JPS63152601A - 修飾された微生物産生セルロ−スのゲルおよび動物細胞膜との複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、微生物が産生ずるセルロースのゲルであって
、該セルロースに動物細胞接着性蛋白質が結合している
か、または該セルロースが化学的に修飾されているゲル
に関する。

このゲルは動物細胞の大量培養用担体および医療用創傷
カバーとして有用である。特に、上記ゲルに動物細胞が
吸着または結合せる複合体は医療用創傷カバーとして非
常に有用である。

〔従来の技術〕

動物細胞を担体に付着させることに工って大量培養をは
かる方法は広く用いられている。

従来用いられている担体用成形物素材には、シート状も
しくは平板状の成形物素材としてはプラスチックやガラ
スなどがあり、ビーズ状の成形物素材としては架橋ゼラ
チン（ジェリピーズ（米国ＫＣパイオロノカル社製）な
ど）もしくは、荷電基を付加したポリアクリルアミド（
）ｆイオキャリヤー（米国バイオラド社製）など）、ポ
リスチレン（バイオシロン（７′ンマ一クヌンク社製）
など）デキストラン〔スーパーピース（ｌｉｔフローラ
？社製〕など）、セルロース顆粒（ＤＥ−５２（英国ワ
ットマン社製）など）もしくは、コラ−ダン皮膜処理を
施したデキストラン（サイトデックス−３（スウェーデ
ン、ファルマシア社製）ナト）などがあり、中空繊維状
の成形物素材としてはセルロースアセテート（米国アミ
コン社）などがある。

一方、事故、災害時に外傷や熱傷の皮膚を保護し上皮の
再生を促進させ、傷を治癒にいたらしめる傷の保護材が
創傷カバー又は人工皮膚といわれる（以下、「創傷カバ
ー」という）。

従来、創傷カバーとしてはが−ゼがもっとも広く用いら
れてきたが、近年ガーゼより特性のすぐれた凍結乾燥豚
皮（ＬＰＳ）が用いられている。これは生体材料であり
、ヒトの皮膚に外観的にも類似し、柔軟で傷口との密着
性がよく、皮膚の再生を促進するという点で優れている
。

また、最近ではコラーゲン製のものも出てきており、不
織布状、膜状、あるいはシリコン膜と複合化したものも
ある。これは抗原性がないことや滅菌可能であること等
種々の特長を有している。

さらに、ポリアミノ酸膜と合成高分子膜を複合化したも
のも創傷カバーとして拭作されつつある。

これは、プロテアーゼにより分解されないという特長が
ある。

さらに、人の血液からつくったプラズマ膜やフィブリン
膜もある。これは吸収性にすぐれており、人体に対する
刺激性もない。

さらにこれらアミノ酸のポリマーやタンパク系のものと
ちがって特開昭５９−１２０１５９に述べられている工
うに、微生物が産生ずるセルロースの薄膜を使用してい
るものもある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかるに、動物細胞の大量培養用担体として従来使用さ
れている成形物の素材は、動物細胞の付着、増殖量が充
分ではない等の解決すべき問題点かある。また柔軟性な
どの点ですぐれた、シート状もしくは平板状の担体用成
形物になる素材はない。

一方、創傷カバーとして従来用いられている物は、次の
ような問題点があった。凍結乾燥豚皮やコラーゲンでつ
くられたものは、プロテアーゼに工り分解されやすく、
傷口において融解して雑菌感染の原因となるため、たび
たびはりかえる必要があった。ポリアミノ酸膜は、プロ
テアーゼにより分解されることはないが、シリコン膜の
工うな適当な支持体が必要であり、製造工程が複雑であ
った。人の血液からつくったプラズマ膜やフィブリン膜
は特性的には優れているが、原料が高く供給が困難であ
った。微生物が産生ずるセルロースの薄膜は、上皮の細
胞との接着性が悪く、傷口から剥離しやすく雑菌感染が
おこりやすいことや、皮膚再生を促進しないこと等の問
題があった。

従って、本発明の目的は、従来の問題点を解決し、動物
細胞の増殖に適し、表皮細胞との接着性に優ｒしている
微生物産生セルロースのゲルを提供するにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、−面において、微生物産生セルロースのゲル
であって、該セルロースに動物細胞接着性蛋白質が物理
的もしくは化学的に結合しており、および／または、該
セルロースの少くとも一部の水酸基中の水素原子が正ま
たは負に荷電した有機基で置換されていることを特徴と
する修飾された微生物産生セルロースのゲルを提供する
。

本発明は、他の一面において、上述の修飾された微生物
産生セルロースゲルに動物細胞が吸着ま九は結合されて
いる複合体を提供する。

本発明は、さらに他の一面において、未修飾微生物産生
セルロースゲルに動物細胞が吸着または結合されている
複合本金提供する。

本明細書において「微生物産生セルロースのゲル」とは
、微生物が産生ずるセルロースと生理的に受容され得る
液体（例えば、蒸溜水、食塩水、グリセロール）とから
なる固形または半固形コロイド溶液を意味する。代表的
な生理的に受容され得る液体は蒸溜水である。

微生物産生セルロースは以下のようにして得ることがで
きる。

微生物産生セルロースを産生ずる微生物は、アセトバク
ター属、シュードモナス属、アグロバクテリウム属など
に属し、微生物セルロースを産生ずる微生物であればど
のような微生物でも良い。

−例を挙げればアセトバクター・アセチ・サブスピーシ
ス・キシリナム（Ａｅｓｔｏｂａｃｔ＠ｒ　ａｃａｔｉ
　ａｕｂａｐ。

ｘｙｌｉｎｕｍ）　ＡＴＣＣＩ　Ｏ８２１を挙げること
ができる。

本発明において微生物により微生物産生セルロースを産
生させる為には炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要
に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有
する通常の栄養培地に微生物を接穐し静置又はゆるやか
に通気攪拌を行なえばよい。炭素源としてはゲルコース
、シュークロース、マルトース、澱粉氷解物、糖蜜等が
使用され、その他エタノール、酢酸、クエン酸等も単独
或は上記他の炭素源と併用して用いられる。窒素源とし
ては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アン
モニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素、ペプトン
等が使用される。有機微量栄養素としてはアミノ酸、ビ
タミン、脂肪酸、核酸、更にこれらを含有するペプトン
、カブきノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が使用さ
れる。生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を
使用する場合には要求される栄養素を補添することが必
要である。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩
、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。

