CN101636181A - 形成水凝胶的新颖的可注入壳聚糖混合物 - Google Patents

Abstract

一种壳聚糖组合物，其包含至少一种具有从约30％至约60％的范围内的乙酰化度的壳聚糖和至少一种具有至少约70％的脱乙酰化度的壳聚糖，其中所述组合物经历pH依赖性和温度依赖性胶凝以形成水凝胶；以及制备方法及其用途。

Description

形成水凝胶的新颖的可注入壳聚糖混合物

发明领域

本发明涉及带正电的多糖水凝胶的领域。更具体地，本发明涉及pH依赖性热敏性多糖水凝胶及其制备方法，所述多糖水凝胶包含至少两种不同壳聚糖的组合物，所述至少两种不同壳聚糖在乙酰化度和乙酰化比率、乙酰化位点的均一的(homogenic)或非均一的分布、它们的分子量、溶解度和生物降解性上不同。

发明背景

水凝胶是高度水合的大分子网络，分散于水或其他生物流体中。

显示出随温度增加而粘度增加的特性的水凝胶被称为热敏性(或热固性)水凝胶。这样的水凝胶相较于非-热敏性水凝胶已显示出具有较容易的应用以及在应用位点处较长的残存期，并因此作为缓释药物递送系统是有利的。

已知热敏性水凝胶可由诸如壳聚糖的天然源聚合物制备(O.Felt等，The Encyclopedia of Controlled Drug Delivery(控制药物递送百科全书)，1999)，壳聚糖是商业可得的便宜的聚合物，其通过壳多糖的部分至大部分碱性N-脱乙酰化而获得，壳多糖是由经β-1，4糖苷键连接的、N-乙酰葡糖胺单元制成的线性多糖。通常，使用热的、浓的氢氧化物溶液(通常为氢氧化钠)来进行脱乙酰化过程。

壳多糖是天然存在的生物聚合物，见于诸如甲壳动物、虾、蟹、真菌等海洋生物的细胞骨架和硬壳中，并且是在纤维素和昆布多糖之后位列第三的最丰富的天然存在的多糖。壳多糖是化学惰性的、不溶性的，并且具有薄片状、粒状或瓦片状的晶体结构。

壳聚糖包含游离的胺(-NH₂)基团并可通过N-乙酰-D-葡糖胺单元与D-葡糖胺单元的比例来表征，所述比例通常以壳多糖聚合物的乙酰化度(DA)(与脱乙酰化相反)来表达。乙酰化度和分子量(MW)均为壳聚糖的重要参数，影响诸如溶解度、生物降解性和粘度的性质。

壳聚糖是唯一带正电的多糖，这使其具有生物附着性，该性质延迟了药剂从应用位点的释放(He等，1998；Calvo等，1997)，并允许与诸如细胞外膜的糖胺聚糖(glyosaminoglycans)的阴离子天然化合物发生离子型盐相互作用。

壳聚糖

壳聚糖是生物相容的、非毒性的并且是非免疫原性的，这允许其用于医疗、制药、化妆品和组织构建领域。例如，局部眼应用和在视网膜附近的眼内注入或移植(Felt等，1999；Patashnik等；1997；Song等，2001)。此外，壳聚糖被诸如溶菌酶的某些特定酶裂解代谢，并因此可被视为生物可侵蚀和生物可降解的(Muzzarelli 1997，Koga 1998)。另外，已报导壳聚糖通过打开上皮的紧密连接(tight-junction)作为渗透促进剂(Junginger和Verhoef，1998；Kotze等，1999)，与透明质酸酶(所谓的“扩散因子”)的作用类似。壳聚糖还促进伤口愈合，以及作为抗附着剂(antiadhesive)(防止病理性粘连)(Biagini等，1992；Ueno等，2001)并表现出抗菌(Felt等，2000；Liu等，2001)、抗真菌作用和抗肿瘤性能。

鉴于壳聚糖的卓越性能，对用于药物缓释和再生医学的成长性产业中的新壳聚糖水凝胶存在增长的需求。

近来，已描述了温度受控的、pH依赖性、离子型多糖凝胶的形成，所述离子型多糖凝胶例如壳聚糖/有机磷酸盐水体系(美国专利第6,344,488号)。虽然壳聚糖水溶液是pH依赖性胶凝体系，但将多羟基化合物或糖的单磷酸二代盐加入壳聚糖水溶液中导致进一步温度受控的、pH依赖性胶凝。在低温下将固体有机磷酸盐加入并溶解于0.5％至4.0％w/v内的壳聚糖的酸性水溶液中。壳聚糖/有机磷酸盐水溶液最初储存在低温下(4℃)，然后在30℃至60℃的温度范围内吸热地胶凝。壳聚糖/有机磷酸盐溶液在所需胶凝温度下迅速变为凝胶。

多种相互作用是造成溶液/凝胶转变的原因：由于盐的基本特性和作用，静电排斥减少，结果壳聚糖链间氢键合增加；以及通过增加pH应当被增强的壳聚糖-壳聚糖疏水作用。增加温度时出现的胶凝过程主要源于壳聚糖疏水性吸引力的增强，该增强在甘油部分(作为增塑剂)和壳聚糖存在时也会出现。在低温下，壳聚糖-水的强相互作用防止壳聚糖链聚集。一旦加热，水分子的鞘被除去，允许排成行的壳聚糖大分子缔合。此外，一旦升高温度，静电力可能降低，并且预期疏水作用对壳聚糖混合物的胶凝具有主要的贡献。

已制备了透明的壳聚糖/甘油磷酸盐水凝胶，需要通过用乙酸酐再乙酰化而对壳聚糖的脱乙酰化进行改变。使用预先过滤的壳聚糖、稀释的乙酸酐和降低的温度已显示出提高效率和再现性(Berger等，2004)。壳聚糖/甘油磷酸盐水凝胶的浊度显示出受壳聚糖脱乙酰化度以及再乙酰化期间的介质的均一性所调节，所述介质的均一性影响葡萄糖胺单体的分布模式。透明的壳聚糖/甘油磷酸盐水凝胶的制备需要脱乙酰化度介于30％和60％之间的、均一地(homogeneously)再乙酰化的壳聚糖。

含有壳聚糖的水凝胶对于药物递送是非常有用的。它们可以方便地通过局部(关节内)途径被施用；它们可使用微创技术被注入；使用水凝胶的药物递送直接在靶位点提供高水平的药物浓度；并且它们使药物的不利的系统作用和毒性最小化。

壳聚糖微球已被开发用于药物递送，其中药物释放是通过制备的微球的粒径、水化度、膨胀比或生物降解性来控制的。已尝试通过壳聚糖的交联以形成网络而开发用于递送诸如抗癌药、肽、抗生素剂、类固醇等药物的壳聚糖微球。

传统的壳聚糖交联反应包括壳聚糖与二醛的反应，二醛可能具有生理毒性。使用被称为京尼平的天然存在的交联剂合成了具有较低细胞毒性的新颖的壳聚糖网络，其通过京尼平与壳聚糖经亲核进攻的杂环连接和形成酰胺键合而提供了双功能交联(Mi等，2000)。

