CN110804193B - 一种3d打印水凝胶支架的方法 - Google Patents

一种3d打印水凝胶支架的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种3D打印水凝胶支架的方法，该方法包括以下步骤：(1)将不饱和聚酯、不饱和聚酯重量1～2倍的多官能团丙烯酸酯、不饱和聚酯重量2～4倍的平均分子量为475的聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯和不饱和聚酯重量0.1～0.5倍的光引发剂加入到不饱和聚酯重量1～2倍亲水溶剂中混合均匀，得到水凝胶溶液；(2)在水凝胶溶液中加入粘度调剂，调整粘度为3000～6000mPa.s；(3)将步骤2调整粘度的水凝胶溶液导入到3D打印机的注射器中，按照设定程序打印，得到初级水凝胶支架；然后将初级水凝胶支架在365nm紫外光照射下进行光固化，冷冻干燥，得到所述的水凝胶支架；本方法所制备的水凝胶支架具有良好的亲水性，促进细胞附着和增值的效果显著。

Description

一种3D打印水凝胶支架的方法
技术领域
本发明涉及以其功能或物理性质为特征的假体材料，具体涉及高分子水凝胶，该水凝胶适用于3D打印。
背景技术
在生物医疗领域，器官与组织的移植及修复仍面临巨大的困难与挑战。而近年来出现的3D打印组织工程支架技术在解决这类问题上发挥着越来越重要的作用。
3D打印支架技术是采用三维快速成型技术，打印出具有良好生物相容性、优异力学性能、理想三维微观结构及可控宏观外形的支架，广泛应用在生物医疗行业。通过这种技术打印出的支架可用于进行细胞培养，使细胞在其中生长、增殖与分化，形成具有特定形状结构的组织或器官，从而用于作为人体组织或器官的替代物，以解决器官或组织供体不足的问题。水凝胶是亲水的聚合物网络，能够吸收大量的水分，在水中溶胀且保持一定的形状。水凝胶具有良好的生物相容性、亲水性、水渗透性，是一个理想的3D支架材料，可应用于细胞存储、细胞培养、监测细胞与细胞之间的相互作用等。3D打印水凝胶支架因为能实现对材料外部形态和内部微结构的可控调节，实现材料与生物体的匹配，同时能得到力学性能优异的支架材料，成为研究热点。
3D生物打印材料要求其良好的打印性、机械稳定性、生物降解性以及细胞相容性、细胞活性等。目前3D生物打印材料包括天然材料(如海藻酸，纤维，胶原和明胶等)和合成材料(如聚乙二醇，聚乳酸以及他们的衍生物。天然材料如海藻酸盐和纤维蛋白，有利于细胞的增殖和分化，也有利于药物的传递，然而天然材料降解快，不利于人体细胞的生长，并且在结构成熟之前机械性能较差且易降解。
交联结构是影响3D打印水凝胶支架的关键因素之一。打印成型的水凝胶的交联结构，对于保持其形状必不可少。即使用最粘稠的前驱体溶液打印，由于某些位点的变形和坍塌都会导致构建的结构变形。而浆料一旦交联，则形状可以完全保持。水凝胶可以通过物理(基于可逆相互作用)和化学方法(基于共价键的形成)交联。专利CN104628936A中采用将海藻酸钠、N,N一二甲基丙烯酞胺单体预混，先后采用打印-光照-浸泡的步骤进行化学交联成型，得到化学交联水凝胶。这种方法成分复杂，化学交联时间过长，打印出来的溶胶塑形困难、尺寸难以保持，容易发生坍塌，该过程中操作繁琐，大大降低3D打印的效率。
聚乙二醇嵌段修饰聚酯是一种生物医用价值和潜力十分巨大的可降解高分子材料，具有良好的生物相容性，广泛应用在药物载体、细胞培养支架和手术辅助材料等领域。陈昌(RSC Advances,2014,4:8789)等合成了聚乙二醇聚乳酸嵌段共聚物，通过升温制备热致水凝胶，将其应用为药物载体。但是聚乙二醇修饰聚酯通过体系升温形成的热致水凝胶。该水凝胶是通过分子间相互作用力物理交联形成，对外界环境刺激比较敏感，溶胀性能较差，稳定性不能满足要求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种3D打印水凝胶支架的方法，该方法制备的水凝胶支架具有细胞毒性低的优点，可以应用为细胞培养。
本发明解决上述问题的技术方案是：
一种3D打印水凝胶支架的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将不饱和聚酯、不饱和聚酯重量1～2倍的多官能团丙烯酸酯、不饱和聚酯重量2～4倍的平均分子量为475的聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯和不饱和聚酯重量0.1～0.5倍的光引发剂加入到不饱和聚酯重量1～2倍亲水溶剂中混合均匀，得到水凝胶溶液；
(2)在水凝胶溶液中加入粘度调剂，调整粘度为3000～6000mPa.s，所述的粘度调节剂是海藻酸、透明质酸、甲基丙烯酸化透明质酸、明胶、甲基丙烯酸化明胶和壳聚糖中的一种或者两种以上；
(3)将步骤2调整粘度的水凝胶溶液导入到3D打印机的注射器中，按照设定程序打印，得到初级水凝胶支架；然后将初级水凝胶支架在365nm紫外光照射下进行光固化，冷冻干燥，得到所述的水凝胶支架；
上述步骤1中，
所述的不饱和聚酯由以下方法制成：将分子量为2000的聚乙二醇单甲醚、丁二酸酐、辛基缩水甘油醚、甲基丙烯酸缩水甘油酯和双(三苯基正膦基)氯化铵加入DMF中，氮气保护下升温至80～100℃开环聚合反应5～10h，降温至室温，加入冷乙醚中沉淀得到所述的不饱和聚酯；其中，所述丁二酸酐的加入量为所述聚乙二醇单甲醚摩尔数的20～50倍；所述辛基缩水甘油醚和甲基丙烯酸缩水甘油酯的加入量之和为所述聚乙二醇单甲醚摩尔数的20～50倍，且辛基缩水甘油醚和甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔数之比为1︰3～3︰1；所述丁二酸酐的加入量与所述辛基缩水甘油醚和甲基丙烯酸缩水甘油酯的加入量之和相等；所述双(三苯基正膦基)氯化铵的加入量为所述聚乙二醇单甲醚摩尔数的0.2～0.5倍；
所述的光引发剂为2-甲基-2-(4-吗啉基)-1-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮或/和(2,4,6-三甲基苯甲酰基)二苯基氧化膦；
所述的多官能团丙烯酸酯是平均分子量为400的聚乙二醇二丙烯酸酯或/和乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯；
所述的亲水溶剂为丙酮或/和乙醇。
上述方案中，所述3D打印机是本领域常用的生物3D打印机，可以是3D-Bioplotter(德国ENVISIONTEC公司)或Bio-Architect@-Pro(杭州捷诺飞生物科技生产)。
上述方案中，所述聚乙二醇二丙烯酸酯的CAS登录号为26570-48-9。
上述方案中，所述乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯的CAS登录号为28961-43-5