培養は通常の培養条件下で行えばよ＜、−を２．５ない
し９、温度を２０ないし４０℃に制御しつつ１〜３０日
間培養することにより培養液の表層に微生物セルロース
が産生される。

かくして得られる微生物産生セルロースは幅１００Ｓ５
００Ｘ、厚さ１０〜２００久程度のりメン状ミクロフィ
ブリルがからみ合った構造をしており、多量の水を含ん
だゲル状、嶺をしている。

微生物産生セルロースの含水率は９５％（ｖ／ｖ　’）
以上である。１次、微生物産生セルロースはセルラーゼ
により容易に分解され、ゲルコースが生成する。すなわ
ち、微生物産生セルロースの懸濁液０、１　（ｗ／ｖ）
のものを調製し、天野裂薬社製のセルラーゼ（ＥＣ３，
２，１，４）を０．５％（−／ｖ　）の濃度になる工う
に０．１Ｍの酢酸緩衝液に溶かし３０℃で２４時間反応
させると、本物質の一部が分解されることが観察される
。上澄液を（−／４’−クロマトグラフィーで展開して
調べるとゲルコースの池に少量のセロビオース、セロト
リオース及びセロオリゴ糖等が検出される。この他に少
量のフラクトース、マンノース等が検出される場合もあ
る。

本発明で使用する微生物産生セルロースは上記の：うな
物性を有するものであればいかなるものであっても使用
可能である。

本発明で使用する微生物産生セルロースは微生物の培養
物から単離されたもののほか、ある程度不純物を含むも
のでありても良い。例えば、培養液中の残糖、塩類、酵
母エキス等が微生物産生セルロースに残留してい−Ｃも
さしつかえない。また、菌体がある程度含まれていても
良い。

又、本発明で用いる該セルロース性物質は発酵生産によ
って得られた微生物産生セルロースのゲル状のものを洗
滌後そのまま使用してもよいし、又、とのゲル状のもの
を機械的剪断力を作用させることにより離解した後使用
してもよい。機械的な剪断の方法はどの工うな方法でも
よいが回転式の離解機、ミキサー等で容易に行うことが
出来る。

又、該セルロース性物質の微生物によって産生されたま
まの状態のゲル状のもの、あるいは離解したものを一旦
乾燥させてからゲルに戻しても工い。乾燥の方法は、ど
のような方法でもよいが、通常セルロースが分解しない
温度範囲で行なうことが必要なのは言うまでもない。又
、該セルロース性物質は表面に多数の水酸基を有する微
細な繊維より成っているので、乾燥中に繊維が相互膠着
することにより繊維状の形態が失なわれることがある。

したがって、これを防止して微細な繊維状の形ｇを生か
して使用したい時は、凍結乾燥や臨界点乾燥等の方法を
用いることが望ましい。

微生物産生セルロースのゲルは、例えば、補強、比重の
変化、固定化、親和性の改変、液体成分の滲出防止など
の目的を以って、適当な補助材料を組合せて複合化する
ことができる。複合すべき補助材料としては、例えば、
綿１毛等の天然繊維や再生セルロース、　ｆ！ＩＪエス
テル、等の人造繊維からなる不織布、その他の布帛類、
ホリエチレン。

ポリビニルアルコール、シリコーンゴム等のフィルム、
紙等の多孔性の膜状物、アルミナ、ガラス。

結晶セルロース等の有機あるいは無機材料の粒状物、寒
天、デキストラン、ポリアクリルアミド、ポリビニルピ
ロリドン、アルギニン酸塩、キチン、ヒアルロン酸、カ
ードラン、ポリアクリル酸塩、プルラン、カラギナン、
ゲルコマンナン、セルロース誘導体、ポリエチレングリ
コール等の水溶性もしくは極性溶剤に可溶性補助材料ま
たは親水性のゲルを形成する補助材料が挙げられる。

複合化方法は、大別すると、複合化しようとする物質を
培養液中に入れて培養を行なうことにより、複合化しよ
うとする物質の表面あるいは内部に微生物産生セルロー
スを生成させる方法と、培養後にゲル状膜として得られ
た微生物産生セルロースに複合化しようとする物質を含
浸させたり、裏打ちしたり、ゲル状膜をホモジナイザー
で離解した後に複合化したりする方法の２通りがある。

本発明で用いる微生物産生セルロースには動物細胞接着
性蛋白質が物理的または化学的に結合しているか、およ
び／または、微生物産生セルロースが化学的に修飾され
ている。

蛋白質の物理的な結合法としては、微生物産生セルロー
スの表面にタン・ぐり賞金そのまま吸着させた９、表面
にてゲル化させてしまう方法がある。

例えば、タンノやり質溶液に微生物産生セルロース全浸
漬させるだけで、吸着させることができる。

さらにタンパク質溶液にセルロースを吸着後、タン・や
り質を声、温度、塩濃度、金属イオン濃度等の変化によ
ってゲル化、あるいは固化させることによって強固な物
理的結合を形成することもできる。例えば、具体的には
コラーゲンの場合は声を変化させればいいし、ゼラチン
の場合は温度を下げればよいし、タン／？り間に架橋を
行なわせしめたい場合にはゲルタルアルデヒドやトラン
スゲルタミナーゼ等を用いて行なってもよい。

まだ、微生物産生セルロースを公知の方法により、例え
ば、エーテル化、エステル化、グラフト化またはデオキ
シ化することにより蛋白質との結合を高めることも可能
である。

化学的結合方法としては、エビハロヒドリン、ハロゲン
化シアン等を用いて架橋を形成する方法が、一般的に採
られる。多糖系物質とタンパク質との間に共有結合また
は架橋を形成する方法であれば何でもよい。

結合する蛋白質は動物細胞の成形物への接着を促進させ
る性質を有するものであればよく、一般的には細胞接着
因子に分類される蛋白質で、具体的にはタイプｔ、ｎ、
ｍ、■のコラーゲン、アテロコラ−ｒン（商品名、コー
ケン（株）　）　、フィブロネクチン、ラミニンなどで
ある。

