CN113614177A - 蛋白质水凝胶、其制备方法和用途 - Google Patents

蛋白质水凝胶、其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于低浓度的组分试剂A和试剂B产生的新蛋白质水凝胶，蛋白质水凝胶的制备方法，以及其用于健康和肿瘤细胞两者的、细胞系和原代细胞两者的细胞培养、包括2D和3D细胞培养的用途。

Description

蛋白质水凝胶、其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及蛋白质水凝胶、其制备方法及其用于健康细胞和肿瘤细胞两者的、细胞系和原代细胞两者的细胞培养、包括2D和3D细胞培养的用途；用于在3D条件下水凝胶中的迁移和侵袭测定、进行血管生成测定和进行主动脉出芽测定(aortic sprouting assay)的用途。
背景技术
现在有许多不同类型的用于在三维环境中进行细胞培养的培养基。它们一般可分为几种类型：蛋白质水凝胶、合成水凝胶、支架、悬滴法等。
蛋白质水凝胶的优点是它们最接近细胞生长的生理环境。目前，三维条件下细胞培养最频繁使用的材料是水凝胶，其成分由细胞外基质(ECM)蛋白质组成。除此以外从合成肽中生产的其他水凝胶也是可用的，但是它们不太常用。在另一方面，在二维细胞培养中将胶原和明胶用于包被培养表面。
胶原也用于三维培养。通常，使用随着pH变化而交联的水凝胶。在低pH下，胶原(例如大鼠尾胶原)溶解，并且在向其中添加具有更中性pH的培养基之后，胶原凝胶化并且培养物可以在其上生长。明胶是胶原纤维部分水解的产物。在可用的明胶种类中，可以鉴定两种基本类型，即酸性类型(即在酸性环境中进行水解的类型)和碱性类型(即在碱性环境中进行水解的类型)。根据决定凝胶化强度的值，鉴定出具有不同Bloom值的明胶。Bloom值越高，胶凝化强度越大。
目前，使得3D细胞培养和血管生成测定成为可能的水凝胶是可商购获得的。使得能够进行血管生成测定的产品的几个实例之一是
Figure BDA0003188316000000021
(及其衍生物)。Matrigel的主要组分是提取自鼠类肿瘤(即Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)肉瘤)的层粘连蛋白、IV型胶原、蛋白聚糖、巢蛋白和生长因子。美国专利US4829000公开了用于细胞培养的组合物和用于生产生物活性提取物的方法。从Orci et al.,Vascular outgrowths from tissueexplants embedded in fibrin or collagen gels:a simple in vitro model ofangiogenesis,Cell Biology International Reports,1985年10月第9卷第10期中也已知使用胶原进行血管生成测定，但是胶原的使用在现有技术中描述为劳动密集型的并且给出的结果重现性差。其基本构建材料为明胶以及特别是甲基丙烯酸明胶(FastLink GelMA)的水凝胶也是可商购获得的，这样的水凝胶的示例性生产者是Stemorgan Inc.。然而，这些水凝胶使用约10％的浓度的明胶，这大大超过了本发明中提出的明胶浓度范围。此外，GelMA中的明胶与在紫外线辐射的影响下产生自由基的引发剂交联。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于低浓度混合物的水凝胶，其将解决现有技术中已知的现有问题并且毒性较低，同时降低生产成本并提高生产效率。由于所用的组分，与现有技术中已知的水凝胶相比，新的水凝胶具有明显更大的再现性。这种再现性产生自新的水凝胶的两个基本特征。首先，与现有技术中已知的水凝胶相比，新的水凝胶基本上不含生长因子，这源于两个原因：首先，明胶生产技术大大降低了生长因子的存活潜力，其次，在明胶与戊二醛(GTA)的交联反应期间，可能残留量的生长因子失活。新的水凝胶再现性的第二个理由是其组分浓度的再现性。