基于壳聚糖/多羟基化合物盐的组合的热敏性中性溶液的制备已由Chenite等，2000描述。这些制剂具有生理pH并能在室温以下保持为液体以包封活细胞和治疗蛋白；它们在体温下形成单块凝胶而没有任何化学修饰或交联。由于促进凝胶形成的协同力，例如氢键合、静电作用和疏水作用，加入带有单个阴离子头的多羟基化合物盐导致凝胶的形成。当注入到体内时，液体制剂原位变成凝胶植入物。该系统已被用作用于体内递送生物活性生长因子的容器库(container-reservoir)以及用作用于组织工程应用的活软骨细胞的包封基质。

壳聚糖-甘油磷酸盐/血液植入物已显示出通过提高组织的量和改善其生物化学组成与细胞组织而改善微裂缝(microfacture)缺陷中的透明软骨修复(Hoemann等，2005)。微裂缝(microfracture)缺陷由血凝块填充，所述血凝块由骨髓衍生细胞寄居，其已经通过引入壳聚糖而被稳定。因此，使用这样的植入物将预期导致更好的整合、改善的生物化学性能和修复组织更长的耐久性。

可在作为人造肌肉、作为生物传感器或作为人造器官成分方面具有重要应用的均一的亚微壳聚糖纤维可通过电湿纺技术(electro-wet-spinningtechnology)制备(Lee等，2006)。

已显示基于壳聚糖的凝胶通过俘获大量新合成的阴离子蛋白聚糖而变成骨架和用作骨架，所述骨架用于包封椎间盘(IVD)细胞(Roughley等，2006)。因此，这样的凝胶是在IVD恶化早期帮助恢复髓核结构区功能的基于细胞的补充(supplementation)的合适骨架。较密的、纤维胶原构造可作为纤维化环的结构替代物，允许内源细胞的群集。

胶原凝胶先前已显示可用于通过包埋入凝胶中的、培养的软骨细胞修复关节软骨缺陷(Katusbe等，2000)。最近，壳聚糖水凝胶已显示可用于软骨再生和防止与急性和慢性软骨缺陷相关的膝部疼痛。

这样的壳聚糖水凝胶的一种高级临床产品是在PCT申请WO 99/07416中描述的、由BioSyntech生产的水凝胶。BioSyntech的热敏性壳聚糖水凝胶是通过使用多羟基化合物的单磷酸二代盐(特别是β-甘油磷酸盐(β-GP))中和具有约80％-90％的脱乙酰化度的商业壳聚糖来制备。在生理温度下，将β-GP加入壳聚糖中使pH能够升高至约7而没有壳聚糖沉淀并在该pH形成水凝胶。

壳聚糖水凝胶(BST-CarGel^TM)是由BioSyntech生产的，该壳聚糖水凝胶填充软骨缺陷并为软骨修复提供最佳环境。使用患者自己的血液作为生物成分的唯一来源，在清创软骨缺陷(debrided cartilage defect)内沿着微裂缝递送壳聚糖增塑剂混合物。该混合物填充缺陷并在8-12分钟内原位凝固，为软骨再生提供了有效的骨架。然后，健康的软骨细胞从深的内骨经微裂缝孔迁移并重新住入填充凝胶的损伤。

第二种BioSyntech的壳聚糖水凝胶，BST-DermOn^TM，可用作刺激和支持伤口愈合的局部治疗。该产品作为粘膜粘附屏障并且能够密封伤口并维持潮湿环境，同时继续允许气体交换。

另外的BioSyntech壳聚糖水凝胶，BST-InPod^TM，旨在治疗足跟痛。这是可注入的产品，其旨在通过与患者自己的垫脂肪(pad fat)整合并恢复生物力学缓冲性能和舒适性而永久恢复足底脂肪垫的舒适性。

这些有前景的实例还表现出一些局限性。相信包含具有约15％-20％DA的乙酰化度的商业可得的壳聚糖的BioSyntech产品表现不希望的较慢的降解速率。此外，在生理pH 7.4下，壳聚糖具有有限的能力与细胞混合并包封细胞来形成三维骨架。

BioSynthech的水凝胶家族具有有限的降解速率并且形成这样的水凝胶需要甘油磷酸盐或类似的增塑盐的存在。甘油磷酸盐(Glyerophosphate)是带负电的分子实体，它能够与生物活性组分的正电荷发生反应，导致其沉淀，或导致其从水凝胶中释放的干扰。因此，甘油磷酸盐的存在可减少可使用壳聚糖/甘油磷酸盐(glyceroposphate)水凝胶的药物的范围。

此外，调节水凝胶的诸如胶凝时间和粘度的性能取决于甘油磷酸盐的浓度，并因此受甘油磷酸盐溶解度的限制。尤其是，需要高浓度的甘油磷酸盐以具有低胶凝时间，避免水凝胶在其施用后的快速消除。然而，高浓度的甘油磷酸盐还降低了水凝胶的粘度。因此，胶凝时间必须与水凝胶的稠度相平衡，并且不可能获得具有作为期望的组合特性的低胶凝时间和高粘度两者的水凝胶。另外，过高浓度的甘油磷酸盐可在其施用位点处引起水凝胶的沉淀。

进一步地，热敏性壳聚糖/甘油磷酸盐凝胶被发现是浑浊的，因此使它们不适用于诸如眼施用或局部施用的特定应用。

已鉴定了一种新型的壳聚糖。已经发现，商业壳聚糖再乙酰化以产生具有从约30％至约60％的乙酰化度的、均一地乙酰化的壳聚糖，大大增加了在生理pH下壳聚糖在水中和体液中的溶解度而无需使用甘油磷酸盐。这样的壳聚糖产生可用于细胞包封的清澈透明的凝胶(Berger等人的WO05/097871)。

可用于制备再乙酰化壳聚糖的商业壳聚糖的实例是从AldrichChemical，Milwaukee，USA获得的制药级且高MW的壳聚糖，其具有1100kDa的MW，如由O.Felt等在Int.J.Pharm.180，185-193(1999)中报导的尺寸排阻色谱法所测定，并且具有83.2％的脱乙酰化度DD，如由R.A.Muzarelli等在″Chitin in Nature and Technology(在自然界中的壳多糖和技术)″，Plenum press，纽约，385-388，(1986)中报导的UV法所测量。然而，可以使用具有80％至90％的脱乙酰化度和不小于10kDa的分子量的任何商业壳聚糖。用于溶解商业壳聚糖的酸性介质可以是例如乙酸，并且在壳聚糖溶解后得到的壳聚糖酸性溶液可接着用诸如甲醇的醇稀释。

壳聚糖的均一再乙酰化一方面通过用乙酰基置换胺基团而具有增加疏水性位点数量的作用，但另一方面，使壳聚糖趋于折叠的晶体结构被大大减少，使壳聚糖溶解度不断提高。再乙酰化防止聚合物的再折叠、保持直链并因此防止pH相关的溶解度降低。