上述方案中，所述聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯的CAS登录号为26915-72-0。
上述方案中，所述丁二酸酐的加入量优选为所述聚乙二醇单甲醚摩尔数的20～40倍；所述辛基缩水甘油醚和甲基丙烯酸缩水甘油酯的加入量之和优选为所述聚乙二醇单甲醚摩尔数的20～40倍；所述辛基缩水甘油醚和甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔数之比优选1︰2～2︰1；所述双(三苯基正膦基)氯化铵的加入量优选为所述聚乙二醇单甲醚摩尔数的0.4倍。
更进一步地，所述丁二酸酐的加入量优选为所述聚乙二醇单甲醚摩尔数的15倍；所述辛基缩水甘油醚和甲基丙烯酸缩水甘油酯的加入量之和优选为所述聚乙二醇单甲醚摩尔数的30倍；所述丁二酸酐的加入量与所述辛基缩水甘油醚和甲基丙烯酸缩水甘油酯的加入量之和相等，所述辛基缩水甘油醚和甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔数之比优选1:1。
上述方案中，所述开环聚合反应的温度优选90℃，时间优选8h。
本方法所制备的水凝胶支架中含有聚乙二醇嵌段改性不饱和聚酯，该不饱和聚酯主链嵌段连接平均分子量为2000的聚二乙醇，赋予了不饱和聚酯良好的亲水性，生物相容性及可降解性能；同时侧链连接不饱和双键，赋予不饱和聚酯化学反应活性，可以在光引发剂作用下，与其他含不饱和双键的组份进行光固化反应形成网状结构，所制备出的支架具有较好的弹性模量和溶胀性能，而且细胞毒性低，生物相容性好，细胞亲和性高，可促进细胞附着和增值。
具体实施方式
下面用具体实施例来进一步详细描述本方法及其效果。
实施例1
(a)不饱和聚酯的制备
将2g(0.00mol)分子量为2000的聚乙二醇单甲醚(CAS：9004-74-4)，2g(0.02mol)丁二酸酐，1.43g(0.01mol)辛基缩水甘油醚，2.28g(0.02mol)甲基丙烯酸缩水甘油酯和114.8mg(0.2mmol)双(三苯基正膦基)氯化铵加入10mL DMF中，氮气保护下升温至100℃开环聚合反应10h，降温至室温，加入冷乙醚中沉淀得到。
上述得到的不饱和聚酯的红外光谱采用Shimadzu FTIR-8100红外光谱仪进行测定。检测发现其IR(v-1，KBr)为3129，2757，1987，1761，1607，1204，1176，989，692cm-1。3129处吸收峰对应烯丙基上的C-H伸缩振动峰，2757cm-1对应饱和C-H伸缩振动峰，1761cm-1对应酯键中羰基的伸缩振动峰，1607cm-1对应甲基丙烯酸酯的双键伸缩振动峰，1204对应酯中醚键的伸缩振动峰，1176cm-1对聚乙二醇中醚键的伸缩振动峰。因此，证明得到的聚酯含有聚乙二醇和不饱和双键。
(b)3D打印水凝胶支架
水凝胶组成：
步骤a制备的不饱和聚酯2g；
多官能团丙烯酸酯：平均分子量为400的聚乙二醇二丙烯酸酯1.8g，乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯0.2g；
平均分子量为475的聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯6g；
光引发剂：2-甲基-2-(4-吗啉基)-1-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮0.1g和(2,4,6-三甲基苯甲酰基)二苯基氧化膦0.1g。
3D打印方法：
(1)将不饱和聚酯，多官能团丙烯酸酯，平均分子量为475的聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯，光引发剂和2g乙醇混合均匀即得水凝胶溶液。
(2)在步骤1中的水凝胶溶液中加入浓度为0.1％透明质酸水溶液，调整粘度为3542mPa.s。
(3)将步骤2制备的水凝胶溶液导入到3D打印机(3D-Bioplotter，德国ENVISIONTEC公司)的注射器中，按照设定模式打印，得到初级水凝胶支架；然后将初级水凝胶支架在365nm紫外光照射下进行光固化，光固化后冷冻干燥得到水凝胶支架。
(c)水凝胶支架的性能检测
1.溶胀性能
取水凝胶支架，冷冻干燥得到固体，精确称重，得到Wo；然后将支架溶胀于足量蒸馏水中，置于37℃恒温水浴中，每24h取出样品，用滤纸拭干表面水分后称重，称重至恒重We，按下式计算细胞支架的溶胀度。溶胀度＝We/W0。
经检测制备的细胞支架的溶胀度为1687％
2.机械性能测试
使用万能力学试验机测试水凝胶支架抗压强度和压缩模量，压缩速率为0.5mm/min，保持恒定。测试前保证支架上下表面平整，支架没有弯曲变形，使用游标卡尺量取支架的外形尺寸，每组测试5个平行样。
经检测制备的水凝胶支架的抗压强度达到3.65mPa，弹性模量达到2.32Mpa。
3.稳定性检测
取完全成型的水凝胶支架样品，冷冻干燥得到固体，精确称重，得到Wo；然后将支架分别加入足量的pH为5.0的磷酸缓冲溶液、pH为9.0的硼酸/氯化钾缓冲溶液，0.1M的过氧化氢水溶液，0.1M的半胱氨酸溶液，0.1M的亚硫酸氢钠溶液，室温条件下浸泡24h后，取出支架，蒸馏水冲洗三次，观察支架形状，冷冻干燥得到固体，精确称重，得到W1
稳定性＝W1/W0
表1实施例1制备支架的稳定性
Figure BDA0002254954070000051
本发明制备的水凝胶支架在酸性、碱性、氧化或者还原条件下浸泡24小时后，观察到支架维持原来，没有发生支架破坏现象。同时，由上表可以知道本发明制备的水凝胶支架在酸性、碱性、氧化或者还原条件下浸泡24小时后，其质量没有减少，显示出高稳定性。
4.细胞增殖实验
将完全成型的水凝胶支架样品真空干燥24h后，浸泡在完全培养基中使其彻底溶胀，避免在与细胞共培养过程中吸收培养液影响细胞活性。根据ISO 10993-12的要求，将样品制备成半径为2.5mm，高1mm的圆柱体，面积为24孔培养板单个孔底面面积的十分之一。
采用CCK-8方法测定细胞支架对细胞增殖的影响。CCK-8试剂可用于简便而准确的细胞增殖分析。其原理是该试剂中含有WST-8(化学名为2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯-2H-四唑单钠盐))，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；对于同样的细胞，颜色的深浅(生成的formazan量)和细胞数目呈线性关系。利用酶标仪(SYNERGY HTX,BioTek美国)测定溶液的450nm处的吸光度(OD值)，OD值的越大代表细胞的增殖能力越强，细胞活性也越强。
