WO2018143736A1 - 갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체를 기재로 하는 하이드로젤 및 이의 용도 - Google Patents

갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체를 기재로 하는 하이드로젤 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2018143736A1
WO2018143736A1 PCT/KR2018/001473 KR2018001473W WO2018143736A1 WO 2018143736 A1 WO2018143736 A1 WO 2018143736A1 KR 2018001473 W KR2018001473 W KR 2018001473W WO 2018143736 A1 WO2018143736 A1 WO 2018143736A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hyaluronic acid
hydrogel
formula
group
acid derivative
Prior art date
Application number
PCT/KR2018/001473
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
조승우
이정승
조정호
이종승
Original Assignee
(주)앰틱스바이오
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to US16/483,146 priority Critical patent/US20200230288A1/en
Application filed by (주)앰틱스바이오 filed Critical (주)앰틱스바이오
Priority to BR122021001969-0A priority patent/BR122021001969B1/pt
Priority to KR1020197025688A priority patent/KR102099981B1/ko
Priority to CN201880010122.5A priority patent/CN110603268B/zh
Priority to BR112019015891-0A priority patent/BR112019015891A2/pt
Priority to CA3052135A priority patent/CA3052135C/en
Priority to EP18748489.4A priority patent/EP3578573A4/en
Priority to AU2018216540A priority patent/AU2018216540B2/en
Priority to RU2019127536A priority patent/RU2778054C2/ru
Priority to JP2019542124A priority patent/JP6997470B2/ja
Publication of WO2018143736A1 publication Critical patent/WO2018143736A1/ko
Priority to US17/842,493 priority patent/US20230147416A1/en
Priority to US17/842,475 priority patent/US20220313866A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1808—Epidermal growth factor [EGF] urogastrone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1891—Angiogenesic factors; Angiogenin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/20—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/02—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques
    • C08J3/03—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques in aqueous media
    • C08J3/075—Macromolecular gels
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/24—Crosslinking, e.g. vulcanising, of macromolecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
    • C08L5/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
    • A61L2300/414—Growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/06—Flowable or injectable implant compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/18—Modification of implant surfaces in order to improve biocompatibility, cell growth, fixation of biomolecules, e.g. plasma treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/34—Materials or treatment for tissue regeneration for soft tissue reconstruction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2305/00—Characterised by the use of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08J2301/00 or C08J2303/00
    • C08J2305/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L2203/00—Applications
    • C08L2203/02—Applications for biomedical use