在现有技术中，从DOILLON et al.Three-dimensional Culture System as aModel for Studying Cancer Cell Invasion Capacity and Anticancer DrugSensitivity,Anticancer Research 24:2169-2178(2004)中已知，使用添加了纤维蛋白的胶原作为肿瘤细胞培养的3D模型的组分。此外，从Yamada和Even-Ram:Cell migration in3D matrix 2005看出，3D细胞培养的使用是已知的，所述使用基于胶原和纤维蛋白来测试肿瘤细胞侵袭并迁移到水凝胶内部的潜力。
在现有技术中，从MONTESANO et al.,Vascular outgrowths from tissueexplants embedded in fibrin or collagen gels:a simple in vitro model ofangiogenesis,Cell Biology International Reports,1985年10月第9卷第10期，3D内皮细胞培养的使用也是已知的，所述使用基于胶原和纤维蛋白并且使得进行血管生成测定成为可能。然而，这些水凝胶不含有GTA。
特别是因为其通过赖氨酸的游离氨基基团或多肽链的羟基赖氨酸的氨基酸残基与醛基团的反应来高效稳定胶原材料，GTA(戊二醛)成为最频繁使用的化学交联剂之一。然而，在细胞培养的情况下，其缺点是毒性，即使在非常低的浓度下。正如Ou和Yang Themicro patterning of glutaraldehyde(GA)-crosslinked gelatin and itsapplication to cell-culture,Lab on a Chip,2005中所公开的，曾试图通过用水洗涤水凝胶以便在45％GTA中润湿之后除去残余物来解决这个问题，但是即使在另外的漂洗步骤之后，所使用的GTA浓度仍然很高，以至于根据所公开的方法生产的水凝胶具有与本发明的水凝胶不同的品质。
相比之下，Bigi et al.,Mechanical and thermal properties of gelatinfilms at different degrees of glutaraldehyde crosslinking,Biomaterials 22(2001)763-768表明，含有GTA交联明胶的水凝胶组合物以良好的稳定性为特征。根据在0.1％至1％GTA范围内呈现的结果，交联程度从60％增加到100％，并且热性能和机械性能相应地不同，这就是为什么可以采用不同的GTA浓度来调节膜的理化性质。然而，GTA浓度仍然足够高，以至于不能在以这种方式制备的水凝胶上进行细胞培养。
文档CN105316285公开了一种生产用于3D细胞培养的培养基的方法，所述方法包括将胶原溶解于乙酸中，将壳聚糖溶解于乙酸中，将它们混合，干燥，然后添加GTA，并使它们静置8-16小时以交联和纯化所获得的水凝胶。
目前在现有技术中还没有通过低浓度的GTA交联蛋白质而产生的水凝胶。通过降低浓度同时通过降低GTA与可以结合的赖氨酸的量的比例，获得了具有更好的理化性质以及更低的毒性的水凝胶，这使得能够将本发明的水凝胶用于健康细胞和肿瘤细胞两者的2D和3D细胞培养、在3D条件下水凝胶中的迁移和侵袭测定、进行血管生成测定或进行主动脉出芽测定中。
然而，仍然需要开发一种具有精确选择的品质(例如密度、硬度和弹性)的水凝胶，其以这种方式将能够广泛用于测试，例如用于进行血管生成测定。在本发明中，适当地通过改变明胶或胶原和GTA的浓度来进行密度和硬度参数的精确选择。弹性是上述两个参数修改和水凝胶生产方法的结果。交联水平决定了最终产品的参数，并且只有本发明人描述的技术才能够将浓度降低到足以能够获得本发明的水凝胶参数的水平。