取对数培养的小鼠成纤维细胞L929准备细胞悬液。以每孔10万的密度接种至细胞支架表面，于24孔板中培养，每组样品设三个孔，在1天、3天、5天的时间点取出，吸出培养基，每孔加入300uL含1％CCK-8培养液，培养箱中放置2小时后取出，将各孔所得的培养液吸出100uL至96孔板中，最后在酶标仪上测量450nm处的OD值。为增加检测数据的准确，设定空白对照。在不含细胞的培养基中加入CCK8，培养相同时间，测定450nm的吸光度即为空白对照。检测得到空白对照的OD值为0.014±0.002。
表1为将小鼠成纤维细胞L929种实施例1制备的水凝胶支架上1天、3天和5天的增殖情况，OD值在2.0以内，值越大代表细胞数量越多。
表2实施例1样品的细胞增殖性能
1天 3天 5天
OD<sub>450nm</sub> 0.313±0.012 0.812±0.022 1.627±0.018
细胞和支架一起培养1,3,5天后，OD值远远大于空白对照组的OD值，具有显著差异。首先，细胞第一天便能在支架上较好地增殖说明支架无毒，具有良好的细胞活性，而且细胞数量能从第1天OD值0.3左右，3天时间内增殖到OD值在0.8以上，5天内OD值达到1.6以上，说明细胞增殖速度非常快。上述结果证明制备的水凝胶支架细胞毒性低，细胞可以在上面增值。
5.血液相容性检测
参照中国卫生部《生物材料和医疗器材生物学评价技术要求》附件五:溶血实验。在离心管中分别加入3mL含水凝胶支架的水溶液，37℃的恒温培养箱中保温30min，加入事先预热的稀释的抗凝血0.06mL，轻轻混匀，37℃继续保温1h。离心(850rpm,5min)，测定上清液OD540nm吸光度值。实验重复3次，取平均值记为Dsample。阴性(nc)对照组加入0.9％生理盐水注射液3mL，设3个平行样。阳性(pc)对照组加入蒸馏水3mL，设3个平行样。样品的溶血率(Haemolysisrate,HR)按照下列公式计算。
HR％＝(Dsample-Dnc)/(Dpc-Dnc)
样品在1h观察时间内无溶血和凝聚发生，溶血率为0.98％<5％。说明水凝胶支架的血液相容性好，满足水凝胶支架对血液相容性的要求。
实施例2
(a)不饱和聚酯的制备
将2g(0.001mol)分子量为2000的聚乙二醇单甲醚，3g(0.03mol)丁二酸酐，3.72g(0.02mol)辛基缩水甘油醚，1.42g(0.01mol)甲基丙烯酸缩水甘油酯和287mg(0.5mmol)双(三苯基正膦基)氯化铵加入20mL DMF中，氮气保护下升温至90℃开环聚合反应8h，降温至室温，加入冷乙醚中沉淀得到。
上述得到的不饱和聚酯的红外光谱采用Shimadzu FTIR-8100红外光谱仪进行测定。检测发现其IR(v-1 ，KBr)为3221，2941，2007，1893，1644，1211，1189，991，703cm-1。3221处吸收峰对应烯丙基上的C-H伸缩振动峰，2941cm-1对应饱和C-H伸缩振动峰，1893cm-1对应酯键中羰基的伸缩振动峰，1644cm-1对应甲基丙烯酸酯的双键伸缩振动峰，1211对应酯中醚键的伸缩振动峰，1189cm-1对聚乙二醇中醚键的伸缩振动峰。因此，证明得到的聚酯含有聚乙二醇和不饱和双键。
(b)3D打印水凝胶支架
水凝胶组成：
步骤a制备的不饱和聚酯2g；
多官能团丙烯酸酯：平均分子量为400的聚乙二醇二丙烯酸酯2.6g，乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯0.4g；
475的聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯4g；
光引发剂：2-甲基-2-(4-吗啉基)-1-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮1.0g。
3D打印方法：
(1)将不饱和聚酯，多官能团丙烯酸酯，平均分子量为475的聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯，光引发剂和3.5g丙酮混合均匀即得水凝胶溶液。
(2)在步骤1中的水凝胶溶液中加入浓度为0.1％海藻酸水溶液，调整粘度为6000mPa.s。
(3)将步骤2制备的水凝胶溶液导入到3D打印机(3D-Bioplotter，德国ENVISIONTEC公司)的注射器中，按照设定模式打印，得到初级水凝胶支架；然后将初级水凝胶支架在365nm紫外光照射下进行光固化，光固化后冷冻干燥得到水凝胶支架。
(c)水凝胶支架性能检测
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的溶胀度为1869％。
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的抗压强度达到3.48mPa，弹性模量达到2.17Mpa。
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的稳定性，结果如下表所示。
表3实施例2制备支架的稳定性
Figure BDA0002254954070000071
本发明制备的水凝胶支架在酸性、碱性、氧化或者还原条件下浸泡24小时后，观察到支架维持长方体小块形式，没有发生支架破坏现象。同时，由上表可以知道本发明制备的水凝胶支架在酸性、碱性、氧化或者还原条件下浸泡24小时后，其质量没有减少，显示出高稳定性。
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的细胞增殖性能如下：
表4为将小鼠成纤维细胞L929种实施例2制备的水凝胶支架上1天、3天和5天的增殖情况。
表4实施例2样品的细胞增殖性能
1天 3天 5天
OD<sub>450nm</sub> 0.324±0.013 0.821±0.019 1.621±0.023
细胞第一天便能在支架上较好地增殖说明支架无毒，具有良好的细胞活性，而且细胞数量能从第1天OD值0.3左右，3天时间内增殖到OD值在0.8以上，5天内OD值达到1.6以上，说明细胞增殖速度非常快。上述结果证明制备的水凝胶支架细胞毒性低，细胞可以在上面增值。
样品在1h观察时间内无溶血和凝聚发生，溶血率为0.57％<5％。说明水凝胶支架的血液相容性好，满足水凝胶支架对血液相容性的要求。
实施例3
(a)不饱和聚酯的制备
将2g(0.001mol)分子量为2000的聚乙二醇单甲醚，3g(0.03mol)丁二酸酐，1.863g(0.01mol)辛基缩水甘油醚，2.84g(0.02mol)甲基丙烯酸缩水甘油酯和229.6mg双(三苯基正膦基)氯化铵(0.4mmol)加入15mL DMF中，氮气保护下升温至85℃开环聚合反应6h，降温至室温，加入冷乙醚中沉淀得到。
上述得到的不饱和聚酯的红外光谱采用Shimadzu FTIR-8100红外光谱仪进行测定。检测发现其IR(v-1 ，KBr)为3207，2909，2010，1847，1612，1209，1122，987，700cm-1。3207处吸收峰对应烯丙基上的C-H伸缩振动峰，2909cm-1对应饱和C-H伸缩振动峰，1847cm-1对应酯键中羰基的伸缩振动峰，1612cm-1对应甲基丙烯酸酯的双键伸缩振动峰，1209对应酯中醚键的伸缩振动峰，1122cm-1对聚乙二醇中醚键的伸缩振动峰。因此，证明得到的聚酯含有聚乙二醇和不饱和双键。