Definitions

  • the present invention relates to hydrogels based on galulol-modified hyaluronic acid derivatives and uses thereof.
  • Hyaluronic acid is a bio-derived polymer with little side effects when applied in vivo and is hydrophilic due to the chemical structure of the sugars contained. In addition, it contains a lot of moisture, has a physical buffering effect and friction lubricating effect in the joints, and is known to be involved in the flexibility of the skin. In addition, there is a protective property against bacterial invasion from the outside, it is biodegraded during in vivo transplantation by hyaluronic acid enzyme (hyaluronidase) in vivo, and is used as an important material of the drug delivery system by combining various drugs with hyaluronic acid.
  • hyaluronic acid enzyme hyaluronidase
  • hyaluronic acid has been approved by the US Food and Drug Administration, it has been widely used as a material for medical biomaterials, tissue engineering scaffolds and drug delivery polymers.
  • hyaluronic acid is abundantly present in several different layers of the skin and, for example, is involved in hydrating function, assisting tissue of the extracellular matrix, functioning as a filler, and tissue regeneration mechanisms. Has the same complex function.
  • the amount of hyaluronic acid, collagen, elastin, and other matrix polymers present in the skin decreases. For example, repeated exposure to ultraviolet light from the sun causes dermal cells to reduce their hyaluronic acid production as well as increase their rate of degradation. Loss of these materials causes wrinkles, holes, water loss, and / or other undesirable conditions that contribute to aging. Therefore, as one of methods for improving the skin condition, filler compositions containing hyaluronic acid as a main component have been widely used.
  • hyaluronic acid derivative gel in which a carboxyl group is modified with O-acylurea or N-acylurea is disclosed.
  • the hyaluronic acid crosslinked products prepared by the methods in these patents have a low stability to hyaluronic acid degrading enzymes and have a high content of unreacted chemicals, which may cause biotoxicity.
  • there is a limit to the application of a variety of medical materials because it is not easy to control the crosslinking or control the physical properties for the intended use. Therefore, there is still a need for development of a technology that can easily control the physical properties of hyaluronic acid hydrogel while maintaining excellent biocompatibility.
  • the present inventors have endeavored to develop a technology capable of improving the functionality of hyaluronic acid, a biocompatible material.
  • a hyaluronic acid-based hydrogel platform technology modified with a pyrogallol group was developed, and thus the present invention was completed.
  • hyaluronic acid derivative prepared by modifying hyaluronic acid with a pyrogallol group and a method for producing the same.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing a hyaluronic acid derivative hydrogel comprising crosslinking the hyaluronic acid derivative.
  • Another object of the present invention relates to a hyaluronic acid derivative hydrogel having a structure in which the hyaluronic acid derivative is crosslinked.
  • Another object of the present invention is to provide a drug delivery carrier or drug delivery system (DDS) using the hyaluronic acid derivative hydrogel.
  • DDS drug delivery carrier or drug delivery system
  • Another object of the present invention is to provide a wound dressing or an adhesion barrier based on the hyaluronic acid derivative.
  • Another object of the present invention is to provide a filler composition comprising the hyaluronic acid derivative hydrogel.
  • Another object of the present invention is to provide a method for improving skin wrinkles, comprising the step of injecting the filler composition into or subcutaneously of an individual.
  • the present invention includes the step of crosslinking the hyaluronic acid derivative modified by gallo group, the hyaluronic acid derivative is a gallo group by the reaction between hyaluronic acid and 5'-hydroxydopamine
  • the hyaluronic acid derivative is a gallo group by the reaction between hyaluronic acid and 5'-hydroxydopamine
  • a modified, method for producing a hyaluronic acid hydrogel is provided.
  • the hyaluronic acid derivative may be represented by Formula 1, wherein, the molecular weight of the hyaluronic acid derivative may be 10,000 Da to 2,000,000 Da, the galol substitution rate of the hyaluronic acid derivative is 0.1% to May be 50%.
  • R 1 is a hydroxy group or N is an integer from 1 to 1000.
  • the step of crosslinking may be crosslinked by adding an oxidizing agent or a pH adjusting agent, and the oxidizing agent may be sodium periodate, hydrogen peroxide, mustard peroxidase or tyrosinase, and the pH
  • the modulator may be sodium hydroxide, lithium hydroxide, potassium hydroxide, rubidium hydroxide, cesium hydroxide, magnesium hydroxide, calcium hydroxide, strontium hydroxide or barium hydroxide.
  • the step of crosslinking by adding the oxidizing agent may form a crosslinking bond of the following formula (2) between the hyaluronic acid derivative.
  • HA represents hyaluronic acid in which a carboxyl group is substituted with an amide group.
  • the step of crosslinking by adding the pH adjusting agent may form a cross-linking bond of the following formula (3) between the hyaluronic acid derivative.
  • HA represents hyaluronic acid in which a carboxyl group is substituted with an amide group.
  • the present invention is a hyaluronic acid hydrogel prepared by crosslinking the hyaluronic acid derivative of the formula (1), for example, hyaluronic acid hydrogel in which the crosslinking of the formula (2) or formula (3) between the hyaluronic acid derivative is formed; And it provides a carrier for the delivery of a bioactive material comprising the hyaluronic acid hydrogel.
  • the drug delivery carrier is an antibody, antibody fragment, protein, peptide, polypeptide, small molecule chemical compound, DNA and / or RNA, siRNA, gene, and Stem cells including, but not limited to, adult stem cells, mesenchymal stem cells or induced pluripotent stem cells (iPSCs).
  • the carrier for delivery of the bioactive material provides a sustained release of the bioactive material in vivo and ex vivo.
  • the present invention is a hyaluronic acid hydrogel prepared by crosslinking the hyaluronic acid derivative of the formula (1), for example, hyaluronic acid hydrogel in which the crosslinking of the formula (2) or formula (3) between the hyaluronic acid derivative is formed; And it provides a support for tissue engineering comprising the hyaluronic acid hydrogel.
  • the present invention provides a filler composition comprising a hyaluronic acid derivative modified by a gallolic group or a hyaluronic acid derivative hydrogel prepared by crosslinking the same.
  • the molecular weight of the hyaluronic acid derivative may be 10,000 Da to 2,000,000 Da
  • the pyrogallol group substitution rate of the hyaluronic acid derivative is 0.1% to 50%, preferably 1% to 30%, more preferably 2% to 20%.
  • the hyaluronic acid derivative may be contained in 0.1% (w / v) to 15% (w / v) with respect to the total filler composition.
  • the filler composition is in a liquid state in vitro and can form a gelled state in the body without a crosslinking agent.
  • the filler composition is any one selected from the group consisting of tear bone area, glacial fold area, eye area, forehead area, dorsal area, nasal wrinkle area, lateral wrinkle area, and neck wrinkle area It can be injected at one site.
  • the filler composition may further comprise any one cell growth factor selected from the group consisting of.
  • the filler composition may further include any one component selected from the group consisting of local anesthetics, antioxidants, vitamins, and combinations thereof.
  • the present invention comprises the steps of preparing a hyaluronic acid derivative by introducing a pyrogallol group into the skeleton of the glucuronic acid of hyaluronic acid; And adding the hyaluronic acid derivative to an aqueous medium to mix the same.
  • the present invention provides a method for improving skin wrinkles, comprising the step of injecting the filler composition into the subcutaneous or subcutaneous of the individual.
  • the present invention also provides a wound dressing or an adhesion barrier comprising a hyaluronic acid derivative modified by a gallolic group or a hyaluronic acid derivative hydrogel prepared by crosslinking the same.
  • Techniques for preparing hyaluronic acid hydrogels according to the present invention include the step of crosslinking them under appropriate oxidation or specific pH conditions, based on galulol-modified hyaluronic acid derivatives.
  • the present invention can effectively control the physical properties such as the crosslinking rate, elasticity, adhesive strength according to each crosslinking method with excellent biocompatibility of the hydrogel, it can be utilized in various fields such as medical and cosmetics.
  • FIG. 1 is a diagram showing a synthesis process of a hyaluronic acid derivative according to the present invention.
  • Figure 3 is a schematic diagram showing the change in appearance and crosslinking of the hyaluronic acid hydrogel by different crosslinking methods.
  • FIG. 4 is a diagram showing a cross-linking mechanism based on (a) UV-vis analysis of the change in chemical structure and (b) the manufacturing process of hyaluronic acid hydrogel using NaIO 4 .
  • FIG. 5 is a diagram illustrating a crosslinking mechanism based on (a) UV-vis analysis of changes in chemical structure and (b) based on the above results in the preparation of hyaluronic acid hydrogel using NaOH.
  • Figure 6 confirms the formation rate of the hyaluronic acid hydrogel according to the present invention, (a) as a result of visually confirming the formation of the hydrogel over time, and (b) the change in the elastic modulus over time The result is confirmed.
  • Figure 7 confirms the strength and elasticity of the hyaluronic acid hydrogel according to the present invention, (a) the result of confirming the change in the elastic modulus at 0.1 to 1Hz, and (b) the elastic modulus and tan ⁇ (G '' / G ' ) Is the result of comparison.
  • Figure 9 confirms the adhesive force of the hyaluronic acid hydrogel according to the present invention, (a) the result of measuring the change in the force applied to the rheology device according to the distance between the plates, and (b) the result of quantifying the adhesive force .
  • Figure 10 confirms the swelling and decomposition of the hyaluronic acid hydrogel according to the present invention, the hyaluronic acid synthesized by adding a 5-hydroxy dopamine of (a) 0.5X or (b) 1.0X compared to the molar concentration of hyaluronic acid It is the result of quantifying and evaluating the swelling rate and decomposition rate of the hyaluronic acid hydrogel manufactured using the derivative.
  • Figure 12 confirms the in vivo suitability of the hyaluronic acid hydrogel according to the present invention
  • (a) is HA-PG hydro recovered at 0, 7, 28, and 84 days after implantation into the subcutaneous region from the subcutaneous region of the mouse The form of the gel (DS 8%) is shown.
  • (b) shows the in vivo biodegradation profile of HA-PG.
  • Figure 13 confirms the in vivo degradation of the hyaluronic acid hydrogel according to the present invention, after transplanting the mouse subcutaneous (a) visually confirmed the volume change of the hydrogel, and (b) the weight of the remaining hydrogel The result is confirmed.
  • FIG. 17 shows the preparation of tissue adhesive HA-PG hydrogels using NaOH-mediated crosslinking.
  • Hyaluronic acid derivative hydrogel formation by NaOH-mediated crosslinking is shown.
  • the adhesion of hyaluronic acid derivative hydrogels crosslinked with NaOH or NaIO 4 is compared.
  • FIG. 18 (a) briefly illustrates the adhesion chemistry of NaOH-derived HA-PG hydrogels, and (b) shows direct adhesion to various mouse organs (heart, kidney and liver). It is a photograph.
  • hADSCs human adipose tissue-derived stem cells
  • FIG. 20 shows gelation by oxidative power in the body of the HA-PG solution according to the present invention
  • FIG. 20a shows gelation by injection and oxidative power of the HA-PG solution
  • 20B is a result of visually confirming the skin of a mouse including a hydrogel formed in the body.
  • Figure 21 is a HA-PG solution according to the present invention after injection into the skin, confirming whether or not to maintain the body of the hydrogel formed in the body,
  • Figure 5a is a result of visually confirming the hydrogel formed in the body (Week 0, 10, 24);
  • 5b is a result of measuring the weight change of the hydrogel formed in the body for about 6 months.
  • Figure 22 confirms the conditions for the formation and injection of HA-PG hydrogel of the HA-PG solution according to the present invention
  • Figure 22a is a schematic diagram showing the formation process of the HA-PG hydrogel
  • FIG. 22B is a result of comparing the size of the injectable injection needle with a conventional filler product (Megafill, Perlane).
  • Figure 23 after the HA-PG solution according to the present invention was injected into the skin, confirming the effect of improving wrinkles before and after injection, Figure 23a is a result of comparing the wrinkle-induced skin with a replica template; And FIG. 23B is a result of quantifying and comparing the area, length, and depth of wrinkles.
  • Figure 24 is a comparison of the body filler performance with conventional filler products (Megafill, Perlane),
  • Figure 24a is a HA-PG solution (200KDa, 1MDa), Megafill product, Perlane product after injection into the skin, Hydrogel formed in the body is the result of visual observation (D0, 14, 28, 56, 84, 168, 252);
  • 24B is a result of measuring the weight change of the hydrogel formed in the body for about 9 months.
  • FIG. 25 is a comparison of the body filler capacity with conventional filler products (Megafill, Perlane), Figure 25a is a HA-PG solution (200KDa, 1MDa), Megafill product, Perlane product after injection into the skin according to the present invention ,
  • the result of visual confirmation of the hydrogel formed in the body (D0, 14, 28, 56, 84, 168);
  • 25B is a result of measuring the volume change of the hydrogel formed in the body for about 9 months.
  • FIG. 26 shows the in vivo adhesion of the hydrogel formed in the body, and FIG. 26A is a result of the Perlane product; And FIG. 26B is the result of HA-PG solution (200 KDa, 1 MDa).
  • FIG. 27 is a comparison of the possibility of injecting a conventional filler product (Megafill, Perlane), and using the needles 21, 25, 29, and 30G of various sizes, according to the present invention, the HA-PG solution (200 KDa, 1 MDa), Megafill products, Perlane products, the result of the extrusion force change was confirmed.
  • FIG. 28 is a comparison of the possibility of injection with a conventional filler product (Megafill, Perlane),
  • Figure 28a is a HA-PG solution (200 KDa, 1M Da), Megafill product, using a 30G needle Injecting the Perlane product, the result of confirming the extrusion force change
  • FIG. 28B is a result of confirming the extrusion force change when injecting HA-PG solution (200 KDa, 1MDa), Megafill product, and Perlane product according to the present invention using a 29G needle.
  • FIG. 29 is a comparison of the possibility of injecting with conventional filler products (Megafill, Perlane)
  • Figure 29a is a HA-PG solution according to the present invention using a needle (21, 25, 29, 30G of various sizes) 200 KDa, 1M Da), Break Loose Force, compared with the Megafill, Perlane product
  • FIG. 29B shows a dynamic glide force when injecting HA-PG solution (200 KDa, 1 MDa), Megafill product, and Perlane product according to the present invention using needles 21, 25, 29, and 30G of various sizes. Is the result of comparing.
  • Figure 30 shows the effect of improving the wrinkles before and after injection after injection into the skin HA-PG solution containing epidermal growth factor (20 ng / ml, 1 ⁇ g / ml, 20 ⁇ g / ml) according to the present invention
  • 30A shows a comparison of wrinkle-induced skin templated with replicas
  • FIG. 30B is a result of quantifying and comparing the area, length, and depth of wrinkles.
  • FIG. 31 shows HA-PG solution containing epithelial growth factor (20 ng / ml, 1 ⁇ g / ml, 20 ⁇ g / ml) according to the present invention injected into the skin, followed by H & E staining of the OCT frozen sections thereof. The result is a biopsy.
  • Figure 33 shows the effect of regeneration of skin tissue between HA-PG solution containing a filler product (Perlane) and epidermal growth factor is not sealed and the epidermal growth factor (10 ⁇ g / ml) according to the present invention was compared over time (1 month), and OCT frozen sections were stained with MT (Masson's Trichrome) staining, and the results of pathological examination were performed.
  • Figure 34 is a result of applying the HA-PG solution according to the present invention to the wound site, visually confirming the hydrogel formation and adhesion according to the wound site.
  • 35 is a view briefly illustrating a process of formulating a HA-PG solution in powder form according to the present invention.
  • FIG. 37 shows the storage stability of the HA-PG solution according to the present invention.
  • the HAPG solution is stored at room temperature (25 ° C.) or refrigerated (4 ° C.) while gelling in a storage container.
  • the HA-PG solution was stored for 10 days in a frozen state (-80 °C), after which the solution was injected into the skin to confirm the hydrogel formed in the body with the naked eye.
  • the present invention includes a step of crosslinking a hyaluronic acid derivative modified with a gallo group, wherein the hyaluronic acid derivative is a method for preparing a hyaluronic acid hydrogel, which is modified with a gallo group by a reaction between hyaluronic acid and 5'-hydroxydopamine. to provide.
  • hyaluronic acid refers to D-glucuronic acid (D-glucuronic acid, GlcA) and N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) group ⁇ 1,3-glyco
  • D-glucuronic acid D-glucuronic acid
  • GlcNAc N-acetyl-D-glucosamine
  • ⁇ 1,3-glyco a high molecular weight linear polysaccharide comprising repeating units of disaccharides connected by a seed bond ( ⁇ 1,3-glycosidic bond)
  • the salts include sodium salts, potassium salts, magnesium salts, calcium salts and aluminum salts.
  • the disaccharide repeating units of hyaluronic acid are represented by the following Chemical Formula 4, and the repeating units may be 1 to 1,000, but is not limited thereto.
  • Hyaluronic acid has been found in ocular free fluids, synovial fluid in joints, chicken chives and the like and is known as a highly biocompatible biomaterial.
  • Hyaluronic acid hydrogels despite their high applicability to biomaterials, suffer from difficulties in application as biomaterials (eg drug carriers, tissue engineering supports) due to the limitations of mechanical properties resulting from the natural polymer itself. .
  • the present inventors prepared a hyaluronic acid derivative by introducing a galol group having a high oxidation capacity into hyaluronic acid (Preparation Example 1), and the hyaluronic acid derivative was crosslinked under appropriate oxidation or specific pH conditions (pH 8 to 9) to hydrogel By manufacturing (Production Example 2), it is technically significant that physical properties such as crosslinking speed, elasticity, and adhesive force could be efficiently controlled (Examples 1 and 3).
  • hyaluronic acid derivative or "hyaluronic acid-pyrogallol conjugate” is interpreted to include all of hyaluronic acid or a salt thereof in which a galol group is introduced into the skeleton of glucuronic acid of hyaluronic acid or a salt thereof. do.
  • the terminal of the disaccharide repeating unit of Formula 4 may be prepared by the reaction between the carboxy group and 5'- hydroxy dopamine.
  • the hyaluronic acid derivative prepared by the above reaction includes one or more repeating units represented by the following Chemical Formula 5, and may be represented by the following Chemical Formula 1.
  • R 1 is a hydroxy group or N is an integer from 1 to 1,000.
  • the molecular weight of the hyaluronic acid derivative may be 10,000 Da to 2,000,000 Da
  • the galol substitution rate of the hyaluronic acid derivative may be 0.1% to 50%, but is not limited thereto.
  • substitution rate means that a specific functional group of hyaluronic acid or a salt thereof is replaced or modified with a galolo group.
  • Substitution rate to galol group is defined as the ratio of the repeating unit in which galol group was introduce
  • hydrogel refers to a three-dimensional structure of a hydrophilic polymer having a sufficient amount of water, and for the purposes of the present invention, the hydrogel is formed between gallon-modified hyaluronic acid derivatives. Hydrogel is shown.
  • the process of preparing the hyaluronic acid hydrogel may be carried out by a crosslinking reaction of the hyaluronic acid derivative, and further comprising preparing a hyaluronic acid hydrogel precursor solution by mixing the hyaluronic acid derivative with PBS for the crosslinking reaction. It may include.
  • Such crosslinking may be formed into a hydrogel by chemical crosslinking, physical crosslinking or biological crosslinking by UV irradiation.
  • the chemical crosslinking by UV irradiation may include crosslinking using photo-crosslinking or reactive crosslinker
  • the biological crosslinking may include crosslinking using DNA or binding factor of heparin and growth factor or DNA.
  • Crosslinking using a complementary bond, and the like, and physical crosslinking may include crosslinking by hydrogen bonding, crosslinking by hydrophobic (hydrophobic) interaction, or crosslinking using electrostatic interaction, but preferably, an oxidizing agent or a pH adjusting agent. It can be added and crosslinked.
  • the oxidant may be sodium periodate, hydrogen peroxide, mustard peroxidase or tyrosinase
  • the pH adjusting agent may be sodium hydroxide, lithium hydroxide, potassium hydroxide, rubidium hydroxide, cesium hydroxide, magnesium hydroxide, calcium hydroxide, strontium hydroxide or Barium hydroxide may be, but is not limited thereto.
  • a crosslinked bond of the following formula 2 is formed between hyaluronic acid derivatives.
  • HA ' represents hyaluronic acid in which the carboxyl group is substituted with an amide group.
  • HA represents hyaluronic acid in which the carboxyl group is substituted with an amide group.
  • the hyaluronic acid hydrogel was prepared using the sodium iodate as the oxidizing agent or the sodium hydroxide as the pH adjusting agent in the crosslinking step of the hyaluronic acid derivative modified with gallo groups (see Preparation Example 2).
  • the hyaluronic acid hydrogel prepared according to each crosslinking method was able to confirm a marked difference in physical properties such as crosslinking speed, strength, elasticity, adhesiveness, and decomposition mode with excellent biocompatibility (see Examples 1 to 3). .
  • a filler composition comprising a hyaluronic acid derivative or hyaluronic acid hydrogel of the present invention.
  • the filler composition of the present invention is provided in a liquid or solution state in which a hyaluronic acid derivative having a galol group introduced thereon is mixed on an aqueous medium.
  • a cross-linking component when injected into the body, even if the solution does not contain a cross-linking component, it can play a role of replenishing the skin tissue and maintaining the moisture of the skin by forming a hydrogel with the body's oxidative power without variation between individuals.
  • the aqueous medium is Phosphate buffered saline (PBS) and the hyaluronic acid derivative is preferably 0.1% (w / v) to 20.0% (w / v), based on the total filler composition, More preferably, it may contain 0.3% (w / v) to 10.0% (w / v), but may be prepared by various modifications or alterations depending on the content ratios in aqueous media and filler compositions well known in the art.
  • PBS Phosphate buffered saline
  • the hyaluronic acid derivative is preferably 0.1% (w / v) to 20.0% (w / v), based on the total filler composition, More preferably, it may contain 0.3% (w / v) to 10.0% (w / v), but may be prepared by various modifications or alterations depending on the content ratios in aqueous media and filler compositions well known in the art.
  • filler refers to an injectable substance that replenishes skin tissue, such as by injecting a biocompatible material into the skin or subcutaneously to improve wrinkles and restore aesthetic appearance.
  • fillers for the preparation of fillers approved by the FDA or MFDS there are collagen, hyaluronic acid, calcium hydroxylapatite, polymatic acid, and the like.
  • hyaluronic acid is a substance similar to human components, and it can be used without skin reaction test, and it has the property of attracting 214 water molecules per molecule, which can effectively maintain the moisture of the skin. Accounted for%.
  • a hydrogel in the filler composition according to the present invention, by using a hyaluronic acid derivative having a galol group having a high oxidizing power, a hydrogel can be formed by oxidizing power in the body without the addition of a crosslinking agent, thereby improving biocompatibility, and forming a hydrogel formed in the body as described above.
  • the gel is able to maintain its shape in a transparent state for a long time (at least 6 months or more) shows excellent wrinkle improvement effect according to the characteristics of the hyaluronic acid described above, as well as excellent adhesion and body stability compared to the conventional filler products, There is a technical significance that it can stably scan the target site irrespective of the extrusion force (Examples 2 and 3).
  • the filler compositions of the present invention may be formulated in powder form, more specifically in lyophilized powder form, to provide ease of use and storage stability.
  • the filler composition requires a pretreatment step of dissolving and solubilizing in an aqueous medium such as PBS before injection into the skin, but it is also possible to directly apply the filler composition to be liquefied depending on the storage and formulation conditions.
  • the filler composition of the present invention may further comprise a cell growth factor or vitamin.
  • the cell growth factor is a generic term for polypeptides that promote cell division, growth, and differentiation, preferably fibroblast growth factor (FGF), epithelial growth factor (EGF), keratinocyte growth factor (KGF), Transforming growth factor alpha (TGF- ⁇ ), transforming growth factor beta (TGF- ⁇ ), granulocyte formation stimulating factor (GCSF), insulin-like growth factor (IGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), hepatocyte growth factor ( HGF), platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), and glial-derived neurotrophic factor (GDNF), the cell growth factor being from 20 ng / ml to It may be contained at a concentration of 20 ⁇ g / ml, but is not limited thereto.
  • FGF fibroblast growth factor
  • EGF epithelial growth factor
  • KGF keratinocyte growth factor
  • the filler composition of the present invention may further comprise a local anesthetic.
  • the topical anesthetics include ambucaine, amolanone, amylocaine, amylocaine, benoxinate, benzocaine, benzoxine, beoxycaine, biphenamine, Bupivacaine, butacaine, butamben, butamben, butanilicaine, butethamine, butethamine, butoxycaine, carticaine, chloroprocaine, Cocaethylene, Cocaine, Cyclomethicane, Dibucaine, Dimethisoquinone, Dimethocaine, Diferrodon, Dicyclonin, Exgonidine, Exgonin, Ethyl Chloride, Ethidocaine, Beta-Eucane, Eu Procin, phenalcomin, formocine, hexylcaine, hydroxytetracaine, isobutyl p-aminobenzoate, rheinokine
  • the filler composition of the present invention may further include an antioxidant to prevent oxidation and decomposition of the hydrogel formed by gelling in the body.
  • the antioxidant may be selected from the group consisting of polyols, mannitol, and sorbitol, the amount of the antioxidant is preferably from 0.1% to 5.0% by weight, more preferably from 0.2% to 1.0% by weight of the total filler composition It may be included in the wt%, but is not limited thereto.
  • the present invention comprises the steps of preparing a hyaluronic acid derivative by introducing a galol group into the skeleton of the glucuronic acid of hyaluronic acid; And adding the hyaluronic acid derivative to an aqueous medium to mix the same.
  • the step of adding and mixing the hyaluronic acid derivative to the aqueous medium in order to prevent gelation before the injection of the filler composition in the liquid state, preferably blocked contact with oxygen and other oxidation sources (for example , Injection of nitrogen gas) at about 4 ° C. to 28 ° C., and / or at a pH of 4 to 8.
  • oxygen and other oxidation sources for example , Injection of nitrogen gas
  • the aqueous medium is a phosphate buffered saline (PBS)
  • the hyaluronic acid derivative may be the formula (1) by the reaction between hyaluronic acid and 5'- hydroxy dopamine
  • the filler of the present invention The composition can be prepared by adding the aforementioned cell growth factor local anesthetics, antioxidants, vitamins, and combinations thereof.
  • the filler composition target site may be any part of the body, such as the face, neck, ears, chest, hips, arms, hands, etc. of the individual, and preferably, as the wrinkle area of the skin, the tear bone area, the brow
  • the wrinkle area, the eye area, the forehead area, the nasal area, the nasal wrinkle area, the lateral wrinkle area, and the neck wrinkle area may be any one selected from the group consisting of, but are not limited thereto.
  • "individual" means a subject in need of improvement of skin wrinkles, and more specifically, includes all of human or non-human primates and the like.
  • the filler composition of the present invention can be easily injected or injected into the target site irrespective of the extrusion force.
  • the filler composition may be injected intradermally or subcutaneously by using a needle or a cannula of various sizes, and as a filler injection method, for example, a serial punture that pierces several times little by little. Way; Linear threading method that advances the needle about 10mm and scans little by little while pulling backward; After stabbing once, the needle injected by the linear threading method can be used, such as a fanning method of repeatedly repeating the same method by twisting a slight angle without removing the needle.
  • a hyaluronic acid hydrogel prepared by crosslinking a hyaluronic acid derivative of Chemical Formula 1, hyaluronic acid hydrogel in which a crosslinking bond of Chemical Formula 2 is formed between hyaluronic acid derivatives; And it provides a drug delivery carrier, drug delivery system or tissue engineering support comprising the hyaluronic acid hydrogel.
  • a hyaluronic acid hydrogel prepared by crosslinking a hyaluronic acid derivative of Chemical Formula 1 may include: a hyaluronic acid hydrogel in which a crosslinking bond of Chemical Formula 3 is formed between hyaluronic acid derivatives; And it provides a drug delivery carrier, drug delivery system, or a tissue engineering support comprising the hyaluronic acid hydrogel.
  • the hyaluronic acid hydrogel of the present invention can be used as an artificial extracellular matrix as an effective skeleton for drug delivery, and can realize nano or micro-particulate forms by the excellent oxidation ability of the hyaluronic acid derivative in which the galol group is modified.
  • the drug is not particularly limited, but preferably a chemical, small molecule, peptide, antibody, antibody fragment, nucleic acid, including DNA, RNA or siRNA, protein, gene, virus, bacteria, antibacterial, antifungal, anticancer, anti-inflammatory, or Mixtures thereof, and the like, but are not limited thereto.
  • the hyaluronic acid hydrogel of the present invention can be used as a support for tissue engineering based on excellent elasticity and adhesion.
  • Tissue engineering means that a cell-support complex is prepared by culturing cells or stem cells isolated from a patient's tissue in a scaffold, and then transplanting the prepared cell-support complex again in vivo, wherein the hyaluronic acid Hydrogels can be implemented with supports similar to living tissue, in order to optimize the regeneration of living tissue and organs. Therefore, it can be used for gene therapy or cell therapy.
  • hydrogel of the present invention may be used as cosmetics and medical materials such as wound healing agents, wound coatings, anti-adhesion agents, or dental matrices, but is not limited thereto.
  • hyaluronic acid derivative modified with a gallolic group of the present invention was prepared. Specifically, hyaluronic acid (MW 200K, Lifecore Biomedical, IL, USA) is completely dissolved in water (TDW), 1 equivalent of NHS (N-hydroxysuccinimide, Sigma, St.
  • EDC, NHS, 5'-hydroxydopamine was converted into PBS and water-based dialysis (Cellu / Sep TM, dialysis membrane (6.8 kDa cut-off, Membrane Filtration Products Inc., Seguin, TX, USA)).
  • the solvent was evaporated through freeze-drying to prepare the hyaluronic acid derivative of the present invention.
  • FT-IR Fourier transform-infrared spectroscopy
  • H-NMR proton Nuclear magnetic Resonance
  • the newly formed amide bonds were confirmed through strong peaks in the frequency range of about 1,580 cm ⁇ 1 to 1,700 cm ⁇ 1 , and as shown in FIG.
  • the peaks in the vicinity confirmed the structures of the aromatic benzene rings and -CH 2 CH 2 -of 5'-hydroxydopamine, respectively. From the above results, it can be seen that the hyaluronic acid derivative of the present invention introduces 5'-hydroxydopamine into an amide bond formed by the carboxyl group of hyaluronic acid and the amine period of 5'-hydroxydopamine.
  • the HA-PG conjugate was dissolved in PBS (pH 5) at 1 mg / ml and the absorbance of the solution was 283 nm (UV-visible spectrophotometer (Cary 100 UV-vis). , Varian Inc., Palo Alto, CA, USA) Standard curves obtained by serial dilution of 5-hydroxydopamine solution (from 1 mg / mL concentration) of% carboxyl in HA substituted with PG Calculated using.
  • the hyaluronic acid hydrogel was prepared by cross-linking the hyaluronic acid derivative of Preparation Example 1, wherein the cross-linking method was a hydroxide of sodium periodate (NaIO 4 ) or a pH regulator (pH 8-9), which is an oxidizing agent. Sodium (NaOH) was used respectively. Specifically, after dissolving the hyaluronic acid derivative in PBS (1% (w / v), 2% (w / v)), 4.5 mg / ml of NaIO 4 Alternatively, the crosslinking was carried out while mixing 0.08 M NaOH in a ratio of 1.5: 1 to 4: 1 relative to the volume of the hyaluronic acid derivative solution, and as shown in FIG. 3, light brown or blue color hyaluronic acid hydrolysis was performed through each of them. Gels were prepared.
  • the cross-linking method was a hydroxide of sodium periodate (NaIO 4 ) or a pH regulator (pH 8-9), which is an
  • the viscoelastic coefficient of hyaluronic acid was analyzed by measuring the storage modulus (G ′) and loss modulus (G “) in the frequency sweep mode in the frequency range of 0.1 to 1 Hz.
  • Gelation kinetics of HA-PG were measured in a time sweep mode at a controlled strain and frequency of 10% and 1 Hz, respectively, with rheometers (MCR 102, Anton Paar, VA, USA). Two oxidants (NaIO 4 and NaOH) were added 30 minutes after the initial measurement of G 1 and G ”.
  • hyaluronidase hyaluronidase (5 units / mL, Sigma)
  • NaIO 4 NaOH
  • the substitution rate of is increased, the swelling rate and the decomposition rate tend to decrease.To sum up these results, even when using hyaluronic acid derivatives of the same structure, the hydrogel is crosslinked with different binding forms depending on the crosslinking method.
  • hADSC human adipose-derived stem cell
  • hADSC Mesenchymal Stem Cell Basal Medium
  • ATCC Mesenchymal Stem Cell Basal Medium
  • ATCC Mesenchymal Stem Cell Basal Medium
  • ATCC Mesenchymal Stem Cell Basal Medium
  • ATCC Mesenchymal Stem Cell Basal Medium
  • ATCC Mesenchymal Stem Cell Basal Medium
  • ATCC Mesenchymal Stem Cell Basal Medium
  • ATCC Mesenchymal Stem Cell Basal Medium
  • Invitrogen Incubated.
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor secreted by an inflammatory response after co-culture of immune cells (Raw 264.7) on a hydrogel using a transwell system (permeable supports with 3.0 ⁇ m pores, Corning, New York, NY, USA)
  • the amount of TNF- ⁇ was measured using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Raw 264.7 cells were incubated overnight, then seeded onto a 96-well plate (2.0 ⁇ 10 4 cells per well), loaded with 50 ⁇ l of hydrogel through the top insert of the transwell and further incubated for 24 hours.
  • the amount of TNF- ⁇ in the media collected from the coculture was quantified using a TNF- ⁇ enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA).
  • PG-HA hydrogel of in vivo 100 ⁇ l of HA-PG hydrogel (final concentration of 2% [w / v]) formed by NaIO 4 or NaOH was implanted subcutaneously in ICR mice.
  • Mice (5-week-old male, OrientBio, Seongnam, Korea) Ketamine (100 mg / kg, Yuhan, Seoul, Korea) and xylazine (20 mg / kg, Bayer Korea, Ansan, Korea).
  • hyaluronic acid constructs were recovered with adjacent tissues at predetermined time points (0, 7, 14, 28, and 84 days).
  • the recovered hyaluronic acid was fixed in 4% paraformaldehyde (Sigma) for 2 days, embedded in an OCT compound (Leica Biosystems, Wetzlar, Hesse, Germany), and cut into 6 ⁇ m thick.
  • OCT compound Leica Biosystems, Wetzlar, Hesse, Germany
  • Toluidine blue staining was performed to investigate the immune response after HA-PG hydrogel implantation.
  • hyaluronic acid hydrogels differing in cross-linking mode (NaIO 4 / NaOH) and the molar ratios (0.5X, 1X) of reacted 5'-hydroxydopamine were implanted subcutaneously into mice. On the day of transplantation, mice were sacrificed one week, four weeks, and twelve weeks thereafter, and each hydrogel was collected, the degree of swelling thereof was visually checked, and the remaining amount was calculated in vivo. Was analyzed.
  • Example 2 The results of Examples 2 and 3 suggest that the hyaluronic acid hydrogel according to the present invention can be used in the field of biomaterials such as drug carriers, tissue engineering supports, and the like.
  • the hydrogel formed by NaIO 4 showing a fast cross-linking rate and in vivo degradation aspect is a carrier for drug delivery in the form of microparticles, excellent adhesion and slow
  • the hydrogel formed by NaOH, showing degradation in vivo may be utilized as a tissue for tissue engineering.
  • a drug delivery formulation in the form of ultra-fine particles having a diameter of nano or micro units and to determine its efficacy.
  • HA-PG hyaluronic acid derivative solution
  • NaIO 4 an oxidizing agent
  • HA-PG solution and protein (bovine serum albumin (BSA) were mixed and made into an emulsion form, and then crosslinked by adding an oxidizing agent (NaIO 4 ) to prepare BSA-enclosed microparticles.
  • an oxidizing agent NaIO 4
  • the protein release pattern of the microparticles was confirmed.
  • FIG. 14a through the above manufacturing process was produced microparticles containing the component of the hyaluronic acid hydrogel, and remained unchanged even after the lyophilization process (Fig. 14a).
  • the encapsulated protein was hardly released in the HA-PG bulk hydrogel, whereas it was confirmed that the protein was released at a constant rate in the HA-PG particle (FIG. 14B).
  • the hydrogel formed by the microparticulate NaIO 4 may be used as a drug delivery agent.
  • HA-PG hydrogel polar particles to NaIO 4-mediated cross-linking of the high-speed gel - the use of the oil-in-water (oil / water) emulsion methods form prepared by (FIG. 15 (a).
  • HA-PG microparticles can be prepared by simply adding to a water-in-oil emulsion of HAPG solution. Rapid chemical crosslinking of HAPG emulsion with NaIO 4 in oil phase results in moisture A large amount of HA particles sub-micro are produced in. The resulting HA-PG microparticles exhibited a sphere having an average diameter of 8.8 ⁇ m ( ⁇ 3.9 ⁇ m) (FIG.
  • vascular endothelial growth factor (VEGF) was released slowly for 60 days, while HA-PG in bulk form was hardly released from the hydrogel constructs (Fig. 15 (c)).
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • HA-PG microparticles incorporated with VEGF were applied to promote therapeutic angiogenesis in peripheral vascular disease.
  • Intramuscular injection of VEGF containing HA-PG microparticles showed a markedly improved therapeutic effect in a model of lower limb ischemia prepared by femoral artery excision and ligation.
  • Mice were obtained from Orient Bio ((Balb / c, 6-week-old female, OrientBio). Four weeks after injection, any leg amputation or tissue necrosis was found in the group treated with HAPG microparticles containing VEGF.
  • the HA-PG solution prepared in Preparation Example 1 was injected subcutaneously, and it was then confirmed whether the injected HA-PG solution could proceed in the body without the addition of a crosslinking agent.
  • the body conditions by measuring the weight change of the formed HA-PG hydrogel for about 6 months, it was confirmed whether the formed HA-PG hydrogel can be maintained in the body for a long time.
  • the HA-PG solution injected subcutaneously in the liquid state gelled within 5 minutes to form HA-PG hydrogel in the body, and the formed HA-PG hydrogel was in a transparent state. As a result, it was well maintained in the body for 6 months without any significant weight difference.
  • FIG. 22 when the HA-PG solution is exposed to oxidative conditions in the body, gallon period quinones having strong self-oxidation ability are easily formed to polymerize hyaluronic acid and form HA-PG hydrogels. .
  • the filler composition of the present invention can be used in the form of a solution, so that it is easier to inject into the skin, and may contain various additional ingredients And it was found. That is, the HA-PG solution of the present invention was able to form a hydrogel in the body without the addition of a crosslinking agent, and was able to be stably maintained, thereby confirming the applicability to the filler composition.
  • Example 5-1 Based on the results of Example 5-1, the effect of improving the wrinkles of the HA-PG solution was to be confirmed. Specifically, Calcitriol was administered to hairless mice five times a week at 0.2 ⁇ g / day for a total of six weeks to cause wrinkles on the skin. Thereafter, HA-PG solution was injected subcutaneously into the skin, and the wrinkle-induced skin before and after injection was templated with a replica, and the area, length, and depth of the wrinkles were measured using a wrinkle analysis machine and compared. As a result, as shown in FIG. 23, the area, length, and depth of the wrinkles before injection of the HA-PG solution were about 6 mm 2, about 36 mm, and about 90 ⁇ m, respectively, respectively, after injection of HA-PG solution.
  • HA-PG solution of the present invention can be utilized as a composition for fillers for improving skin wrinkles.
  • HA-PG hydrogels based on hyaluronic acid derivatives 200 KDa, 1 MDa having various molecular weights and filler products commercially available (Megafill, Perlane) ) Body maintenance and degradation patterns were measured for about 9 months and compared.
  • adhesion of the HA-PG solution of the present invention and the hydrogel produced by the Perlane product was compared with the adhesion or fixation of the body.
  • epidermal growth factor (EGF; 20 ng / ml, 1 ⁇ g / ml, 20 ⁇ g / ml) was added to the skin of the hairless mouse in which the wrinkles were induced by the method of Example 5-2.
  • the encapsulated HA-PG solution was injected, and the wrinkle-induced skin before and after injection was templated with a replica, and the area, length, and depth of the wrinkles were measured and compared using a wrinkle analysis machine.
  • One month after injection of HA-PG solution the skin tissue was taken to prepare OCT frozen sections, and then subjected to pathological examination through H & E (Hematoxylin & eosin) staining.
  • the hairless mice were injected with HA-PG solution, HA-PG solution, and Perlane, which was previously injected with EGF (10 ⁇ g / ml), and H & E and MT (Masson's trichrome) in the same manner as above.
  • EGF 10 ⁇ g / ml
  • H & E and MT Masson's trichrome
  • HA-PG solution was applied to a wound-induced animal model in which the back skin of the mouse was cut to a size of 1 cm x 1 cm, and then crosslinked using the surrounding active oxygen. , Hydrogel formation of the wound site and adhesion was confirmed accordingly. As a result, as shown in Figure 34, the hydrogel film is formed within 10 minutes of applying the HA-PG solution to the wound site, it was confirmed that the stable adhesion through this.
  • the HA-PG solution of Preparation Example 1 was lyophilized to prepare a filler composition in powder form. Thereafter, the filler composition in powder form was dissolved in PBS (pH7) and resolubilized, and then injected into the subcutaneous mouse to observe whether hydrogel was formed. As a result, as shown in Figure 36, re-solubilized in the freeze-dried powder state, the filler composition of the present invention was confirmed that the cross-linked by the body's oxidative power as in the past to form a hydrogel.
  • the HA-PG solution of Preparation Example 1 was stored at room temperature (25 ° C.) or refrigerated (4 ° C.), and then gelation was confirmed in the storage container.
  • the HA-PG solution is frozen (-80 °C)
  • the solution was injected subcutaneously in mice to observe the formation of hydrogels. As a result, as shown in FIG.
  • the filler composition of this invention gelatinized within 1 day at room temperature and 3 days in a refrigerated state by high oxidizing power.
  • gelation did not proceed even after 3 days in the refrigerated state, and the HA-PG solution was stored in the frozen state and then thawed after 10 days.
  • the filler composition of the present invention can be stored for a longer period of time under oxygen-blocked conditions or in a frozen state.