通常，商业可得的壳聚糖是通过干的壳多糖薄片的脱乙酰化而在工业上制备(Muzzarelli，1986)。脱乙酰化优先发生在薄片表面的壳多糖分子的无定形区域中，产生具有可变的脱乙酰单元的块大小分布的非均一单体(Aiba，1991)。相比之下，在均一条件下再乙酰化的壳聚糖采取脱乙酰单体的随机分布，这引起壳聚糖结晶度的降低并由此增加其溶解度(Aiba，1991，1994；Ogawa和Yui，1993；Milot等，1998)。

聚合的水凝胶的适用性是由它们的生物相容性、机械完整性、在生理pH下凝胶形成的速率和可逆性、以及它们的低重量和延长的寿命所决定。然而，几乎不可能控制已知壳聚糖水凝胶的各种重要性能，例如强度、降解速率和释放曲线。

因此，存在对其中凝胶的物理性能可根据需要来控制的含有壳聚糖的水凝胶的普遍公认的需求，并且，有这样的水凝胶将是非常有利的。

发明概述

本发明提供用于形成多糖水凝胶的、pH依赖性和温度依赖性组合物。

根据本发明的一方面，提供了一种壳聚糖组合物，所述组合物包含至少一种具有从约30％至约60％范围内的乙酰化度的壳聚糖和至少一种具有至少约70％的脱乙酰化度的壳聚糖，其中所述组合物经过pH依赖性和温度依赖性胶凝以形成水凝胶。

根据本发明的另一方面，提供了一种制备稳定的水凝胶的方法，所述稳定的水凝胶包含组合物，所述组合物含有至少一种具有从约30％至约60％的乙酰化度的高度乙酰化的壳聚糖和至少一种具有从约70％的脱乙酰化度的高度脱乙酰化的壳聚糖。该方法包括将至少一种高度乙酰化的壳聚糖和至少一种高度脱乙酰化的壳聚糖溶解于酸中以形成复合溶液；将所述复合溶液的pH调节到从高于6.5至约7.2的值；和将所述复合溶液的温度增加至约37℃同时将pH提高到从约7.0至约7.6。

根据本发明的另一方面，提供了一种包含水凝胶的缓释药物递送系统，所述水凝胶包含组合物，所述组合物含有至少一种具有从约30％至约60％的乙酰化度的壳聚糖和至少一种具有从约70％的脱乙酰化度的高度脱乙酰化的壳聚糖。

由含有至少两种壳聚糖的这种混合物产生的壳聚糖凝胶可选择地包含包封药物的壳聚糖微球和/或包埋于凝胶中的电纺壳聚糖纤维。

根据以下描述的本发明优选实施方案的进一步的特征，组合物的胶凝在pH高于pH 6.5时发生。

根据在所述优选实施方案中更进一步的特征，胶凝在接近生理pH和37℃时发生。

高度乙酰化的壳聚糖可均一地乙酰化或均一地脱乙酰化。可选择地并优选地，高度脱乙酰化的壳聚糖是非均一地脱乙酰化的。

高度乙酰化的壳聚糖和高度脱乙酰化的壳聚糖可选择地各自以总组合物的从约0.1％至约6％w/v的浓度存在，并可各自具有从约10kDa至约4000kDa范围内的分子量。可选择地并优选地，高度脱乙酰化的壳聚糖具有大于约200kDa的分子量。另外可选择地并优选地，高度乙酰化的壳聚糖具有大于约60kDa的分子量。

水凝胶的性能可通过对高度乙酰化的壳聚糖和高度脱乙酰化的壳聚糖两者的分子量、脱乙酰化度和脱乙酰化位点的分布进行操控来控制。这些操控将影响凝胶性能，例如胶凝温度、密度或孔隙率、或水化度或疏水程度。水凝胶的降解速率可通过溶菌酶抑制剂三-N-乙酰-葡糖胺与高度乙酰化的壳聚糖相结合来进一步控制。

本发明的组合物可选择地进一步包含带负电的多糖，例如源自动物或源自植物的聚合物。作为源自植物的聚合物的非限制性实例，所述带负电的多糖可选择地包含海藻。或者，所述带负电的多糖可选择地包含糖胺聚糖，例如透明质酸、硫酸软骨素或诸如硫酸葡聚糖的其他酸性聚合物。

根据优选实施方案进一步的特征，本发明的组合物可进一步包含药物、多肽和细胞(例如动物细胞或植物细胞)中的至少一种。

所述组合物可进一步包含乳化剂。可选择地，壳聚糖和乳化剂可形成纳米颗粒。

本发明的水凝胶可选择地用于诸如以下的应用：药物递送、支持细胞生长、骨结构支持、软骨修复、组织重建、伤口愈合、产生人造皮肤、作为降血脂药和降血胆固醇药(hypocholesterolimic agent)、形成人造肾膜、骨填充和软组织重建，例如足跟痛的缓解。用于形成水凝胶的组合物可选择地通过诸如注入或内窥镜施用(endoscopic administration)的途径来施用。

水凝胶可选择地用于制备用于生产可植入设备的生物相容的材料，所述可植入设备例如用于组织修复、组织重建、组织构建和组织置换。

在某些实施方案中，壳聚糖的抗附着(anti-adhesion)性能使该凝胶可用作诸如心胸外科和腹部外科的应用中的抗附着设备。

根据优选实施方案的进一步的特征，水凝胶可选择地用于制备药物递送设备。所述药物递送设备可选择地提供包埋药物的缓慢释放。用于该系统的药物的非限制性实例包括蛋白(例如BSA或血红蛋白)或非蛋白剂(例如ACE-抑制剂或抗炎药)。由于凝胶的透明性，所述药物递送系统可选择地是眼科药物递送系统。然而，所述药物递送系统还可选择地用于诸如膀胱输尿管反流的泌尿科应用以及诸如皱纹处理的美容应用。

所述药物还可选择地包含矿物、维生素、食品添加剂或诸如源自植物的提取物的天然提取物中的一种或多种。凝胶自身，可选择地与活性成分一起，可选择地用作食品添加剂。

可选择地，水凝胶可选择地用于支持三维凝胶构建体中的内源性细胞。作为进一步的选择，水凝胶可选择地用于包埋添加或没有添加生长因子的外源性细胞，该细胞还可提供诸如生长因子的代谢产物。还可选择地，水凝胶可选择地用于制备负载细胞的人造基质，其中所述细胞为，例如，软骨细胞、纤维软骨细胞、韧带成纤维细胞、皮肤成纤维细胞、肌腱细胞、肌成纤维细胞、间叶干细胞和角质形成细胞。

根据本发明的优选实施方案，提供了包含含有活性成分并封装于水凝胶中的纳米颗粒的壳聚糖组合物，该壳聚糖组合物包含至少一种具有从约30％至约60％范围内的乙酰化度的壳聚糖和至少一种具有至少约70％的脱乙酰化度的壳聚糖，其中所述水凝胶通过pH依赖性和温度依赖性胶凝形成。可选择地，所述组合物进一步包含乳化剂。还可选择地，一旦注入受治疗者，所述水凝胶便形成。