(b)3D打印水凝胶支架
水凝胶组成：
步骤a制备的不饱和聚酯2g；
多官能团丙烯酸酯：平均分子量为400的聚乙二醇二丙烯酸酯2.8g；
甲基丙烯酸酯：475的聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯8g；
光引发剂：(2,4,6-三甲基苯甲酰基)二苯基氧化膦0.4g。
3D打印方法：
(1)将不饱和聚酯，多官能团丙烯酸酯，平均分子量为475的聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯，光引发剂,1.5g乙醇和1.5g丙酮混合均匀即得水凝胶溶液。
(2)在步骤1中的水凝胶溶液中加入浓度为0.1％海藻酸水溶液，调整粘度为5423mPa.s。
(3)将步骤2制备的水凝胶溶液导入到3D打印机(3D-Bioplotter，德国ENVISIONTEC公司)的注射器中，按照设定模式打印，得到初级水凝胶支架；然后将初级水凝胶支架在365nm紫外光照射下进行光固化，光固化后冷冻干燥得到水凝胶支架。
(c)水凝胶支架性能检测
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的溶胀度为1877％。
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的抗压强度达到3.36mPa，弹性模量达到2.23Mpa。
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的稳定性，结果如下表所示。
表5实施例3制备支架的稳定性
Figure BDA0002254954070000091
本发明制备的水凝胶支架在酸性、碱性、氧化或者还原条件下浸泡24小时后，观察到支架维持长方体小块形式，没有发生支架破坏现象。同时，由上表可以知道本发明制备的水凝胶支架在酸性、碱性、氧化或者还原条件下浸泡24小时后，其质量没有减少，显示出高稳定性。
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的细胞增殖性能如下：
表6为将小鼠成纤维细胞L929种实施例2制备的细胞支架上1天、3天和5天的增殖情况。
表6实施例3样品的细胞增殖性能
1天 3天 5天
OD<sub>450nm</sub> 0.319±0.014 0.819±0.010 1.652±0.027
细胞第一天便能在支架上较好地增殖说明支架无毒，具有良好的细胞活性，而且细胞数量能从第1天OD值0.3左右，3天时间内增殖到OD值在0.8以上，5天内OD值达到1.6以上，说明细胞增殖速度非常快。上述结果证明制备的水凝胶支架细胞毒性低，细胞可以在上面增值。
样品在1h观察时间内无溶血和凝聚发生，溶血率为0.73％<5％。说明水凝胶支架的血液相容性好，满足水凝胶支架对血液相容性的要求。
实施例4
(a)不饱和聚酯的制备
将2g(0.001mol)分子量为2000的聚乙二醇单甲醚，5g(0.05mol)丁二酸酐，5.589g(0.03mol)辛基缩水甘油醚，2.84g(0.02mol)甲基丙烯酸缩水甘油酯和172.2mg双(三苯基正膦基)氯化铵(0.3mmol)加入15mL DMF中，氮气保护下升温至80℃开环聚合反应10h，降温至室温，加入冷乙醚中沉淀得到。
上述得到的不饱和聚酯的红外光谱采用Shimadzu FTIR-8100红外光谱仪进行测定。检测发现其IR(v-1 ，KBr)为3244，2901，2001，1813，1651，1243，1174，997，709cm-1。3244处吸收峰对应烯丙基上的C-H伸缩振动峰，2901cm-1对应饱和C-H伸缩振动峰，1813cm-1对应酯键中羰基的伸缩振动峰，1651cm-1对应甲基丙烯酸酯的双键伸缩振动峰，1243对应酯中醚键的伸缩振动峰，1174cm-1对聚乙二醇中醚键的伸缩振动峰。因此，证明得到的聚酯含有聚乙二醇和不饱和双键。
(b)3D打印水凝胶支架
水凝胶组成：
步骤a制备的不饱和聚酯2g；
多官能团丙烯酸酯：平均分子量为400的聚乙二醇二丙烯酸酯2g；
甲基丙烯酸酯：甲基丙烯酸乙氧基乙氧基乙酯4g；
光引发剂：2-甲基-2-(4-吗啉基)-1-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮0.1g，(2,4,6-三甲基苯甲酰基)二苯基氧化膦0.3g；
3D打印方法：
(1)将不饱和聚酯，多官能团丙烯酸酯，平均分子量为475的聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯，光引发剂和2.5g乙醇混合均匀即得水凝胶溶液。
(2)在步骤1中的水凝胶溶液中加入浓度为0.08％甲基丙烯酸改性透明质酸水溶液，调整粘度为4216mPa.s。
(3)将步骤2制备的水凝胶溶液导入到3D打印机(3D-Bioplotter，德国ENVISIONTEC公司)的注射器中，按照设定模式打印，得到初级水凝胶支架；然后将初级水凝胶支架在365nm紫外光照射下进行光固化，光固化后冷冻干燥得到水凝胶支架。
(c)水凝胶支架性能检测
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的溶胀度为1760％。
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的抗压强度达到3.43mPa，弹性模量达到2.61Mpa。
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的稳定性，结果如下表所示。
表7实施例2制备支架的稳定性
Figure BDA0002254954070000111
本发明制备的水凝胶支架在酸性、碱性、氧化或者还原条件下浸泡24小时后，观察到支架维持长方体小块形式，没有发生支架破坏现象。同时，由上表可以知道本发明制备的水凝胶支架在酸性、碱性、氧化或者还原条件下浸泡24小时后，其质量没有减少，显示出高稳定性。
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的细胞增殖性能如下：
表8为将小鼠成纤维细胞L929种实施例2制备的水凝胶支架上1天、3天和5天的增殖情况。
表8实施例4样品的细胞增殖性能
1天 3天 5天
OD<sub>450nm</sub> 0.322±0.016 0.833±0.017 1.608±0.013