Abstract

본 발명은 피로갈롤 (PG) 모이어티 (pyrogallol moiety)로 컨쥬게이션 된 히알루론산 (HA, hyaluronic acid)을 기재로 하는 하이드로젤 플랫폼을 제공한다. 본 발명의 HA-PG 컨쥬게이트는 산화제를 사용하거나 pH 조절하는 두가지 서로 다른 방법에 의해 신속하게 가교 될 수 있다. 본 발명의 하이드로젤은 우수한 생체 적합성과 함께, 각각의 가교 방식에 따라 가교 속도, 탄성, 접착력 등의 물리적 특성을 효율적으로 조절할 수 있다. 본 발명의 하이드로젤은 이러한 우수한 안정성과 기능성을 바탕으로 약물전달, 창상치료제 또는 유착방지제와 같은 생물의약소재, 의료, 및 화장품 등을 포함하는 다양한 분야에 이용될 수 있을 것이다.

Description

갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체를 기재로 하는 하이드로젤 및 이의 용도
본 발명은 갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체를 기재로 하는 하이드로젤 및 이의 용도에 관한 것이다.
의료 및 바이오산업, 화장품 등의 산업의 시장이 급격하게 확대됨에 따라 기능성 생물소재 (biomaterials)에 대한 관심이 증가하고 있다. 특히, 독성이나 부작용을 유발할 수 있는 화학적 합성 고분자보다 안정성이 확보된 천연 고분자를 이용한 생체적합소재에 대한 개발이 보다 더 각광받고 있는 실정이다.
생체적합소재로서 히알루론산에 대한 다양한 연구 및 개발이 수행되어 왔다. 히알루론산은 생체유래 고분자로서 생체 적용시 부작용이 거의 발생하지 않으며, 포함된 당의 화학 구조식으로 인해 친수성이다. 또한, 수분을 많이 함유하여 관절에서 물리적 완충효과 및 마찰에 대한 윤활효과를 가지며, 피부의 유연성에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한, 외부로부터의 세균 침입에 대한 보호특성이 있고, 생체 내의 히알루론산 효소 (hyaluronidase)에 의해 생체 내 이식시 생분해되며, 다양한 약물을 히알루론산과 결합시킴으로써 약물 전달 시스템의 중요한 소재로 활용되고 있다. 특히, 히알루론산이 미국 식품의약품안전청의 승인을 받은 이후로, 의료용 생체재료, 조직공학용 지지체의 소재 및 약물전달용 고분자로 폭넓게 활용하고 있다. 또한, 히알루론산은 피부의 여러 상이한 층에 풍부하게 존재하며, 예를 들어, 수분을 공급하는 기능, 세포외 매트릭스의 조직을 보조하는 기능, 충전 물질로 작용하는 기능, 및 조직 재생 메커니즘에 관여하는 기능과 같은 복합적인 기능을 갖는다. 그러나 노화와 더불어, 피부에 존재하는 히알루론산, 콜라겐, 엘라스틴, 및 그 밖의 매트릭스 중합체의 양은 감소한다. 예를 들어, 태양으로부터의 자외선에 대한 반복적인 노출은 진피 세포로 하여금 이들의 히알루론산 생산을 감소시키는 것은 물론이고, 이의 분해 속도를 증가시키게 한다. 이러한 물질의 손실은 주름, 구멍, 수분 손실, 및/또는 노화에 기여하는 기타 바람직하지 않은 상태를 유발한다. 따라서, 피부 상태의 개선을 위한 방법 중 하나로서, 히알루론산을 주요 성분으로 하는 필러 조성물이 널리 사용되고 있다.
종래의 히알루론산 관련 기술로서, 비스에폭사이드, 비스할라이드, 포름알데히드 등과 같이 작용기가 두 개인 화합물을 사용하여 가교 결합된 불용성 히알루론산 유도체를 합성한 예가 여러 문헌에 보고되었다. 특히, 미국특허 제4,582,865호는 히알루론산의 가교를 위해서 디비닐술폰을 사용한 예를 개시하고 있으며, 미국특허 제4,713,448호에는 포름알데히드를 이용한 가교반응, 미국특허 제5,356,883호는 다양한 카르보디이미드를 사용하여 O-아실우레아 또는 N-아실우레아로 카르복실기가 변형된 히알루론산 유도체 젤의 합성예를 개시하고 있다. 그러나 이들 특허에서의 방법으로 제조된 히알루론산 가교물은 히알루론산 분해효소에 대한 안정성이 낮고 미반응 화학 물질의 함량이 높기 때문에 생체 독성을 유발할 우려가 있었다. 또한, 사용하고자 하는 용도에 맞는 가교의 조절이나 물성 조절이 용이하지 않아 다양한 의료용 소재로 적용함에는 한계가 있었다. 따라서, 우수한 생체적합성을 유지하면서도 히알루론산 하이드로젤의 물성을 용이하게 조절할 수 있는 기술에 대한 개발이 여전히 요구되고 있는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 이러한 문제를 해결하기 위해, 생체적합성 물질인 히알루론산의 기능성을 향상시킬 수 있는 기술을 개발하고자 부단히 노력하였다. 그 결과, 피로갈롤기로 수식된 히알루론산 기반의 하이드로젤 플랫폼 기술을 개발하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이와 같이, 본 발명의 목적은, 히알루론산을 피로갈롤기로 수식하여 제조된 히알루론산 유도체 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 히알루론산 유도체를 가교시키는 것을 포함하는, 히알루론산 유도체 하이드로젤의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 히알루론산 유도체가 가교된 구조를 갖는 히알루론산 유도체 하이드로젤에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 히알루론산 유도체 하이드로젤을 이용한 약물전달용 담체 또는 약물전달시스템 (DDS, Drug Delivery System)을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 히알루론산 유도체 하이드로젤을 이용한 포함하는 조직 공학용 지지체 등의 의료용 소재를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 히알루론산 유도체 기반의 창상 치료제 (wound dressing) 또는 유착방지제 (adhesion barrier)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 히알루론산 유도체 하이드로젤을 포함하는 필러 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 필러 조성물을 개체의 피내 또는 피하에 주입하는 단계를 포함하는, 피부 주름의 개선방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체를 가교시키는 단계를 포함하며, 상기 히알루론산 유도체는 히알루론산과 5'-하이드록시도파민간 반응에 의해 갈롤기로 수식되어 있는, 히알루론산 하이드로젤의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 히알루론산 유도체는 하기 화학식 1일 수 있으며, 여기서, 상기 히알루론산 유도체의 분자량은 10,000Da 내지 2,000,000Da일 수 있고, 상기 히알루론산 유도체의 갈롤기 치환율은 0.1% 내지 50%일 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2018001473-appb-I000001
(상기 화학식 1에서, R1은 하이드록시기 또는
Figure PCTKR2018001473-appb-I000002
이고, n은 1 내지 1000의 정수이다.)
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 가교시키는 단계는 산화제 또는 pH 조절제를 첨가하여 가교시킬 수 있고, 상기 산화제는 과요오드산나트륨, 과산화수소, 겨자무과산화효소 또는 타이로시나아제일 수 있고, 상기 pH 조절제는 수산화나트륨, 수산화리튬, 수산화칼륨, 수산화루비듐, 수산화세슘, 수산화마그네슘, 수산화칼슘, 수산화스트론튬 또는 수산화바륨일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 산화제를 첨가하여 가교시키는 단계는, 히알루론산 유도체간 하기 화학식 2의 가교 결합을 형성할 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2018001473-appb-I000003
(상기 화학식 2에서, HA'는 카르복시기가 아마이드기로 치환된 히알루론산을 나타낸다.)
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 pH 조절제를 첨가하여 가교시키는 단계는, 히알루론산 유도체간 하기 화학식 3의 가교 결합을 형성할 수 있다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2018001473-appb-I000004
(상기 화학식 3에서, HA'는 카르복시기가 아마이드기로 치환된 히알루론산을 나타낸다.)
또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 히알루론산 유도체를 가교시켜 제조된 히알루론산 하이드로젤로서, 예를 들어, 히알루론산 유도체간 상기 화학식 2 또는 화학식 3의 가교 결합이 형성되어 있는 히알루론산 하이드로젤; 및 상기 히알루론산 하이드로젤을 포함하는 생체활성물질의 전달을 위한 담체를 제공한다. 이러한 관점에서 본 발명의 일 실시예에서, 상기 약물전달용 담체는, 항체, 항체단편, 단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 저분자화합물 (small molecule chemical compound), DNA 및/또는 RNA, siRNA, 유전자, 및 성체줄기세포, 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cells) 또는 유도만능줄기세포 (iPSC)를 포함하는 줄기세포를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 관점에서 본 발명의 다른 일 실시예는, 상기 생체활성물질의 전달을 위한 담체는 생체활성물질의 생체 내 및 생체 외에서 서방형 방출 (sustained release)을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 히알루론산 유도체를 가교시켜 제조된 히알루론산 하이드로젤로서, 예를 들어, 히알루론산 유도체간 상기 화학식 2 또는 화학식 3의 가교 결합이 형성되어 있는 히알루론산 하이드로젤; 및 상기 히알루론산 하이드로젤을 포함하는 조직 공학용 지지체를 제공한다.
또한, 본 발명은 갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체 또는 이를 가교시켜 제조한 히알루로산 유도체 하이드로젤을 포함하는, 필러 조성물을 제공한다.
이러한 목적에 따르는 본 발명의 일 실시예에서, 상기 히알루론산 유도체의 분자량은 10,000 Da 내지 2,000,000 Da일 수 있고, 상기 히알루론산 유도체의 피로갈롤기 치환율은 0.1% 내지 50%, 바람직하게는 1% 내지 30%이며, 더욱 바람직하게는 2% 내지 20%일 수 있다. 본 발명의 다른 실시예에서, 상기 히알루론산 유도체는, 전체 필러 조성물에 대하여 0.1%(w/v) 내지 15%(w/v)로 함유될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 필러 조성물은 체외에서 액체 상태이고, 체내에서 가교제 없이 겔화 상태를 형성할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 필러 조성물은, 눈물골 영역, 미간 주름 영역, 눈가 영역, 이마 영역, 콧등 영역, 코옆 주름 영역, 입옆 주름 영역, 및 목 주름 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 부위에 주입될 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 필러 조성물은, 섬유아세포 성장인자(FGF), 상피세포 성장인자(EGF), 케라티노사이트 성장인자(KGF), 형질전환 성장인자 알파(TGF-α), 형질전환 성장인자 베타(TGF-β), 과립구 형성 자극인자(GCSF), 인슐린 유사 성장인자(IGF), 혈관내피 성장인자(VEGF), 간세포 성장인자(HGF), 혈소판 유래 성장인자-BB(PDGF-BB), 뇌 유래 신경영양인자(BDNF), 및 아교세포 유래 신경영양인자(GDNF)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 세포 성장인자를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 필러 조성물은, 국소 마취제, 항산화제, 비타민, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 성분을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 히알루론산의 글루쿠론산의 골격에 피로갈롤기를 도입하여 히알루론산 유도체를 제조하는 단계; 및 상기 히알루론산 유도체를 수성 매질에 첨가하여 혼합하는 단계를 포함하는, 필러 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 필러 조성물을 개체의 피내 또는 피하에 주입하는 단계를 포함하는, 피부 주름의 개선방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체 또는 이를 가교시켜 제조한 히알루로산 유도체 하이드로젤을 포함하는, 창상치료제 (wound dressing) 또는 유착방지제 (adhesion barrier)를 제공한다.
본 발명에 따른 히알루론산 하이드로젤의 제조 기술은, 갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체를 기초로 하여, 적절한 산화 또는 특정 pH 조건 하에서 이를 가교시키는 단계를 포함한다. 본 발명은 하이드로젤의 우수한 생체 적합성과 함께, 각각의 가교 방식에 따라 가교 속도, 탄성, 접착력 등의 물리적 특성을 효율적으로 조절할 수 있어, 의료 및 화장품 등 다양한 분야에 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 히알루론산 유도체의 합성 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 히알루론산 유도체의 구조를 (a) FT-IR 또는 (b) H-NMR으로 분석한 결과이다.
도 3은 서로 다른 가교 방식에 의한 히알루론산 하이드로젤의 외관 및 가교 결합의 변화를 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 4는 NaIO4를 이용한 히알루론산 하이드로젤의 제조 과정에서, (a) 화학 구조의 변화를 UV-vis으로 분석한 결과, 및 (b) 상기 결과에 기초한 가교 메커니즘을 나타낸 도이다.
도 5는 NaOH를 이용한 히알루론산 하이드로젤의 제조 과정에서, (a) 화학 구조의 변화를 UV-vis으로 분석한 결과, 및 (b) 상기 결과에 기초한 가교 메커니즘을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명에 따른 히알루론산 하이드로젤의 형성 속도를 확인한 것으로서, (a) 시간의 경과에 따른 하이드로젤의 형성을 육안으로 확인한 결과, 및 (b) 시간의 경과에 따른 탄성 계수의 변화를 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 히알루론산 하이드로젤의 강도 및 탄성을 확인한 것으로서, (a) 0.1 내지 1Hz에서 탄성 계수의 변화를 확인한 결과, 및 (b) 탄성계수와 tan δ (G''/G')를 비교한 결과이다.
도 8은 히알루론산 유도체의 분자량 및 농도에 따른 NaIO4로 가교된 히알루론산 하이드로젤의 강도 및 탄성의 변화를 확인한 것으로서, (a) 0.1 내지 1Hz에서 탄성 계수의 변화를 확인한 결과, 및 (b) 탄성계수와 tan δ (G''/G')를 비교한 결과이다.
도 9는 본 발명에 따른 히알루론산 하이드로젤의 접착력을 확인한 것으로서, (a) 플레이트간 거리에 따라 유변학 기기로 가해지는 힘의 변화를 측정한 결과, 및 (b) 접착력을 정량화하여 평가한 결과이다.
도 10은 본 발명에 따른 히알루론산 하이드로젤의 팽윤 및 분해 양상을 확인한 것으로서, 히알루론산의 몰 농도 대비 (a) 0.5X 또는 (b) 1.0X의 5-하이드록시도파민을 첨가하여 합성된 히알루론산 유도체를 이용하여 제조된 히알루론산 하이드로젤의 팽윤율과 분해율을 정량화하여 평가한 결과이다.
도 11은 본 발명에 따른 히알루론산 하이드로젤의 세포 독성 및 염증 반응 유발 여부를 확인한 것으로서, (a) 및 (b)는 각각 HAPG 하이드로젤의 독성을 평가하기 위해 세포를 encapsulation 한 후 1, 3, 및 7일 째의 Live/Dead 염색 (스케일 바 = 100 ㎛) (a) 및 hADSCs 생존력 (b)를 나타낸다. (c)는 NaIO4 또는 NaOH 용액으로 가교된 HA-PG 하이드로젤과 공배양시, 대식세포 (RAW 264.7)로부터 분비된 TNF-α의 정량화를 위한 효소 링크된 면역흡착 어세이 결과이다 (n = 4, **p < 0.01 vs LPS group).
도 12는 본 발명에 따른 히알루론산 하이드로젤의 생체 내 적합성을 확인한 것으로서, (a)는 마우스의 피하영역으로부터 피하영역에 이식된 후 0, 7, 28, 및 84일째에 회수된 HA-PG 하이드로젤 (DS 8%)의 형태를 나타낸 것이다. (b)는HA-PG의 in vivo 생분해 프로파일을 나타낸다. (c) 및 (d)는 각각 이식 후 28일째에 인접하는 조직과 함께 회수한 하이드로젤의 H&E 염색 (c 및 톨루이딘 블루 염색 (d)을 나타낸다 (스케일 바 = 300 ㎛).
도 13은 본 발명에 따른 히알루론산 하이드로젤의 생체내 분해 양상을 확인한 것으로서, 마우스 피하에 이식한 후 (a) 육안으로 하이드로젤의 부피 변화를 확인한 결과, 및 (b) 잔존 하이드로젤의 중량을 확인한 결과이다.
도 14는 NaIO4를 이용한 하이드로젤을 약물 전달용 제제로의 활용 가능성을 확인한 것으로서, (a) 동결 건조 전 또는 후, 극미립자의 형성 및 존재 여부를 확인한 결과, 및 (b) 상기 극미립자에 봉입된 BSA의 방출량을 확인한 결과이다.
도 15는 NaIO4를 이용한 하이드로젤을 약물 전달용 제제로의 활용 가능성을 확인한 것으로서, (a) NaIO4를 이용한 가교반응을 나타내고, (b) HA-PG 극미립자의 형성 (스케일바 - 50 ㎛)을 나타내는 현미경사진이며, (c) 벌크 HA-PG 하이드로젤 또는 HA-PG 극미립자로부터 방출된 VEGF의 누적량을 나타낸 것이다 (PBS, 37℃) (n=4)이다.
도 16은 하지 허혈 (hindlimb ischemia) 마우스 모델에서 NaIO4를 이용한 하이드로젤을 VEGF 전달 및 치료효과를 나타낸 것으로서, (a) VEGF를 포함하는 HA-PG 극미립자를 근육 주입하고 0일째 (약물 주입일) 및 28일째 관찰한 결과를 나타내는 사진이며, (b) 상기 결과를 수치화 하여 나타낸 것이고 (n = 4-5), (c) H&E 염색 및 MT 염색 결과를 정상의 마우스 조직을 대조군으로 하여 나타낸 것이며 (스케일 바 - 100 ㎛). (d) 허혈인 다리에서 섬유증 역역을 정량화 하여 나타낸 것이고 (n = 12, **p < 0.01 vs PBS group, ##p < 0.01 vs HA.PG group, and @p < 0.05 vs VEGF group), (e) 허혈인 다리의 근육을 α-SMA (arteriole formation) 및 vWF (capillary formation)에 대해 면역염색한 사진이다. 검은색 화살표는 허혈 조직에서 소동맥 (α-SMA positive) 및 모세혈관 (vWF positive) 형성을 각각 나타낸다 (스케일 바 = 100 ㎛). (f)는 허혈성 근육에서 α-SMA 양성으로 염색된 루멘과 vWF 양성 모세혈관의 수를 나타낸다 (n = 18.20, *p < 0.05, and **p < 0.01 vs PBS group, ##p < 0.01 vs HA.PG group, and @p < 0.01 vs VEGF group).
도 17은 NaOH-매개 가교를 이용한 조직 접착성 HA-PG 하이드로젤의 제조를 도시한다. (a) NaOH-매개 가교에 의한 히알루론산 유도체 하이드로젤 형성을 도시한다. (b) NaOH 또는 NaIO4에 의해 가교된 히알루론산 유도체 하이드로젤의 접착력을 비교한 것이다. (c)는 각 HA-PG 하이드로젤의 평균 분리강도를 비교한 것이다 (n = 3, **p < 0.01 vs NaIO4 group).
도 18에서 (a)는 NaOH-유도된 HA-PG 하이드로젤의 접착 화학 (adhesion chemistry)을 간략하게 도시한 것이고, (b)는 다양한 마우스 기관 (심장, 신장 및 간)에 대한 직접적인 접착을 나타낸 사진이다.
도 19에서 (a)는 NaOH-유도된 HA-PG 하이드로젤을 마우스 간 표면에 도표하고 7일 후에 간 조직 표면상에 부착된 하이드로젤을 H&E 염색한 결과이다 (스케일 바 = 500 ㎛). (b)는 NaOH에 의해 가교된 HA-PG를 사용하여 마우스 간 위에 hADSCs (human adipose tissue-derived stem cells)를 이식한 후, 본래의 간 조직 및 본 발명의 하이드로젤 구조물 내 hADSCs의 면역염색를 함께 나타낸 것이다. 이식 전에 Dil로 표지된 세포들이 검출되었다 (완쪽). CD44에 대해 면역염색하고 세포 핵을 DAPI로 카운터염색하였다 (오른쪽) (스케일 바 = 500 ㎛)
도 20은 본 발명에 따른 HA-PG 용액의 체내 산화력에 의한 겔화를 나타낸 것으로서, 도 20a는 HA-PG 용액의 주사 및 체내 산화력에 의한 겔화를 나타낸 도이고; 및 도 20b는 체내에서 형성된 하이드로젤을 포함하는, 마우스의 피부를 육안으로 확인한 결과이다.
도 21은 본 발명에 따른 HA-PG 용액을 피부에 주사한 후, 체내 형성된 하이드로젤의 체내 유지 여부를 확인한 것으로서, 도 5a는 체내에 형성된 하이드로젤을 육안으로 확인한 결과이고 (Week 0, 10, 24); 및 도 5b는 체내에 형성된 하이드로젤의 무게 변화를 약 6개월 동안 측정한 결과이다.
도 22는 본 발명에 따른 HA-PG 용액의 HA-PG 하이드로젤의 형성 및 체내 주사를 위한 조건을 확인한 것으로서, 도 22a는 HA-PG 하이드로젤의 형성 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이고; 및 도 22b는 체내 주사 가능한 주사 바늘의 크기를 기존의 필러 제품(Megafill, Perlane)과 비교한 결과이다.
도 23은, 본 발명에 따른 HA-PG 용액을 피부에 주사한 후, 주사 전과 후의 주름 개선 효과를 확인한 것으로서, 도 23a는 주름이 유발된 피부를 레플리카로 주형화하여 비교한 결과이고; 및 도 23b는 주름의 면적, 길이, 및 깊이를 정량화하여 비교한 결과이다.
도 24는 기존의 필러 제품(Megafill, Perlane)과 체내 유지능을 비교한 것으로서, 도 24a는 본 발명에 따른 HA-PG 용액(200KDa, 1MDa), Megafill 제품, Perlane 제품을 피부에 주사한 후, 체내에 형성된 하이드로젤을 육안으로 확인한 결과이고 (D0, 14, 28, 56, 84, 168, 252); 및 도 24b는 체내에 형성된 하이드로젤의 무게 변화를 약 9개월 동안 측정한 결과이다.
도 25는, 기존의 필러 제품 (Megafill, Perlane)과 체내 유지능을 비교한 것으로서, 도 25a는 본 발명에 따른 HA-PG 용액 (200KDa, 1MDa), Megafill 제품, Perlane 제품을 피부에 주사한 후, 체내에 형성된 하이드로젤을 육안으로 확인한 결과이고 (D0, 14, 28, 56, 84, 168); 및 도 25b는 체내에 형성된 하이드로젤의 부피 변화를약 9개월 동안 측정한 결과이다.
도 26은, 체내 형성된 하이드로젤의 체내 접착력을 확인한 것으로서, 도 26a는 Perlane 제품의 결과이고; 및 도 26b는 HA-PG 용액 (200 KDa, 1 MDa)의 결과이다.
도 27은, 기존의 필러 제품 (Megafill, Perlane)과 주사 가능성을 비교한 것으로서, 다양한 크기의 주사바늘 (21, 25, 29, 30G)을 이용하여 본 발명에 따른 HA-PG 용액 (200 KDa, 1 MDa), Megafill 제품, Perlane 제품을 주사하면서, 압출력 변화를 확인한 결과이다.
도 28는, 기존의 필러 제품 (Megafill, Perlane)과 주사 가능성을 비교한 것으로서, 도 28a는 30G의 주사바늘을 이용하여 본 발명에 따른 HA-PG 용액 (200 KDa, 1M Da), Megafill 제품, Perlane 제품을 주사하면서, 압출력 변화를 확인한 결과이고; 및 도 28b는 29G의 주사바늘을 이용하여 본 발명에 따른 HA-PG 용액 (200 KDa, 1MDa), Megafill 제품, Perlane 제품을 주사할 때, 압출력 변화를 확인한 결과이다.
도 29는 기존의 필러 제품 (Megafill, Perlane)과 주사 가능성을 비교한 것 으로서, 도 29a는 다양한 크기의 주사바늘 (21, 25, 29, 30G)을 이용하여 본 발명 에 따른 HA-PG 용액 (200 KDa, 1M Da), Megafill 제품, Perlane 제품을 주사하면서, Break Loose Force를 비교한 결과이고; 및 도 29b는 다양한 크기의 주사바늘 (21, 25, 29, 30G)을 이용하여 본 발명에 따른 HA-PG 용액 (200 KDa, 1 MDa), Megafill 제품, Perlane 제품을 주사할 때, Dynamic Glide Force를 비교한 결과이다.
도 30은 본 발명에 따른 상피세포 성장인자 (20 ng/ml, 1 μg/ml, 20 μg/ml)가 봉입된 HA-PG 용액을 피부에 주사한 후, 주사 전과 후의 주름 개선 효과를 확인 한 것으로서, 도 30a는 주름이 유발된 피부를 레플리카로 주형화하여 비교한 결과이고; 및 도 30b는 주름의 면적, 길이, 및 깊이를 정량화하여 비교한 결과이다.
도 31은 본 발명에 따른 상피세포 성장인자 (20 ng/ml, 1 μg/ml, 20 μg/ml)가 봉입된 HA-PG 용액을 피부에 주사한 후, 이의 OCT 동결 절편을 H&E 염색하여 병리조직검사를 실시한 결과이다.
도 32는 기존의 필러 제품 (Perlane) 및 상피세포 성장인자가 봉입되지 않은 HA-PG 용액과 본 발명에 따른 상피세포 성장인자 (10 μg/ml)가 봉입된 HA-PG 용액간 피부조직 재생 효과를 시간의 경과에 따라 (1개월) 비교한 것으로서, OCT 동결 절편을 H&E 염색하여 병리조직검사를 실시한 결과이다.
도 33은 기존의 필러 제품 (Perlane) 및 상피세포 성장인자가 봉입되지 않은 HA-PG 용액과 본 발명에 따른 상피세포 성장인자 (10 μg/ml)가 봉입된 HA-PG 용액간 피부조직 재생 효과를 시간의 경과에 따라 (1개월) 비교한 것으로서, OCT 동결 절편을 MT (Masson's Trichrome) 염색하여 병리조직검사를 실시한 결과이다.
도 34는 본 발명에 따른 HA-PG 용액을 상처 부위에 도포한 후, 상처 부위의 하이드로젤 형성 및 이에 따른 접착여부를 육안으로 확인한 결과이다.
도 35는 본 발명에 따른 HA-PG 용액을 파우더 형태로 제형화시키는 과정을 간략하게 나타낸 도이다.
도 36은 본 발명에 따른 동결 건조 파우더 형태에서 재가용화된 HA-PG 용액을 피부에 주사한 후, 체내 형성된 하이드로젤을 육안으로 확인한 결과이다.