本发明的另一个目的是提供一种用于在进行血管生成测定(血管生成测定、体外血管生成管形成测定、内皮细胞管形成测定)使用的水凝胶。也将新的水凝胶用于其他细胞培养，例如肿瘤细胞培养、芯片实验室培养、植物和细菌细胞培养和流动培养。
本发明解决的另一个技术问题是消除在GTA与明胶反应之后仍然存在的毒性。随着本发明中使用的GTA量的去除(它们已经是残余的)，所生产的水凝胶使得甚至最敏感的细胞也能够生长。
此外，本发明的一个极其重要的特征是经济方面。首先，有可能使GTA与明胶反应，使得可以在如此低的浓度下产生水凝胶。此外，本发明中使用的相对便宜的试剂显著降低了成本，同时提高了生产的效率和成本效益，所要求保护的产品能够在大得多的规模上发挥作用。
一个极其重要的方面是这样一个事实，即以这样的方式产生的蛋白质水凝胶是比当今可商购获得的具有类似应用范围的产品重现性高得多的细胞培养产品。本发明的蛋白质水凝胶是这类产品中唯一不含生长因子并且产品再现性显著提高的产品。其基本上不含生长因子或其不含生长因子，因为每种可商购获得的组分的制造会使可能存在于其中的残余生长因子失活，并且另外，生长因子会在与GTA反应期间失活。本发明的蛋白质水凝胶的高再现性仅源于这一事实：其是由可商购获得的组分合成的，由此它们的浓度可以在最终产品中非常精确地选择和控制。
本发明的主题是一种蛋白质水凝胶，包含：试剂A，其为明胶或胶原；试剂B，其为交联剂GTA(戊二醛)和溶剂，所述蛋白质水凝胶的特征在于试剂A以0.15重量％至1.5重量％的最终浓度存在，在一份水凝胶中试剂A与试剂B的比率为0.375-4.5mg比0.01-0.15mg。
优选地，试剂A的最终浓度为0.25重量％至1重量％，在一份水凝胶中，试剂A与试剂B的比率为0.625-3mg比0.0135-0.075mg。
特别优选地，试剂A的最终浓度为0.3重量％至0.8重量％，在一份水凝胶中，试剂A与试剂B的比率为0.75-2.4mg比0.021-0.045mg。
优选地，本发明的蛋白质水凝胶的特征在于明胶是Bloom值为至少225、优选地Bloom值为300的明胶。
优选地，本发明的蛋白质水凝胶的特征在于溶剂是水溶液，更优选地选自下组：dH2O、PBS、HBSS，并且最优选地是PBS。
本发明的另一个主题是生产本发明的蛋白质水凝胶的方法，包括以下步骤：
a)在水溶液中添加适量的试剂A(其为明胶或胶原)，所述水溶液优选地选自下组：dH2O、PBS、HBSS，并且最优选PBS。
b)加热步骤a)的混合物以溶解凝胶；
c)任选地，初始稳定化凝胶；
d)通过将试剂B(其为交联剂GTA)溶解于水溶液中并使其冷却来制备试剂B；
e)向步骤c)中制备的凝胶中添加在步骤d)中制备的试剂B；
f)任选地混合所获得的混合物；
g)交联；
h)任选地纯化具有过量的试剂B的水凝胶，
其特征在于试剂A以0.15重量％至1.5重量％的最终浓度存在，在一份水凝胶中试剂A与试剂B的比率为0.375-4.5mg比0.01-0.15mg，凝胶的初始稳定化发生在凝胶达到0-12℃的温度时并且其持续时间为至少约5分钟；步骤d)-g)在约0℃至约12℃的降低的温度下进行，在步骤g)中交联的持续时间为至少12小时。
向步骤c)中制备的凝胶中添加在步骤d)中制备的试剂B可以通过向凝胶中添加试剂B或向已经凝胶化的凝胶中添加试剂B来进行。
优选地，试剂A的最终浓度为从0.25重量％至1重量％，在一份水凝胶中，试剂A与试剂B的比率为0.625-3mg比0.0135-0.075mg。
特别优选地，试剂A的浓度为0.3重量％至0.8重量％，在一份水凝胶中，试剂A与试剂B的比率为0.75-2.4mg比0.021-0.045mg。
优选地，初始稳定化的持续时间为30分钟至48小时，最优选地45分钟至24小时。
优选地，交联的持续时间为超过48小时，最优选地超过72小时。
