특정 실시양태에서 상기 용해 단계 동안에, 상기 산은 상기 키토산의 용해에 필요한 최소량, 예를 들면 NH2 부위의 양성자화에 엄격하게 필요한 화학량론적 양으로 첨가된다.
특히 유리하게, 본 발명에 따른 수성 조성물의 pH는 8.5 미만이고, 전형적으로는 4 내지 7.6 이다. 본 발명 관련하여, 상기 키토산은 유리하게는 상기 키토산의 아민 기의 양성자화에 의해, 전술된 pH 범위의 산성 환경에서 물과 같은 수용액중에서 용해된다. 이들 pH 범위는 특히 본 발명에 따른 수성 조성물의 안정성을 극대화하기 위해 선택되었다.
또한, 본 발명의 청구 대상은 상기에 기재된 바와 같이, 피부과적으로 및/또는 생리학적으로 허용가능한 비히클에서 상기 수성 키토산 조성물의 분산 이후에 수득되거나 겔 형태 또는 액체인 것을 특징으로 하는 수성 조성물에 관한 것이다.
"피부과적으로 및/또는 화장품용으로 허용가능한 비히클"은 본 발명 관련하여 임의의 피부과적으로 및/또는 화장품용으로 허용가능한 부형제, 또는 본 발명에 따른 수성 조성물의 투여를 가능하게 하는 임의의 피부과적으로 및/또는 화장품적으로 허용가능한 매트릭스 또는 기기를 의미한다.
본원에 기재된 바와 같은 수성 조성물이 선택적으로 약학적으로, 피부과적으로 및/또는 화장품용으로 허용가능한 화합물 또는 부형제와 함께 조성물에 함유될 때, 피부과적 조성물로서 또는 의료 기기로서, 유리하게는 생체흡수성 또는 부분적으로 생체흡수성 임플란트로서의 사용이 하기 용량으로 투여될 수 있다. 키토산의 양은 투여되는 수성 조성물의 전체 양에 대해 키토산 0.1 중량% 내지 5 중량%, 유리하게 1 중량% 내지 2 중량%, 더욱 유리하게는 1.1 중량% 내지 1.9 중량%, 더욱 더 유리하게는 1.2 중량% 내지 1.8 중량%, 더욱 더 유리하게 1.3 중량% 내지 1.7 중량% 또는 1.4 중량% 내지 1.6 중량%, 예를 들면 1.5 중량% ± 0.05 중량%일 수 있다. 또한, 단일 용량으로 투여되는 조성물 또는 수성 조성물의 양은 주사당 0.01 내지 20 g, 유리하게는 주사당 0.05 내지 10 g, 더욱 유리하게는 주사당 0.1 내지 5 g, 더욱 더 유리하게 주사당 0.4 내지 1 g, 예를 들어 0.7 g ± 0.1 g 이다. 주사 횟수는 가장 극단적인 경우에 1회부터 20회까지 다양할 수 있다. 보다 일상적으로, 주사 횟수는 50ml 미만의 부피(및 생리학적 온도에서)를 갖는 구멍에 효과적으로 필링하기 위해 5회 미만이다. 전술된 것보다 더 큰 수복 수술의 경우(예: 유방성형술, 급성 지방이영양증, 급성 지방이상증 등)의 경우에, 주사 및/또는 임플란트될 수 있는 본 발명에 따른 조성물의 양이 500 g 이하, 더욱 통상적으로는 350 g 이하, 더욱 더 일반적으로는 200 g 이하, 또는 100 g 이하의 질량(mass)에 첨가될 수 있다. 전형적으로, 투여되는 수성 조성물의 밀도는 20 ℃에서 (및 투여 전에) 0.9 내지 1.2이다.