도 37은 본 발명에 따른 HA-PG 용액의 보관 안정성을 확인한 것으로서, HAPG용액을 상온 (25℃) 또는 냉장 (4℃) 상태로 보관하면서 보관 용기 내에서의 젤화 여부를 확인한 결과이다.
도 38은 본 발명에 따른 HA-PG 용액의 보관 안정성을 확인한 것으로서, 보관 용기에 질소 기체를 주입하여 HA-PG 용액과 산소간 접촉을 차단시킨 후, 냉장 (4℃) 상태에서 3일간 보관하고, 다른 한편으로는, HA-PG 용액을 냉동(-80℃) 상태에서 10일간 보관하였으며, 이후, 이들의 용액을 피부에 주사하여 체내 형성된 하이드로젤을 육안으로 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
본 발명은 갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체를 가교시키는 단계를 포함하며, 상기 히알루론산 유도체는 히알루론산과 5'-하이드록시도파민간 반응에 의해 갈롤기로 수식되어 있는, 히알루론산 하이드로젤의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "히알루론산 (Hyaluronic acid, HA)"은 D-글루쿠론산 (D-glucuronic acid, GlcA) 및 N-아세틸-D-글루코사민 (GlcNAc)기 β 1,3-글라이코시드 결합 (β 1,3-glycosidic bond)에 의해 연결되어 있는 다이사카라이드를 반복단위로 포함하는 고분자량의 선형 폴리사카라이드로서, 히알루론산과 그의 염을 모두 지칭하고, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 염으로는 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 칼슘염, 알루미늄염 등이 예시된다.
히알루론산의 다이사카라이드 반복단위 (repeating unit)는 하기 화학식 4와 같으며, 상기 반복단위는 1 내지 1,000개일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 4]
Figure PCTKR2018001473-appb-I000005
히알루론산은 안구의 유리액, 관절의 활액, 닭벼슬 등으로부터 발견되고 있으며, 생체 적합성이 높은 생체 재료로 알려져 있다. 히알루론산 하이드로젤은 바이오 소재로의 높은 적용 가능성에도 불구하고, 천연 고분자 자체로부터 기인하는 기계적 특성의 한계점으로 인하여, 생체 재료 (예, 약물 전달체, 조직 공학용 지지체)로 적용함에 어려움을 겪고 있는 실정이다. 이에, 본 발명자들은 높은 산화능을 갖는 갈롤기를 히알루론산에 도입하여 히알루론산 유도체를 제조하였으며 (제조예 1), 이러한 히알루론산 유도체를 적절한 산화 또는 특정 pH 조건 (pH 8 ~ 9) 하에서 가교시켜 하이드로젤을 제조함으로써 (제조예 2), 가교 속도, 탄성, 접착력 등의 물리적 특성을 효율적으로 조절할 수 있었다는 점에 기술적 의의가 있다(실시예 1 및 3).
본 발명에서 사용되는 용어, "히알루론산 유도체" 또는 "히알루론산-피로갈롤 컨쥬게이트"는 히알루론산 또는 그의 염의 글루쿠론산의 골격에 갈롤기가 도입되어 있는 히알루론산 또는 그의 염을 모두 포함하는 것으로 해석된다.
일 구체예로서, 상기 화학식 4의 다이사카라이드 반복단위의 말단, 구체적으로, 이의 카르복시기와 5'-하이드록시도파민간 반응에 의해 제조될 수 있다. 상기의 반응에 의해 제조된 히알루론산 유도체는 하기 화학식 5의 반복단위를 하나 이상 포함하며, 하기 화학식 1과 같이 나타낼 수 있다.
[화학식 5]
Figure PCTKR2018001473-appb-I000006
[화학식 1]
Figure PCTKR2018001473-appb-I000007
(상기 화학식 1에서, R1은 하이드록시기 또는
Figure PCTKR2018001473-appb-I000008
이고, n은 1 내지 1,000의 정수이다.)
또한, 상기 히알루론산 유도체의 분자량은 10,000 Da 내지 2,000,000 Da 일 수 있고, 상기 히알루론산 유도체의 갈롤기 치환율은 0.1% 내지 50%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "치환율"은 히알루론산 또는 그의 염의 특정 기능기가 갈롤기로 대체되거나 수식되는 것을 의미한다. 갈롤기로의 치환율은 전체 히알루론산 반복단위 중 갈롤기가 도입된 반복단위의 비율로 정의되며, 정의상 0 초과 1 이하의 수치, 또는 0% 초과 100% 이하의 수치, 또는 0몰% 초과 100몰% 이하의 수치로 표현될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "하이드로젤"은 충분한 양의 수분을 보유하고 있는 친수성 고분자의 3차원적 구조를 의미하며, 본 발명의 목적상, 상기 하이드로젤은 갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체 간에 형성된 하이드로젤을 나타낸다.
상기 히알루론산 하이드로젤의 제조 과정은, 상기 히알루론산 유도체의 가교 반응에 의해 진행될 수 있으며, 상기 가교 반응을 위하여 상기 히알루론산 유도체와 PBS 등과 혼합하여 히알루론산 하이드로젤 전구체 용액을 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 가교는 UV 조사에 의한 화학적 가교, 물리학적 가교 또는 생물학적 가교에 의해 하이드로젤로 형성될 수 있다. 여기서, UV 조사에 의한 화학적 가교로는 광가교 (photo-crosslinking) 또는 반응성 가교제 (reactive crosslinker)를 활용한 가교 등이 있고, 생물학적 가교로는 헤파린과 성장인자의 결합력을 활용한 가교 또는 DNA 등의 상보적 결합을 이용한 가교 등이 있으며, 물리적 가교로는 수소결합에 의한 가교, 소수성(hydrophobic) 상호작용에 의한 가교 또는 정전기적 상호작용을 활용한 가교 등이 있으나, 바람직하게는, 산화제 또는 pH 조절제를 첨가하여 가교시킬 수 있다. 상기 산화제는 과요오드산나트륨, 과산화수소, 겨자무과산화효소 또는 타이로시나아제일 수 있고, 상기 pH 조절제는 수산화나트륨, 수산화리튬, 수산화칼륨, 수산화루비듐, 수산화세슘, 수산화마그네슘, 수산화칼슘, 수산화스트론튬 또는 수산화바륨일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예로서, 상기 산화제를 첨가하여 가교시키는 경우, 히알루론산 유도체간 하기 화학식 2의 가교 결합을 형성한다. 화학식 2에서, HA'는 카르복시기가 아마이드기로 치환된 히알루론산을 나타낸다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2018001473-appb-I000009
다른 구체예로서, 상기 pH 조절제를 첨가하여 가교시키는 경우, 히알루론산 유도체간 하기 화학식 3의 가교 결합을 형성한다. 화학식 3에서, HA'는 카르복시기가 아마이드기로 치환된 히알루론산을 나타낸다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2018001473-appb-I000010
본 발명의 일 실시예에서는, 갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체의 가교 단계에서 각각 산화제인 과요오드산나트륨 또는 pH 조절제인 수산화나트륨을 이용하여 히알루론산 하이드로젤을 제조하였으며 (제조예 2 참조), 그 결과, 각각의 가교 방식에 따라 제조된 히알루론산 하이드로젤은 우수한 생체 적합성과 함께 가교 속도, 강도, 탄성, 접착력, 분해 양상 등 물리적 특성의 현격한 차이를 확인할 수 있었다 (실시예 1 내지 3 참조).
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 히알루론산 유도체 또는 히알루론산 하이드로젤을 포함하는 필러 조성물이 제공된다. 본 발명의 필러 조성물은 수성 매질 상에 갈롤기가 도입된 히알루론산 유도체가 혼합되어 있는, 액체 또는 용액 상태로 제공된다. 특히, 체내로 주사될 경우, 이러한 용액은 가교 성분을 포함하지 않을지라도, 개인간 편차 없이 체내 산화력만으로도 하이드로젤을 형성하여 피부 조직을 보충하고, 피부의 수분을 유지할 수 있는 역할을 수행할 수 있다. 한 구체예로서, 상기 수성 매질은 인산 완충 용액 (Phosphate buffered saline; PBS)이고, 상기 히알루론산 유도체는 전체 필러 조성물에 대하여 바람직하게, 0.1% (w/v) 내지 20.0% (w/v), 보다 바람직하게, 0.3% (w/v) 내지 10.0% (w/v)로 함유될 수 있으나, 당업계 널리 알려진 수성 매질 및 필러 조성물 내 함량비에 따라 다양하게 변형 또는 변경하여 제조될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "필러"는 생체 적합한 재료를 피내 또는 피하에 주입하여 주름을 개선하고, 미관상 볼륨을 회복 시켜주는 등 피부 조직을 보충하는 주사 가능한 물질을 의미한다. 현재, FDA 또는 MFDS에서 승인한 필러 제조용 물질로서, 콜라겐, 히알루론산, 칼슘 하이드록실아파타이트, 폴리라틱액시드 등이 있다. 이 중에서도 히알루론산은 인체 구성성분과 유사한 물질로서, 피부 반응 검사없이 사용 가능하고, 1분자 당 214개의 물 분자를 끌어당기는 특성이 있어 피부의 수분을 효과적으로 유지할 수 있는바, 현재 필러 시장의 약 90%를 차지하고 있다. 본 발명에 따른 필러 조성물은, 높은 산화력을 지닌 갈롤기가 도입된 히알루론산 유도체를 사용함으로써, 가교제의 첨가 없이도 체내 산화력만으로 하이드로젤을 형성할 수 있어 생체 적합성을 향상시키고, 상기와 같이 체내에서 형성된 하이드로젤은 장기간 동안 투명한 상태로 그 형태를 유지할 수 있어 (적어도 6개월 이상) 전술한 히알루론산의 특성에 따라 우수한 주름 개선 효과를 보이며, 기존의 필러 제품에 비해 우수한 접착력 및 체내 안정성을 지닐 뿐만 아니라, 압출력에 관계없이 안정적으로 대상 부위에 주사할 수 있다는 점에 기술적 의의가 있다 (실시예 2 및 3).
또한, 본 발명의 필러 조성물은 사용 편이성 및 보관 안정성을 제공하기 위하여, 파우더 형태, 보다 구체적으로 동결 건조된 파우더 형태로 제형화할 수 있다. 한편, 상기의 필러 조성물은 피부에 주사하기 전, PBS와 같은 수성 매질에 용해시켜 가용화시키는 전 처리 단계를 필요로 하지만, 보관 및 제형 상태에 따라 용액화된 필러 조성물의 직접적인 적용도 가능하다.
또한 다른 구체예로서, 효과적인 피부 재생 효과를 부여하기 위하여, 본 발명의 필러 조성물은 세포 성장인자 또는 비타민을 추가로 포함할 수 있다. 상기 세포 성장인자는 세포의 분열, 성장, 및 분화를 촉진하는 폴리펩타이드를 총칭하는 것으로서, 바람직하게 섬유아세포 성장인자(FGF), 상피세포 성장인자(EGF), 케라티노사이트 성장인자(KGF), 형질전환 성장인자 알파(TGF-α), 형질전환 성장인자 베타(TGF-β), 과립구 형성 자극인자(GCSF), 인슐린 유사 성장인자(IGF), 혈관내피 성장인자(VEGF), 간세포 성장인자(HGF), 혈소판 유래 성장인자-BB(PDGF-BB), 뇌 유래 신경영양인자(BDNF), 및 아교세포 유래 신경영양인자(GDNF)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 상기 세포 성장인자는 20ng/ml 내지 20μg/ml의 농도로 함유될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 구현예로서, 주입 과정에서의 통증을 완화하기 위하여, 본 발명의 필러 조성물은 국소 마취제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 국소 마취제는 앰부카인(ambucaine), 아몰라논(amolanone), 아밀롤카인(amylocaine), 베녹시네이트(benoxinate), 벤조카인(benzocaine), 베톡시카인(betoxycaine), 비펜아민(biphenamine), 부피바카인(bupivacaine), 부타카인(butacaine), 부탐벤(butamben), 부타닐리카인(butanilicaine), 부테타민(butethamine), 부톡시카인(butoxycaine), 칼티카인(carticaine), 클로로프로카인, 코카에틸렌, 코카인, 사이클로메티카인, 다이부카인, 다이메티소퀸, 다이메토카인, 다이페로돈, 다이사이클로닌, 엑고니딘, 엑고닌, 에틸 클로라이드, 에티도카인, 베타-유카인, 유프로신, 페날코민, 포모카인, 헥실카인, 하이드록시테트라카인, 아이소부틸 p-아미노벤조에이트, 류시노카인 메실레이트, 레복사드롤, 리도카인, 메피바카인, 메프릴카인, 메타부톡시카인, 메틸 클로라이드, 미르테카인, 네파인, 옥타카인, 오쏘카인, 옥세타자인, 파레톡시카인, 페나카인, 페놀, 피페로카인, 피리도카인, 폴리도카놀, 프라목신, 프릴로카인, 프로카인, 프로파노카인, 프로파라카인, 프로피코카인, 프로폭시카인, 슈도코카인, 파이로카인(pyrrocaine), 로피바카인, 부피바카인, 살리실 알코올, 테트라카인, 톨릴카인, 트라이메카인, 졸라민 및 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며 상기 마취제의 양은 전체 필러 조성물 중량에 대하여 바람직하게 0.1 중량% 내지 5.0 중량%, 보다 바람직하게, 0.2 중량% 내지 1.0% 중량%로 함유될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 구체예로서, 체내에서 겔화되어 생성된 하이드로젤의 산화 및 분해를 막기 위하여, 본 발명의 필러 조성물은 항산화제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 항산화제는 폴리올, 만니톨, 및 소르비톨로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 상기 항산화제의 양은 전체 필러 조성물 중량에 대하여 바람직하게 0.1 중량% 내지 5.0 중량%, 보다 바람직하게, 0.2 중량% 내지 1.0% 중량%로 함유될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 히알루론산의 글루쿠론산의 골격에 갈롤기를 도입하여 히알루론산 유도체를 제조하는 단계; 및 상기 히알루론산 유도체를 수성 매질에 첨가하여 혼합하는 단계를 포함하는, 필러 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 히알루론산 유도체를 수성 매질에 첨가하여 혼합하는 단계는, 액체 상태인 필러 조성물의 주입 전 겔화를 막기 위하여, 바람직하게 산소 및 기타 산화원과의 접촉을 차단한 상태 (예를 들어, 질소가스의 주입)로 약 4℃ 내지 28℃, 및/또는 pH 4 내지 8의 조건에서 이루어질 수 있다.
일 구체예로서, 상기 수성 매질은 인산 완충 용액 (Phosphate buffered saline; PBS)이고, 상기 히알루론산 유도체는 히알루론산과 5'-하이드록시도파민간 반응에 의한 상기 화학식 1일 수 있으며, 본 발명의 필러 조성물은 전술한 세포 성장인자 국소 마취제, 항산화제, 비타민, 및 이들의 조합을 추가하여 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 상기 필러 조성물을 개체의 피내 또는 피하에 주입하는 단계를 포함하는, 피부 주름의 개선방법을 제공한다. 본 발명에서, 상기 필러 조성물 대상 부위는 개체의 얼굴, 목, 귀, 가슴, 엉덩이, 팔, 손 등과 같은 신체의 임의의 부위일 수 있으며, 바람직하게, 피부의 주름 영역으로서, 눈물골 영역, 미간 주름 영역, 눈가 영역, 이마 영역, 콧등 영역, 코옆 주름 영역, 입옆 주름 영역, 및 목 주름 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 부위일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에서, "개체"는 피부 주름의 개선을 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로 인간 또는 비-인간인 영장류 등을 모두 포함한다.
특히, 본 발명의 필러 조성물은 압출력에 관계없이 손쉽게 대상 부위에 주입 또는 주사할 수 있다. 상기 주입하는 단계에서는, 다양한 크기의 주사기 (Needle) 또는 삽입관 (Cannula)을 사용하여 필러 조성물을 피내 또는 피하에 주입할 수 있으며, 필러의 주입방법으로는, 예를 들어, 조금씩 여러번 찌르는 Serial punture 방법; 10mm 가량 바늘을 전진시킨 뒤, 뒤로 빼면서 조금씩 주사하는 Linear threading 방법; 한번 찌른 뒤, Linear threading 방법으로 주사한 바늘은 빼지 않고 약간의 각도를 비틀어 다시 같은 방법으로 반복 주사하는 Fanning 방법 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 상기 화학식 1의 히알루론산 유도체를 가교시켜 제조된 히알루론산 하이드로젤로서, 히알루론산 유도체간 상기 화학식 2의 가교 결합이 형성되어 있는 히알루론산 하이드로젤; 및 상기 히알루론산 하이드로젤을 포함하는 약물 전달용 담체, 약물전달시스템 또는 조직 공학용 지지체를 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 화학식 1의 히알루론산 유도체를 가교시켜 제조된 히알루론산 하이드로젤로서, 히알루론산 유도체간 상기 화학식 3의 가교 결합이 형성되어 있는 히알루론산 하이드로젤; 및 상기 히알루론산 하이드로젤을 포함하는 약물 전달용 담체, 약물전달시스템, 또는 조직 공학용 지지체를 제공한다.
본 발명의 히알루론산 하이드로젤은 약물 전달용 유효 골격으로서의 인공 세포외 기질로 사용될 수 있으며, 상기 갈롤기가 수식된 히알루론산 유도체의 뛰어난 산화능에 의해 나노 또는 마이크로 단위의 극미립자 형태를 구현할 수 있다는 점에 기술적 의의가 있다. 상기 약물은 특별하게 제한되지 않으나, 바람직하게 화학물질, 소분자, 펩타이드, 항체, 항체단편, DNA, RNA 또는 siRNA를 포함하는 핵산, 단백질, 유전자, 바이러스, 세균, 항균제, 항진균제, 항암제, 항염증제, 또는 이들의 혼합물 등을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 히알루론산 하이드로젤은 우수한 탄성 및 접착력을 바탕으로 조직 공학용 지지체로 사용될 수 있다. 조직 공학이란, 환자의 조직으로부터 분리된 세포 또는 줄기세포를 지지체 (scaffold)에서 배양하여 세포-지지체 복합체를 제조한 후, 제조된 세포-지지체 복합체를 다시 생체 내에 이식하는 것을 의미하며, 상기 히알루론산 하이드로젤은 생체조직 및 장기의 재생을 최적화하기 위하여, 생체 조직과 유사한 지지체로 구현될 수 있다. 따라서, 유전자치료제 또는 세포치료제에 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 하이드로젤은 화장품, 및 창상 치료제, 상처 피복재, 유착 방지제, 또는 치과용 매트릭스 등의 의료용 소재로도 활용될 수 있으며, 이에 제한되는 것이 아님은 물론이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 제조예 ]
제조예 1: 갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체의 제조
도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체를 제조하였다. 구체적으로, 히알루론산 (MW 200K, Lifecore Biomedical, IL, USA)을 물 (TDW)에 완전히 용해시키고, 1 당량의 NHS (N-hydroxysuccinimide, Sigma, St. Louis, MO, USA)와 1.5 당량의 EDC (1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ehtylcarbodiimide hydrochloride, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)를 첨가하였으며, 이로부터 30분 후, PG 모이어티로서 1 당량의 5'-하이드록시도파민 (5-hydroxydopamine, Sigma)을 첨가하여 pH 4 ~ 4.5에서 24시간 동안 반응시켰다. 2개의 다른 몰비의 반응물을 HA-PG 컨쥬게이트 제조에 사용하였다 (HA : EDC : NHS : PG = 1 : 1.5 : 1 : 1 or 2 : 1.5 : 1 : 1). 이후, EDC, NHS, 5'-하이드록시도파민을 PBS 및 물 기반의 투석 (Cellu/Sep (상표명), dialysis membrane (6.8 kDa cut-off, Membrane Filtration Products Inc., Seguin, TX, USA))으로 제거하고, 동결 건조를 통해 용매를 증발시켜 본 발명의 히알루론산 유도체를 제조하였다. 상기 히알루론산 유도체의 합성을 확인하고자, FT-IR (Fourier transform-infrared spectroscopy) (Vertex 70, Bruker, Billerica, MA, USA)및 H-NMR (proton Nuclear magnetic Resonance) (Bruker 400 MHz, Bruker)로 분석한 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 약 1,580 cm-1에서 1,700 cm-1 파수 영역에서의 강한 피크를 통해 새롭게 형성된 아마이드 결합을 확인할 수 있었으며, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 6.5 ppm 및 3 ppm 부근의 피크를 통해 각각 5'-하이드록시도파민의 방향족의 벤젠고리 및 -CH2CH2-의 구조를 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터 본 발명의 히알루론산 유도체는, 히알루론산의 카르복시기와 5'-하이드록시도파민의 아민기간 형성된 아마이드 결합으로 5'-하이드록시도파민이 도입됨을 알 수 있었다. HA 골격에 대한 갈롤기의 치환 정도를 계산하기 위해, HA-PG 컨쥬게이트를 PBS (pH 5)에 1 ㎎/㎖에서 용해시키고 용액의 흡광도를 283 ㎚ (UV-visible spectrophotometer (Cary 100 UV-vis, Varian Inc., Palo Alto, CA, USA)에서 측정하였다. PG로 치환된 HA내의 카르복실시의 %를 5-hydroxydopamine solution (from 1 mg/mL concentration)의 연속 희석을 통해 수득한 표준 곡선을 이용하여 계산하였다.
제조예 2: 히알루론산 하이드로젤의 제조
상기 제조예 1의 히알루론산 유도체를 가교 (cross-linking)시켜 히알루론산 하이드로젤을 제조하였으며, 이때, 가교 방식은 산화제인 과요오드산나트륨 (NaIO4) 또는 pH 조절제 (pH 8 ~ 9)인 수산화나트륨 (NaOH)을 각각 이용하였다. 구체적으로, 상기 히알루론산 유도체를 PBS에 용해시킨 후 (1% (w/v), 2% (w/v)), 4.5 mg/ml의 NaIO4 또는 0.08 M의 NaOH를 히알루론산 유도체 용액 부피 대비 1.5:1 ~ 4:1의 비율로 혼합시키면서 가교를 진행하였으며, 도 3에 나타낸 바와 같이, 이들 각각을 통해 밝은 갈색 또는 푸른색을 띄는 히알루론산 하이드로젤을 제조하였다.
상기 히알루론산 하이드로젤의 가교를 구체적으로 확인하고자, UV-vis (Ultraviolet-visible spectroscopy)으로 분석하였다. NaIO4를 이용한 경우, 도 4에 나타낸 바와 같이, 시간의 경과에 따라 350 ~ 400 nm 파장 영역이 변화됨을 확인할 수 있었으며 (도 4a), 이는 산화 과정에서 중간체인 라디컬의 순간적인 형성과 감소를 의미하는 것으로, 이후 라디컬 중합반응에 의해 바이페놀 (biphenol)이 형성됨을 알 수 있었다 (도 4b). 또한, NaOH를 이용한 경우, 도 5에 나타낸 바와 같이, 시간의 경과에 따라 600 nm 파장 영역이 변화됨을 확인할 수 있었으며 (도 5a), 이는 산화 과정에서 [5+2] tautomerization에 의해 전하 이동 복합체 및 벤조트로폴론 (benzotropolone)이 형성됨을 알 수 있었다 (도 5b).
[실시예]
실시예 1. 가교 방식에 따른 히알루론산 하이드로젤의 물성 변화
본 실시예에서는, 상기 제조예 2의 가교 방식의 차이에 따른 히알루론산 하이드로젤의 물성 변화를 비교하였다. 한편, 상기 하이드로젤의 제조 단계에서, 히알루론산 대비 5'-하이드록시도파민의 몰 농도비 (0.5X (HA : EDC : NHS : 5'-hydroxydopamine = 2 : 1.5 : 1 : 1), 1X (HA : EDC : NHS : 5'-hydroxydopamine = 1 : 1.5 : 1 : 1))에 의해 갈롤기의 치환율을 4 ~ 5% (0.5X), 또는 8 ~ 9% (1X)로 조절할 수 있었으며 (나타내지 않음), 5'-하이드록시도파민의 치환 정도에 따른 하이드로젤의 물성 변화도 비교하였다. 구체적으로, 시간의 경과에 따른 하이드로젤 형성 및 탄성계수의 변화를 가교 방식에 따라 비교하였고, 가교 방식 및 5'-하이드록시도파민의 치환 정도에 따른 탄성, 접착력, 팽윤, 및 분해 양상을 각각 비교 분석하였다.
1-1. 히알루론산 하이드로젤의 형성 속도 비교
도 6a에 나타낸 바와 같이, NaIO4를 이용한 경우, 밝은 갈색을 띠는 하이드로젤이 즉각적인 가교 반응을 통해 순간적인 형성되었던 반면, NaOH를 이용한 경우, 푸른색을 띄는 하이드로젤이 상대적으로 서서히 형성됨을 확인할 수 있었다. 또한, 시간의 경과에 따른 저장 탄성률 (G')과 손실 탄성률 (G'')을 측정하였으며, 카테콜기가 도입된 히알루론산 유도체를 NaIO4를 이용하여 가교시킨 하이드로젤 (HA-CA(NaIO4))과 상기 결과를 비교하였다. 그 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 모두 산화가 진행되면서 안정적으로 하이드로젤이 형성되었다 (G'>G''). 특히, 저장 탄성률 곡선과 손실 탄성률 곡선이 접하게 되는 시점을 통해 하이드로젤의 형성 시점을 확인하였을 때, NaOH를 이용하여 가교시킨 경우 약 2 ~ 3분, HA-CA (NaIO4)의 경우 약 30초 정도가 소요되었던 반면, NaIO4를 이용한 경우에는 측정할 수 없을만큼 빠르게 가교가 진행됨을 알 수 있었다.
히알루론산의 점탄성 계수는 0.1 ~ 1 Hz 의 주파수 범위 (frequency range)에서 주파수 스윕 모드 (frequency sweep mode) 내의 저장탄성율 (G’) 및 손실 탄성율 (G“) 은 측정하여 분석하였다. 히알루론산의 탄성은 1 Hz (n = 45)에서 저장계수를 손실계수로 나누어 계산하였다. HA-PG의 젤화 동력학 (Gelation kinetics)은 레오미터 (rheometer) (MCR 102, Anton Paar, VA, USA)를 각각 10% 및 1 Hz의 조절된 스트레인 및 주파수에서 타임 스윕 모드에서 측정하였다. 두 가지의 산화제 (NaIO4 및 NaOH)를 G1 및 G”의 최초 측정 후 30분 후에 첨가하였다. 하이드로젤의 접착성은 레오미터 (MCR 102, Anton Paar)에서 프로브와 기재 플레이트 사이의 완전히 가교된 하이드로젤의 분리 스트레스를 기록하여 측정하였다 (n = 3). 프로브의 잡아당기는 속도는 5 ㎛/sec 였다.