根据某些实施方案，壳聚糖凝胶可选择地在诸如阴道萎缩、干眼症、干燥性结膜炎(conjuctivitis sicca)、上呼吸道感染后的鼻干燥(dry nose)的此类应用中用作润滑剂以及各种磨损的通用缓和剂(general soothing agent)。壳聚糖凝胶还可选择地通过局部注入或外部按摩用作诸如纤维肌痛(fibromyalgia)的筋膜疾病(fascial disease)中的抗炎剂。

通过提供形成其中物理性能和化学性能可被准确确定的水凝胶的组合物，本发明成功解决了目前已知的用于形成多糖水凝胶的组合物的缺陷。

除非另外定义，本文使用的所有科技术语均具有与本发明所属领域中的普通技术人员所普遍理解的相同的含义。虽然与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料能够用于本发明的实践或试验中，但以下描述合适的方法和材料。如果冲突，将以本专利说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例只是说明性的，并且不预期为限制性的。

附图简述

仅作为实例、参考附图在此描述本发明。现将详细地具体参考附图，这里强调，所显示的细节是作为实例且只是为了本发明优选实施方案的说明性论述目的，并且是为了提供被认为对本发明的原理和概念方面最有益的和容易理解的描述而提出。在这点上，没有试图显示比基本理解本发明所必需的更详细的本发明的结构细节，参考附图的描述使得如何可在实践中具体实现本发明的若干形式对于本领域技术人员来说是明显的。

在附图中：

图1说明由含有两种不同类型的壳聚糖的液体组合物形成根据本发明的水凝胶；和

图2a说明包含按照本发明原理的壳聚糖类型1和类型2的组合物的降解时间；

图2b说明包含不同比例的壳聚糖类型1和类型2的组合物的降解时间；

图3说明了洗脱液中以μg/ml测量的血红蛋白从本发明水凝胶的释放；

图4说明了以光密度(OD)测量的牛血清白蛋白(BSA)从本发明水凝胶的释放；

图5表示说明BSA从本发明水凝胶释放的条形图。

图6说明本发明水凝胶的降解曲线；

图7说明了BSA的释放曲线与本发明水凝胶的降解曲线的整合；

图8A和图8B显示由采用本发明水凝胶治疗的大鼠进行的创面活组织检查的组织病理学；

图9显示治疗结果的图；并且

图10A和图10B显示对回旋肌腱群损伤的大鼠进行的体内试验结果。

优选实施方案描述

本发明人已发现，包含至少两种不同类型的壳聚糖的组合物(其中所述不同类型是按照它们的乙酰化度/脱乙酰化度和乙酰化单元的均一性水平来分类)提供了一种水凝胶，其中相较于包含单一类型壳聚糖的水凝胶，更大程度地控制各种物理性能和化学性能是可能的。

脱乙酰至脱乙酰化度(DD)为约70％-100％(即DA最多约30％)的壳聚糖，例如商业可得的壳聚糖，可被称为类型1壳聚糖。这些壳聚糖在生理pH是不可溶的，并且很难被溶菌酶识别，导致缓慢的生物降解。由这种类型的壳聚糖形成的凝胶具有低乙酰化度，通过许多疏水作用形成密集的氢键。降解速率已显示为脱乙酰化度的函数。壳聚糖的降解对细胞增殖和重塑有影响。

高度均一地脱乙酰化的或再乙酰化的壳聚糖(具有从约30％至约60％的乙酰化度)被称为类型2。这样的壳聚糖容易被溶菌酶消化/降解，从而使控制药物释放成为可能。如果壳聚糖的脱乙酰化度低于30％，则壳聚糖变成与在酸性条件下不可溶的壳多糖接近的聚合物，并因此不能用于本发明。脱乙酰化度大于60％时出现壳聚糖的沉淀。

壳聚糖的脱乙酰化度可通过分光光度法测定，该法例如在文献R.A.Muzarelli和R.Richetti的Carbohydr.Polym.5，461-472，1985中或在R.A.Muzarelli和R.Richetti的″Chitin in Nature and Technology(在自然界中的壳多糖和技术)″，Plenum press 385-388，1986中描述。简要地，在例如后一种方法中，壳聚糖溶解于1％乙酸中，然后通过使用N-乙酰-D-葡糖胺溶液作为标准品、在200nm、201nm、202nm、203nm和204nm用UV测量壳聚糖的N-乙酰-葡糖胺的含量来测定壳聚糖的DD。

根据优选实施方案，本发明涉及一种多糖水凝胶组合物，所述多糖水凝胶组合物包含至少一种具有从约30％至约60％的乙酰化度的高度乙酰化的壳聚糖和至少一种具有至少约70％的脱乙酰化度的高度脱乙酰化的壳聚糖的组合。

高度乙酰化的类型2壳聚糖可通过静电作用、氢的作用和疏水作用与高度脱乙酰化的家族类型1壳聚糖发生作用。作用的程度随着pH增加而增加。包含两种类型壳聚糖溶液的组合物能够在生理pH下形成稳定的凝胶而无需甘油磷酸盐。

类型1壳聚糖在约6.5的pH沉淀，该pH小于生理pH。高度疏水性的、均一的壳聚糖类型2与壳聚糖类型1的相互作用通过形成氢键和疏水键而防止了非均一地乙酰化的类型1壳聚糖的沉淀，允许从约pH 6.7时形成稳定的溶液并在约pH 7.0和以上时形成稳定的半固体水凝胶。

形成的次级键允许非均一的壳聚糖链的包封并且在大于其pKa值的pH下保持其溶解度。通常，这样的次级链相互作用(secondary chaininteraction)是凝胶形成中涉及的主要分子力(Chenite等，2000；Berger等，2005)。

类型1壳聚糖主要促进凝胶的稳定性、强度和刚性并提供缓慢降解，而类型2壳聚糖促进凝胶的柔软性、弹性和快速增溶。类型1和类型2壳聚糖的不同降解曲线在以下的实施例2中进一步讨论并在图2中显示。

凝胶的物理性能和化学性能通过升高或降低壳聚糖的分子量和/或其乙酰化度和通过由不同来源的壳聚糖的自然的乙酰化差异而改变。凝胶的性能可通过选择再乙酰化类型(即均一的或非均一的)或通过设计脱乙酰化/乙酰化的位点的分布模式而进一步控制。

优选地，高度乙酰化的壳聚糖被均一地乙酰化。进一步优选地，高度脱乙酰化的壳聚糖是非均一地脱乙酰化的。

增加壳聚糖的分子量增加其粘度，以致该聚合物是高度水化和高度疏水的。因此，由这样的聚合物形成的凝胶具有增加的强度并具有更高的保水作用。这导致缓慢的降解速率、药物缓慢释放和改善的机械性能。优选地，高度乙酰化的壳聚糖和高度脱乙酰化的壳聚糖的每一个具有从约10kDa至约4000kDa的分子量。壳聚糖的分子量可通过例如由O.Felt，P.Purrer，J.M.Mayer，B.Plazonnet，P.Burri和R.Gumy在Int.J.Pharm.180，185-193(1999)中报导的尺寸排阻色谱法而容易地测定。MW的上限由施用的容易性决定，取决于所选的应用。