细胞第一天便能在支架上较好地增殖说明支架无毒，具有良好的细胞活性，而且细胞数量能从第1天OD值0.3左右，3天时间内增殖到OD值在0.8以上，5天内OD值达到1.6以上，说明细胞增殖速度非常快。上述结果证明制备的水凝胶支架细胞毒性低，细胞可以在上面增值。
样品在1h观察时间内无溶血和凝聚发生，溶血率为0.86％<5％。说明水凝胶支架的血液相容性好，满足水凝胶支架对血液相容性的要求。
实施例5
(a)不饱和聚酯的制备
将2g(0.001mol)分子量为2000的聚乙二醇单甲醚，4g(0.04mol)丁二酸酐，5.589g(0.03mol)辛基缩水甘油醚，1.42g(0.01mol)甲基丙烯酸缩水甘油酯和229.6mg(0.4mmol)双(三苯基正膦基)氯化铵加入20mL DMF中，氮气保护下升温至85℃开环聚合反应7h，降温至室温，加入冷乙醚中沉淀得到。
上述得到的不饱和聚酯的红外光谱采用Shimadzu FTIR-8100红外光谱仪进行测定。检测发现其IR(v-1 ，KBr)为3189，2887，2011，1827，1681，1220，1193，997，707cm-1。3189处吸收峰对应烯丙基上的C-H伸缩振动峰，2887cm-1对应饱和C-H伸缩振动峰，1827cm-1对应酯键中羰基的伸缩振动峰，1681cm-1对应甲基丙烯酸酯的双键伸缩振动峰，1220对应酯中醚键的伸缩振动峰，1189cm-1对聚乙二醇中醚键的伸缩振动峰。因此，证明得到的聚酯含有聚乙二醇和不饱和双键。
(b)3D打印水凝胶支架
水凝胶组成：
步骤a制备的不饱和聚酯2g；
多官能团丙烯酸酯：平均分子量为400的聚乙二醇二丙烯酸酯3.8g；
甲基丙烯酸酯：475的聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯2g，甲基丙烯酸乙氧基乙氧基乙酯3.6g；
光引发剂：2-甲基-2-(4-吗啉基)-1-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮0.4g和(2,4,6-三甲基苯甲酰基)二苯基氧化膦0.4g。
3D打印方法：
(1)将不饱和聚酯，多官能团丙烯酸酯，平均分子量为475的聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯，光引发剂和4.0g丙酮混合均匀即得水凝胶溶液。
(2)在步骤1中的水凝胶溶液中加入浓度为0.07％羧甲基纤维素水溶液，调整粘度为3560mPa.s。
(3)将步骤2制备的水凝胶溶液导入到3D打印机(3D-Bioplotter，德国ENVISIONTEC公司)的注射器中，按照设定模式打印，得到初级水凝胶支架；然后将初级水凝胶支架在365nm紫外光照射下进行光固化，光固化后冷冻干燥得到水凝胶支架。
(c)水凝胶支架性能检测
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的溶胀度为1824％。
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的抗压强度达到3.14mPa，弹性模量达到2.11Mpa。
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的稳定性，结果如下表所示。
表9实施例5制备支架的稳定性
Figure BDA0002254954070000121
本发明制备的水凝胶支架在酸性、碱性、氧化或者还原条件下浸泡24小时后，观察到支架维持长方体小块形式，没有发生支架破坏现象。同时，由上表可以知道本发明制备的水凝胶支架在酸性、碱性、氧化或者还原条件下浸泡24小时后，其质量没有减少，显示出高稳定性。
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的细胞增殖性能如下：
表10为将小鼠成纤维细胞L929种实施例2制备的水凝胶支架上1天、3天和5天的增殖情况。
表10实施例5样品的细胞增殖性能
1天 3天 5天
OD<sub>450nm</sub> 0.321±0.12 0.835±0.021 1.631±0.026
细胞第一天便能在支架上较好地增殖说明支架无毒，具有良好的细胞活性，而且细胞数量能从第1天OD值0.3左右，3天时间内增殖到OD值在0.8以上，5天内OD值达到1.6以上，说明细胞增殖速度非常快。上述结果证明制备的水凝胶支架细胞毒性低，细胞可以在上面增值。
样品在1h观察时间内无溶血和凝聚发生，溶血率为0.83％<5％。说明水凝胶支架的血液相容性好，满足水凝胶支架对血液相容性的要求。
实施例6
(a)不饱和聚酯的制备
将2g(0.001mol)分子量为2000的聚乙二醇单甲醚，4g(0.04mol)丁二酸酐，1.863g(0.01mol)辛基缩水甘油醚，4.26g(0.03mol)甲基丙烯酸缩水甘油酯和114.8mg(0.2mmol)双(三苯基正膦基)氯化铵加入20mL DMF中，氮气保护下升温至100℃开环聚合反应10h，降温至室温，加入冷乙醚中沉淀得到。
上述得到的不饱和聚酯的红外光谱采用Shimadzu FTIR-8100红外光谱仪进行测定。检测发现其IR(v-1 ，KBr)为3203，2981，2014，1822，1651，1223，1142，995，700cm-1。3203处吸收峰对应烯丙基上的C-H伸缩振动峰，2981cm-1对应饱和C-H伸缩振动峰，1822cm-1对应酯键中羰基的伸缩振动峰，1651cm-1对应甲基丙烯酸酯的双键伸缩振动峰，1223对应酯中醚键的伸缩振动峰，1142cm-1对聚乙二醇中醚键的伸缩振动峰。因此，证明得到的聚酯含有聚乙二醇和不饱和双键。
(b)3D打印水凝胶支架
水凝胶组成：
步骤a制备的不饱和聚酯2g；
多官能团丙烯酸酯：平均分子量为400的聚乙二醇二丙烯酸酯2.4g；
甲基丙烯酸酯：475的聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯5.5g，甲基丙烯酸乙氧基乙氧基乙酯1.5g；
光引发剂：2-甲基-2-(4-吗啉基)-1-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮0.6g和(2,4,6-三甲基苯甲酰基)二苯基氧化膦0.4g。
3D打印方法：
(1)将不饱和聚酯，多官能团丙烯酸酯，平均分子量为475的聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯，光引发剂和3.5g丙酮混合均匀即得水凝胶溶液。
(2)在步骤1中的水凝胶溶液中加入浓度为0.05％甲基丙烯酸改性海藻酸钠水溶液和浓度为0.01％明胶，调整粘度为5463mPa.s。
(3)将步骤2制备的水凝胶溶液导入到3D打印机(3D-Bioplotter，德国ENVISIONTEC公司)的注射器中，按照设定模式打印，得到初级水凝胶支架；然后将初级水凝胶支架在365nm紫外光照射下进行光固化，光固化后冷冻干燥得到水凝胶支架。
(c)水凝胶支架性能检测
