CN110507848B - 载酶细菌纤维素基复合抗菌水凝胶敷料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种载酶细菌纤维素基复合抗菌水凝胶敷料及其制备方法，所述水凝胶层是通过自由基聚合在细菌纤维素的骨架结构中引入聚合物聚N‑异丙基丙烯酰胺，以形成互穿双网络结构，并以此为载体负载生物抗菌剂，从而得到获得具有高效保湿抗菌功能的“理想”医用创伤水凝胶敷料。本发明得到的水凝胶敷料产品溶胀性及力学性能好，透明度较高，其硅胶层起到防水透气的作用，能使创面周围和创面区保持封闭的湿润环境；同时水凝胶层对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有良好的杀菌抗菌性，有利于抵御伤口感染，促进伤口愈合，且骨架材料细菌纤维原料来源广泛，价格低廉，组织相容性好而抗原性弱，不会引起异物、炎症和排斥反应，具有良好的医学应用前景。

Description

载酶细菌纤维素基复合抗菌水凝胶敷料及其制备方法
技术领域
本发明属生物医用水凝胶的制备和应用领域，特别是涉及一种具有抗菌功能的载酶细菌纤维素基复合水凝胶及其制备。
背景技术
水凝胶医用敷料是近年来发展起来的一种新型创伤敷料，主要由高分子聚合物吸水溶胀后形成一种具有三维立体网状结构的胶状物质构成，其含水量可高达96%，可保持创面的湿润环境。细菌纤维素（BC）作为纳米级纤维材料，具有良好的生物相容性、湿态时高的机械强度、良好的液体和气体透过性，有利于皮肤组织生长并能限制感染，可作为一种临时皮肤代用品和有应用潜力的生物敷料。
查询国家食品药品监督管理总局的医疗器械产品数据库，国内的含纤维素的医疗器械产品均为羟丙基纤维素产品，因此目前国内尚没有细菌纤维素膜类的医疗器械产品上市。同时在国内，目前没有抗MRSA的创伤水凝胶敷料文章发表，同样也没有相关专利。项目前期研究中，搜索有关创伤水凝胶敷料的国内授权专利发现48篇，大部分是没有抑菌作用，和本项目相关的大致有6篇。专利“一种磺胺嘧啶银/细菌纤维素复合伤口敷料的制备方法”（CN101905031）将细菌纤维素膜与磺胺嘧啶银混悬液进行反应得到磺胺嘧啶银/细菌纤维素复合膜，用于预防和治疗II度、III度烧伤或者烫伤继发的创面感染。专利“一种含银纳米粒子的细菌纤维素膜及其制备方法”（CN102206355）将细菌纤维素膜在室温下浸入银盐溶液中浸泡，然后采用紫外照射方法照射，获得含银纳米粒子的细菌纤维素湿膜。专利“细菌纤维素/透明质酸复合材料的制备方法”（CN102212208）将其细菌纤维素置于透明质酸溶液中浸渍，再碳化二亚胺作用下纤维素分子与透明质酸发生交联，形成细菌纤维素/透明质酸复合材料。专利“一种细菌纤维素复合敷料”（CN103480028）将能分泌细菌纤维素的菌株种子醪液均匀滴加在经灭菌处理的无纺布或织造布上，加入发酵培养基，发酵产物即为细菌纤维素复合无纺布或织造布敷料。专利“一种多聚糖与纳米细菌纤维素的复合伤口敷料的制备方法”（CN102727926）将纳米细菌纤维素膜脱去部分水分后与多聚糖溶液通过浸泡、流延或喷涂得方法进行复合，得到多聚糖/纳米细菌纤维素复合膜。专利“一种细菌纤维素/聚乙烯醇复合水凝胶的制备方法”（CN103044693）采用浸渍法使聚乙烯醇进入细菌纤维素水凝胶内部，然后冷冻-解冻数次得到细菌纤维素/聚乙烯醇复合水凝胶。
上述敷料普遍存在各种缺点，例如不能有效杀灭引起创面感染的病原菌，或者不能有效控制和吸收创面渗液，尤其是载溶葡萄球菌酶酶纱布在临床使用时存在保湿性较差，使用不方便等缺点等。因此，开发一种既能有效杀菌，特别是耐药性金黄色葡萄球菌（MRSA），同时又能有效的控制和吸收创面渗液，保护新生组织、加速创面愈合的外用创伤敷料显得非常迫切。近年来，生物酶及多肽类物质因其能直接裂解细菌的独特杀菌机制得到了越来越多的重视，其中溶葡萄球菌酶就是一种能直接裂解并杀灭MRSA的生物酶，并且不易产生耐药性，非常适合用于局部抗感染，将其与聚N-异丙基丙烯酰胺等复合后填充入含细菌纤维素纳米纤维形成的支架中，形成物理交联的三维结构，最终开发成为抗细菌感染尤其是MRSA感染的新型创伤水凝胶敷料。