본 발명에 따른 화장품적 용도는 사실상 본 발명에 따른 조성물의 투여시에 침습성이 아닌 것으로 정의된다. 이는 임의의 수술적 행위를 배제시킨다. 그럼에도 불구하고, 본 발명에 따른 화장품적 용도는 문신 적용에 필적하는 행위로서, 작은 칼리버 바늘 및 주사기에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 임의의 방식으로, 5 g 보다 많은 본 발명에 따른 조성물의 주사량은 화장품적 용도에 있어서 배제된다. 이와 관련하여, 주사 횟수는 총 주사량 10g에 대해 임의적으로 5회 이하로 제한된다.
또한, 단일 용량으로 투여되는 수성 조성물의 양은 피부 표면 cm2당 0.001 내지 1 g, 유리하게는 피부 표면 cm2당 0.01 내지 0.5 g일 수 있다. 전형적으로, 투여되는 수성 조성물의 밀도는 25 ℃에서 0.9 내지 1.2 이다.
또한, 본 발명에 따른 사용은 시험관 내에서 및/또는 생체 내에서 수행될 수 있다.
시험관 내에서의 사용은 본 발명이 관련된 모든 용도에 적용될 수 있고, 특히 투여될 활성 제제의 농도/양을 결정하기 위한 목적으로 적용된다.
도면의 상세한 설명
도 1a 및 도 1b은 3T3L1의 증식에 대한 효과를 보여준다. 도 1은 씨딩 2일 후에 세포 모폴로지가 2% 조건의 경우에 공격적 또는 심지어는 독성 매질임을 시사하고 있으나, 모든 농도의 경우에 3T3L1 세포가 5일 이내에 증식하고 컨플루언스(confluence)에 도달할 수 있음을 보여준다. 도 1b는 수득된 실험 이미지 상에서 AdipoRed에 상응하는 시그널이 보여질 수 있는 위치(실험에 대해 녹색, vs. Hoecht에 대해 적색)를 명시한다.
도 2a, 도 2b 및 도 2c는 지방 세포 분화 동안에 3T3L1 세포에 의한 올레산 저장에 대해 키토산 농도가 갖는 영향을 보여준다. AdipoRed 마킹(도 2a)은 키토산을 함유하지 않은 조건과 비교할 때 상기 세포가 0.5%, 0.75% 및 1%에서 키토산 존재하에 있을 때 지방산이 축적됨을 보여준다. 도 2b는 수득된 실험 이미지 상에, AdipoRed에 상응하는 시그널이 보여질 수 있는 위치(실험에 대해 녹색)를 명시한다. 상기 축적의 양(도 2c)은 상기 세포가 0.5%에서 키토산 존재하에 배양될 때 최대임을 증명한다.
도 3은 콜라겐 및 피브로넥틴과 결합된 키토산을 포함하는 배합 및 키토산의 조성물에서 3T3L1s의 지방소립(n > 10000)의 분포를 보여준다. 도 3은 (Col2+FN1) + 키토산 2%)이 지방소립의 수 및 평균 크기(부피)를 증가시키기 위한 최고의 배합임을 보여준다.
실시예
실시예 1: 용액의 준비
일정 농도 범위의 겔화 키토산 용액을 준비하기 위해 2가지 방안이 이용된다.
최종 희석 기준
키토산 4 g을 NaCl 150 mM(300 mOsmol.l-1에 상응)을 함유하는 염수 용액 95 g에서 교반한다. 상기 키토산이 완전히 분산되면 아세트산 1g을 첨가한다. 상기 키토산이 완전히 용해될 때까지 교반을 유지한다. 이어서, 4% 농도의 투명 키토산 용액을, 상기 키토산 기원에 따라 3 내지 4.5 일 수 있는 pH를 갖게 수득한다.
4%(w/w) 키토산 용액은 1%(w/w) 아세트산을 함유한 염수 용액(300 mOsmol.l-1에서 NaCl)에서 수득한다.
상기 산성 키토산 용액의 pH는 6 내지 6.5가 될 때까지 증가한다. 상기 단계는 pH 6.5 내지 7을 갖는 PBS 완충제에 대한 투석에 의해 수행한다. 이 단계동안 최종농도 3%(w/w)에 도달하도록 상기 키토산 용액의 팽윤도를 제어한다 (33% 팽윤도). 상기 키토산 용액을 사용 전에 보관하기 위해 일반적으로 무균화한다(고압살균에서 15분 동안 121℃).