如果步骤h)中水凝胶纯化发生，其优选地通过用水溶液(优选地用于细胞培养的水溶液、优选地PBS)漂洗(冲洗，rinsing)或者通过中和试剂B(优选地通过添加L-赖氨酸)来进行。
所述方法的上述步骤h)中对具有过量试剂B的水凝胶的任选纯化通过每种能够与-CHO基团反应并使其失活的物质来进行。这样的物质的实例是L-赖氨酸，但也包括包含赖氨酸的未结合侧链-NH2的蛋白质。使用这种物质以便中和有毒的交联物质(例如包含两个-CHO基团的GTA)。这种物质的使用浓度是当生产水凝胶时添加的-CHO基团的摩尔浓度的倍数。例如，当使用30μl的0.1％GTA时，那么约0.6*10-3摩尔的-CHO基团以这样的体积存在。使用10x(十倍)浓度的L-赖氨酸意味着添加的L-赖氨酸的摩尔数是生产水凝胶所添加的-CHO基团的10倍。L-赖氨酸在侧链中仅包含一个-NH2基团，所述基团能够结合-CHO基团，并且通常以等于水凝胶的初始体积的体积添加。
本发明的另一个主题是本发明的蛋白质水凝胶用于细胞培养(优选地用于3D细胞培养)的用途。
本发明的又一个主题是通过本发明的方法生产的蛋白质水凝胶进行血管生成测定的用途，其中步骤c)中初始稳定化的持续时间为10至90分钟、优选地15至60分钟、最优选地40至55分钟并且交联的持续时间为超过60小时，并且试剂A的最终浓度为0.35-0.55％，其中在一份水凝胶中保持这样的比例，使得试剂A的质量为0.875mg至1.375mg范围内每0.024mg至0.036mg的试剂B。
优选地，在一份水凝胶中保持这样的比例，使得试剂A的质量为1mg至1.25mg范围内每0.027mg至0.033mg的试剂B。
特别优选地，在一份水凝胶中保持这样的比例，使得试剂A的质量为1mg量每0.03mg的试剂B。
将GTA的浓度降低到低于0.15mg的值(即，在30μl中0.5％或在300μl中0.05％)，将GTA添加到浓度为0.15％-1.5％的明胶中(即分别添加到250μl或300μl中)，不仅降低了其毒性(其随后更容易去除)，而且最重要的是，使得可以改变水凝胶的弹性和粘度，从而影响细胞生长的参数并提供了全新的机会。
本文所使用的术语具有本领域普遍接受的含义。
术语“降低的温度”意指在约0℃至约12℃、优选地约0℃至约8℃范围内的温度，特别优选地在冰上，该表述能够与表述“冰箱温度”互换使用。
术语“约”旨在表示给定的数值具有所定义的值，然而，该值可以有10％的误差。
术语“水溶液”优选地意指用于细胞培养的水溶液，优选地选自：dH2O、PBS、HBSS，特别优选地为PBS。
术语“交联剂”、“试剂B”意指执行连接两个或更多个蛋白质链的功能的化学化合物。蛋白质链由氨基酸侧链或在蛋白质末端的氨基酸连接。蛋白质的连接当由于蛋白质链连接而产生蛋白质网络时称为交联，也称为水凝胶。如Sung et al.Evaluation ofgelatin hydrogel crosslinked with various crosslinking agents asbioadhesives:In vitro study,Journal of biomedical materials Research,1999的著作中的实施例中所示，在列举示例性蛋白质交联机制的情况下，蛋白质交联可以发生，例如通过-NH2或-COOH官能团。如Bigi等人中所公开，交联剂优选地是戊烷-1,5-二醇(戊二醛，GTA)。GTA通过共价结合蛋白质之间的-NH2基团来交联明胶或胶原，并且此外，通过结合一种蛋白质内部的那些基团，从而使它们稳定。
术语“蛋白质水凝胶份/孔”意指示例性份，在该份产生期间在权利要求中所给出的比例得以遵守。使用了“份”的两个实例，250μl凝胶，向其中添加30μl GTA(添加到凝胶内部，结果目标体积是280μl水凝胶)。份的另一个实例是300μl凝胶份，在该凝胶份的表面上添加300μl GTA-这里该份限于300μl水凝胶，因为添加到凝胶表面上的GTA不会与凝胶本身混合，并且因此不会增加最终所得的水凝胶的体积。所施加的试剂B以这样的方式扩散到凝胶中，在这些凝胶中发生交联反应，并且剩余的多余部分通过抽吸从水凝胶表面除去。出于本发明的目的，呈现了上文给出的和实施方式中公开的水凝胶份体积。然而，保护也涵盖更少量和更大量的试剂A和试剂B，如说明书中所述的试剂A与试剂B的比例得以遵守。