在0％-30％DA的范围增加乙酰化度导致增加的疏水性，但在较高的值，例如30％-60％DA，聚合物随着DA量的增加开始变得越来越可溶。此外，增加乙酰葡糖胺基团的数量增加体内的降解速率，这是由于溶菌酶识别位点的增加。因此，水凝胶从身体的释放速率能够通过改变壳聚糖乙酰化度来控制。

在分子量、脱乙酰化度和乙酰化位点的分布上的改变影向发生凝胶形成的条件(pH、温度等)；溶解度；生物降解性；与蛋白、活性药物成分或其他化学品的反应性程度；疏水性/亲水性；水化度；以及凝胶的生物学性能和生物相容性，例如影响细胞生长、增殖和存活、壳聚糖起炎症介质或抗炎介质作用的能力、和壳聚糖对伤口愈合的加速或减速作用。

例如，较高分子量的类型1壳聚糖具有较高的疏水性和较高的粘度，导致由于较高的分子间相互作用的较强的凝胶。较高DDA的类型1壳聚糖具有较低的降解速率。具有较高结晶度的类型1壳聚糖具有较低的降解速率，这是由于晶体形式是不可溶的事实。因此，本领域技术人员可预测所得凝胶混合物的性能，并从而能够使用不同类型的壳聚糖的独特组合来制备具有所需特性的凝胶。

优选地，高度乙酰化的壳聚糖和高度脱乙酰化的壳聚糖每一个以总组合物的约0.1％至6％w/v的浓度存在。

本发明的组合物在体温和生理pH下形成凝胶。本发明的凝胶不需要甘油磷酸盐。

本发明的水凝胶相较于由BioSyntech取得专利权的基于壳聚糖/βGP的水凝胶提供了更大的控制凝胶强度、降解速率和释放速率的可能性，并且扩展了以下的可能性：控制凝胶性能并将这些性能调整为满足更宽范围的化学用途和物理用途。

根据本发明的多糖水凝胶可选择地包含壳聚糖与带负电的多糖(例如诸如透明质酸或硫酸软骨素的糖胺聚糖)的混合物。

已发现添加乙酰透明质酸造成包含类型1壳聚糖和类型2壳聚糖的组合物沉淀形成稳定的凝胶。

本发明的水凝胶还可包含具有不同分子量或脱乙酰化度的、选自类型1或类型2的第三种壳聚糖，因此扩展了对所得水凝胶的控制。

因此，基于这两种类型的壳聚糖的不同组合物和混合物可用于提供具有适于宽范围应用的性能的半固体凝胶，所述应用例如诸如用于试剂或药物的缓慢释放的药物或蛋白递送系统、各种稠度(consistency)的支架(scaffolding)，包括以下应用的凝胶：支持细胞生长或骨结构支持；软骨修复；组织重建；伤口敷料，促进无瘢痕愈合与巨噬细胞活化；用于产生人造皮肤；作为降血脂药和降血胆固醇药；作为人造肾膜；用于骨填充；和足跟痛的缓解。

可在皮下、腹膜内、肌肉内或在生物结缔组织、骨缺陷、裂痕、关节腔、身体管道(conduit)或腔、眼睛盲管、或实体瘤中原位形成凝胶。

多糖凝胶溶液可通过注入或内窥镜施用引入动物或人类的身体。

在胶凝之前，可将药物、多肽、活的微生物、动物或人类细胞并入多糖凝胶。

根据本发明，还提供了多糖凝胶在制备用于化妆品、药理学、医学和/或外科的生物相容的、可降解的材料中的用途。

凝胶可作为整体或作为组成部分被并入用于修复、重建和/或置换动物或人类的组织和/或器官的可植入设备或植入物中。

凝胶可作为整体使用或作为可植入的、透皮的或皮肤病学的药物递送系统的组成部分使用。

凝胶可作为整体使用或作为眼科植入物或药物递送系统的组成部分使用。

凝胶可用于制备用于生物工程混合材料与组织等价物的设计和培养的负载细胞的人造基质。

负载的细胞可选自由软骨细胞(关节软骨)、纤维软骨细胞(半月板)、韧带成纤维细胞(韧带)、皮肤成纤维细胞(皮肤)、肌腱细胞(腱)、肌成纤维细胞(肌肉)、间叶干细胞、角质形成细胞(皮肤)和神经细胞、以及脂肪细胞或骨髓细胞组成的组。事实上，来自能够增殖的任何组织的细胞均可选择地包埋于这样的构建体中。

对伤口愈合的主要损害是生物膜的存在。生物膜包含至少80％的细胞外大分子，所述细胞外大分子通常带正电，与壳聚糖类似。壳聚糖可选择地用作生物膜破坏剂，因此有助于伤口卫生和限制生物膜对细菌破坏的抑制作用。与乳铁蛋白混合的壳聚糖凝胶可选择地作为缓释库(slow releasereservoir)以破坏任何慢性伤口或可变成慢性的伤口中的生物膜。与木糖醇混合的壳聚糖凝胶还可选择地是特定的生物膜破坏剂。

根据本发明，还提供了负载的多糖凝胶作为可注入的或可植入的凝胶生物材料的用途，所述凝胶生物材料作为用于在动物或人类的生理位置原位形成骨样组织、纤维软骨样组织或软骨样组织的支持体、载体、重建设备或替代物。

例如，根据本发明的壳聚糖凝胶可用作治疗眼睛的药物持续递送系统。基于壳聚糖化合物的眼部刺激试验(ocular irritation test)的结果已表明，基于壳聚糖制剂优秀的耐受性，它们适于用作眼用凝胶(Molinaro等，2002)。

根据本发明进一步的实施方案，提供了包含高度乙酰化的类型1的壳聚糖和高度脱乙酰化的类型2的壳聚糖的缓释药物递送水凝胶系统。

本发明的任何药物递送系统均可用于递送多种药物，包括但不限于镇痛药、麻醉剂、抗粉刺药(antiacne agent)、抗衰老剂、抗细菌剂、抗生素、抗烧伤药(antiburn agent)、抗抑郁药、抗皮炎药(antidermatitis agent)、抗水肿药、抗组胺剂、驱虫药(antihelminths)、抗过度角化药(antihyperkeratolyteagent)、抗炎剂、抗刺激剂、抗血脂药、抗微生物剂、抗霉菌药、抗氧化剂、止痒剂、抗牛皮癣剂、抗酒渣鼻药(antirosacea agent)、抗皮脂溢出剂、抗菌剂、抗肿胀剂(antiswelling agent)、抗病毒剂、抗酵母剂、心血管剂、化疗剂、皮脂类固醇、杀真菌药、激素、羟酸、角质层分离剂、内酰胺、杀螨剂(mitocide)、非类固醇抗炎剂、杀虱药、黄体酮、治愈剂(sanatives)、杀芥螨药和血管扩张药。