이 용액은 6에 근접한 pH 및 3%(w/w) 농도가 되도록 투석한다.
사용 전에, 보다 낮은 농도에 근접하도록 3%의 키토산 용액을 150 mM NaCl + 1% 아세트산으로 염수 용액에서 희석할 수 있다.
수득된 용액은 생리학적 매질 h는 배지의 존재하에 겔화될 수 있다.
초기 희석 기준
키토산 4 g은 NaCl 150 mM(300 mOsmol.l-1에 상응)을 함유하는 염수 용액 95 g에서 교반한다. 상기 키토산이 완전히 분산되면 아세트산 1g을 첨가한다. 상기 키토산이 완전히 용해될 때까지 교반을 유지한다. 이어서, 4% 농도의 투명 키토산 용액을, 상기 키토산 기원에 따라 3 내지 4.5 일 수 있는 pH를 갖게 수득한다.
4%(w/w) 키토산 용액은 1%(w/w) 아세트산을 함유하는 염수 용액(300 mOsmol.l-1에서 NaCl)에서 수득한다.
이어서, 상기 모액 (4%)을 1% (w/w) 아세트산을 함유하는 염수 용액(300 mOsmol.l-1에서 NaCl)에서 4% 내지 0.1% 범위의 상이한 농도로 희석한다. 이어서, 각 용액을 6.5 내지 7의 pH를 갖는 PBS 완충제에 대해 투석한다. 각 용액의 최종 농도를 제어하기 위해 팽윤도를 측정한다. 상기 용액의 pH가 6.0 내지 7.4가 될 때 투석을 중지한다. 각각의 용액을 고압 멸균(15분 동안 121℃)에 의해 무균화한다. 상기 용액은 임의의 다른 형태의 희석없이 그대로 사용하여, pH를 보존한다.
수득된 용액은 생리학적 매질 또는 배지의 존재하에 겔화될 수 있다.
실시예 2: 3T3L1 설치류 지방세포주에 의한 지방산의 증식, 분화 및 포획에 대한 키토산의 다양한 희석의 효과
장비 및 방법
다양한 키토산 용액(2%, 1%, 0.75% 및 0.5%)은 실시예 1에서 얻은 용액을 희석하여 준비한다.
예를 들어, 실시예 1 (DA: 2%, Mw: 450000 g.mol-1, Bioxis Pharmaceuticals S.A.S)에서 얻은 2% (w/w) 키토산 제제를, 웰(24-웰 플레이트)에서 1% (w/w) 아세트산을 함유하는 염수 용액 (NaCl, 300 mOsmsmol.l- 1)에서 희석하고, 이후에 다른 웰의 절반에 걸쳐 분포시키고, 건조하고, PBS로 세정하고, 이어서 배지로 세정한 후에 세포를 씨딩하였다 (3T3L1 설치류 지방세포주 ATCC CL-173TM). 상기 세포가 컨플루언스 상태에 있을 때, 분화 매질을 첨가함으로써 분화가 유도된다. 이어서, 상기 세포를 적은 용량의 올레산(OA, 2.5μM)으로 6시간동안 처리한다. OA에서 발생하는 임의의 배경 노이즈를 피하기 위해 다음날까지, 상기 세포들을 OA없이 배지에 다시 넣는다. 증식을 위상차 현미경(phase contrast microscope)(x20)에 의해 분석한다: 상기 이미지를 각 웰에 대해 동일한 위치에서 다양한 시간(씨딩 2일후 및 5일후)에 촬영한다. 올레산의 분화 및 저장을 형광 현미경으로 분석한다: 상기 세포를 고정하고, AdipoRed(도면에서 확인됨)로 마킹하여, 분화 동안에 복수개의 소립(droplet)에 저장된 트리글리세라이드(TG) 형태의 지방산의 존재를 나타낸다: 상기 지방 세포가 성숙될 때 단일 소립으로 융합되고 핵 마킹을 위해 Hoechst 3352(실험에 대해 적색)를 사용하였다. 상기 마킹은 형광 현미경으로 관찰되고, 이미지화에 의해 정량화를 수행하였다. 이미지화 및 형광 정량화은 실시간 이미지화 스테이션에서 수행된다. 비교예는 분화 유도 전에 고정된다(컨플루언스, D0).