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的溶胀度为1689％。
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的抗压强度达到3.22mPa，弹性模量达到2.37Mpa。
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的稳定性，结果如下表所示。
表11实施例6制备支架的稳定性
Figure BDA0002254954070000141
本发明制备的水凝胶支架在酸性、碱性、氧化或者还原条件下浸泡24小时后，观察到支架维持长方体小块形式，没有发生支架破坏现象。同时，由上表可以知道本发明制备的水凝胶支架在酸性、碱性、氧化或者还原条件下浸泡24小时后，其质量没有减少，显示出高稳定性。
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的细胞增殖性能如下：
表12为将小鼠成纤维细胞L929种实施例6制备的水凝胶支架上1天、3天和5天的增殖情况。
表12实施例6样品的细胞增殖性能
1天 3天 5天
OD<sub>450nm</sub> 0.318±0.014 0.852±0.027 1.647±0.032
细胞第一天便能在支架上较好地增殖说明支架无毒，具有良好的细胞活性，而且细胞数量能从第1天OD值0.3左右，3天时间内增殖到OD值在0.8以上，5天内OD值达到1.6以上，说明细胞增殖速度非常快。上述结果证明制备的水凝胶支架细胞毒性低，细胞可以在上面增值。
样品在1h观察时间内无溶血和凝聚发生，溶血率为0.87％<5％。说明水凝胶支架的血液相容性好，满足水凝胶支架对血液相容性的要求。
实施例7
(a)不饱和聚酯的制备
将2g(0.001mol)分子量为2000的聚乙二醇单甲醚，3g(0.03mol)丁二酸酐，1.863g(0.01mol)辛基缩水甘油醚，2.84g(0.02mol)甲基丙烯酸缩水甘油酯和344.4mg(0.6mmol)双(三苯基正膦基)氯化铵加入20mL DMF中，氮气保护下升温至100℃开环聚合反应5h，降温至室温，加入冷乙醚中沉淀得到。
上述得到的不饱和聚酯的红外光谱采用Shimadzu FTIR-8100红外光谱仪进行测定。检测发现其IR(v-1 ，KBr)为3253，2937，2017，1844，1631，1219，1121，997，700cm-1。3253处吸收峰对应烯丙基上的C-H伸缩振动峰，2937cm-1对应饱和C-H伸缩振动峰，1844cm-1对应酯键中羰基的伸缩振动峰，1631cm-1对应甲基丙烯酸酯的双键伸缩振动峰，1219对应酯中醚键的伸缩振动峰，1121cm-1对聚乙二醇中醚键的伸缩振动峰。因此，证明得到的聚酯含有聚乙二醇和不饱和双键。
(b)3D打印水凝胶支架
水凝胶组成：
步骤a制备的不饱和聚酯2g；
多官能团丙烯酸酯：平均分子量为400的聚乙二醇二丙烯酸酯3g；
甲基丙烯酸酯：475的聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯6.8g
光引发剂：2-甲基-2-(4-吗啉基)-1-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮0.3g，(2,4,6-三甲基苯甲酰基)二苯基氧化膦0.6g。
3D打印方法：
(1)将不饱和聚酯，多官能团丙烯酸酯，平均分子量为475的聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯，光引发剂和4.0g丙酮混合均匀即得水凝胶溶液。
(2)在步骤1中的水凝胶溶液中加入浓度为0.01％甲基丙烯酸化明胶海藻酸水溶液和0.03％羟乙基纤维素，调整粘度为4900mPa.s。
(3)将步骤2制备的水凝胶溶液导入到3D打印机(3D-Bioplotter，德国ENVISIONTEC公司)的注射器中，按照设定模式打印，得到初级水凝胶支架；然后将初级水凝胶支架在365nm紫外光照射下进行光固化，光固化后冷冻干燥得到水凝胶支架。
(c)水凝胶支架性能检测
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的溶胀度为1788％。
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的抗压强度达到3.62mPa，弹性模量达到2.14Mpa。
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的稳定性，结果如下表所示。
表13实施例7制备支架的稳定性
Figure BDA0002254954070000161
本发明制备的水凝胶支架在酸性、碱性、氧化或者还原条件下浸泡24小时后，观察到支架维持长方体小块形式，没有发生支架破坏现象。同时，由上表可以知道本发明制备的水凝胶支架在酸性、碱性、氧化或者还原条件下浸泡24小时后，其质量没有减少，显示出高稳定性。
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的细胞增殖性能如下：
表14为将小鼠成纤维细胞L929种实施例7制备的水凝胶支架上1天、3天和5天的增殖情况。
表14实施例7样品的细胞增殖性能
1天 3天 5天
OD<sub>450nm</sub> 0.325±0.013 0.841±0.027 1.644±0.019
细胞第一天便能在支架上较好地增殖说明支架无毒，具有良好的细胞活性，而且细胞数量能从第1天OD值0.3左右，3天时间内增殖到OD值在0.8以上，5天内OD值达到1.6以上，说明细胞增殖速度非常快。上述结果证明制备的水凝胶支架细胞毒性低，细胞可以在上面增值。
样品在1h观察时间内无溶血和凝聚发生，溶血率为0.93％<5％。说明水凝胶支架的血液相容性好，满足水凝胶支架对血液相容性的要求。
实施例8
(a)不饱和聚酯的制备
将2g(0.001mol)分子量为2000的聚乙二醇单甲醚，3g(0.03mol)丁二酸酐，3.726g(0.02mol)辛基缩水甘油醚，1.42g(0.01mol)甲基丙烯酸缩水甘油酯和229.6mg(0.4mmol)双(三苯基正膦基)氯化铵加入20mL DMF中，氮气保护下升温至90℃开环聚合反应6h，降温至室温，加入冷乙醚中沉淀得到。
上述得到的不饱和聚酯的红外光谱采用Shimadzu FTIR-8100红外光谱仪进行测定。检测发现其IR(v-1 ，KBr)为3171，2844，2100，1769，1618，1200，1143，998，693cm-1。3171处吸收峰对应烯丙基上的C-H伸缩振动峰，2844cm-1对应饱和C-H伸缩振动峰，1769cm-1对应酯键中羰基的伸缩振动峰，1618cm-1对应甲基丙烯酸酯的双键伸缩振动峰，1200对应酯中醚键的伸缩振动峰，1143cm-1对聚乙二醇中醚键的伸缩振动峰。因此，证明得到的聚酯含有聚乙二醇和不饱和双键。