1-2. 탄성 및 접착력의 비교
도 7a에 나타낸 바와 같이, 가교 방식 또는 5'-하이드록시도파민의 치환 정도의 차이에도 불구하고, 모두 저장 탄성률 (G')이 손실 탄성률 (G'')에 비해 일정한 수준으로 높게 측정되었는바, 안정적으로 하이드로젤이 형성됨을 확인할 수 있었다. 또한, 하이드로젤의 강도를 대변하는 탄성계수 (Elastic modulus)와 탄성 정도를 대변하는 tan δ(G''/G')을 산출한 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이, NaIO4를 이용하는 경우, 하이드로젤의 강도가 보다 우수하였고, 낮은 치환율에서도 모두 우수한 탄성력을 지니고 있었던 반면, NaOH를 이용하는 경우에는 치환율의 증가에 따라 우수한 탄성력을 획득하였다. 또한, 동일한 가교 방식일 경우 5'-하이드록시도파민의 치환율이 증가함에 따라 이러한 각각의 우수한 물성 역시 향상됨을 알 수 있었다 (0.5X < 1X). 또한, 상기 결과에 기초하여, 히알루론산 유도체의 분자량 (40, 200, 500kDa) 및 농도 (1% (w/v), 2% (w/v))에 따른 NaIO4로 가교된 하이드로젤의 물성 차이를 확인한 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 모두 저장 탄성률(G')이 손실 탄성률 (G'')에 비해 일정한 수준으로 높게 측정되었는바, 안정적으로 하이드로젤이 형성됨을 확인할 수 있었고 (도 8a), 히알루론산의 분자량의 크기가 커질수록, 농도가 높아질수록, 하이드로젤의 강도 및 탄성력이 향상됨을 알 수 있었다 (도 8b). 또한, 하이드로젤의 접착력을 평가하기 위하여, 유변학 기기 (Bohlin Advanced Rheometer, Malvern Instruments, Worcestershire, UK)의 각 플레이트 사이에서 하이드로젤을 가교시키고, 상기 플레이트의 간격을 증가시키면서 기기에 가해지는 힘을 측정하였으며, 카테콜기가 도입된 히알루론산 유도체를 NaIO4를 이용하여 가교시킨 하이드로젤 (HA-CA(NaIO4))과 상기 결과를 비교하였다. 그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, NaOH에 의해 형성된 하이드로젤, 및 HA-CA (NaIO4)은 뛰어난 접착력을 나타내었던 반면, NaIO4에 의해 형성된 하이드로젤은 접착력이 거의 관찰되지 않았다.
1-3. 팽윤 및 분해 양상의 비교
도 10에 나타낸 바와 같이, 가교 방식 및 5'-하이드록시도파민의 치환 정도에 따라 다소 상이한 팽윤 및 분해 양상을 보였다. 팽윤 특성은 특정 시점 (0, 1, 2, 3, 5, 7, 14 및 28일째)에 잔존하는 하이드로젤의 무게를 측정하여 평가하였다. 구체적으로, HA-PG를 PBS, 37℃에서 인큐베이션하고 팽윤율을 다음식으로 계산하였다: (Wt - Wi)/Wi X 100, 여기서 Wt는 각 시점에서 하이드로젤의 무게이고, Wi는 초기 시점에서 하이드로젤의 무게이다 (n = 4 ~ 5). 분해 프로파일을 조사하기 위해, 3일간 팽윤된 HA-PG 하이드로젤을 히알루로니다아제 (hyaluronidase (5 units/mL, Sigma)로 처리하고, 잔존하는 히알루론산의 무게를 각 시점마다 측정하였다 (n = 4 ~7, 0, 2, 5, 12, 24, 48 및 72시간). NaOH 보다 NaIO4를 이용한 경우, 팽윤율은 낮고 분해는 보다 빠르게 진행되었으며, 동일한 가교 방식일 경우 5'-하이드록시도파민의 치환율이 증가한 경우, 이러한 팽윤율 및 분해 속도는 감소되는 경향을 보였다. 이러한 결과들을 종합하면, 동일한 구조의 히알루론산 유도체를 이용한 경우라 할지라도, 가교 방식에 따라 하이드로젤은 상이한 결합 형태로 가교되고 (제조예 2), 이는 강도, 탄성, 접착력, 팽윤 및 분해와 같은 고유한 물리적 특성의 변화로 이어짐을 나타낸다. 또한, 이와 반대로, 동일한 가교 방식을 채택하였다 할지라도, 히알루론산 유도체의 구조에 따라 상기의 물리적 특성 역시 변화됨을 알 수 있었다.
실시예 2. 세포 독성 및 생체 적합성 분석
본 실시예에서는, 상기 제조예 2의 히알루론산 하이드로젤의 세포 독성 및 생체 적합성을 평가하고자 하였다. 우선, 3D 세포 배양에서의 독성 및 염증반응 유발 여부를 확인하기 위하여, 하이드로젤에 줄기세포 (human adipose-derived stem cell, hADSC) (1.0 x 106 cells per 100 μL of hydrogel)를 배양하고, LIVE/DEAD viability/cytotoxicity kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 제조사의 지시에 따라 각 시점 (time point) (1, 3 및 7일째)에서 Live/Dead 염색을 수행하였다. 염색된 세포를 공초점현미경 (confocal microscope) (LSM 880, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였고, 생존력은 형광이미지로부터 생존 세포와 사멸 세포를 계수하여 정량화 하였다 (n = 4 ~ 5). hADSC는 ATCC (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 입수하고, Growth Kit-low serum (ATCC) 및 1% penicillin/streptomycin (Invitrogen)이 보충된 중간엽줄기세포 배지 Mesenchymal Stem Cell Basal Medium (ATCC)에서 배양하였다.
또한, 면역세포 (Raw 264.7)를 하이드로젤에 트랜스웰 시스템 (permeable supports with 3.0 μm pores, Corning, New York, NY, USA)을 사용하여 공배양한 후, 염증 반응에 의해 분비되는 종양괴사인자 (TNF-α)의 양을 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용해 측정하였다. Raw 264.7 세포를 하룻밤 인큐베이션한 후, 96-well plate (2.0 x 104 cells per well) 상에 시딩한 후, 트랜스 웰의 상부 삽입부를 통해 하이드로젤 50 ㎕를 로딩한 후, 24시간 더 인큐베이션 하였다. 공배양에서 수거한 배지 내의 TNF-α의 양을 TNF-α enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 정량화 하였다.
HA-PG 하이드로젤의 in vivo 생체적합성을 평가하기 위해, NaIO4 또는 NaOH 에 의해 형성된 100 ㎕의 HA-PG 하이드로젤 (final concentration of 2% [w/v])을 ICR 마우스의 피하에 이식하였다. 마우스 (5-week-old male, OrientBio, Seongnam, Korea) 이식 전에 케타민 (ketamine) (100 ㎎/㎏, Yuhan, Seoul, Korea) 및 자일라진 (xylazine) (20 ㎎/㎏, Bayer Korea, Ansan, Korea)으로 마취하였다. 조직분석을 위해, 미리설정 한 시점 (0, 7, 14, 28, 및 84일)에서 인접하는 조직과 함께 히알루론산 구조물을 회수 하였다. 회수한 히알루론산을 4% paraformaldehyde (Sigma)에서 2일간 고정하고, OCT 화합물 (Leica Biosystems, Wetzlar, Hesse, Germany)에 임베딩한 다음, 6 ㎛ 두꼐로 절단하였다. in vivo 실험으로부터의 절단된 시료를 H&E 로 염색하여 하이드로젤 유지를 평가하였다. 톨루이딘 블루 (Toluidine blue) 염색을, HA-PG 하이드로젤 이식 후의 면역 반응을 조사하기 위해 수행하였다. HA-PG 하이드로젤의 in vivo 분해는 각 시점에서 회수된 하이드로젤 구조물의 잔존 무게를 측정하여 평가하였다 (n = 3 ~ 5).
그 결과, 도 11 및 도 12에 나타낸 바와 같이, 가교 방식에 따른 두 형태의 하이드로젤 모두, 배양 7일 후까지 세포 독성을 나타내지 않았다 (도 11 (a). (b)). LPS에 의해 증가된 TNF-α는 상기 두 형태의 하이드로젤을 처리한 경우, 소량만이 검출되었고, 아무런 처리를 하지 않은 대조군 (NT)과도 큰 차이가 없었다 (도 11 c). 또한, 도 12에 나타낸 바와 같이, 상기 하이드로젤을 마우스에 이식한 경우에도, 특이적 염증 소견은 관찰되지 않았으며, 이식된 하이드로젤 부근, 대식세포 등 염증 관련 세포의 증식없이 그 구조가 잘 유지되고 있음을 확인할 수 있었다 (도 12 c 및 d).
실시예 3. 생체 내 분해 양상 분석
본 실시예에서는, 가교 방식(NaIO4/NaOH) 및 반응시킨 5'-하이드록시도파민의 몰비 (0.5X, 1X)에 차이가 있는 히알루론산 하이드로젤을 마우스에 피하에 이식하였다. 이식한 당일, 이로부터 1주, 4주, 및 12주 후에 마우스를 희생시키고 각각의 하이드로젤을 채취하여 이들의 팽윤 정도를 육안으로 확인하고, 생체 내 잔존량을 산출함으로써, 생체 내 분해 양상 등을 분석하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, NaIO4를 이용하여 가교시킨 하이드로젤은 보다 팽윤의 정도가 적음을 확인할 수 있었고, 보다 빠르게 생체 내 분해가 이루어짐을 알 수 있었다. 또한, 동일한 가교 방식일 경우, 5'-하이드록시도파민(갈롤기)의 치환율이 증가한 경우, 분해 속도는 감소되는 경향을 보였다.
상기 실시예 2 및 3의 결과들은, 본 발명에 따른 히알루론산 하이드로젤은 예를 들어, 약물 전달체, 조직 공학용 지지체 등과 같은 바이오 소재 분야에 활용될 수 있음을 시사하는 것이다. 특히, 상기 실시예 1 등의 고유한 물리적 특성을 고려해 볼 때, 빠른 가교 속도 및 생체 내 분해 양상을 보이는, NaIO4에 의해 형성된 하이드로젤은 미세입자 형태의 약물 전달용 담체로, 우수한 접착력 및 느린 생체 내 분해 양상을 보이는, NaOH에 의해 형성된 하이드로젤은 조직 공학용 지제체 등으로 활용될 수 있을 것이다.
실시예 4. 극미립자 형성을 통한 약물 전달 시스템으로서의 활용
4-1. HA- PG 하이드로젤 극미립자를 이용한 단백질의 서방출 (sustained release)
본 실시예에서는, NaIO4에 의해 형성된 하이드로젤의 일 실시 태양으로서, 나노 또는 마이크로 단위의 직경을 갖는 극미립자 형태의 약물 전달용 제제를 제조하고 이의 효능을 확인하고자 하였다. 우선, Oil/water emulsion 방식을 이용하여 제조예 2의 히알루론산 유도체 용액 (HA-PG)의 에멀젼 형성을 유도하고 상기 용액에 산화제 (NaIO4)를 첨가한 뒤, 동결 건조 전 및 후의 극미립자의 형성 및 존재를 확인하였다. 또한, HA-PG 용액과 단백질 (bovine serum albumin, BSA)를 혼합하고 에멀젼 형태로 만든 후, 산화제 (NaIO4)를 첨가하여 가교시킴으로써, BSA가 봉입된 극미립자를 제조하였으며, 14일에 걸쳐 극미립자의 단백질 방출 양상을 확인하였다. 그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 상기의 제조 과정을 통해 히알루론산 하이드로젤을 성분으로 하는 극미립자가 생성되었으며, 동결건조 과정을 거쳐도 변함없이 유지되었다 (도 14a). 또한, 벌크하게 제조된 하이드로젤 (HA-PG bulk hydrogel)에서는 봉입된 단백질이 거의 방출되지 않았던 반면, 상기 극미립자 (HA-PG particle)에서는 단백질이 일정한 속도로 방출됨을 확인할 수 있었는바 (도 14b), 극미립자 형태의 NaIO4에 의해 형성된 하이드로젤은 약물 전달 제제로 활용될 수 있을 것이다.
4-2. HA- PG 하이드로젤 극미립자를 이용한 항체의 서방출
먼저, 치료적 적용을 성장인자의 서방 및 조절 전달을 위한 방법으로서, HA-PG 하이드로젤 극미립자를 NaIO4-매개 가교의 초고속 젤-형성을 이용하고 수중유 (oil/water) 에멀젼 방법으로 제조하였다 (도 15 (a). HA-PG 극미립자는 HAPG 용액의 유중수 (water-in-oil) 에멀젼에 단순히 가하는 것으로 제조될 수 있다. 오일상에서 NaIO4에 의한 HAPG 에멀젼의 신속한 화학적 가교는 수분 내에 마이크로 이하의 HA 입자를 다량 생성시켰다. 생성된 HA-PG 극미립자는 평균 직경 8.8 ㎛ (±3.9 ㎛)의 구형을 나타냈다 (도 15 (b)). 흥미롭게도, HA-PG 극미립자에 의해 봉입된 VEGF (vascular endothelial growth factor)는 60일간 천천히 방출된 반면에, 벌크 형태의 HA-PG는 하이드로겔 구조물로부터 거의 방출되지 않았다 (도 15 (c )). 본 발명자들의 선행연구에서, 본 발명자들은 카테콜-수식된 알지네이트 하이드로젤 내에 봉입된 성장인자 (growth factor)가, 젤화과정에서 단백질이 산화된 카테콜에 강하게 결합하는 것으로 인해, 거의 방출되지 않는 것을 확인한 바 있다. PG 기 또한 카테콜 기와 마찬가지로 성장인자의 하이드로겔 구조물로의 강력한 결합을 유도할 수 있을 것이다. 그러나, 미립자로 형성된 HA-PG가 현저하게 증가된 성장인자의 방출을 위한 표면적으로 인하여 VEGF를 방출할 수 있는 것으로 보인다.
VEGF (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)와 인코포레이션된 HA-PG 극미립자를 말초혈관 질환에서 치료적 혈관생성을 촉진하기 위해 적용하였다. HA-PG 극미립자를 함유하는 VEGF의 근육내 주입 (VEGF 로딩 dose: 마우스 당 6 ㎍)은 대퇴동맥 (femoral artery) 절제 및 결찰하여 제조한 하지 허혈 마우스 모델에서 현저히 개선된 치료효과를 나타냈다. 마우스는 오리엔트바이오에서 입수하였다 ((Balb/c, 6-week-old female, OrientBio). 주입 후 4주 경과 후에, VEGF를 함유하는 HAPG 극미립자로 처리한 군에서는 어떠한 다리 절단이나 조직 괴사 (tissue necrosis)도 없었다. 반면에, PBS 또는 VEGF 없이 HA-PG만 처리한 군의 단지 20% 만이 허혈성 다리의 개선을 보였다 (도 16 (a)). 동일한 용량 (마우스 당 6 ㎍)의 VEGF의 단일 (Single bolus) 투여는 허혈성 다리의 다소의 개선을 보였으나, 하지 허혈 마우스의 50%는 여전히 다리 손실 또는 조직 괴사를 보였다 (도 16 (b)). 또한 H&E 및 Massons’s trichrome (MT) 염색에 의해 확인한 조직학적 분석은, HAPG/VEGF 군의 허혈 마우스 모델에서 최소의 근육 손상 및 섬유증 형성을 보였다 (도 16 (c ), (d)) 또한, 소동맥 염색을 위한 α-smooth muscle actin (α-SMA) 및 모세혈관 염색을 위한 von Willebrand factor (vWF) 면역조직화학 분석은, 소동맥 및 모세혈관이 대조군 ((PBS, HAPG, and VEGF)과 비교하여 HAPG/VEGF 군에서 현저히 증가한 것을 나타냈다 (도 16 (e), (f)). 이러한 결과는 혈관형성의 실질적인 개선을 보여준다. 비침습적이고 주사하지 않는 (injection-free) 세포 이식을 위한 접착성 하이드러젤 스캐폴드를 제조하기 위해 NaOH-매개 가교를 이용하였다 (도 17 (a)). 이전 연구에서 카테콜-수식 폴리머는 단백질 내의 산화된 카테콜의 다양한 친핵체 (nucleophiles)에 대한 높은 결합 친화력을 통해 강한 조직 접착력을 보이는 것이 확인된 바 있다.
실시예 5. 체내 산화력을 이용한 히알루론산 필러 조성물의 겔화 및 주름 개 선 효과 확인
5-1. 체내 산화력을 이용한 하이드로젤의 형성 및 유지
제조예 1에서 제조된 HA-PG 용액을 마우스의 피하에 주입하였으며, 이후 상기 주입된 HA-PG 용액이 가교제의 첨가 없이도 체내에서 겔화가 진행될 수 있는지 여부를 확인하였다. 또한, 체내 조건에서, 형성된 HA-PG 하이드로젤의 무게 변화를 약 6개월 동안 측정함으로써, 형성된 HA-PG 하이드로젤이 체내에서 오랜기간 유지될 수 있는지 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 20 및 도 21에 나타낸 바와 같이, 액체 상태로 피하에 주입된 HA-PG 용액은 5분 내에 겔화되어 체내에서 HA-PG 하이드로젤을 형성하였으며, 형성된 HA-PG 하이드로젤은 투명한 상태로 6개월 동안 큰 무게의 차이없이 체내에서 잘 유지됨을 알 수 있었다. 또한, 도 22에 나타낸 바와 같이, 상기 HA-PG 용액은 체내 산화 조건에 노출될 경우, 강한 자가 산화 능력을 갖는 갈롤기간 퀴논을 손쉽게 형성하여 히알루론산을 중합시키고 HA-PG 하이드로젤을 형성하게 된다. 따라서, 중합된 형태의 제형으로 이루어진 필러 제품(Megafill, perlane)과 달리, 본 발명의 필러 조성물은 용액 상태의 제형으로 사용될 수 있으므로 피부로의 주입이 보다 용이하고, 다양한 추가 성분을 함유할 수 있음을 알 수 있었다. 즉, 본 발명의 HA-PG 용액은 가교제의 첨가 없이도 체내에서 하이드로젤을 형성하고, 안정적으로 유지될 수 있었는바, 이로부터 필러 조성물로의 활용 가능성을 확인할 수 있었다.
5-2. 주름 개선 효과 확인
상기 실시예 5-1의 결과에 기초하여, HA-PG 용액의 주름 개선 효과를 확인하고자 하였다. 구체적으로, hairless 마우스에 Calcitriol을 0.2μg/day씩 1 주일에 5회, 총 6주 동안 투여하여 피부의 주름을 유발시켰다. 이후, HA-PG 용액을 피부의 피하에 주사하였으며, 주사 전과 후의 주름이 유발된 피부를 레플리카로 주형화하고, 주름 분석 기계를 이용하여 주름의 면적, 길이, 및 깊이를 측정하여 비교하였다. 그 결과, 도 23에 나타낸 바와 같이, HA-PG 용액의 주사 전 주름의 면적, 길이, 및 깊이는 각각 약 6 ㎟, 약 36 ㎜, 약 90 ㎛였던 반면, HA-PG 용액 주사 후에는 각각 약 2 ㎟, 약 19 ㎜, 약 68 ㎛로서, 주름의 면적, 길이, 및 깊이 모두가 현저하게 감소됨을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 피부 주름 개선을 위한 필러용 조성물로 본 발명의 HA-PG 용액이 활용될 수 있음을 나타내는 것이다.
5-3. 기존의 필러 제품과의 비교
(1) 체내 접착력 및 고정성 비교
HA-PG 용액의 필러로서의 활용 가능성을 보다 구체적으로 확인하기 위하여, 다양한 분자량을 갖는 히알루론산 유도체 (200 KDa, 1 MDa) 기반의 HA-PG 하이드로젤과 기존에 시판되고 있는 필러 제품 (Megafill, Perlane)간 체내 유지 및 분해 양상을 약 9개월 동안 측정하여 비교하였다. 이와 함께, 본 발명의 HA-PG 용액과 Perlane 제품에 의해 생성된 하이드로젤의 체내 접착력 또는 고정성을 비교하였다. 그 결과, 도 24 및 도 25에 나타낸 바와 같이, Megafill, Perlane 제품은 주사한 날로부터 약 한 달째부터, 체내의 하이드로젤의 중량 및 부피가 감소하는 경향을 보인 반면, HA-PG 하이드로젤은 9개월 동안 중량 및 부피의 큰 변화없이 그 모양이 유지됨을 확인할 수 있었는바, HA-PG 하이드로젤의 체내 유지능이 우수함을 알 수 있었다. 또한, 하이드로젤의 체내 접착력을 확인한 결과, 도 26에 나타낸 바와 같이, Perlane 제품은 피부에 고정되지 못하고 특정 부위로 몰리는 현상을 보였던 반면, HA-PG 용액에 의한 하이드로젤은 주사 부위에 접착 및 고정되어 생체 내에서 잘 유지됨을 확인할 수 있었으며, 이러한 우수한 체내 접착력은 아민기, 티올기 (thiol group)등과 같이 피부에 존재하는 작용기와 본 발명의 히알루론산 유도체간 반응으로부터 비롯된 결과이다 (도 22a). 즉, 본 발명의 HA-PG 용액은 기존의 필러 제품에 비해 보다 우수한 체내 안정성 및 접착성을 지님을 나타내는 것이다.
(2) 주사 가능성 비교 ( Injectability test)
HA-PG 용액의 우수한 주사 가능성을 구체적으로 확인하고자, 다양한 분자량을 갖는 히알루론산 유도체 (200 KDa, 1 MDa) 기반의 HA-PG 하이드로젤과 기존에 시판되고 있는 필러 제품 (Megafill, Perlane)간 주사바늘의 크기 (21G, 25G, 29G, 30G)에 따른 압출력 변화를 Universal testing machine (UTM)을 이용하여 측정하였을 뿐만 아니라, 최초로 주사기를 이동시키는데 필요한 힘인 Break Loose Force와 이동 중인 주사기의 운동성을 유지하는데 필요한 힘인 Dynamic Glide Force를 정량하여 비교하였다. 그 결과, 도 27 및 28에 나타낸 바와 같이, Megafill은 입자의 큰 크기에 의해 작은 크기의 주사바늘에서는 압출되지 못하였고 21G 이하에서만 압출이 가능하였으며, Perlane의 경우도 입자의 크기로 인해 29G 및 30G에서는 불규칙한 형태의 압출력을 보였던 반면, 본 발명의 HA-PG 용액 (200 KDa, 1 MDa)의 경우 29G 및 30G를 포함하는 모든 크기의 주사바늘에서 작은 힘으로도 효과적으로 압출됨을 확인할 수 있었다. 또한, Break Loose Force 및 Dynamic Glide Force를 비교한 결과, 도 29에 나타낸 바와 같이, 압출이 원할하지 못하여 측정이 불가능한 Megafill, 및 높은 force 값을 보인 Perlane에 비해, 본 발명의 HA-PG 용액(200K, 1M)은 현저하게 낮은 force 값을 나타내어 주사의 압출력, 즉 주사바늘의 크기에 영향없이 용이하게 주사할 수 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과는, 본 발명의 HA-PG 용액은 대상 부위에 직접 주사할 수 있으며, 보다 안정적으로 주사 가능함을 나타내는 것이다.
5-4. 세포 성장인자를 포함하는 기능성 필러 조성물
기능성 필러로서의 응용을 확인하기 위하여, 상기 실시예 5-2의 방법으로 주름을 유발시킨 Hairless 마우스의 피부에 상피세포 성장인자 (EGF; 20 ng/㎖, 1 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖)가 봉입된 HA-PG 용액을 주사하였으며, 주사 전과 후의 주름이 유발된 피부를 레플리카로 주형화하고, 주름 분석 기계를 이용하여 주름의 면적, 길이, 및 깊이를 측정하여 비교하였으며, 상기 EGF가 봉입된 HA-PG 용액을 주사한 후 한 달째, 상기 피부조직을 채취하여 OCT 동결 절편을 제작한 뒤, 이를 H&E (Hematoxylin & eosin) 염색을 통해 병리조직검사를 실시하였다. 또한, 상기의 Hairless 마우스에 EGF (10 ㎍/㎖)가 봉입된 HA-PG 용액, HA-PG 용액, 및 기존의 제품인 Perlane을 주사한지 한 달째, 상기와 동일한 방법으로 H&E 및 MT (Masson's trichrome)을 통해 피부조직 재생의 차이를 비교하였다.
그 결과, 도 30에 나타낸 바와 같이, 주사 전에 비해, EGF가 봉입된 HA-PG 용액을 주사한 경우, 형성된 주름의 크기와 상관없이 주름의 면적, 길이, 및 깊이 모두가 현저하게 감소됨을 확인할 수 있었다. 또한, 도 31에 나타낸 바와 같이, 피부의 진피층 내 교원 섬유가 파괴되어 밀도가 엉성하고 배열이 불규칙하였던 반면, 봉입된 상피세포 성장인자의 농도가 증가할수록 교원 섬유가 규칙적으로 배열되는 경향을 보였는바, 유의적인 피부 재생 및 주름 개선 효과를 확인할 수 있었다. 아울러, 도 32 및 도 33에 나타낸 바와 같이, EGF가 봉입된 HA-PG 용액을 주사한 경우, 다른 비교군들 (No filler, Perlane, HA-PG)에 비해 주름 유발로 인해 두꺼워진 표피층이 현저하게 얇아졌으며, 진피층의 콜라겐 밀도가 크게 높아짐을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 피부 주름 개선을 위한 세포 성장 인자를 본 발명의 HA-PG 용액에 적용함으로써, 기능성 필러로도 활용될 수 있음을 나타내는 것이다.
실시예 6. 상처 드레싱, 창상 치료제 및 유착 방지제용 제제
상처 치료용 드레싱 제제로서의 응용을 확인하기 위하여, 마우스의 등 피부를 1 ㎝ x 1 ㎝ 크기로 절개한 상처 유발 동물 모델에 HA-PG 용액을 도포한 뒤, 주변의 활성 산소를 이용하여 가교시킨 후, 상처 부위의 하이드로젤 형성 및 이에 따른 접착여부를 확인하였다. 그 결과, 도 34에 나타낸 바와 같이, HA-PG 용액을 상처 부위에 도포한지 10분 이내에 하이드로젤 막이 형성되며, 이를 통해 안정적으로 접착됨을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는, HA-PG 용액은 우수한 산화능을 지녀 별도의 첨가제 없이 상처에 고르게 도포할 수 있는, 새로운 형태의 상처 드레싱 재료로 활용될 수 있음을 나타내는 것이다.
실시예 7. 분말 제형화 및 보관 안정성 분석
7-1. 분말 제형화
필러 조성물의 분말 (파우더) 제형화 가능성을 확인하기 위하여, 도 35에 나타낸 바와 같이, 제조예 1의 HA-PG 용액을 동결 건조시켜 파우더 형태의 필러 조성물을 제조하였다. 이후, 상기 파우더 형태의 필러 조성물을 PBS (pH7)에 용해시켜 재가용화 (Resolubilization)시킨 뒤, 이를 마우스의 피하에 주입하여 하이드로젤 형성여부를 관찰하였다. 그 결과, 도 36에 나타낸 바와 같이, 동결 건조 파우더 상태에서 재가용화된, 본 발명의 필러 조성물은 종전과 마찬가지로 체내 산화력에 의해 가교되어 하이드로젤을 형성함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는, 파우더 제형화가 가능한 본 발명의 필러 조성물은 사용자에게 사용 편이성 및 보관 용이성을 제공할 수 있음을 나타낸 것이다.
7-2. 보관 안정성 분석
필러 조성물의 구체적인 보관 안정성을 확인하기 위하여, 먼저, 제조예 1의 HA-PG 용액을 상온 (25℃) 또는 냉장 (4℃) 상태로 보관하면서 보관 용기 내에서의 젤화 여부를 확인하였다. 또한, 보관 용기에 질소 기체를 주입하여 HA-PG 용액과 산소간 접촉을 차단시킨 후, 냉장 (4℃) 상태에서 3일간 보관하고, 다른 한편으로는 HA-PG 용액을 냉동 (-80℃) 상태에서 10일간 보관하였으며, 이후, 이들의 용액을 마우스의 피하에 주사하여 하이드로젤 형성여부를 관찰하였다. 그 결과, 도 37에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 필러 조성물은 높은 산화력에 의해 상온에서는 1일, 냉장 상태에서는 3일 내에 젤화가 진행되었다. 반면, 도 38에 나타낸 바와 같이, 산소를 차단시킨 조건에서, 냉장 상태의 경우 3일이 경과한 때에도 젤화가 진행되지 않았으며, HA-PG 용액을 냉동 상태로 보관 한뒤, 10일 후 해동시킨 경우, 용액의 성질을 유지하고 있었을 뿐만 아니라, 이를 마우스의 피부에 주사한 경우에도 종전과 마찬가지로 체내 산화력에 의해 가교되어 하이드로젤을 형성됨을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는, 본 발명의 필러 조성물은 산소를 차단시킨 조건 또는 냉동 상태에서 보다 장기간 보관할 수 있음을 나타내는 것이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (29)