微生物産生セルロースを化学的に修飾するには、セルロ
ースの少くとも一部の水酸基中の水素原子を正または負
に荷電した有機基で置換する。

動物細胞培養用としては正に荷電した置換基の導入が望
ましい。

すくなくとも一つの水素がアルキルに置換したアンモニ
アを含む置換基、すなわち下記式〔１〕および〔２〕で
表わされる置換基が好適である。

式〔１〕及び式〔２〕のｎはＯ〜８の整数であシ、Ｒ１
−Ｒ３は水素原子又はメチル、エチル、プロピル等のア
ルキル、フェニル、ナフチル等のアリール、ベンジル等
のアラルキル、アルカリール、シクロアルキル、アルコ
キシアルキル基である。但し、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３が同時
に水素原子を表わすことはない。また、これらの基には
アミノ基、水酸基等が結合していてもよい。

式〔１〕および〔２〕で表わされる置換基の代表例とし
て、アミノアルキル基（例、アミノエチル基）、ジアル
キルアミンアルキル基（例、ジエチルアミノエチル基）
、トリアルキルアミンアルキル基（例、トリエチルアミ
ノエチル基）、ジアルキルヒドロキシアルキルアミノア
ルキル基（例、ジエチル−（２−ヒドロキシプロピル）
−アミノ−エチル基）、エピハロヒトリントトリアルコ
ールアミン（例、トリエタノールアミン）とセルロース
とを反応させることによって導入される置換基、エピハ
ロヒドリンと、第３級アミンを反応させることによって
得られる第４級ハロヒドリン、または第４級アミンを含
むエポキサイド等をセルロースと反応させることによっ
て導入される置換基、グアニドアルキル基、バラアミノ
ベンジル基、ベンゾイル化及び／もしくはナフトイル化
されたジアルキルアミノアルキル基等があげられる。

正に巷電した置換基としては以上のようなものの他にセ
ルロース性物質に導入できるものであれば上記の例に限
定されない。該セルロース性物質を弱くアニオン化した
後に適当なカチオン、例えばポリエチレンイミン等を吸
着してもよい。

負に荷電した置換基を導入する方法としては、例えば、
カルボキシメチル基、カルボキシメチル基、リン酸基、
硫酸基金導入する方法が挙げられる。

本発明の修飾された微生物産生セルロースのゲルは種々
の形態で利用できるが、シート状または薄膜状成形物と
して用いることが好ましい。

〔発明の効果〕

本発明の修飾された微生物産生セルロースはヒト表皮細
胞を含む動物細胞培養用担体として用いることができ、
それにより、動物細胞を高い密度にて、しかも速い増殖
速度で培養することができる。また、未修飾の微生物産
生セルロースも動物細胞培養用担体として用いることが
できる。培養できる動物細胞は、ヒトを含む動物の全て
の付着依存性細胞と、付着非依存性（浮遊）細胞のうち
本発明のゲル素材に接着しうる細胞である。

このような動物細胞の培養は、０〜５０％の血清を含む
通常の細胞培養用培地を用いて行うことが出来る。培養
器は通常の細胞培養用のプラスチックシャーレやフラス
コでよく、必要に応じて、回転子付のスピンナーフラス
コなどを用いることもできる。

また、修飾された、または未修飾の微生物産生セルロー
スゲルはその１ま、動物細胞の大量培養用の担体として
利用することもできる。

従って、微生物産生セルロースのゲルは、例えば、線維
芽細胞によるインターフェロン、ネズミマクロファージ
によるインターロイキン１．ヒト線維芽細胞によるプラ
スミノーグンアクテペータ。

ヒト白血病細胞による腫瘍壊死因子、ハイプリドーマ細
胞によるモノクローナル抗体等のポリペプチド等を生産
する際に利用できる。

ヒト表皮細胞をシート状微生物産生セルロースゲル上に
実質的に単層状態に培養したものは、熱傷や外傷を受け
た皮膚患部に適用する創傷カバーまたは人工皮膚として
非常に有用である。すなわち、そのような培養物は比較
的短時間に得られ、しかも、細胞層が患部に密着するよ
うにシート状培養物を患部に当てるだけでよい。かくし
て、活性のある細胞層が表皮再生の核となり、また、上
面のセルロースゲルが乾燥すると通気性・細菌不透過性
の多孔質保護層となる。従来、これに類似せる人工皮膚
を調製し適用するには、時間をかけて担体上に表皮細胞
が多層になるまで培養しくハワード・グリーン、オラニ
ー・ケヒンデＰｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　１９７９　：
　７６　、５６６５〜８）、手間のかかる作業によって
担体から培養細胞層を剥離し、多重細胞層の剥離面（活
性のある細胞層側）が患部に密着するように当てがい、
その上をガーゼのような保獲材で被覆しなければならな
かった。

また、修飾された微生物産生セルロースは、微生物産生
セルロースが本来持っている特性と、修飾によって附加
された動物細胞との高い付着性とによって、創傷部組織
との高い密着性を有するので、医療用創傷カバー材とし
てすぐれている。

〔実施例〕

以下、実施例について説明する。

実施例１ シュクロース５１１７ｄｉ、酵母エキス（Ｄｉｒｃｏ　
）０、５　ｇ／ｄ／！、硫安０．５１／ｄｉ　、　ＫＨ
２ＰＯ４０，３１１７ｄｉ　。

及びＭｇ５０４７Ｈ２００，０５１１／ｄ７！（ｐＨ５
，０）　Ｏ組成の培地１００１ｄｔ−１２０℃で２０分
間蒸気滅菌した後に、あらかじめ滅菌法の直径１５備の
シャーレに入れた。

これに、上記組成の培地に寒天を２１１７ｄｉ加えて作
製した試験管斜面寒天培地で３０℃、７日間生育させた
、アセトバクター・アセチ・サブスピーシス・キシリナ
ムＡＴＣＣ１０８２１’ｉ２白金耳ずつ液洩し、３０℃
で培養した。２週間後培養液の上層に厚さ約２■のセル
ロース性多糖を含むゲル状の膜が形成された。

こうして得られた膜を水洗後、膜重量の２０倍量の２０
％ＮａＯＨ溶液に１００℃、３０分間浸漬した。このＮ
ａＯＨ溶液浸漬操作を更に２回くりかえした。アルカリ
溶液浸漬後、Ｉ　ＮＨＣｌ溶液で中和してからゲル状膜
を一昼夜流水中で洗浄した。

この洗浄後の乳白色透明のゲル状膜（以下、「洗浄ｙル
状膜」という）２００．９と水２００．９及びＮａＯＨ
４１１’ａ−混合し、攪拌しつつ７０℃で１時間放置し
た。さらにこの混合液にグリシジルトリメチルアンモニ
ウムクロライド１２Ｉを４０＋ａＡ’のＨ２Ｏに溶解し
た液を加えて７０℃、５時間反応させカチオン化処理を
行なった。反応終了後希塩酸でアルカリを中和してから
カチオン化ゲル状膜を水洗した。