按照本发明进一步的实施方案，提供了一种制备稳定的水凝胶的方法，所述稳定的水凝胶包含组合物，所述组合物含有至少一种具有从约30％至约60％的乙酰化度的高度乙酰化的壳聚糖和至少一种具有从约70％的脱乙酰化度的高度脱乙酰化的壳聚糖。该方法包括以下步骤：将高度乙酰化的壳聚糖溶解于HCl溶液中；将高度脱乙酰化的壳聚糖溶解于HCl溶液中；将高度乙酰化的壳聚糖溶液与高度脱乙酰化的壳聚糖溶液混合以形成复合溶液；将所述复合溶液的pH调节至中性pH；和将所述复合溶液的温度增加至约37℃。

在详细说明本发明的至少一个实施方案之前，应当理解本发明并不限于在以下说明中提出的或由实施例说明的细节上的应用。本发明允许其他实施方案或能够以各种方式实施或进行。此外，应当理解，本文使用的措词和术语是为了说明的目的并且不应视为限制性的。

本文使用的术语“约”是指±10％。

本文与本发明组合物结合使用的术语“假-热固性”是指温度不引起组合物胶凝而是起在升温时大大减少胶凝时间的催化剂作用。

本文使用的术语“被中和的”是指pH为6.8-7.2。

实施例

实施例1：壳聚糖水凝胶的制备

将乙酰化度为15％且分子量为65KDa的3％壳聚糖(Koyo，Japan)通过与0.9％HCl混合24小时而溶解，形成类型1壳聚糖溶液。

均一地脱乙酰化的、51％脱乙酰化且分子量为220KDa的3％壳聚糖(Koyo，Japan)通过与0.9％HCl相混合24小时而溶解，形成类型1壳聚糖溶液。

按照类型-1与类型-2的以下比例：1∶1、2∶1和3∶1，将类型1壳聚糖溶液和类型2壳聚糖溶液相混合、用氢氧化钠滴定至pH 6.8并在4℃放置24小时、然后在4℃下进一步滴定至pH 7.2。所得组合物在室温下为液体。一旦将温度增加至37℃并将pH升高至7.4时，液体溶液形成稳定的半固体凝胶，如图1所示。

将1克该凝胶置于50ml塑料管中，一式三份。

以预定时间间隔(1、2、3、4、5、6和7天)将3ml 10％牛血清培养基的小份加入每个管中。在每一时间间隔的末端，通过重复添加50ml蒸馏水、置于室温下若干小时并除去水在24小时时段内将该凝胶洗涤3次。洗涤过程将所有可溶物质从凝胶中除去。

然后将凝胶冷冻、冻干并称量。作为时间间隔的函数，由样品的重量改变来计算重量降低，如图2a所示。

实施例2：壳聚糖(chiosan)凝胶的降解时间

以1∶1w/w比例的均一的壳聚糖(类型2)和非均一的壳聚糖(类型1)制备假-热固性水凝胶(3％)。水凝胶由血清酶的降解在图2a和图2b中显示。

通过凝胶重量损失在第2、4、7和14天测量降解。

在图2a中显示两种截然不同的降解动力学，一种在3-6天内终止的快速阶段(fast phase)，一种在14天后仅显示部分降解的较慢阶段。认为快速阶段反映高度可溶的并且易于被血清酶识别的类型2壳聚糖的降解。慢动力学阶段与不易于被血清酶识别和消化的壳聚糖类型1壳聚糖相关联。

控制葡糖胺聚合物的再乙酰化对于操控壳聚糖被溶菌酶识别的程度并从而对于操控水凝胶降解速率是很重要的工具。控制酶活性的主要因素是N-乙酰葡糖胺(NAG)在聚合物中的百分比(Ran等2005)。为此，将壳聚糖类型2中的再乙酰化度从50％降低至35％将允许降解速率显著降低，导致小得多的斜率(图2)。另一方面，增加壳聚糖类型1的乙酰化度导致聚合物较快的降解(图2)。选择两种类型壳聚糖的合适的组合预期形成对时间的单一的线性降解曲线，而不是在该图中显示的两个斜率。

现参考图2b，其显示类型1壳聚糖和类型2壳聚糖的混合物，所述混合物中类型1与类型2的比例为1∶1、2∶1和3∶1。如图所示，凝胶的降解速率随着类型2壳聚糖与类型1壳聚糖的比例的增加而增加。

实施例3：通过壳聚糖凝胶的蛋白缓慢释放

为了研究本发明的壳聚糖假热固性水凝胶作为缓释载体的潜力，使用血红蛋白和牛血清白蛋白(BSA)作为溶质。这些化合物被公认为蛋白标准品。将25μl小份BSA或40μl血红蛋白加入1ml含有壳聚糖混合物的溶液，分别得到蛋白在水凝胶中1mg/ml和4mg/ml的最终浓度。在37℃下将蛋白在3ml PBS中孵育1周。每天更换培养基，并测量从水凝胶中释放的蛋白的量，如图3-7所示。

最初释放出大量血红蛋白并且释放速率随时间降低(图3)。未显示初始突释(initial burst)。BSA显示了与血红蛋白相同的曲线(图4和图5)。得到接近线性的斜率(图4)。BSA与凝胶的混合提高了凝胶的稳定性，提供了与单独的壳聚糖混合物的降解速率相比降低的降解速率(图6)。释放的BSA的量与降解的凝胶的量的比较(图7)显示，蛋白的释放速率比凝胶的降解速率快。

图7中显示的数据涉及类型1壳聚糖的单一乙酰化度和单一分子量，这导致蛋白释放曲线具有每天降低的释放速率。然而，合适地选择诸如两种类型壳聚糖的再乙酰化度和分子量的另外的变量允许确定凝胶的特性，并且使蛋白类药物对壳聚糖结构的亲和力能够得到改善。预期这样的特定组合将提供特定药物的固定释放速率，反映出组合的扩散速率和基质降解速率。

实施例4：作为伤口敷料的壳聚糖凝胶的体内研究

使用已知以高脂肪饮食圈养时形成糖尿病症状的嗜沙肥鼠(psammomys obesus)品系大鼠作为II型糖尿病的模型。这些动物被认为是模拟糖尿病的慢性皮肤溃疡和研究皮肤伤口愈合的优良模型，由于它们倾向于产生深度感染、坏疽和败血病，导致发病甚至死亡。

以下是检查皮肤溃疡愈合的常用参数：

1.在修复组织中出现新血管形成的时机。

2.嗜中性粒细胞活性的降低。

3.巨噬细胞活性的增加。

4.通过伤口的完全上皮再形成，伤疤伤口闭合的时机。

5.角质形成细胞单层的形成。

6.通过成纤维细胞沉积的细胞外基质网络的活化，表皮层和真皮层的结合。

使用作为生物敷料的、基于壳聚糖的凝胶，避免了对包扎或缝合的需要，并且对创面提供直接的包覆以促进愈合。经8天时间研究了各愈合阶段的出现率，特别是伤口收缩-伤疤收缩(scar shrinkage)和闭合阶段。

使用25只成年的雌性嗜沙肥鼠大鼠，每只重150-160克。

在施用高脂肪饮食后、从第0天前4至6周开始，发现13只动物形成糖尿病。

使用高脂肪饮食饲养时具有正常血糖(血糖量正常)(表明形成抗性)的6只动物作为第一对照，并且使用当以正常的低脂肪、低能量饮食饲养时血糖量正常的6只动物作为第二对照。