  1. 피로갈롤기 (pyrogallol group)로 수식된 히알루론산 유도체를 가교 (cross-linking) 시키는 것을 포함하고, 상기 히알루론산 유도체는 히알루론산이 피로갈롤기로 수식된 것인, 히알루론산 하이드로젤의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 히알루론산 유도체는, 하기 화학식 1인 것을 특징으로 하는, 히알루론산 하이드로젤의 제조방법.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018001473-appb-I000011
    (상기 화학식 1에서, R1은 하이드록시기 또는
    Figure PCTKR2018001473-appb-I000012
    이고, n은 1 내지 1,000의 정수이다.)
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 가교시키는 단계는, 산화제 또는 pH 조절제를 첨가하여 가교시키는 것을 특징으로 하는, 히알루론산 하이드로젤의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 산화제는, 과요오드산나트륨 (sodium periodate), 과산화수소 (hydrogen peroxide), 겨자무과산화효소 (horseradish peroxidase), 및 타이로시나아제 (tyrosinase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 히알루론산 하이드로젤의 제조방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 산화제를 첨가하여 가교시키는 단계는, 하기 화학식 2의 가교 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는, 히알루론산 하이드로젤의 제조방법.
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2018001473-appb-I000013
    (상기 화학식 2에서, HA'는 카르복시기가 아마이드기로 치환된 히알루론산을 나타낸다.)
  6. 제3항에 있어서, 상기 pH 조절제는, 수산화나트륨 (sodium hydroxide), 수산화리튬 (lithium hydroxide), 수산화칼륨 (potassium hydroxide), 수산화루비듐 (rubidium hydroxide), 수산화세슘 (cesium hydroxide), 수산화마그네슘 (magnesium hydroxide), 수산화칼슘 (calcium hydroxide), 수산화스트론튬 (strontium hydroxide) 및 수산화바륨 (barium hydroxide)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 히알루론산 하이드로젤의 제조방법.
  7. 제3항에 있어서, 상기 pH 조절제를 첨가하여 가교시키는 단계는, 하기 화학식 3의 가교 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는, 히알루론산 하이드로젤의 제조방법.
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2018001473-appb-I000014
    (상기 화학식 3에서, HA'는 카르복시기가 아마이드기로 치환된 히알루론산을 나타낸다.)
  8. 하기 화학식 1의 히알루론산 유도체를 가교시켜 제조된 히알루론산 하이드로젤로서, 하기 화학식 2의 가교 결합이 형성되어 있는, 히알루론산 하이드로젤.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018001473-appb-I000015
    (상기 화학식 1에서, R1은 하이드록시기 또는
    Figure PCTKR2018001473-appb-I000016
    이고, n은 1 내지 1,000의 정수이다.)
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2018001473-appb-I000017
    (상기 화학식 2에서, HA'는 카르복시기가 아마이드기로 치환된 히알루론산을 나타낸다.)
  9. 제8항에 있어서, 상기 히알루론산 유도체의 분자량은 10,000Da 내지 2,000,000Da인 것을 특징으로 하는, 히알루론산 하이드로젤.
  10. 제8항에 있어서, 상기 히알루론산 유도체는, 0.1% 내지 50%의 갈롤기 치환율을 갖는 것을 특징으로 하는, 히알루론산 하이드로젤.
  11. 하기 화학식 1의 히알루론산 유도체를 가교시켜 제조된 히알루론산 하이드로젤로서, 하기 화학식 3의 가교 결합이 형성되어 있는, 히알루론산 하이드로젤.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018001473-appb-I000018
    (상기 화학식 1에서, R1은 하이드록시기 또는
    Figure PCTKR2018001473-appb-I000019
    이고, n은 1 내지 1,000의 정수이다.)
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2018001473-appb-I000020
    (상기 화학식 3에서, HA'는 카르복시기가 아마이드기로 치환된 히알루론산을 나타낸다.)
  12. 제11항에 있어서, 상기 히알루론산 유도체의 분자량은 10,000 Da 내지 2,000,000 Da인 것을 특징으로 하는, 히알루론산 하이드로젤.
  13. 제11항에 있어서, 상기 히알루론산 유도체는, 0.1% 내지 50%의 갈롤기 치환율을 갖는 것을 특징으로 하는, 히알루론산 하이드로젤.
  14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항의 히알루론산 하이드로젤을 포함하는, 조직 공학용 지지체.
  15. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항의 히알루론산 하이드로젤을 포함하는, 약물 전달용 담체.
  16. 제5항에 있어서, 상기 약물이, 항체, 항체단편, DNA, RNA 또는 SiRNA를 포함하는 핵산, 펩타이드, 유전자, 단백질, 줄기세포 또는 화합물 (chemical compound)인 것인 약물 전달용 담체.
  17. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항의 히알루론산 하이드로젤을 포함하는, 필러 조성물.
  18. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항의 히알루론산 하이드로젤을 포함하는, 유착 방지용 조성물.
  19. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항의 히알루론산 하이드로젤을 포함하는, 상처 드레싱용 조성물.
  20. 피로갈롤기 (pyrogallol group)로 수식된 하기 화학식 1을 갖는 히알루론산 유도체.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018001473-appb-I000021
    (상기 화학식 1에서, R1은 하이드록시기 또는
    Figure PCTKR2018001473-appb-I000022
    이고, n은 1 내지 1,000의 정수이다.)
  21. 피로갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체를 포함하는, 필러 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 히알루론산 유도체는 하기 화학식 1인 것인, 필러 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018001473-appb-I000023
    (상기 화학식 1에서, R1은 하이드록시기 또는
    Figure PCTKR2018001473-appb-I000024
    이고, n은 1 내지 1,000의 정수이다.)
  23. 제22항에 있어서, 상기 히알루론산 유도체의 분자량이 10,000 Da 내지 2,000,000 Da인 것인, 필러 조성물.
  24. 제22항에 있어서, 상기 히알루론산 유도체가, 1% 내지 20%의 갈롤기 치환율을 갖는 것인, 필러 조성물.
  25. 제22항에 있어서, 상기 히알루론산 유도체는, 전체 필러 조성물에 대하여 0.1%(w/v) 내지 10%(w/v)로 함유되는 것을 특징으로 하는, 필러 조성물.
  26. 제21항에 있어서, 상기 조성물은, 생체 외에서 액체 상태이고, 생체 내에서 가교제 없이 겔화 상태를 형성하는 것을 특징으로 하는, 필러 조성물.
  27. 제21항 또는 제26항에 있어서, 상기 조성물은, 눈물골 영역, 미간 주름 영역, 눈가 영역, 이마 영역, 콧등 영역, 코옆 주름 영역, 입옆 주름 영역, 및 목 주름 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 부위에 주입되는 것을 특징으로 하는, 필러 조성물.
  28. 제21항 또는 제26항에 있어서, 상기 조성물은, 섬유아세포 성장인자(FGF), 상피세포 성장인자(EGF), 케라티노사이트 성장인자(KGF), 형질전환 성장인자 알파(TGF-α), 형질전환 성장인자 베타(TGF-β), 과립구 형성 자극인자(GCSF), 인슐린 유사 성장인자(IGF), 혈관내피 성장인자(VEGF), 간세포 성장인자(HGF), 혈소판 유래 성장인자-BB(PDGF-BB), 뇌 유래 신경영양인자(BDNF), 및 아교세포 유래 신경영양인자(GDNF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 세포 성장인자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 필러 조성물.
  29. 제21항 또는 제26항에 있어서, 상기 조성물은, 국소 마취제, 항산화제, 비타민, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 성분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 필러 조성물.
PCT/KR2018/001473 2017-02-02 2018-02-02 갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체를 기재로 하는 하이드로젤 및 이의 용도 WO2018143736A1 (ko)