カチオン化ゲル状膜を直径３０ｍの円形状に切断し、充
分量の蒸留水中で１２０℃、２０分間加熱滅菌した。滅
菌したカチオン化ゲル状膜は１０チ仔牛脂児血清を含む
ＭＥＭ培地（イ）、あるいはゲルベツコ改変ＭＥＭ培地
（ロ）ちるいはα−ＭＥＭ培地（ハ）、あるいはＲＰＭ
Ｉ培地（ニ）の中で充分平衡化後直径３０ｍのプラスチ
ックシャーレの中に置いた。とのシャーレ（イ）の中に
２×１０５個のＬ−９２９細胞を懸濁した４−の１０％
仔牛脂児血清を含むＭＥＭ培地あるいは２ｘ１０５　個
のＪ−１１１細胞を懸濁した４ゴの１０’％仔牛脂児血
清を含むＭＥＭ培地、シャーレ（ロ）の中に２×ｌＯ５
個の３Ｔ３スイスアルピノ細胞金懸濁した４−の１０％
仔牛脂児血清を含むゲルベツコ改変ＭＥＭ培地、アルイ
は２　Ｘ　Ｉ　０５個（１り　Ｍ−ＭＳｖ−Ｂａｌｂ／
３Ｔ３細胞を懸濁した４−の１０％仔牛脂児血清を含む
ゲルベツコ改変ＭＥＭ培地、シャーレ（ハ）の中に２×
１０　個のＣＨＯ細胞を懸濁した４ｄのｌＯ％仔牛脂児
血清を含むα−ＭＥＭ培地、シ〜−レ（ニ）の中に２×
１０　個のＴＨＰ−１細胞を懸濁した４１ｒＬｌの１０
チ仔牛脂児血清を入れ、３７℃の炭酸ガスインキユバ−
ターの中に５日間静置培養した。培養終了後、カチオン
化ゲル状膜をとり出し、ホスフェートバッファーセーラ
インで良く洗滌した後、０．３チのトリプシン溶液４ｄ
中で３７℃、２０分間処理してからラバーポリスマンを
使ってカチオン化ゲル状膜表面から細胞をはがしとった
。こうして得た細胞懸濁液中の生細胞数を、トリノ母ン
プルーの色素排泄能力を指標とした方法を用いて測定し
た。表１に結果を示した。

表１　静置培養法を用いたカチオン化ゲル状膜の評価細
胞名　　Ａ　　　　Ｂ　　　　Ｃ 接着依存性細胞マウスＬ−９２９３Ｂ刈０　０ｇＸ１０
　　：３２Ｘ１０６ヒトＪ−１１１２ＪＸ１０　　Ｃ）
８Ｘ１０　１．７Ｘ１０６マウスＭ−ＭＳＶ−Ｂ＆ｌｂ
／３Ｔ３２５Ｘ１０　　０Ｊ３Ｘ１０　　３ＤＸＩＯ６
マウス３Ｔ３　スイスアルピノ　３ＤＸ１０　　０Ｊ３
Ｘ１０　　２Ｊ３Ｘ１０６ハムスターＣＨＯ３１Ｘ１０
　　０Ｊ３Ｘ１０　　３３Ｘ１０’Ａは３０鵡のプラス
チックシャーレに付着して生育した細胞数を示した。

Ｂはカチオン化処理を行っていない洗浄ｒル状膜に付着
していた細胞数を示した。

Ｃはカチオン化ゲル状膜上に付着して生育した細胞数を
示した。

いずれも３０■シヤーレ当シの生細胞数で表わした。

実施例２ 実施例１において得られたカチオン化ゲル状膜の総窒素
含量を元素分析及びケルブール法により測定し九結果を
表２に示した。

表２ 元素分析法　　ケルブール法 洗浄ゲル状膜全乾燥し、重量を測定し、粉砕した後、カ
チオン化を実施例１と同条件で行なった。

この後よく洗浄し、乾燥してから重量を測定した。

結果を表３に示した。

表３ 以上の結果よりセルロースの水酸基の内約０．８チ程度
に置換基が導入されたと考えられた。

実施例３ 実施例１に記載した組成の培地４００１ｊｔ−５００ｄ
容の坂ロフラスコに張込み、１２０℃、３０分間滅菌し
た。これに、前記のアセトバクター・アセチ・サブスピ
ーシス・キシリナムＡＴＣＣ１０８２１を一白金耳ずつ
接種し、３０℃、２０日間振盪培養し、種母とした。

上記培地３５０ｄを５００１容の直径４ｃｒｎのガラス
製の気泡塔に無菌的に入れ、また５０ｄの種母をあわせ
て入れ通気量１１５　、　Ｖ、Ｖ、Ｍ、にて３０℃で２
週間培養したところゲル状セルロース性物質からなる直
径１００〜２００μｍの粒状Ｒレフトが得られる。

この粒状間レットを実施例１と同様の方法で洗浄後カチ
オン化処理を行った。

こうして調製したカチオン化粒状ベレン）ｋ充分址の蒸
留水中に懸濁して、１２０℃、２０分間加熱滅菌した。

滅菌したカチオン化粒状ベレットを遠心分離機を用いて
回収し、１０％仔牛脂児血清を含むＭＥＭ培地あるいは
、ゲルベツコ改変ＭＥＭ培地あるいはα−ＭＥＭ培地の
中に懸濁した。充分平衡化後、遠心分離機を用いてカチ
オン化粒状ベレットヲ集め、全容９０ｍ／のスピンナー
フラスコ当シ８×１０個を入れ、ｌＸ１０個のＬ　−９
２９細胞を懸濁した２０１の１０％仔牛脂児血清を含む
ＭＥＭあるいは１×１０個のＪ　−１１１細胞を懸濁し
た２０Ｔｎｌの１０％仔牛脂児血清を含むＭＥＭ培地あ
るいは、１×１０　個のＭ−ＭＳＶ−Ｂａｌｂ／３Ｔ３
細胞を懸濁した２０−の１０％仔牛脂児血清を含むゲル
ベツコ改変ＭＥＭ培地を入れ、３７℃の炭酸ガス存在下
、５日間１００　ｒｐｍで攪拌培養した。培養終了後、
一部のカチオン化粒状ベレット’ｔとって、光学顕微鏡
を用いて、粒状ペレット１個当り耐着している細胞数を
計測した。表４に結果を示した。