(b)3D打印水凝胶支架
水凝胶组成：
步骤a制备的不饱和聚酯2g；
多官能团丙烯酸酯：平均分子量为400的聚乙二醇二丙烯酸酯3.4g；
甲基丙烯酸酯：475的聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯7.8g；
光引发剂：2-甲基-2-(4-吗啉基)-1-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮0.6g和(2,4,6-三甲基苯甲酰基)二苯基氧化膦0.2g。
3D打印方法：
(1)将不饱和聚酯，多官能团丙烯酸酯，平均分子量为475的聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯，光引发剂和3.5g乙醇混合均匀即得水凝胶溶液。
(2)在步骤1中的水凝胶溶液中加入浓度为0.1％壳聚糖水溶液，调整粘度为4300mPa.s。
(3)将步骤2制备的水凝胶溶液导入到3D打印机(3D-Bioplotter，德国ENVISIONTEC公司)的注射器中，按照设定模式打印，得到初级水凝胶支架；然后将初级水凝胶支架在365nm紫外光照射下进行光固化，光固化后冷冻干燥得到水凝胶支架。
(c)水凝胶支架性能检测
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的溶胀度为1796％。
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的抗压强度达到3.22mPa，弹性模量达到2.17Mpa。
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的稳定性，结果如下表所示。
表15实施例8制备支架的稳定性
Figure BDA0002254954070000171
本发明制备的水凝胶支架在酸性、碱性、氧化或者还原条件下浸泡24小时后，观察到支架维持长方体小块形式，没有发生支架破坏现象。同时，由上表可以知道本发明制备的水凝胶支架在酸性、碱性、氧化或者还原条件下浸泡24小时后，其质量没有减少，显示出高稳定性。
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的细胞增殖性能如下：
表16为将小鼠成纤维细胞L929种实施例8制备的水凝胶支架上1天、3天和5天的增殖情况。
表16实施例8样品的细胞增殖性能
1天 3天 5天
OD<sub>450nm</sub> 0.312±0.011 0.853±0.025 1.631±0.021
细胞第一天便能在支架上较好地增殖说明支架无毒，具有良好的细胞活性，而且细胞数量能从第1天OD值0.3左右，3天时间内增殖到OD值在0.8以上，5天内OD值达到1.6以上，说明细胞增殖速度非常快。上述结果证明制备的水凝胶支架细胞毒性低，细胞可以在上面增值。
样品在1h观察时间内无溶血和凝聚发生，溶血率为0.89％<5％。说明水凝胶支架的血液相容性好，满足水凝胶支架对血液相容性的要求。
实施例9
(a)不饱和聚酯的制备
将2g(0.001mol)分子量为2000的聚乙二醇单甲醚，4g(0.04mol)丁二酸酐，3.726g(0.02mol)辛基缩水甘油醚，2.84g(0.02mol)甲基丙烯酸缩水甘油酯和172.2mg(0.3mmol)双(三苯基正膦基)氯化铵加入20mL DMF中，氮气保护下升温至95℃开环聚合反应7h，降温至室温，加入冷乙醚中沉淀得到。
上述得到的不饱和聚酯的红外光谱采用Shimadzu FTIR-8100红外光谱仪进行测定。检测发现其IR(v-1 ，KBr)为3201，2933，2107，1829，1621，1207，1121，997，683cm-1。3201处吸收峰对应烯丙基上的C-H伸缩振动峰，2933cm-1对应饱和C-H伸缩振动峰，1829cm-1对应酯键中羰基的伸缩振动峰，1621cm-1对应甲基丙烯酸酯的双键伸缩振动峰，1207对应酯中醚键的伸缩振动峰，1121cm-1对聚乙二醇中醚键的伸缩振动峰。因此，证明得到的聚酯含有聚乙二醇和不饱和双键。
(b)3D打印水凝胶支架
水凝胶组成：
步骤a制备的不饱和聚酯2g；
多官能团丙烯酸酯：平均分子量为400的聚乙二醇二丙烯酸酯4g；
甲基丙烯酸酯：475的聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯8g；
光引发剂：2-甲基-2-(4-吗啉基)-1-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮0.3g和(2,4,6-三甲基苯甲酰基)二苯基氧化膦0.5g。
3D打印方法：
(1)将不饱和聚酯，多官能团丙烯酸酯，平均分子量为475的聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯，光引发剂和3.0g丙酮混合均匀即得水凝胶溶液。
(2)在步骤1中的水凝胶溶液中加入浓度为0.01％海藻酸水溶液，0.02％透明质酸和0.04％明胶，调整粘度为4750mPa.s。
(3)将步骤2制备的水凝胶溶液导入到3D打印机(3D-Bioplotter，德国ENVISIONTEC公司)的注射器中，按照设定模式打印，得到初级水凝胶支架；然后将初级水凝胶支架在365nm紫外光照射下进行光固化，光固化后冷冻干燥得到水凝胶支架。
(c)水凝胶支架性能检测
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的溶胀度为1881％。
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的抗压强度达到3.40mPa，弹性模量达到2.13Mpa。
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的稳定性，结果如下表所示。
表17实施例2制备支架的稳定性
Figure BDA0002254954070000191
本发明制备的水凝胶支架在酸性、碱性、氧化或者还原条件下浸泡24小时后，观察到支架维持长方体小块形式，没有发生支架破坏现象。同时，由上表可以知道本发明制备的水凝胶支架在酸性、碱性、氧化或者还原条件下浸泡24小时后，其质量没有减少，显示出高稳定性。
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的细胞增殖性能如下：
表18为将人正常肠上皮细胞HIEC种实施例9制备的水凝胶支架上1天、3天和5天的增殖情况。
表18实施例9样品的细胞增殖性能
Figure BDA0002254954070000192
Figure BDA0002254954070000201