“试剂A”意指明胶或胶原，但也指从活的生物体中获得的与明胶或胶原具有相同或相似氨基酸序列的任何其他蛋白质，以及重组蛋白质(即通过在基因改变的生物体中生产获得的)。
附图说明
本发明的主题在实施方式和附图中示出，其中：
图1–示出了在水凝胶上的管形成HUVEC内皮细胞。这个测试是展示血管形成的模型测定。它支持促血管生成和抗血管生成测试。
图2–示出了在水凝胶上培养的4T1细胞，所述细胞形成三维结构，即球状体。在长期培养之后，观察到细胞在相邻球状体之间迁移。图2A示出了在接种后14天的4T1细胞，并且图2B示出了在接种后17天的4T1细胞。
图3–示出了半填充水凝胶并倒入了培养基的培养孔。展示了取决于水凝胶的各种细胞生长和行为。图A和C示出了在硬而稠的水凝胶上的生长和迁移，图B和D示出了在软而稀薄的水凝胶上的生长和迁移。图A示出了在水凝胶表面上的细胞生长，这是一种3D生长，但在水凝胶表面上。图B示出了细胞生长到水凝胶内部。图C示出了在水凝胶表面上的迁移。图D示出了两个团块，它们已经生长到水凝胶内并且细胞在水凝胶内部在它们之间迁移。
具体实施方式
下面示出了实施方式，它们仅仅是为了说明本发明，而不是限制性的。
实施例I—蛋白质水凝胶的生产
为了生产浓度为0.4％的60份水凝胶，称取0.06g A型Bloom 300明胶并将其溶解于14.94ml PBS溶液中。每份水凝胶含有0.001g明胶。将溶液在37℃下加热以溶解凝胶，并且然后通过过滤灭菌。以这种方式制备的凝胶以每孔250μl用移液器吸取到48孔板中，并放入冰箱冷却，然后在冰箱中稳定化45分钟。剩余的12份凝胶仍未使用。通过取得0.03mg GTA并补充到30μl dH2O中，提前制备0.1％GTA在dH2O中的溶液并在冰箱中冷却30分钟。向冷却的、稳定化的但未凝胶化的凝胶中添加30μl GTA溶液。GTA的添加在冰上发生。在每份水凝胶中，有约0.03mg GTA。然后将添加了含GTA的凝胶的板放入冰箱中持续72小时。此后，通过添加L-赖氨酸通过水凝胶中和来纯化所得的水凝胶中过量的GTA。使用溶解在PBS中的10x浓度的L-赖氨酸。将赖氨酸与水凝胶一起孵育24小时。以这种方式制备的水凝胶供进一步使用。
实施例II—蛋白质水凝胶的生产
为了生产浓度为0.7％的50份水凝胶，称取0.105g的A型Bloom 300明胶并将其溶解在14.895ml PBS溶液中。每份水凝胶含有0.0021g明胶。将溶液在37℃下加热以溶解凝胶，并且然后通过过滤灭菌。将凝胶用移液器吸取到48孔板中，每孔300μl。剩余的2份凝胶仍未使用。将以这种方式制备的板放入冰箱中持续2小时。通过取得0.06mg GTA并补充到300μl dH2O中，提前制备0.02％GTA在dH2O中的溶液并在冰箱中冷却最少30分钟。在凝胶化凝胶的表面上轻轻倒入300μl GTA溶液，并放入冰箱中持续24小时。GTA的添加在冰上发生。在每份水凝胶中，有约0.06mg GTA。此后，通过用PBS漂洗水凝胶3次，纯化在所得水凝胶中过量的GTA。以这种方式制备的水凝胶供进一步使用。
实施例III
在实施例I中制备的水凝胶上，以15,000个细胞/48孔板的孔的密度接种内皮(HUVEC)细胞(取决于具体的细胞系批次和细胞分裂的次数，所接种细胞的密度可以在5至50,000个细胞/48孔板的孔变化)。在EGMTM-2BulletKitTMLonza培养基中培养内皮细胞。实验的结果是内皮细胞在水凝胶表面上形成管(图1)。
实施例IV
在实施例II中制备的水凝胶上，以10,000个细胞/48孔板的孔的密度接种肿瘤4T1(鼠类乳腺癌)细胞。在RPMI+10％FBS培养基中培养细胞。实验的结果是肿瘤细胞形成球状体(图2)。