駄下余日 表　４　攪拌培養法を用いたカチオン化粒状ペレットの
評価 細胞基　　　　　　Ａ　　　　　Ｂ Ｌ−９２９２５Ｘ１０’　　　４．０Ｘ１０’Ｊ−１１
１１Ｊ３Ｘ１０’　　　２５Ｘ１０’Ｍ−ＭＳＶ−Ｂａ
ｌｂ／３Ｔ３　２３Ｘ１０’　　　３２Ｘ１０’人はサ
イトデックスー１（ファルマシア（株））をマイクロキ
ャリヤー使用マニュアル（ファルマシア（株）に従って
、６０ｒＩ９サイトデツクス−１を２０耐培養液中に懸
濁し、４Ｘ１０’個の細胞上播種した後５日培養後の細
胞数を示した。

Ｂはカチオン化粒状ベレットを使った場合を示した。

いずれもＩＷｉｌ中に含まれる粒子に付着している細胞
数で表わした。

実施例４ 実施例１によって得られた洗浄ゲル状膜を直径３０ｍの
円形状に切断し、充分量の蒸留水中で１２０℃、２０分
間加熱滅菌した。滅菌した洗浄ゲル状膜を少量のＮａＯ
Ｈ液で中性に合わせた後１ゴの仔牛脂児血清と８−のピ
トローグン・１００（コラーゲン社、米国）と１−の１
０倍濃縮ＭＥＭの混合液中（ホ）あるいは１ｄの仔牛脂
児血清と８１Ｌｌのビトロ−ｒン・１００（コラーゲン
社、米国）と１ｄの１０倍濃縮ゲルベツコ改変ＭＥＭ培
地の混合液中（へ）に入れ、４℃に一装置いた。こうし
てコラ−ダンで平衡化したゲル状膜を３０ＩＩＩ１１の
プラスチックシャーレ中に置き、３７℃、１０分間靜装
置てコラーゲンをゲル化させた。

このシャーレ（（ホ）のコラーゲン処理ゲル状膜）の中
に２Ｘ１０　個のＬ−９２９細胞を懸濁した４−の１０
チ仔牛脂児血清を含むＭＥＭ培地あるいは２　Ｘ　１０
５個のＪ−１１１細胞を懸濁した４Ｍの１０％仔牛脂児
血清を含むＭＥＭ培地、（へ）のコラーゲン処理ゲル状
膜を入れたシャーレの中に２　Ｘ　１０５個の３Ｔ３ス
イスアルピノ細胞を懸濁した４−の１０％仔牛脂児血清
を含むゲルベツコ改変ＭＥＭ培地あるいは２×１０　個
のＭ−ＭＳＶ−Ｂａ　ｌ　ｂ／３Ｔ３細胞を懸濁した４
ゴの１０’％仔牛脂児血清を含むゲルベツコ改変ＨＥＭ
培地を入れ、３７℃の炭酸ガスインキュベーターの中に
５日間静置培養した。

培養終了後、コラーゲン処理ゲル状膜をとシ出し、ホス
フェートパッファーセーラインで良＜　洗Ｓした後、０
．３％のトリプシン溶液４ｄ中で３７℃。

２０分間処理してからラバーポリスマンを使ってコラー
ゲン処理ゲル状膜表面から細胞をはがしとった。こうし
て得た細胞懸濁液中の生細胞数を、トリバンプルーの色
素排泄能力を指標とした方法を用いて測定した。表５に
結果を示した。

Ｌ　−９２９３ｆ＋Ｘ１０　０Ｊ３Ｘ１０　３．０Ｘ１
０６Ｊ−１１１２１Ｘ１０　０Ｂ刈０　２．ＯＸ１０６
Ｍ−ＭＳＶ−Ｂａｌｌｙ’３Ｔ３　２．６Ｘ１０　０Ｊ
３Ｘ１０　２．７Ｘ１０’３Ｔ３スイスアルピノ　　　
３４）ＸＩＯ０ＢＸ１０　　３２Ｘ１０’Ａは３０ｍの
プラスチックシャーレに生育した細胞数を示した。

Ｂは洗浄ゲル状膜を用いた場合を示した。

Ｃはコラーゲン処理した洗浄ゲル状膜上に生育した細胞
数を示した。

いずれも３０冑シャーレ当りの生細胞数で表わした。

以下余白 実施例５ 実施例１によって得られた。洗浄ゲル状膜２００ｇと水
２００ｇ及びＮａ０Ｔ（４ｇを混合し攪拌しつつ８０℃
で２時間放置した後、さらにこの混合液に２−臭化エチ
ルアミン・臭酸塩１０．９を３０分かけて加えて、８０
℃で６時間反応させた。反応終了後希塩酸でアルカリを
中和してから得られたアミノエチル化ゲル状膜を十分量
の水で水洗した。

実施例６ 実施例１によって得られた、洗浄ゲル状膜２００ｙと水
２００Ｉ及びＮａＯＨ３，５、！ｉ’を混合し攪拌しつ
つ８０℃で１時間放置させた後さらにこの混合液に２−
ジメチルアミノエチルクロライド・塩酸塩１５Ｆを４Ｑ
ｍＪの水とともに加え８０℃、６時間反応させた。反応
終了後希塩酸でアルカリを中和してから得られたジエチ
ルアミノエチル化ゲル状膜を十分量の水で水洗した。

実施例７ 実施例１によって得られた、洗浄ゲル状膜１００ｇと水
１００ｇ及びＮａＯＨ２ｇを混合し７０℃で１時間放置
した後にエピクロルヒドリン５１１を加え８０℃で５時
間放置した。反応後のゲル状膜を十分に洗浄した後に、
直径３０ｍの円盤状に切断し蒸留水中で１２０℃、２Ｑ
ｍｌｎ加熱滅菌した。

このゲル状膜に３ｍｌのビトロ−ｒン１００（コラーダ
ン社、米国）と水５ｒＪＬｌと１−の１０倍濃縮ＭＥＭ
を加え４０℃で一昼夜放置することによりコラーゲンを
ゲル状セルロース性膜に共有結合させた。

