CN105802916B - 一种壳聚糖水凝胶三维细胞培养基的制备及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种壳聚糖水凝胶三维细胞培养基的制备和使用方法，由水溶性壳聚糖、交联剂反应得到。本发明的壳聚糖水凝胶三维细胞培养基，组分安全性高，生物相容性好，水凝胶强度可根据所需细胞环境调节，可实现可控体外细胞三维增殖。

Description

一种壳聚糖水凝胶三维细胞培养基的制备及使用方法
技术领域
本发明属于生物材料及水凝胶制备技术领域，涉及一种壳聚糖水凝胶三维细胞培养基的制备及使用方法。
背景技术
近年来，随着生物学、医学的不断发展，科研人员对疾病的研究正逐渐由器官层次向组织、细胞层次深入。对于细胞这一生命体构筑基元研究的重要性愈发凸显。传统的体外细胞培养以二维培养为主，细胞在培养瓶或培养皿底部贴壁生长，与生物体内的三维生长在形式及环境上具有较大的差异。利用三维的细胞培养体系可以在体外构建起从二维培养到三维培养的桥梁，有利于模拟细胞在体内的生理条件、有利于研究细胞行为。
目前所采用的三维培养系统虽然比二维培养有了较大改善，但仍有一定的提升空间。多肽水凝胶作为一种具有生物相容性的三维培养基质，可以较好地模拟细胞生长环境，但外缘多肽潜在的免疫反应风险及其高昂的成本限制了其在科学研究及实际应用的进一步发展；合成聚合物物理凝胶具有良好的可注射性，但成胶所需的剧烈物理条件变化及较长的成胶时间，对于细胞的存活率及利用效率均会产生较大负面影响，不利于进一步的细胞治疗。
申请号为201210027133.9的发明公开了一种三维空间细胞培养系统。该发明提供制作的三维细胞培养单元可以长期培养细胞、生产大量细胞作为组织工程的种子细胞，还可在短期内形成再生组织和微器官。
申请号为201110191645.4的发明公开了一种合成高分子水凝胶细胞培养支架，由于合成高分子水凝胶的化学结构明确、物理化学性能稳定且易于调控、无异物感染且易于灭菌且廉价的优势，是安全培养人体多潜能干细胞的理想生物材料。
发明内容
本发明针对市场三维细胞培养基的强度调节困难、成本高、成胶后不可注射，提供一种壳聚糖水凝胶三维细胞培养基，由交联剂与壳聚糖发生反应得到水凝胶。
本发明还提供该材料的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）低强度壳聚糖水凝胶的制备：取浓度为0.03g/mL的壳聚糖溶液，加入0.005-0.015g/mL的交联剂溶液，其中壳聚糖溶液与交联剂溶液的体积比为1:1，在室温下混合反应2-5min，得到低强度壳聚糖水凝胶；
（2）中强度壳聚糖水凝胶的制备：取浓度为0.03g/mL的壳聚糖溶液，加入0.015-0.1g/mL的交联剂溶液，其中壳聚糖溶液与交联剂溶液的体积比为1:1，在室温下混合反应1-2min，得到中强度壳聚糖水凝胶；
（3）高强度壳聚糖水凝胶的制备：取浓度为0.03g/mL的壳聚糖溶液，加入0.1-0.5g/mL的交联剂溶液，其中壳聚糖溶液与交联剂溶液的体积比为1:1，在室温下混合反应0.5min-1min，得到高强度壳聚糖水凝胶；
优选的，所述的壳聚糖的脱乙酰度在85%-99.9%之间，重均分子量在10,000-100,000之间，具有水溶性。
优选的，壳聚糖溶液的浓度为0.03g/mL，交联剂的浓度为0.005-0.5g/mL。
优选的溶剂包括但不限与水、生理盐水、磷酸缓冲溶液、液态细胞培养基。
本发明的有益效果在于，该壳聚糖水凝胶三维细胞培养基生物相容性优异，细胞三维种植后存活率达98%以上，可通过调节水凝胶组分控制水凝胶强度以更好的匹配细胞生理环境，调节细胞增殖速率、干细胞生长分化。水凝胶固含量较低，易于营养物质交换与细胞排泄物代谢，实现体外细胞三维培养。在体外培养时细胞的生长率、成活率与二维细胞培养液相当，具有三维细胞培养优势。搭载细胞的三维水凝胶可通过注射植入体内。
附图说明
图1：本发明的水凝胶细胞培养基用于细胞三维培养的的光学照片。图1 a)为将细胞植入水凝胶三维培养基后，用光学显微镜拍摄的细胞在水凝胶中三维分布的照片； 图1b)为培养7天后用光学显微镜拍摄的细胞在水凝胶中三维分布的照片。细胞密度明显增长证明细胞在该水凝胶三维细胞培养基中生长良好增殖明显。
图2：本发明所制备的水凝胶细胞培养基用于细胞三维培养的荧光共聚焦照片。图2 a)为将细胞植入水凝胶三维培养基后，细胞经FDA/PI染色后用荧光共聚焦显微镜拍摄的细胞在水凝胶中三维分布的照片； 图2b)为培养7天后，细胞经FDA/PI染色后用荧光共聚焦显微镜拍摄的细胞在水凝胶中三维分布的照片。细胞密度明显增长证明细胞在该水凝胶三维细胞培养基中生长良好增殖明显。
图3：本发明所制备的水凝胶经注射器挤出后自愈的照片。图3 a)为将水凝胶三维细胞培养基经注射器挤出后破碎的照片； 图3b)为2小时后，水凝胶三维细胞培养基自发愈合成一块完整的水凝胶的照片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例1
取1体积浓度为0.03g/mL的壳聚糖细胞悬液，加入1体积浓度为0.015g /mL的交联剂溶液，在室温下混合反应2min，得到细胞三维分布的水凝胶。
实施例2
取1体积浓度为0.03g/mL的壳聚糖细胞悬液，加入1体积浓度为0.1g/mL的交联剂溶液，在室温下混合反应1min，得到细胞三维分布的水凝胶。
实施例3
取3体积浓度为0.03g/mL的乙二醇壳聚糖细胞悬液，加入1体积浓度为0.5g/mL的交联剂溶液，在室温下混合反应0.5min，得到细胞三维分布的水凝胶。
对于细胞培养，采用上述实施例制得的水凝胶样品可实现从二维培养到三维培养的过度，控制水凝胶组分比例选择水凝胶强度可控制细胞增殖速率、干细胞分化方向。
该水凝胶具有可注射的特点，将三维培养细胞的水凝胶可经经注射直接植入动物体内，实现微创细胞治疗。
以上实施例显示并描述了本发明的基本原理、制备方法。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，而不是以任何方式限制本发明的范围，在不脱离本发明范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的范围内。