实施例V(使用现有技术浓度的对比实施例)
进行测定，其中根据现有技术中公开的方法生产水凝胶(Bigi等人)。为此，制备了组成为5％A型Bloom 300明胶(质量)和表1-8中所述质量浓度的GTA的水凝胶。在表1、2、3和4所示的实验中，将蛋白质水凝胶干燥24小时(干燥根据出版物Bigi等人中的描述进行)，然而在表5、6、7和8中，使所制备的蛋白质水凝胶交联24小时，其中A表示不漂洗水凝胶，B表示用dH2O漂洗5次，并且C表示用PBS漂洗5次。漂洗步骤在引用的出版物中没有描述。在实验后，评价所得的细胞：0–无扁平细胞；很可能全部死亡；1–存在少量的扁平细胞；2–存在大量的扁平细胞。下表示出了所得的结果。
所接种的细胞系是：Panc_02
表1
GTA浓度[％] 0.1 0.125 0.25 0.5
A 0 0 0 0
B 0 0 0 0
C 1 1 0 0
表2
GTA浓度[％] 1 1.5 2 2.5
A 0 0 0 0
B 0 0 0 0
C 0 0 0 0
表5
GTA浓度[％] 0.1 0.125 0.25 0.5
A 0 0 0 0
B 0 0 0 0
C 1 1 0 0
表6
GTA浓度[％] 1 2 3 4
A 0 0 0 0
B 0 0 0 0
C 0 0 0 0
所接种的细胞系是：HUVEC
表3
GTA浓度[％] 0.1 0.125 0.25 0.5
A 0 0 0 0
B 2 2 2 0
C 2 2 2 2
表4
GTA浓度[％] 1 1.5 2 2.5
A 0 0 0 0
B 0 0 0 0
C 0 0 0 0
表7
GTA浓度[％] 0.1 0.125 0.25 0.5
A 0 0 0 0
B 1 1 1 0
C 2 1 1 1
表8
GTA浓度[％] 1 1.5 2 2.5
A 0 0 0 0
B 0 0 0 0
C 1 1 1 1
上述数据表明，在现有技术的较高浓度的水凝胶上，细胞不生长或生长成扁平的。在HUVEC细胞系的情况下，其阻止血管形成，即进行血管生成测定。在Panc_02细胞系的情况下，这意味着如果交联剂已经适当地去除/中和，细胞可以生长，但是生长是在硬培养基上，因此细胞变平，这是标准2D培养的典型情况。
实施例VI–用dH2O溶剂生产蛋白质水凝胶
为了生产浓度为0.3％的50份水凝胶(每份300μl)，称取0.045g的A型Bloom 300明胶并将其溶解在14.955ml dH2O中。每份水凝胶含有0.0009g明胶。将溶液加热至37℃持续30分钟以溶解凝胶，并且然后通过过滤灭菌。将以这种方式制备的凝胶以每孔300μl用移液器吸取到48孔板中。两份仍未用移液器吸取以待处置。将含有48份凝胶的48孔板放入冰箱冷却，并且然后在冰箱温度下稳定化23小时。通过取得0.0105mg GTA并补充到300μl dH2O中，提前制备0.0035％(质量)GTA在dH2O中的溶液，并通过让其在冰箱中静置最少30分钟将其温度降低到冰箱温度。在冷却的、稳定化的和凝胶化的凝胶表面上，添加300μl冷却的GTA溶液。GTA的添加在冰上进行。然后将倒入了含GTA的凝胶的板放入冰箱持续72小时。在每份水凝胶中，有约0.0105mg GTA。此后，通过用PBS漂洗水凝胶3次，纯化在所得水凝胶中过量的GTA。以这种方式制备的水凝胶供进一步使用。
实施例VII–用于细胞培养的水凝胶生产，无需进行去除有毒GTA残余物的步骤
为了生产浓度为0.6％的50份水凝胶(每份250μl)，称取0.075g的A型Bloom 300明胶并将其溶解在12.425ml PBS中。每份水凝胶含有0.0015g明胶。将溶液加热至37℃持续30分钟以溶解凝胶，并且然后通过过滤灭菌。将以这种方式制备的凝胶以每孔250μl用移液器吸取到48孔板中。2份仍未用移液器吸取以待处置。将含有48份凝胶的48孔板放入冰箱冷却，并且然后在冰箱温度下稳定化60分钟。通过取得0.018mg GTA并补充到30μl dH2O中，提前制备0.06％(质量)GTA在dH2O中的溶液，并通过让其在冰箱中静置最少30分钟将其温度降低到冰箱温度。向冷却的、稳定化的但未凝胶化的凝胶中每种添加30μl冷却的GTA溶液。GTA的添加在冰上进行。然后将添加了含GTA的凝胶的板放入冰箱持续72小时。在每份水凝胶中，有约0.018mg GTA。以这种方式制备的水凝胶供进一步使用。