実施例８ 実施例１によって得られた１００Ｉの洗浄ゲル状膜を１
１の水に入れた。これを１０　ＮＮａＯＨでｐｔ＋１１
．５に調整した。臭化シアン２０ｇを徐々に加えつつ、
−が１１．５付近より下がらないように１０　ＮＮａＯ
Ｈを滴下した。反応は３０℃で１時間行なった。反応後
の活性化ゲルを、流水で３時間洗浄した。コラ−ダン５
００■を１０−の水にとかした溶液と活性化ゲルを２時
間２０℃で反応させた。この反応後、コラ−ダンと結合
したゲルを流水中でよくあらい、さらにＰＨ８０トリス
塩酸バツフアー中に２４ｈ室温で浸漬して過剰の臭化シ
アンをブロックした。この後トリス塩酸バッファーを流
水で洗いながした。

実施例９ 実施例１によって得られた洗浄ゲル状膜１００ｙと水１
００ｇ及びＮａＯＨ３９を混合し攪拌しつつ８０℃で１
時間放置した。次いで、この混合液に、水酸化ナトリウ
ムで−を１２．０にしたクロル酢酸の１％水溶液を１０
０−加え、９０℃で４時間反応させた。反応終了後希塩
酸でアルカリを中和してから得られたカルボキシメチル
化ゲル状膜を十分値の水で水洗した。

実施例１０ 実施例】で得られた洗浄ゲル状膜の毒性および発熱性物
質試験 実施例１によって得られた洗浄ゲル状膜１００ｙを９０
０ｍｌの生理食塩水中に３７℃で２４時間浸漬した。浸
漬後の液を試験液として以下の試旅を実施した。なお、
コントロールとして、洗浄ゲル状膜を浸漬する前の生理
食塩水金用いた。

■急性毒性試験 １８〜２１ｇのマウス１０匹に試験液ｔｌ−５０畔／ゆ
静脈注射して１日ごとに５日間の体重の変化を観察した
がコントロールと有意な差は認められなかった。

■発熱性物質試験 １．７〜１．９１Ｋｇのウサギ３匹に試験液を１０ｍＡ
！／ｋｙ静脈注射し、１時間間隔で３回体温を測定した
が体温の上昇は認められなかった。

■エンドトキシンの定量試験 比色法エンドトキシン定量試鱗薬パイｏ７’インク（生
化学工業（株））を用いて試験液中のエンドトキシンを
定量したが検出されなかった。

実施例１１ 実施例１，４，５．６，７，８．９で得られたゲル状膜
を用いた細胞培養 実施例１，４，５，６，７．８．９で得たデル状膜を各
々直径３０聾の円形状に切断し、充分量の蒸留水中で１
２００，２０分間加熱滅菌あるいはＵＶ滅菌した。滅菌
したゲル状膜金１０矛仔牛胎児血清を含むＭＥＭ培地の
中で充分平衡化後、直径３０ｍのプラスチックシャーレ
の中に置いた。

このシャーレの中に２×１０個のＬ−９２９細胞を懸濁
した４−の１０％仔牛脂児血清を含むＭＥＭ培地を入れ
、３７℃の炭酸ガスインキュベーターの中で５日間静置
培養した。培養終了後、ゲル状膜をとり出し、ホスフェ
ートパッファーセーラインで良く洗滌した後、０．３チ
のトリジシン溶液４ｄ中で３７℃、２０分間処理してか
らラバーポリスマンを使ってカチオン化ゲル状膜表面か
ら細胞をはがしとった。こうして得た細胞懸濁液中の生
細胞数を、トリ・９ノブルーの色素排泄能力を指標とし
た方法を用いて測定した。表６に結果を示した。

以下余日 表６　各種処理を施し九ゲル状膜を 用いたＬ−９２９細胞の培養 ゲル状膜処理方法　　　　　　　細胞数０無　処　理（
洗浄ゲル状膜）　　　０．８Ｘ１０５コラ−ｒノ処理（
実施例４）　　　３．０Ｘ１０６コラーグン架橋（実施
例７）　　　２．８刈０６カチオン化　　（実施例１　
）　　　３．２ｘ１０’アミノエテル化（実施例５）　
　　２．５Ｘ１０’ＤＥＡＥ化　　　（実施例６）　　
　３．０Ｘ１０’カルメキシメチル化（実施例９）　　
　　２．６Ｘ１０６コラーｒノ架橋（実施例８）　　　
３．０Ｘ１０’カチオン化＋コラーゲン処理”　　　　
３．０ｘ１０６申　細胞数は３０園のゲル状膜１枚当り
から回収された生細胞数で示した。

ｍ−実施例１で得たカチオン化デル状膜を実施例３の方
法でコラ−ダン処理をして得た。

実施例１２ 実施例１および４に示した方法に従って洗浄ゲル状膜、
カチオン化ゲル状膜、カチオン化した後コラ−モノ処理
したゲル状膜を無菌的に得た。各各のゲル膜を直径２ｍ
の円形状に整形し、６週令、体重２５ＯＮの雄のＳＤラ
ットの背部の体毛を取り除いたうえ１〜２ｃの円形状の
表皮部分をカミソリの刃で表面より平均的０．５〜１日
の深さに実験的につくった皮膚損傷部に外科手術用糸を
使ってぬいつけ、更にガーゼで固定した。１０日後に損
傷部における皮膚再生度をしらべたところいずれのゲル
状膜を用いた場合も、対照として用いたワセリンガーゼ
に比べて良好でありたが特にカチオン化ゲル状膜及びカ
チオン化後コラーダン処理したゲル状膜を用いた場合に
損傷部組織との接着が良好であった。ゲル状膜は２０日
後に皮膚表面から脱落した。

実施例１３ 無菌処理をほどこした洗浄ゲル状膜、カチオン化ゲル状
膜（実施例１）及び実施例４の方法でコラ−ダン処理し
たカチオン化ゲル状膜を各々直径３０−の円形状に切断
し、１０％仔牛脂児血清を含むゲルベツコ改変ＭＥＭ培
地の中で充分平衡化後、直径３０ｍのプラスチックシャ
ーレの中に置いた。