由于物理交联的方法条件温和同时不加入含有毒性的交联剂，也有利于酶活性的保持，同时水性环境更有利于复合酶抑杀菌作用很好的发挥。该敷料有望成为具有高吸水性、保水性、良好的透气性、生物亲和性、顺应性、自粘接性、生物降解性以及抗菌作用尤其是抗MRSA的新型创伤水凝胶敷料。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种用于治疗烧伤、烫伤创面、皮肤移植及慢性皮肤溃疡等皮肤伤病的载酶医用水凝胶敷料及其制备方法，所述水凝胶利用细菌纤维素天然的纳米三维网络结构，在其骨架中引入聚N-异丙基丙烯酰胺网络，制备出机械性能更优的互穿双网络水凝胶，并以此为载体负载生物抗菌剂，从而得到获得具有高效保湿抗菌功能的“理想”医用创伤水凝胶敷料。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种载酶细菌纤维素基复合抗菌水凝胶敷料，利用细菌纤维素天然的纳米三维网络结构，在其骨架中引入聚N-异丙基丙烯酰胺网络，制备出机械性能更优的互穿双网络水凝胶，并以此为载体负载生物抗菌剂，从而获得具有高效保湿抗菌功能的载酶细菌纤维素基复合抗菌水凝胶敷料。
所述的载酶细菌纤维素基复合抗菌水凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备细菌纤维素水凝胶；
（2）将步骤（1）得到的细菌纤维素水凝胶机械除水，使其厚度为原来的1/5，再在膜上滴加一定量生物抗菌剂水溶液，4℃冷藏放置12h，使其达到吸附平衡得到载酶细菌纤维素水凝胶；
（3）在去离子水中通氮气 3 小时以上以除去其中溶解的氧气，将N-异丙基丙烯胺（NIPA）与无机粘土（Clay）溶解于除氧去离子水中，在冰水浴中搅拌至溶液澄清；
（4）将步骤（2）中得到的载酶细菌纤维素水凝胶渍于步骤（3）得到的澄清溶液中，并于4℃冰箱中放置24h，使其达到吸附平衡；
（5）将步骤（4）得到的水凝胶取出并用蒸馏水反复冲洗，以去除表面吸附的物质，再将水凝胶放入40℃的恒温水浴中反应6h，进行原位自由基聚合反应，聚合完成后，得到载酶细菌纤维素基复合抗菌水凝胶敷料。
进一步，所述步骤（1）细菌纤维素水凝胶的制备方法如下：取活化好的木醋杆菌1.1812菌株接入种子培养基，再取出一定量培养好的种子接入灭菌后发酵培养基中，接种时需充分振荡，使菌株分离出来并充分分散在发酵培养基中，32℃恒温静置培养8天得到具有一定厚度的细菌纤维素水凝胶。
进一步，细菌纤维素水凝胶的制备方法如下：取活化好的木醋杆菌1.1812菌株接入种子培养基，32℃振荡培养24h，摇床转速为150rpm，再取出10mL培养好的种子接入200mL灭菌后发酵培养基中，32℃恒温静置培养8天得到具有一定厚度的细菌纤维素水凝胶，将生成的细菌纤维素水凝胶取出后，用去离子水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质，再将膜浸泡于1%的NaOH溶液，煮沸6h，去除液膜中的菌体和残留培养基，然后用去离子水多次冲洗并平衡至中性。
进一步，所用的发酵培养基碳源选自葡萄糖、麦芽糖、蔗糖其中的一种或几种，碳源占培养基溶液的质量分数为2%~10%。
进一步，所述步骤（2）中的生物抗菌剂为溶菌酶或溶葡萄球菌酶中的一种或二者组成的复合酶溶液，酶用量为10U/g~1000 U/g。
进一步，所述步骤（3）中N-异丙基丙烯酰胺与无机粘土的投料比为6:1~6:7。
进一步，在所述载酶细菌纤维素基复合抗菌水凝胶敷料上表面还设有具有防水透气功能的硅胶保护膜。
进一步，所述硅胶保护膜采用厚度为0.02-0.1mm的有机硅氧烷薄膜。
进一步，将载酶细菌纤维素基复合抗菌水凝胶敷料与硅胶保护膜之间贴合后进行包装灭菌，即得到最终产品。