결과
씨딩 2일 후 모든 농도에 대해 3T3L1 세포는 5일후에 증식하여 컨플루언스에 도달할 수 있다(도 1a 및 도 1b). 따라서, 시험된 농도에서, 상기 지방 세포의 수와 부피가 증가한다. 그러나, 세포 모폴로지는 2% 조건의 경우에 공격적 또는 심지어는 독성의 매질을 시사한다.
도 2는 지방 세포 분화 동안에 3T3L1 세포의 경우에 올레산의 저장에 대한 키토산 농도의 영향을 보여준다. 따라서, 도 1에서 시험한 것과 동일한 세포가 올레산(지방 세포가 포획 능력을 갖는 지방산)의 존재하에 사용된다. AdipoRed 마킹(도 2a 및 도 2b)는 키토산을 함유하지 않은 조건과 비교할 때 세포가 키토산 존재하에 0.5%, 0.75% 및 1%로 있을 때 지방산이 축적됨을 보여준다. 따라서, 키토산의 존재하에, 상기 3T3L1 세포는 기준보다 더 많은 올레산을 포획한다. 이러한 축적의 정량화는 세포가 0.5% (도 2c)에서 키토산의 존재하에 배양될 때 최대로 됨을 증명한다.
결론
3T3L1 세포는 키토산의 존재하에 증식할 수 있다. 그러나, 배양 2일 후에 키토산의 존재는 2% 이상의 농도의 경우에 3T3L1 주에 독성 영향을 갖는 것으로 보인다. 키토산은 용량-의존적인 방식으로 지방산의 포획을 돕는다. 테스트된 용액 중에서 0.5%의 용액이 최고의 효능을 갖는 것으로 보인다. 이 포획은 지방 세포의 부피 증가를 허용하며, 따라서 외삽에 의할 때 생체내 지방조직의 부피 증가를 허용할 것이다.
실시예 3: 3T3L1 설치류 지방세포주에 의한 피브로넥틴 및 콜라겐 존재하에 지방산의 포획에 대한 키토산의 다양한 희석의 효과
장비 및 방법
다양한 키토산 용액(2%, 1%, 0.75% 및 0.5%)은 실시예 1에서 얻은 용액을 희석하여 준비한다.
예를 들어, 2% (w/w) 키토산 제제는 실시예 1에서 수득한다. 이를 위해, 2% (w/w) 키토산 제제 (DA: 2%, Mw: 450000 g.mol-1, Bioxis Pharmaceuticals S.A.S). 상기 용액을 산성 염수 용액에서 임의의 예비희석없이 그 자체로 사용하였다. 또한, 2 mg/ml 콜라겐 I + 1 mg/ml 피브로넥틴 I + 2% 키토산(Col FN Chi로 지칭됨)에 기반한 용액을 또한 평가한다. 상기 조성물은 세포 씨딩 (3T3L1 설치류 지방 세포주, 기준물질 ATCC CL-173TM)한 후에 96-웰 플레이트에 분포시킨다. 상기 세포가 컨플루언스 상태에 있을 때, 분화 매질을 첨가함으로써 분화를 유도한다. 이어서, 상기 세포를 적은 용량의 올레산(OA, 2.5μM)으로 6시간동안 처리한다. 상기 세포들은 Cytation 3에서 관찰하기 전에 익일까지 올레산없이 배지에 다시 넣는다. 지방소립의 크기 및 분포(지방 세포의 부피)를 관찰한다.