このシャーレの中に３．５Ｘ１０　個の８０００レント
ゲンのガンマ−線を照射したマウス３Ｔ３細胞を懸濁し
た２１１Ｌｔの１０チ仔牛脂児血清を含むゲルベツコ改
変ＭＥＭ培地を入れ、３７℃の炭酸ガスインキュベータ
の中に６時間静置した。培地を除いてから、グリーンら
の方法（）・ワード・グリーン、オラニー・ケヒンデＰ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ
１９７９；７９，５６６５〜８）に従って培養した２×
１０５個のヒト表皮ケラチノサイト細胞を懸濁した２面
の１０％仔牛脂児血清を含むゲルベツコ改変ＭＥＭ培地
を主成分としたヒト表皮ケラチノサイト用培地（グリー
ンらの方法に従って調製した）を入れ、３７℃の炭酸ガ
スインキエイ−ター中で５日間培養した。培養終了後ゲ
ル状膜上に増殖したヒト表皮ケラテノサイト細胞の数を
顕微境を用いて測定した。表７に結果を示した。

以下亦白 表７　ゲル状膜を用いたヒト表皮 ケラチノサイト細胞の培養 ゲル状膜　　　　　　　　　細　胞　数洗浄ゲル状［０
，５Ｘ１０’（０，２Ｘ１０’）”カチオン化ゲル状膜
　　　　１．２Ｘ１０　（０，２Ｘ１０　）カチオン化
＋コラーゲン処理　　２．５Ｘ１０　（１，０Ｘ１０　
　）ゲル状膜 中カッコ内はガンマ−線照射したマウス３Ｔ３細胞を付
着させず、ゲル状膜をそのまま用いてヒト表皮ケラチノ
サイト細胞を培養したときに得られた細胞数を示した。

上記のように５日間の培養で細胞を央部的に単層に増殖
させた後、さらに培養を続けたところ１０日後の顕微鏡
観察で明瞭な重層化が観察された。

実施例１４ 無菌処理をほどこした洗浄ゲル状膜、カチオン化ゲル状
膜（実施例１）および実施例４の方法でコラーゲン処理
したカチオン化ゲル状膜を各々直径３０■の円形状に切
断しゲルベツコ改変ＭＥＭ培地の中で充分平衡化後直径
３０５ｍのプラスチックシャーレの中に置いた。このシ
ャーレの中に２×１０５ないし４Ｘ１０６個のヒト底皮
ケラチノサイト細胞を懸濁した２ｄの１０％仔牛脂児血
清を含むゲルベツコ改変ＭＥＭ培地を主成分としたヒト
表皮ケラナノサイト用培地（グリーンらの方法（ハワー
ド、グリーン、第２ニー・ケヒンデＰｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　１９７９
　：　７９　’。

５６６５〜８）に従って調製した）を入れた。

３７℃の炭酸ガスインキエイ−ター中に６時間静置し、
ヒト表皮ケラチノサイト細胞をゲル状膜に付着させた。

ゲル状膜上に付着しているヒト表皮ケラチノサイト細胞
の数を顕微鏡ヲ用いて測定した。表８に結果を示した。

以下余白 表８　ヒト表皮ケラチノサイト 細胞のゲル状膜への付着 申付濁液として入れた細胞の個数 実施例１５ 実施例６で得られたジエチルアミノエチル化ゲル状１１
０．５％アルギン酸ナトリウム水溶液に５０℃で３時間
浸漬することによりアルギン酸ナトリウムｔよくしみこ
ませた後に、表面を軽く水洗して過剰のアルギンばを除
いてから、０．１Ｍの塩化カルシウム水浴液中に常温で
３０分間浸漬させることによりノエテルアミノエチル化
ケ９ル状腹中のアルギン酸す）　ＩＪウムの一部をゲル
化させた。

このものを′ｖＣ浄後、実施例１１と同様の方法で動物
細胞の培養を行ったところ、表面に生育した生細胞数は
３．０Ｘ１０６個であった。

また、アルギン酸ナトリウムをしみこませてからゲル化
させたジエチルアミノエチル化ゲル状膜とアルギン酸ナ
トリウム金しみこませなかったゲル状膜および、０．５
％アルギン駿ナナトリウム溶液０，１Ｍ塩化カルシウム
水溶液中でゲル化させたアルギン酸カルシウムデルの３
者のｒル強度全レオメータ−で測定した。表９に結果を
示した。

表９ ゲル強度（１／ａｎ　） アルギン酸ナトリウムをしみ　　　　　　　３５０こま
せてからゲル化させたゾ エチルアミノエチル化ゲル状膜 ジエチルアミノエチル化ゲル状膜　　　　　　２９０ア
ルギン酸カルシウムのゲル　　　　　　　　４０以上の
ようにジエチルアミノエチル化ゲル状膜にアルギン酸を
しみこませてゲル化させることにより、動物細胞培養に
は影響を与えずに、補強効果が得られることがわかった
。

実施例１６ 実施例１で得られたカチオン化ゲル状膜を７％ポリビニ
ルアルコール水溶液（平均重合度２０００　）の溶液中
に３０℃で２４時間浸漬することによりポリビニルアル
コールをよくしみこませた。次いで、表面を軽く水洗し
て過剰のポリビニルアルコールを除いてから一２０℃の
雰囲気中に１時間静置してから常温に戻し、ポリビニル
アルコールの一部をゲル化させた。このものを室温で洗
浄後、りた。

また、ポリビニルアルコールをしみこませてからゲル化
させたカチオン化ゲル状膜と、しみこませなかったカチ
オン化ゲル状膜および７％のポリビニルアルコール溶液
のみを一４０℃の雰囲気中に１時間静置してから常温に
戻して得られるポリビニルアルコールゲルの３者のゲル
強度をレオメータで測定した。表１０に結果を示した。

表１０ みこませてからデル化させ たカチオン化ゲル状膜 カチオン化ゲル状膜　　　　　２８５ ホリビニルアルコールのゲル　　　　　　　　２５以上
のようにカチオン化ゲル状膜にポリビニルア、ルコール
をしみこませてゲル化させることにより、動物細胞培養
には影響を与えずに、補強効果が得られることがわかっ
た。

実施例１７ 実施例１５及び実施例１６においてゲル強度を比較した
合計６種類のものについて、ゲル中の液体成分の滲出量
を測定した。それぞれのゲルケ２枚のｐ紙の間にはさん
で１０９／ａｎ　の圧力全１０分間加えた後参出液の割
合を測定した。結果を表１１に示した。