实施例VIII–用B型明胶生产蛋白质水凝胶
为了生产浓度为0.4％的60份水凝胶(每份250μl)，称取0.06g的B型明胶并将其溶解在14.940ml PBS溶液中。每份水凝胶含有0.001g明胶。将溶液加热至37℃持续30分钟以溶解凝胶，并且然后通过过滤灭菌。将以这种方式制备的凝胶以每孔250μl用移液器吸取到48孔板中。十二份仍未用移液器吸取以待处置。将含有48份凝胶的48孔板放入冰箱冷却，并且然后在冰箱温度下稳定化50分钟。通过取得0.045mg GTA并补充到30μl dH2O中，提前制备0.15％(质量)GTA在dH2O中的溶液，并且使其温度降低到冰箱温度。向冷却的且部分稳定的但未凝胶化的凝胶中添加30μl冷却的GTA溶液。GTA的添加在冰上发生。在每份蛋白质水凝胶中，有约0.045mg GTA。然后将倒入了含GTA的凝胶的板放入冰箱中持续72小时。此后，通过用PBS漂洗水凝胶3次来纯化所得的蛋白质水凝胶中过量的GTA。以这种方式制备的水凝胶供进一步使用。
实施例IX–血管生成的再现性
为了生产浓度为0.4％的50份水凝胶(每份250μl)，称取0.05g的A型Bloom 300明胶并将其溶解在12.45ml PBS中。每份水凝胶含有0.001g明胶。将溶液加热至37℃持续30分钟以溶解凝胶，并且然后通过过滤灭菌。将以这种方式制备的凝胶以每孔250μl用移液器吸取到48孔板中。2份仍未用移液器吸取以待处置。将含有48份凝胶的48孔板放入冰箱冷却，并且然后在冰箱温度下稳定化40分钟。通过取得0.03mg GTA并补充到30μl dH2O中，提前制备0.1％(质量)GTA在dH2O中的溶液，并通过让其在冰箱中静置最少30分钟将其温度降低到冰箱温度。向冷却的、稳定化的但未凝胶化的凝胶中每种添加30μl冷却的GTA溶液。GTA的添加在冰上进行。然后将添加了含GTA的凝胶的板放入冰箱持续72小时。在每份水凝胶中，有约0.03mg GTA。将以这种方式制备的蛋白质水凝胶用PBS漂洗3次。以10个不同的生产批次制备蛋白质水凝胶，每次重复4次。
在以这种方式制备的蛋白质水凝胶上，接种细胞，并且在孵育10小时后在显微镜下观察细胞。下表9示出了测定结果，其中：
A–细胞形成形状良好的管
B–细胞开始形成管
表9
Figure BDA0003188316000000171
Figure BDA0003188316000000181
实验表明，作为本公开主题的方法的特征之一是结果的高再现性。在所有40次尝试中，血管生成测定都返回了阳性结果，并且只有两次时间上略有延迟，这可能是由于统计误差。上述结果代表了与竞争产品相比血管生成测定有效性的显著改善。
作为本发明主题的蛋白质水凝胶使得可以获得具有精确选择的参数(例如水凝胶的密度或硬度)的培养基。这些参数对细胞自然生长的生理条件的复制有影响，这进而又影响所述细胞的行为，例如：迁移到水凝胶内部、形成球状体的能力等。

Claims (16)

1.一种蛋白质水凝胶，包含：试剂A，其为明胶或胶原；试剂B，其为交联剂GTA和溶剂，其特征在于，试剂A以0.15重量％至1.5重量％的最终浓度存在，在一份所述水凝胶中试剂A与试剂B的比率为0.375-4.5mg比0.01-0.15mg。
2.根据权利要求1所述的蛋白质水凝胶，其特征在于，试剂A的最终浓度为0.25重量％至1重量％，在一份所述水凝胶中试剂A与试剂B的比率为0.625-3mg比0.0135-0.075mg。