결과
도 3은 2 mg/ml 콜라겐 I + 1 mg/ml 피브로넥틴 I + 2% 키토산 용액(Col FN Chi로 지칭됨)이 2% 키토산 용액에 비해 15 ㎛ 미만의 크기를 갖는 지방 세포를 보다 적게 갖고 15 내지 55 ㎛ 크기를 갖는 지방 세포를 보다 많이 가짐을 보여준다. 따라서, 콜라겐 또는 피브로넥틴과 같은 세포외 매트릭스의 화합물의 첨가는 지방소립의 수 및 평균 크기(따라서 부피)의 증가를 촉진한다.
결론
키토산 단독은 지방소립의 크기를 증가시킨다. 이 효과는 피브로넥틴 및 콜라겐의 존재하에 더욱 증가한다.

Claims (14)

  1. 수성 키토산 조성물로서,
    지방 세포의 부피 및/또는 수를 증가시키기 위해 사용하기 위하여 상기 조성물의 전체 중량에 대하여 키토산 0.1 중량% 내지 5 중량%을 포함하는 수성 키토산 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 피부 노화를 치료 또는 방어하기 위해, 주름과 같은 피부 결함에 필링하기 위해 또는 피부 또는 피하 조직을 리페어(repair) 또는 수복(reconstructing)하기 위해 사용되는 수성 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물의 전체 중량에 대하여 키토산 0.2 중량% 내지 3 중량%, 바람직하게는 0.5 중량% 내지 2 중량%, 더욱 바람직하게는 0.5 중량% 내지 1.9 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 수성 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 8.5 미만의 pH, 유리하게는 4 내지 7.6의 pH, 더욱 유리하게는 5.5 내지 7.5의 pH, 바람직하게는 6.2 내지 6.8의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 수성 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 키토산이 아세틸화도 30% 미만, 유리하게는 15% 미만, 바람직하게는 10% 미만을 갖는 것을 특징으로 하는 수성 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 세포외 매트릭스의 구성성분 적어도 1종 및/또는 상기 세포외 매트릭스의 대체물 적어도 1종을 포함하는 것을 특징으로 하는 수성 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 세포외 매트릭스의 구성성분이 단백질 및 그의 글리코실화된 유도체로부터 선택되고, 특히 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 라미닌 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 수성 조성물.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 조성물의 전체 중량에 대하여 상기 세포외 매트릭스의 구성성분 적어도 1종 및/또는 상기 세포외 매트릭스의 대체물 적어도 1종 0.01 중량% 내지 5 중량%, 유리하게는 0.1 중량% 내지 4 중량%, 더욱 유리하게는 0.2 중량% 내지 3 중량%, 더욱 더 유리하게는 0.3 중량% 내지 2 중량% 또는 심지어는 0.5 중량% 내지 1 중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 수성 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 액체이거나 또는 겔 형태로 있는 것을 특징으로 하는 수성 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 진통 화합물과 같은 활성 화합물, 리도카인, 메피바카인, 부피바카인 또는 로피바카인과 같은 국소 마취제, 혈관형성 화합물, 또는 성장 인자 또는 생체활성(bioactive) 올리고당 유형의 활성 화합물 적어도 1종을 포함하는 것을 특징으로 하는 수성 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 경피 주사, 피하 또는 복강내 주사에 의해 투여되도록 배합된 것인 수성 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 피부과적 조성물 또는 의료 기기로서 사용하기 위한 수성 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 생체흡수성(bioresorbable) 또는 부분적으로 재흡수성(resorbable) 임플란트로서 사용하기 위한 수성 조성물.
  14. 조성물의 전체 중량에 대하여 키토산 0.1 중량% 내지 5 중량%를 포함하는 수성 조성물의 지방 세포에 대해 독성을 감소시키기 위한, 세포외 매트릭스의 구성성분 적어도 1종 및/또는 상기 세포외 매트릭스의 대체물 적어도 1종의 용도.
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