表１１ 対する割合（％） アルギン酸ナトリウムをしみこ　　　　　　１５ませて
からゲル化させたジエチ ルアミノエチル化ゲル状膜 ジエチルアミノエチル化ゲル状膜　　　　　　　７５ア
ルギン酸カルシウムゲル　　　　　２゜ポリビニルアル
コールをしみこ　　　　　　２５ませてからゲル化させ
たカチオ ン化ゲル状膜 カチオン化ゲル状膜　　　　　　　　７２ホリビニルア
ルコールのゲル　　　　　３３表１１にみられるとおり
、アルギン酸やポリビニルアルコール等を本発明の微生
物産生セルロースを化学修飾して得られるゲル状膜にし
みこませることにより、液体成分の滲出を防止できた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、微生物産生セルロースのゲルであって、該セルロー
   スに動物細胞接着性蛋白質が物理的もしくは化学的に結
   合しており、および／または、該セルロースの少くとも
   一部の水酸基中の水素原子が正または負に荷電した有機
   基で置換されていることを特徴とする修飾された微生物
   産生セルロースのゲル。 ２、正に荷電した有機基が下式〔１〕または〔２〕：▲
   数式、化学式、表等があります▼〔１〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔２〕 （式〔１〕及び式〔２〕のｎは０〜８の整数であり、Ｒ
   ＿１〜Ｒ＿３は水素原子又はアルキル、アリール、アラ
   ルキル、アルカリール、シクロアルキル、アルコキシア
   ルキル基である。但し、Ｒ＿１、Ｒ＿２、Ｒ＿３が同時
   に水素原子を表わすことはない。）で表わされる特許請
   求の範囲第１項記載の修飾された微生物産生セルロース
   のゲル。 ３、負に荷電した有機基がカルボキシメチル基、カルボ
   キシエチル基、リン酸基および硫酸基の中から選ばれる
   特許請求の範囲第１項記載の修飾された微生物産生セル
   ロースのゲル。 ４、動物細胞接着性蛋白質がコラーゲン、フィブロネク
   チン、ラミニン及びゼラチンより成る群より選ばれる特
   許請求の範囲第１項記載の修飾された微生物産生セルロ
   ースのゲル。 ５、化学的結合がエピハロヒドリンまたはハロゲン化シ
   アンを介した架橋である特許請求の範囲第１項記載の修
   飾された微生物産生セルロースのゲル。 ６、酵素、制菌剤、抗菌剤、化学療法剤、凝固剤及び抗
   凝固剤より成る群より選ばれる少くとも一種の薬剤が化
   学的または物理的に結合している特許請求の範囲第１項
   から第５項までのいずれかに記載の修飾された微生物産
   生セルロースのゲル。 ７、補助材料が複合化されている特許請求の範囲第１項
   から第６項までのいずれかに記載の修飾された微生物産
   生セルロースのゲル。 ８、微生物産生セルロースのゲルであって、該セルロー
   スに動物細胞接着性蛋白質が物理的もしくは化学的に結
   合しており、および／または、該セルロースの少くとも
   一部の水酸基中の水素原子が正または負に荷電した有機
   基で置換されている修飾された微生物産生セルロースの
   ゲルに、動物細胞が結合または吸着していることを特徴
   とする修飾された微生物産生セルロースゲルの複合体。 ９、正に荷電した有機基が下式〔１〕または〔２〕：▲
   数式、化学式、表等があります▼〔１〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔２〕 （式〔１〕及び式〔２〕のｎは０〜８の整数であり、Ｒ
   ＿１〜Ｒ＿３は水素原子又はアルキル、アリール、アラ
   ルキル、アルカリール、シクロアルキル、アルコキシア
   ルキル基である。但し、Ｒ＿１、Ｒ＿２、Ｒ＿３が同時
   に水素原子を表わすことはない。）で表わされる特許請
   求の範囲第８項記載の複合体。 １０、負に荷電した有機基がカルボキシメチル基、カル
   ボキシエチル基、リン酸基および硫酸基の中から選ばれ
   る特許請求の範囲第８項記載の複合体。 １１、動物細胞接着性蛋白質がコラーゲン、フィブロネ
   クチン、ラミニン及びゼラチンより成る群より選ばれる
   特許請求の範囲第８項記載の複合体。 １２、化学結合がエピハロヒドリンまたはハロゲン化シ
   アンを介した架橋である特許請求の範囲第８項記載の複
   合体。 １３、酵素、制菌剤、抗菌剤、化学療法剤、凝固剤及び
   抗凝固剤より成る群より選ばれる少くとも一種の薬剤が
   化学的または物理的に結合している特許請求の範囲第８
   項から第１２項までのいずれかに記載の複合体。 １４、さらに補助材料が、修飾された微生物産生セルロ
   ースゲルに複合化されている特許請求の範囲第８項から
   第１３項までのいずれかに記載の複合体。 １５、結合または吸着している動物細胞が接着依存性動
   物細胞である特許請求の範囲第８項から第１４項までの
   いずれかに記載の複合体。 １６、結合または吸着している動物細胞が接着非依存性
   動物細胞である特許請求の範囲第８項から第１４項まで
   のいずれかに記載の複合体。 １７、接着依存性動物細胞がヒト表皮細胞である特許請
   求の範囲第１５項に記載の複合体。 １８、ヒト表皮細胞が、修飾された微生物産生セルロー
   スゲル上に実質的に単層状態で培養されている特許請求
   の範囲第１７項記載の複合体。 １９、微生物産生セルロースのゲルに動物細胞が結合ま
   たは吸着していることを特徴とする微生物産生セルロー
   スゲルの複合体。 ２０、酵素、制菌剤、抗菌剤、化学療法剤、凝固剤及び
   抗凝固剤より成る群より選ばれる少くとも一種の薬剤が
   化学的または物理的に結合している特許請求の範囲第１
   ９項記載の複合体。 ２１、さらに補助材料が、修飾された微生物産生セルロ
   ースゲルに複合化されている特許請求の範囲第１９項ま
   たは第２０項に記載の複合体。 ２２、結合または吸着している動物細胞が接着依存性動
   物細胞である特許請求の範囲第１９項から第２１項まで
   のいずれかに記載の複合体。 ２３、結合または吸着している動物細胞が接着非依存性
   動物細胞である特許請求の範囲第１９項から第２１項ま
   でのいずれかに記載の複合体。 ２４、接着依存性動物細胞がヒト表皮細胞である特許請
   求の範囲第２２項に記載の複合体。 ２５、ヒト表皮細胞が、修飾された微生物産生セルロー
   スゲル上に実質的に単層状態で培養されている特許請求
   の範囲第２４項記載の複合体。