3.根据权利要求2所述的蛋白质水凝胶，其特征在于，试剂A的最终浓度为0.3重量％至0.8重量％，在一份所述水凝胶中试剂A与试剂B的比率为0.75-2.4mg比0.021-0.045mg。
4.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质水凝胶，其特征在于，明胶是Bloom值为至少225、优选地Bloom值为300的明胶。
5.根据前述权利要求中任一项所述蛋白质水凝胶，其特征在于，所述溶剂是水溶液，更优选地来自下组：dH2O、PBS、HBSS，最优选地为PBS。
6.一种生产权利要求1-5所述的蛋白质水凝胶的方法，包括以下步骤：
a)在水溶液中添加适量的试剂A，所述试剂A为明胶或胶原，所述水溶液优选地选自下组：dH2O、PBS、HBSS，最优选地为PBS；
b)加热步骤a)的混合物以溶解凝胶；
c)任选地初始稳定化所述凝胶；
d)通过使试剂B溶解于水溶液中并使其冷却来制备试剂B，所述试剂B为交联剂GTA；
e)向步骤c)中制备的所述凝胶中添加步骤d)中制备的试剂B；
f)任选地混合所获得的混合物；
g)交联；
h)任选地纯化具有过量的试剂B的水凝胶，
其特征在于，试剂A以0.15重量％至1.5重量％的最终浓度存在，在一份所述水凝胶中试剂A与试剂B的比率为0.375-4.5mg比0.01-0.15mg，所述凝胶的初始稳定化发生在所述凝胶达到0℃-12℃的温度并且持续时间为至少约5分钟时；步骤d)-g)在约0℃至约12℃的降低的温度下进行，在步骤g)中交联的持续时间为至少12小时。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，试剂A的最终浓度为0.25重量％至1重量％，在一份所述水凝胶中试剂A与试剂B的比率为0.625-3mg比0.0135-0.075mg。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，试剂A的最终浓度为0.3重量％至0.8重量％，在一份所述水凝胶中试剂A与试剂B的比率为0.75-2.4mg比0.021-0.045mg。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，初始稳定化的持续时间为30分钟至48小时，最优选地45分钟至24小时。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，交联的持续时间为超过48小时、最优选地超过72小时。
11.根据权利要求6至10中任一项所述的方法，其特征在于，如果步骤h)中的所述水凝胶的纯化发生，则所述纯化如下进行：通过用水溶液、优选地用于细胞培养的水溶液、优选地PBS漂洗，或者通过中和试剂B、优选地通过添加L-赖氨酸。
12.权利要求1-5所述的蛋白质水凝胶用于细胞培养的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，用于3D细胞培养。
14.通过根据权利要求6所述的方法生产的蛋白质水凝胶用于进行血管生成测定的用途，其中步骤c)中的所述初始稳定化的持续时间为10至90分钟、优选地15至60分钟、最优选地40至55分钟，并且在所述降低的温度下的交联反应的持续时间为超过60小时，并且试剂A的最终浓度为约0.35-0.55重量％，在一份所述水凝胶中试剂A与试剂B的比率为0.875-1.375mg比0.024-0.036mg。
15.根据权利要求14所述的用途，在一份所述水凝胶中试剂A与试剂B的比率为1-1.25mg比0.027-0.033mg。
16.根据权利要求15所述的用途，在一份所述水凝胶中，试剂A与试剂B的比率为1-0.03mg比0.01-0.15mg，在一份所述水凝胶中保持这样的比例：试剂A的质量为1mg的量每0.03mg的试剂B。
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