在第0天，使用Metricoconventer生产设备(Metricoconventer-productiondevice)在颈部剃过的皮肤处经表皮、真皮和下皮至肌肉地进行6mm直径的圆形全深度钻孔活组织检查(round full depth punch biopsy)。

通过将实施例1的基于壳聚糖的凝胶施用于伤口区域而治疗7只患有糖尿病的动物的损伤，而另外的6只动物未治疗。每天将凝胶再用于治疗组的伤口区域。

全部动物在7天时期中被宏观照相(macro-photograph)，并且每3天测量一次伤口的尺寸。每周一次使用数字血糖测计仪(Ascensia Elite ofBayer)、通过从大鼠的尾部产生的切口吸收血滴来测量重量水平和血糖水平。

7天后，处死动物并进行全深度活组织检查。皮肤被收集并置于固定溶液中。对皮肤样品进行进一步处理来进行组织学的和免疫组织化学的染色过程，以评价治疗的伤口和未治疗的伤口之间的不同。

结果在图8a和8b以及图9显示。如图所示，与对照组相比较，治疗组显示出伤口愈合统计学上显著的增加以及伤口愈合所需时间段的减少。

实施例5：回旋肌腱群修复

回旋肌腱群撕裂是肩疼痛的常见来源。回旋肌腱群损伤发病率随年龄增加并且最常见地是由腱的退化而不是来自运动或创伤的损伤所造成的。治疗建议从复原到手术修复撕裂的腱而变化。对每个患者的最佳治疗方法是不同的并且确实许多患者未获得对其损伤令人满意的修复。

在某些实施方案中，本发明通过提供在超声检查控制下允许自体细胞递送至回旋肌腱群撕裂中的可注入的产品而克服了背景技术的这些缺陷。在其他实施方案中，所述可注入的产品还允许引入骨髓细胞，例如用于组织愈合。

优选地，该方法作为门诊患者的方法而进行或者作为需要局部麻醉的不必卧床的方法(ambulatory procedure)而进行。

凝胶最初的液态性能允许完全附着至腱撕裂区域。

对大鼠的腱损伤和修复进行体内试验(使用外科手术损伤的腱)。损伤的腱被缝合并用根据本发明的凝胶与骨髓细胞的混合物来治疗；对照的动物仅接受缝合。对20只动物研究3个月。获得了组织学上证实的腱修复和对肌肉萎缩的预防(结果未显示)。

还对大鼠的再次经外科手术引起的回旋肌腱群损伤进行了体内试验。该损伤如上治疗。组织的组织学切片在术后6周显示，内源性细胞被从相邻的组织捕获，相较于在对侧肩的未治疗的对照缺陷，改善了受损位点的状况。示例性结果在图10A(治疗的)和图10B(未治疗的)中显示。

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一旦研究了并不旨在限制的以下实施例，本发明的另外的目的、优势和新颖的特征将对本领域普通技术人员变得明显。此外，如在上文所描述的和如在以下的权利要求部分所要求保护的本发明各种实施方案和方面的每一个均可在以下的实施例中找到试验支持。

应当理解，为了清楚而在分开的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。反过来，为了简洁而在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的亚组合提供。

虽然已经结合其具体实施方案描述了本发明，但显然许多替代、修改和变化对本领域技术人员是明显的。因此，意图涵盖落入所附权利要求的精神和宽范围内的所有这样的替代、修改和变化。在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在此以其整体通过引用并入本说明书，到如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地且单独地指示为通过引用并入本文一样的程度。此外，本申请中的任何参考的引用或鉴定不应解释为承认这样的参考可用作本发明的现有技术。

Claims (56)

1.一种壳聚糖组合物，其包含至少一种具有从约30％至约60％的范围内的乙酰化度的壳聚糖和至少一种具有至少约70％的脱乙酰化度的壳聚糖，其中所述组合物经过pH依赖性和温度依赖性胶凝以形成水凝胶。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述胶凝在高于pH 6.5的pH下发生。

3.如权利要求1所述的组合物，其中所述胶凝在接近生理pH和37℃时发生。

4.如权利要求1所述的组合物，其中所述高度乙酰化的壳聚糖是均一地乙酰化的或均一地脱乙酰化的。

5.如权利要求1所述的组合物，其中所述高度脱乙酰化的壳聚糖是非均一地脱乙酰化的。

6.如权利要求1所述的组合物，其中所述高度乙酰化的壳聚糖和所述高度脱乙酰化的壳聚糖各自以总组合物的从约0.2％至约3％w/v的浓度存在。

7.如权利要求1所述的组合物，其中所述高度乙酰化的壳聚糖和所述高度脱乙酰化的壳聚糖各自具有从约10kDa至约4000kDa范围内的分子量。

8.如权利要求7所述的组合物，其中所述高度脱乙酰化的壳聚糖具有大于约60kDa的分子量。

9.如权利要求8所述的组合物，其中所述高度乙酰化的壳聚糖具有大于约200kDa的分子量。

10.如权利要求1所述的组合物，其进一步包含含有带正电的多糖和带负电的多糖的混合物。

11.如权利要求10所述的组合物，其中所述带负电的多糖选自由源自动物的聚合物和源自植物的聚合物组成的组。

12.如权利要求11所述的组合物，其中所述源自植物的聚合物源自海藻。

13.如权利要求10所述的组合物，其中所述带负电的多糖是糖胺聚糖。

14.如权利要求13所述的组合物，其中所述糖胺聚糖选自由透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素和诸如硫酸葡聚糖的其他带负电的聚合物组成的组。

15.如权利要求1所述的组合物，其进一步包含药物、多肽和细胞中的一种。

16.如权利要求15所述的组合物，其中所述细胞选自由人类细胞和动物细胞组成的组。

17.如权利要求15所述的组合物，其中所述药物选自由以下组成的组：镇痛药、麻醉剂、抗粉刺药、抗衰老剂、抗细菌剂、抗生素、抗烧伤药、抗抑郁药、抗皮炎药、抗水肿药、抗组胺剂、驱虫药、抗过度角化药、抗炎剂、抗刺激剂、抗血脂药、抗微生物剂、抗霉菌药、抗氧化剂、止痒剂、抗牛皮癣剂、抗酒渣鼻药、抗皮脂溢出剂、抗菌剂、抗肿胀剂、抗病毒剂、抗酵母剂、心血管剂、化疗剂、皮脂类固醇、杀真菌药、激素、羟酸、角质层分离剂、内酰胺、杀螨剂、非类固醇抗炎剂、杀虱药、黄体酮、治愈剂、杀芥螨药和血管扩张药。

18.一种制备稳定的水凝胶的方法，所述稳定的水凝胶包含组合物，所述组合物含有至少一种具有从约30％至约60％的乙酰化度的高度乙酰化的壳聚糖和至少一种具有从约70％的脱乙酰化度的高度脱乙酰化的壳聚糖，所述方法包括：

a)将所述高度乙酰化的壳聚糖和所述高度脱乙酰化的壳聚糖溶解于酸中以形成复合溶液；

b)将所述复合溶液的pH调节至约6.6至约7的值；和

c)将所述复合溶液的温度增加至约37℃，同时将pH提高到至少约7.0。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述高度乙酰化的壳聚糖和所述高度脱乙酰化的壳聚糖的所述溶解是基本上同时地在同一容器中进行的。