细胞第一天便能在支架上较好地增殖说明支架无毒，具有良好的细胞活性，而且细胞数量能从第1天OD值0.3左右，3天时间内增殖到OD值在0.8以上，5天内OD值达到1.6以上，说明细胞增殖速度非常快。上述结果证明制备的水凝胶支架细胞毒性低，细胞可以在上面增值。
样品在1h观察时间内无溶血和凝聚发生，溶血率为1.02％<5％。说明水凝胶支架的血液相容性好，满足水凝胶支架对血液相容性的要求。
实施例10
(a)不饱和聚酯的制备
将2g(0.001mol)分子量为2000的聚乙二醇单甲醚，3g(0.03mol)丁二酸酐，2.79g(0.015mol)辛基缩水甘油醚，2.13g(0.015mol)甲基丙烯酸缩水甘油酯和229.6mg双(三苯基正膦基)氯化铵(0.4mmol)加入20mL DMF中，氮气保护下升温至90℃开环聚合反应8h，降温至室温，加入冷乙醚中沉淀得到。
上述得到的不饱和聚酯的红外光谱采用Shimadzu FTIR-8100红外光谱仪进行测定。检测发现其IR(v-1 ，KBr)为3189，2871，1988，1871，1624，1226，1173，1001，688cm-1。3189处吸收峰对应烯丙基上的C-H伸缩振动峰，2871cm-1对应饱和C-H伸缩振动峰，1871cm-1对应酯键中羰基的伸缩振动峰，1624cm-1对应甲基丙烯酸酯的双键伸缩振动峰，1226对应酯中醚键的伸缩振动峰，1173cm-1对聚乙二醇中醚键的伸缩振动峰。因此，证明得到的聚酯含有聚乙二醇和不饱和双键。
(b)3D打印水凝胶支架
水凝胶组成：
步骤a制备的不饱和聚酯2g；
多官能团丙烯酸酯：平均分子量为400的聚乙二醇二丙烯酸酯2g；
甲基丙烯酸酯：475的聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯4g；
光引发剂：2-甲基-2-(4-吗啉基)-1-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮0.3g和(2,4,6-三甲基苯甲酰基)二苯基氧化膦0.5g。
3D打印方法：
(1)将不饱和聚酯，多官能团丙烯酸酯，平均分子量为475的聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯，光引发剂和3.8g乙醇混合均匀即得水凝胶溶液。
(2)在步骤1中的水凝胶溶液中加入浓度为0.1％透明质酸水溶液，调整粘度为3450mPa.s。
(3)将步骤2制备的水凝胶溶液导入到3D打印机(3D-Bioplotter，德国ENVISIONTEC公司)的注射器中，按照设定模式打印，得到初级水凝胶支架；然后将初级水凝胶支架在365nm紫外光照射下进行光固化，光固化后冷冻干燥得到水凝胶支架。
(c)水凝胶支架性能检测
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的溶胀度为1866％。
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的抗压强度达到3.14mPa，弹性模量达到2.11Mpa。
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的稳定性，结果如下表所示。
表20实施例10制备支架的稳定性
Figure BDA0002254954070000211
本发明制备的水凝胶支架在酸性、碱性、氧化或者还原条件下浸泡24小时后，观察到支架维持长方体小块形式，没有发生支架破坏现象。同时，由上表可以知道本发明制备的水凝胶支架在酸性、碱性、氧化或者还原条件下浸泡24小时后，其质量没有减少，显示出高稳定性。
依据实施例1所述方法检测制备的水凝胶支架的细胞增殖性能如下：
表20为将小鼠胚胎成纤维细胞3T3种实施例10制备的水凝胶支架上1天、3天和5天的增殖情况。
表20实施例10样品的细胞增殖性能
1天 3天 5天
OD<sub>450nm</sub> 0.317±0.015 0.854±0.021 1.621±0.025
细胞第一天便能在支架上较好地增殖说明支架无毒，具有良好的细胞活性，而且细胞数量能从第1天OD值0.3左右，3天时间内增殖到OD值在0.8以上，5天内OD值达到1.6以上，说明细胞增殖速度非常快。上述结果证明制备的水凝胶支架细胞毒性低，细胞可以在上面增值。
样品在1h观察时间内无溶血和凝聚发生，溶血率为0.86<5％。说明水凝胶支架的血液相容性好，满足水凝胶支架对血液相容性的要求。

Claims (1)

1.一种3D打印水凝胶支架的方法，该方法包括以下步骤：
（1）将不饱和聚酯、不饱和聚酯重量1~2倍的多官能团丙烯酸酯、不饱和聚酯重量2~4倍的平均分子量为475的聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯和不饱和聚酯重量0.1~0.5倍的光引发剂加入到不饱和聚酯重量1~2倍亲水溶剂中混合均匀，得到水凝胶溶液；
（2）在水凝胶溶液中加入粘度调节剂，调整粘度为3000~6000mPa.s，所述的粘度调节剂是海藻酸、透明质酸、甲基丙烯酸化透明质酸、明胶、甲基丙烯酸化明胶和壳聚糖中的一种或者两种以上；
（3）将步骤2调整粘度的水凝胶溶液导入到3D打印机的注射器中，按照设定程序打印，得到初级水凝胶支架；然后将初级水凝胶支架在365nm紫外光照射下进行光固化，冷冻干燥，得到所述的水凝胶支架；
上述步骤（1）中，
所述的不饱和聚酯由以下方法制成：将分子量为2000的聚乙二醇单甲醚、丁二酸酐、辛基缩水甘油醚、甲基丙烯酸缩水甘油酯和双（三苯基正膦基）氯化铵加入DMF中，氮气保护下升温至80~100℃开环聚合反应5~10h，降温至室温，加入冷乙醚中沉淀得到所述的不饱和聚酯；其中，所述丁二酸酐的加入量为所述聚乙二醇单甲醚摩尔数的20~50倍；所述辛基缩水甘油醚和甲基丙烯酸缩水甘油酯的加入量之和为所述聚乙二醇单甲醚摩尔数的20~50倍，且辛基缩水甘油醚和甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔数之比为1︰3~3︰1；所述丁二酸酐的加入量与所述辛基缩水甘油醚和甲基丙烯酸缩水甘油酯的加入量之和的摩尔数相等；所述双（三苯基正膦基）氯化铵的加入量为所述聚乙二醇单甲醚摩尔数的0.2~0.5倍；
所述的光引发剂为2-甲基-2-(4-吗啉基)-1-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮或/和(2,4,6-三甲基苯甲酰基)二苯基氧化膦；
所述的多官能团丙烯酸酯是平均分子量为400的聚乙二醇二丙烯酸酯或/和乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯；
所述的亲水溶剂为丙酮或/和乙醇。
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