Priority Applications (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA3052135A CA3052135C (en) 2017-02-02 2018-02-02 Hydrogel using, as substrate, hyaluronic acid derivative modified with gallol group and use thereof
BR122021001969-0A BR122021001969B1 (pt) 2017-02-02 2018-02-02 Hidrogel usando, como substrato, derivado de ácido hialurônico modificado com grupo galol e uso do mesmo
KR1020197025688A KR102099981B1 (ko) 2017-02-02 2018-02-02 갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체를 기재로 하는 하이드로젤 및 이의 용도
CN201880010122.5A CN110603268B (zh) 2017-02-02 2018-02-02 将利用棓酚基改性的透明质酸衍生物用作底物的水凝胶及其用途
BR112019015891-0A BR112019015891A2 (pt) 2017-02-02 2018-02-02 Hidrogel usando, como substrato, derivado de ácido hialurônico modificado com grupo galol e uso do mesmo
US16/483,146 US20200230288A1 (en) 2017-02-02 2018-02-02 Hydrogel using, as substrate, hyaluronic acid derivative modified with gallol group and use thereof
EP18748489.4A EP3578573A4 (en) 2017-02-02 2018-02-02 HYDROGEL USING AS A SUBSTRATE A HYALURONIC ACID DERIVATIVE MODIFIED BY A GALLOL GROUP, AND ASSOCIATED USE
JP2019542124A JP6997470B2 (ja) 2017-02-02 2018-02-02 ガロール基で修飾されたヒアルロン酸誘導体を基材とするヒドロゲルおよびその用途
RU2019127536A RU2778054C2 (ru) 2017-02-02 2018-02-02 Гидрогель, содержащий в качестве субстрата производное гиалуроновой кислоты, модифицированное галлольной группой, и его применение
AU2018216540A AU2018216540B2 (en) 2017-02-02 2018-02-02 Hydrogel using, as substrate, hyaluronic acid derivative modified with gallol group and use thereof
US17/842,493 US20230147416A1 (en) 2017-02-02 2022-06-16 Hyaluronic acid derivative and use thereof
US17/842,475 US20220313866A1 (en) 2017-02-02 2022-06-16 Hyaluronic acid derivative and use thereof