20.如权利要求18所述的方法，其中所述高度乙酰化的壳聚糖和所述高度脱乙酰化的壳聚糖的所述溶解在分开的容器中进行以形成两种溶液，并且其中所述方法进一步包括将所述两种溶液混合以形成复合溶液的步骤。

21.权利要求1所述的水凝胶在选自由以下组成的组的应用中的用途：药物递送、支持细胞生长、骨结构支持、软骨修复、组织重建、伤口愈合、产生人造皮肤、降血脂药、降血胆固醇药、形成人造肾膜、骨填充和软组织重建。

22.如权利要求21所述的用途，其中所述组合物通过选自由直接滴注、注入和内窥镜施用组成的组的途径来施用。

23.权利要求1所述的水凝胶在制备用于制备可植入设备的生物相容性材料中的用途。

24.如权利要求23所述的用途，其中所述可植入设备用于选自由以下组成的组的应用中：组织修复、组织重建、组织构建和组织置换。

25.权利要求1所述的水凝胶在制备药物递送系统中的用途。

26.如权利要求25所述的用途，其中所述药物递送系统提供包埋的药物的缓慢释放。

27.如权利要求26所述的用途，其中所述包埋的药物选自由以下组成的组：镇痛药、麻醉剂、抗粉刺药、抗衰老剂、抗细菌剂、抗生素、抗烧伤药、抗抑郁药、抗皮炎药、抗水肿药、抗组胺剂、驱虫药、抗过度角化药、抗炎剂、抗刺激剂、抗血脂药、抗微生物剂、抗霉菌药、抗氧化剂、止痒剂、抗牛皮癣剂、抗酒渣鼻药、抗皮脂溢出剂、抗菌剂、抗肿胀剂、抗病毒剂、抗酵母剂、心血管剂、化疗剂、皮脂类固醇、杀真菌药、激素、羟酸、角质层分离剂、内酰胺、杀螨剂、非类固醇抗炎剂、杀虱药、黄体酮、治愈剂、杀芥螨药和血管扩张药。

28.如权利要求27所述的用途，其中所述药物递送系统是眼科药物递送系统或泌尿科药物递送系统。

29.权利要求1所述的水凝胶在寄居三维凝胶构建体中侵入的内源性细胞中的用途。

30.权利要求1所述的水凝胶在包埋用于提供代谢产物的外源性细胞中的用途。

31.如权利要求30所述的用途，其中所述代谢产物是生长因子。

32.权利要求1所述的水凝胶在制备负载细胞的人造基质中的用途。

33.如权利要求32所述的用途，其中所述细胞选自由以下组成的组：软骨细胞、纤维软骨细胞、韧带成纤维细胞、皮肤成纤维细胞、肌腱细胞、肌成纤维细胞、间叶干细胞和角质形成细胞。

34.一种包含水凝胶的缓释药物递送系统，所述水凝胶包含组合物，所述组合物含有至少一种具有从约30％至约60％的乙酰化度的壳聚糖和至少一种具有从约70％的脱乙酰化度的高度脱乙酰化的壳聚糖。

35.如权利要求1所述的壳聚糖组合物，其中所述水凝胶的性能通过操控所述高度乙酰化的壳聚糖和所述高度脱乙酰化的壳聚糖来控制。

36.如权利要求35所述的壳聚糖组合物，其中通过所述操控所控制的所述水凝胶的所述性能选自由胶凝温度、密度和孔隙率组成的组。

37.如权利要求35所述的壳聚糖组合物，其中所述操控包括操控选自由水化度和疏水程度组成的组的特征。

38.权利要求34所述的缓释药物递送系统在用于递送选自由以下组成的组的药剂中的用途：镇痛药、麻醉剂、抗粉刺药、抗衰老剂、抗细菌剂、抗生素、抗烧伤药、抗抑郁药、抗皮炎药、抗水肿药、抗组胺剂、驱虫药、抗过度角化药、抗炎剂、抗刺激剂、抗血脂药、抗微生物剂、抗霉菌药、抗氧化剂、止痒剂、抗牛皮癣剂、抗酒渣鼻药、抗皮脂溢出剂、抗菌剂、抗肿胀剂、抗病毒剂、抗酵母剂、心血管剂、化疗剂、皮脂类固醇、杀真菌药、激素、羟酸、角质层分离剂、内酰胺、杀螨剂、非类固醇抗炎剂、杀虱药、黄体酮、治愈剂、杀芥螨药和血管扩张药。

39.权利要求34所述的缓释药物递送系统在用于递送选自由BSA和血红蛋白组成的组的蛋白中的用途。

40.权利要求36所述的缓释药物递送系统在用于递送选自由ACE-抑制剂和抗炎药组成的组的非蛋白药剂中的用途。

41.如权利要求1所述的组合物，其中所述水凝胶的降解速率通过溶菌酶抑制剂三-N-乙酰-葡糖胺与所述高度乙酰化的壳聚糖相结合来控制。

42.如权利要求1所述的组合物，其进一步包含乳化剂。

43.如权利要求42所述的组合物，其中所述壳聚糖和所述乳化剂形成纳米颗粒。

44.一种壳聚糖组合物，其包含含有活性成分并封装于水凝胶中的纳米颗粒，所述壳聚糖组合物包含至少一种具有从约30％至约60％范围内的乙酰化度的壳聚糖和至少一种具有至少约70％的脱乙酰化度的壳聚糖，其中所述水凝胶通过pH依赖性和温度依赖性胶凝而形成。

45.如权利要求44所述的壳聚糖组合物，其进一步包含乳化剂。

46.如权利要求45所述的壳聚糖组合物，其中所述水凝胶在注入受治疗者时形成。

47.如权利要求44-46中任一项所述的组合物的用途，其中所述活性成分包含以非共价相互作用与所述纳米颗粒相互作用的蛋白，所述纳米颗粒在注入后在受治疗者中缓慢释放所述蛋白。

48.如权利要求21所述的用途，其中所述软组织重建包括提供足跟痛的缓解。

49.如上述权利要求的任一项所述的组合物作为生物膜破坏剂的用途，所述组合物可选择地与一种或多种其他生物膜损坏剂相结合。

50.如上述权利要求的任一项所述的组合物作为用于经口摄入的一种或多种食品添加剂的载体的用途。

51.如上述权利要求的任一项所述的组合物作为用于外科领域的抗附着设备的用途。

52.如上述权利要求的任一项所述的组合物作为用于显微注射疗法应用的注射剂的用途。

53.如上述权利要求的任一项所述的组合物作为润滑剂的用途。

54.如上述权利要求的任一项所述的组合物用于将自体细胞递送至回旋肌腱群撕裂和/或腱损伤中的用途。

55.如权利要求54所述的用途，其在超声检查控制下进行。

56.如上述权利要求的任一项所述的组合物，其进一步包含用于修复腱损伤和/或回旋肌腱群损伤的自体细胞。

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