Claims (2)

1.一种可注射壳聚糖水凝胶三维细胞培养基，由水溶性壳聚糖与交联剂在溶液中发生反应得到水凝胶，用于细胞的三维培养，所述的交联剂为二4-醛基苯甲酸聚乙二醇酯；壳聚糖溶液的浓度为0.03g/mL，交联剂的浓度为0.005-0.5g/mL；室温下成胶反应时间0.5到15min；所述的水溶性壳聚糖包括羧甲基壳聚糖、羧乙基壳聚糖、羟乙基壳聚糖、羟丙基壳聚糖、羟丁基壳聚糖、羟戊基壳聚糖中的一种或多种的混合物；壳聚糖的脱乙酰度在85％-99.9％之间，重均分子量在5,000-1,000,000之间；所述的交联剂的重均分子量在100-10,000之间；其中壳聚糖溶液与交联剂溶液的体积比为1:1；所述三维细胞培养基，用于体细胞、干细胞及肿瘤细胞的三维培养；所述的溶液为水、生理盐水、磷酸缓冲溶液、液态细胞培养基。
2.根据权利要求1所述的三维细胞培养基，用于制备注射制剂，其特征在于，所述的三维培养基在搭载细胞后经注射器挤出，并自发愈合成完整的水凝胶。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109022342A (zh) * 2018-09-18 2018-12-18 海安百优基质生物工程有限公司 以手性水凝胶作为贴壁细胞培养的三维培养体系

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106750416B (zh) * 2016-12-26 2019-07-23 西安交通大学 一种拥有自愈合和pH响应性能的可注射水凝胶及其制备方法和应用
CN113215089A (zh) * 2020-10-11 2021-08-06 西北农林科技大学 一种用于细胞培养肉的可食用的壳聚糖3d凝胶支架的制造方法
CN114404676B (zh) * 2022-01-21 2022-12-27 北京化工大学 具有隔热功能的自愈性水凝胶及其应用
CN115011546B (zh) * 2022-06-09 2024-04-12 青岛海洋科技中心 一种鱼类细胞体外三维培养、诱导分化和冷冻保存方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1954817A (zh) * 2005-10-28 2007-05-02 中国科学院过程工程研究所 一种可注射型pH及葡萄糖敏感水凝胶的制备方法
CN101636181A (zh) * 2006-12-11 2010-01-27 莫尔研究应用有限公司 形成水凝胶的新颖的可注入壳聚糖混合物
CN102604149A (zh) * 2012-04-12 2012-07-25 上海华谊生物技术有限公司 三维壳聚糖水凝胶及其制备方法
CN103071181A (zh) * 2013-02-01 2013-05-01 刘昌桂 一种水凝胶及其制备方法和用途
CN104189941A (zh) * 2014-09-03 2014-12-10 北京化工大学 一种壳聚糖凝胶止血材料及其制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1954817A (zh) * 2005-10-28 2007-05-02 中国科学院过程工程研究所 一种可注射型pH及葡萄糖敏感水凝胶的制备方法
CN101636181A (zh) * 2006-12-11 2010-01-27 莫尔研究应用有限公司 形成水凝胶的新颖的可注入壳聚糖混合物
CN102604149A (zh) * 2012-04-12 2012-07-25 上海华谊生物技术有限公司 三维壳聚糖水凝胶及其制备方法
CN103071181A (zh) * 2013-02-01 2013-05-01 刘昌桂 一种水凝胶及其制备方法和用途
CN104189941A (zh) * 2014-09-03 2014-12-10 北京化工大学 一种壳聚糖凝胶止血材料及其制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Synthesis of multiresponsive and dynamic chitosan-based hydrogels for controlled release of bioactive molecules;Zhang Y等;《Biomacromolecules》;20110630;第12卷(第8期);第2894-2901页 *
Zhang Y等.Synthesis of multiresponsive and dynamic chitosan-based hydrogels for controlled release of bioactive molecules.《Biomacromolecules》.2011,第12卷(第8期),第2894-2901页. *
自愈合凝胶:结构、性能及展望;董坤等;《中国科学:化学》;20120630;第42卷(第6期);第742-756页 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109022342A (zh) * 2018-09-18 2018-12-18 海安百优基质生物工程有限公司 以手性水凝胶作为贴壁细胞培养的三维培养体系

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