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20170014855 2017-02-02
KR10-2017-0014855 2017-02-02
KR10-2017-0014856 2017-02-02
KR20170014856 2017-02-02

Related Child Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US16/483,146 A-371-Of-International US20200230288A1 (en) 2017-02-02 2018-02-02 Hydrogel using, as substrate, hyaluronic acid derivative modified with gallol group and use thereof
US17/842,493 Division US20230147416A1 (en) 2017-02-02 2022-06-16 Hyaluronic acid derivative and use thereof
US17/842,475 Division US20220313866A1 (en) 2017-02-02 2022-06-16 Hyaluronic acid derivative and use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018143736A1 true WO2018143736A1 (ko) 2018-08-09

Family

ID=63040885

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2018/001473 WO2018143736A1 (ko) 2017-02-02 2018-02-02 갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체를 기재로 하는 하이드로젤 및 이의 용도

Country Status (9)

Country Link
US (3) US20200230288A1 (ko)
EP (1) EP3578573A4 (ko)
JP (1) JP6997470B2 (ko)
KR (1) KR102099981B1 (ko)
CN (1) CN110603268B (ko)
AU (1) AU2018216540B2 (ko)
BR (2) BR122021001969B1 (ko)
CA (1) CA3052135C (ko)
WO (1) WO2018143736A1 (ko)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200110538A (ko) * 2019-03-14 2020-09-24 연세대학교 산학협력단 세로토닌 수식 히알루론산을 포함하는 하이드로젤 및 이의 용도
IT201900006038A1 (it) * 2019-04-18 2020-10-18 Fidia Farm Spa Composizioni farmaceutiche comprendenti statine e derivati dell’acido ialuronico
WO2021006426A1 (ko) * 2019-07-09 2021-01-14 연세대학교 산학협력단 생체모사 조직 접착성 하이드로젤 패치 및 이의 용도
WO2021162529A1 (ko) * 2020-02-14 2021-08-19 연세대학교 산학협력단 페놀 유도체가 수식된 콘드로이틴 설페이트 하이드로젤 및 이의 용도

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022045230A1 (ja) * 2020-08-27 2022-03-03 京セラ株式会社 生体適合性高分子、生体適合性組成物、ゾルまたはゲル、および注射用組成物
KR102602244B1 (ko) * 2021-01-20 2023-11-16 주식회사 세라트젠 페놀 유도체가 수식된 탈세포화된 조직 유래 세포외기질 및 이의 용도
KR20220123161A (ko) 2021-02-28 2022-09-06 (주)앰틱스바이오 미세입자가 임베딩된 생분해성 마이크로니들 및 이의 용도
JP2024512019A (ja) * 2021-03-31 2024-03-18 ユーアイエフ（ユニバーシティ インダストリー ファンデーション）， ヨンセ ユニバーシティ ガロール誘導体が修飾されたペクチン及びその用途
CN113244437A (zh) * 2021-06-15 2021-08-13 福州大学 一种仿生多功能复合海绵敷料的制备方法与应用
CN113698539B (zh) * 2021-09-22 2022-04-22 四川大学 氧气调控力学性能的生物封闭材料及其制备方法
KR20230109577A (ko) * 2022-01-13 2023-07-20 연세대학교 산학협력단 근육 재생을 위한 페놀기 수식 탈세포 근육조직 유래 세포외기질 및 이의 제조방법
WO2023182761A1 (ko) * 2022-03-22 2023-09-28 연세대학교 산학협력단 갈롤기로 수식된 알데히드 치환 히알루론산 유도체 및 그 용도
CN114632192B (zh) * 2022-03-23 2023-03-17 东莞市人民医院 锶-酚螯合物自组装涂层材料、其制备方法及应用
CN116270423B (zh) * 2023-01-12 2024-01-16 南方医科大学珠江医院 一种装载甲氨蝶呤的透明质酸水凝胶及其制备方法和应用
CN116462863B (zh) * 2023-06-15 2023-09-01 首都医科大学附属北京口腔医院 一种含载Mg2+单宁酸微粒子的没食子酸接枝壳聚糖水凝胶及制备方法和应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4582865A (en) 1984-12-06 1986-04-15 Biomatrix, Inc. Cross-linked gels of hyaluronic acid and products containing such gels
US4713448A (en) 1985-03-12 1987-12-15 Biomatrix, Inc. Chemically modified hyaluronic acid preparation and method of recovery thereof from animal tissues
US5356883A (en) 1989-08-01 1994-10-18 Research Foundation Of State University Of N.Y. Water-insoluble derivatives of hyaluronic acid and their methods of preparation and use
KR20070076386A (ko) * 2006-01-18 2007-07-24 한국과학기술연구원 생분해성 온도 감응성 폴리포스파젠계 하이드로젤, 그의제조방법 및 그의 용도
KR20090013696A (ko) * 2007-08-01 2009-02-05 신풍제약주식회사 가교결합성 히알루론산 유도체 제조방법 및 그 히알루론산유도체의 가교결합물
KR20140072008A (ko) * 2011-06-03 2014-06-12 알러간, 인코포레이티드 항산화제를 포함하는 피부 충전제 조성물
WO2015174934A1 (en) * 2014-05-15 2015-11-19 Agency For Science, Technology And Research Polymer-flavonoid conjugate and uses thereof
KR20160072592A (ko) * 2014-12-15 2016-06-23 유상재 복합 필러 조성물

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101340044B1 (ko) * 2011-10-27 2013-12-10 한국과학기술원 히알루론산 카테콜 접합체 및 이의 용도
KR101552387B1 (ko) * 2012-05-29 2015-09-10 한국교통대학교산학협력단 약물전달용 가교물 하이드로 젤 및 그 하이드로 젤의 제조방법
SG11201506366SA (en) * 2013-02-13 2015-09-29 Agency Science Tech & Res A Polymeric System for Release of an Active Agent
EP3041830B1 (en) * 2013-09-03 2023-10-25 Agency For Science, Technology And Research Polymer-flavonoid conjugates and hydrogels for biomedical applications

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4582865A (en) 1984-12-06 1986-04-15 Biomatrix, Inc. Cross-linked gels of hyaluronic acid and products containing such gels
US4713448A (en) 1985-03-12 1987-12-15 Biomatrix, Inc. Chemically modified hyaluronic acid preparation and method of recovery thereof from animal tissues
US5356883A (en) 1989-08-01 1994-10-18 Research Foundation Of State University Of N.Y. Water-insoluble derivatives of hyaluronic acid and their methods of preparation and use
KR20070076386A (ko) * 2006-01-18 2007-07-24 한국과학기술연구원 생분해성 온도 감응성 폴리포스파젠계 하이드로젤, 그의제조방법 및 그의 용도
KR20090013696A (ko) * 2007-08-01 2009-02-05 신풍제약주식회사 가교결합성 히알루론산 유도체 제조방법 및 그 히알루론산유도체의 가교결합물
KR20140072008A (ko) * 2011-06-03 2014-06-12 알러간, 인코포레이티드 항산화제를 포함하는 피부 충전제 조성물
WO2015174934A1 (en) * 2014-05-15 2015-11-19 Agency For Science, Technology And Research Polymer-flavonoid conjugate and uses thereof
KR20160072592A (ko) * 2014-12-15 2016-06-23 유상재 복합 필러 조성물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3578573A4
SHIN, M. ET AL.: "Gallol-Rich Hyaluronic Acid Hydrogels: Shear-Thinning, Protein Accumulation against Concentration Gradients, and Degradation Resistant Properties", CHEMISTRY OF MATERIALS, vol. 29, 21 September 2017 (2017-09-21), pages 8211 - 8220, XP055532231 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200110538A (ko) * 2019-03-14 2020-09-24 연세대학교 산학협력단 세로토닌 수식 히알루론산을 포함하는 하이드로젤 및 이의 용도
WO2020185041A3 (ko) * 2019-03-14 2020-11-05 연세대학교 산학협력단 세로토닌 수식 히알루론산을 포함하는 하이드로젤 및 이의 용도
KR102308721B1 (ko) * 2019-03-14 2021-10-06 주식회사 세라트젠 세로토닌 수식 히알루론산을 포함하는 하이드로젤 및 이의 용도
CN113574109A (zh) * 2019-03-14 2021-10-29 赛拉尔研究有限公司 包含经血清素修饰的透明质酸的水凝胶及其用途
CN113574109B (zh) * 2019-03-14 2023-01-06 赛拉尔研究有限公司 包含经血清素修饰的透明质酸的水凝胶及其用途
IT201900006038A1 (it) * 2019-04-18 2020-10-18 Fidia Farm Spa Composizioni farmaceutiche comprendenti statine e derivati dell’acido ialuronico
WO2020212853A1 (en) * 2019-04-18 2020-10-22 Fidia Farmaceutici S.P.A. Pharmaceutical compositions comprising statins and hyaluronic acid derivatives
WO2021006426A1 (ko) * 2019-07-09 2021-01-14 연세대학교 산학협력단 생체모사 조직 접착성 하이드로젤 패치 및 이의 용도
CN114072132A (zh) * 2019-07-09 2022-02-18 赛拉尔研究有限公司 仿生组织黏附性水凝胶贴片及其用途
JP2022540223A (ja) * 2019-07-09 2022-09-14 セルアートジェン インコーポレイテッド 生体模倣組織接着性ハイドロジェルパッチ及びその用途
WO2021162529A1 (ko) * 2020-02-14 2021-08-19 연세대학교 산학협력단 페놀 유도체가 수식된 콘드로이틴 설페이트 하이드로젤 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
US20200230288A1 (en) 2020-07-23
EP3578573A1 (en) 2019-12-11
AU2018216540B2 (en) 2021-02-18
RU2019127536A3 (ko) 2021-03-02
CN110603268B (zh) 2022-05-17
CA3052135A1 (en) 2018-08-09
AU2018216540A1 (en) 2019-09-26
CA3052135C (en) 2022-01-11
JP6997470B2 (ja) 2022-02-04
RU2019127536A (ru) 2021-03-02
US20220313866A1 (en) 2022-10-06
BR112019015891A2 (pt) 2020-03-17
KR20190115036A (ko) 2019-10-10
EP3578573A4 (en) 2020-11-18
JP2020506273A (ja) 2020-02-27
BR122021001969B1 (pt) 2022-11-01
KR102099981B1 (ko) 2020-04-10
CN110603268A (zh) 2019-12-20
US20230147416A1 (en) 2023-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2018143736A1 (ko) 갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체를 기재로 하는 하이드로젤 및 이의 용도
Hu et al. 3D-printable supramolecular hydrogels with shear-thinning property: Fabricating strength tunable bioink via dual crosslinking
KR20200017625A (ko) 생체분자 또는 약물의 생체 내 전달을 위한 수식된 히알루론산 유도체의 용도
Tian et al. Mussel-inspired adhesive and polypeptide-based antibacterial thermo-sensitive hydroxybutyl chitosan hydrogel as BMSCs 3D culture matrix for wound healing
Shu et al. In situ crosslinkable hyaluronan hydrogels for tissue engineering
Yang et al. Mechanoadaptive injectable hydrogel based on poly (γ-glutamic acid) and hyaluronic acid regulates fibroblast migration for wound healing
EP3620186B1 (en) Biomaterial devices for guided tissue regeneration
Zhou et al. A self-healing hydrogel based on crosslinked hyaluronic acid and chitosan to facilitate diabetic wound healing
WO2014092239A1 (ko) 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트 및 그 제조방법
CN101636181A (zh) 形成水凝胶的新颖的可注入壳聚糖混合物
Yang et al. Injectable polylysine and dextran hydrogels with robust antibacterial and ROS-scavenging activity for wound healing
CA3163069A1 (en) Hydrogel of mercapto-modified macromolecular compound, and preparation method therefor and use thereof
KR20210144660A (ko) 실크-히알루론산 조직 충전제 및 이를 제조하는 방법
Wang et al. Fabrication of curcumin-loaded silk fibroin and polyvinyl alcohol composite hydrogel films for skin wound healing
KR20230119104A (ko) 조직 충진, 조직 간격화, 및 조직 벌크화를 위한 실크-히알루론산 조성물
US20190184064A1 (en) Composition for Soft Tissue Augmentation Providing Protection from Infection
EP3620152A1 (en) Biomaterial devices and topical compositions for treatment of skin abnormalities
US20180228703A1 (en) Improved Hyaluronan and Modified-Hyaluronan in Biomedical Applications
Chen et al. Mussel-inspired self-healing hydrogel form pectin and cellulose for hemostasis and diabetic wound repairing
RU2778054C2 (ru) Гидрогель, содержащий в качестве субстрата производное гиалуроновой кислоты, модифицированное галлольной группой, и его применение
WO2018062728A1 (ko) 가교 히알루론산을 포함하는 주사용 조성물
WO2016126947A2 (en) Subcutaneous complex and single-component ecm compositing for induction of hair growth and follicular regeneration
WO2024029993A1 (ko) 상처 치유 촉진용 또는 흉터 최소화용 하이드로젤 패치
KR102417671B1 (ko) 자가가교 시스템을 가지는 히알루론산 기반 연조직 충전 조성물 및 이의 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18748489

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3052135

Country of ref document: CA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019542124

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112019015891

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20197025688

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018748489

Country of ref document: EP

Effective date: 20190902

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018216540

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20180202

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112019015891

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20190731