本发明的医用水凝胶敷料产品在水凝胶层上表面还设有具有防水透气功能的硅胶保护膜，所述的硅胶保护膜可采用商业化产品，如深圳杜道联合化工有限公司的以硅橡胶为原料通过模压、压延、流延等工艺成型的一种厚度为0.02-0.1mm的有机硅氧烷薄膜，该产品通过美国FDA和欧盟CE认证，无毒，生理惰性，耐生物老化，对人体组织无刺激排斥反应，在食品、药品及医疗领域具有良好的食用和扩展前景。该硅胶层主要起到防水透气的作用，从而使创面周围和创面区保持封闭的湿润环境。
本发明所述的载酶医用水凝胶敷料产品将复合水凝胶层与硅胶保护膜之间贴合后进行包装灭菌，即得到最终产品。
本发明的有益效果：（1）本发明的载酶复合水凝胶层中含有有效抑杀菌成分，包括溶菌酶、溶葡萄球菌酶或二者组成的复合酶，具有独特的双重破壁生物杀菌机理，不易产生耐药性，而且杀菌的同时不损伤组织细胞，对人体及环境无任何影响。
（2）聚N-异丙基丙烯酰胺为温敏性水凝胶，具有较低临界溶解温度（LCST≈32°C），当温度低于其LCST时，水凝胶具有较高的溶胀度；而当温度在LCST以上时，水凝胶会剧烈收缩，溶胀程度突然减少，基于这种特性在药物的控制释放、酶的固定化等方面有着诱人的应用前景。另外，在其合成过程中选用无机粘土进行物理交，在整个反应过程中没有用到任何化学试剂，从而避免化学残留对酶活的影响以及对皮肤的刺激。
（3）本发明的制备方法操作简单，成本低，对环境友好，经济效益高。
附图说明
图1为载酶复合水凝胶制备路线图；
图2为载酶复合水凝胶微观形貌图；
图3为载酶复合水凝胶的机械性能曲线；
图4 为溶葡萄球菌酶体外释放曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
本实施例的载酶细菌纤维素基复合抗菌水凝胶敷料的制备方法如下：
（1）取活化好的木醋杆菌1.1812菌株接入种子培养基，32℃振荡培养24h，摇床转速为150rpm。再取出10mL培养好的种子接入200mL灭菌后发酵培养基中（盛装在500mL的锥形瓶中），接种时需充分振荡，使菌株分离出来并充分分散在发酵培养基中，32℃恒温静置培养8天得到具有一定厚度的BC水凝胶。将生成的BC取出后，用去离子水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质。再将膜浸泡于1%的NaOH溶液，煮沸6h，去除液膜中的菌体和残留培养基，然后用去离子水多次冲洗并平衡至中性。
（2）将上述步骤得到的BC水凝胶机械除水，使其厚度为原来的1/5，再在膜上滴加一定量溶菌酶水溶液，使复合水凝胶中溶葡萄球菌酶的含量为100U/g，4℃冷藏放置12h，使其达到吸附平衡。
（3）在50 ml去离子水中通氮气3 小时以上以除去其中溶解的氧气，N将6 gN-异丙基丙烯胺与1g无机粘土溶解于除氧去离子水中，在冰水浴中搅拌至溶液澄清。
（4）将步骤（2）中得到的载酶BC膜渍于步骤（3）得到的澄清溶液中，并于4℃冰箱中放置24h，使其达到吸附平衡。
（5）将步骤（4）得到的水凝胶取出并用蒸馏水反复冲洗，以去除表面吸附的物质，再将水凝胶放入40 °C的恒温水浴中反应6h，进行原位自由基聚合反应。聚合完成后，即得到的载酶复合水凝胶BC/NC1。
实施例2
本实施例的载酶细菌纤维素基复合抗菌水凝胶敷料的制备方法如下：
（1）取活化好的木醋杆菌1.1812菌株接入种子培养基，32℃振荡培养24h，摇床转速为150rpm。再取出10mL培养好的种子接入200mL灭菌后发酵培养基中（盛装在500mL的锥形瓶中），接种时需充分振荡，使菌株分离出来并充分分散在发酵培养基中，32℃恒温静置培养8天得到具有一定厚度的BC薄膜。将生成的BC取出后，用去离子水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质。再将膜浸泡于1%的NaOH溶液，煮沸6h，去除液膜中的菌体和残留培养基，然后用去离子水多次冲洗并平衡至中性。
（2）将上述步骤得到的BC膜机械除水，使其厚度为原来的1/5，再在膜上滴加一定量溶葡萄球菌酶水溶液，使复合水凝胶中溶葡萄球菌酶的含量为100U/g， 4℃冷藏放置12h，使其达到吸附平衡。
（3）在50 ml去离子水中通氮气3 小时以上以除去其中溶解的氧气，N将6 gN-异丙基丙烯胺与3g无机粘土溶解于除氧去离子水中，在冰水浴中搅拌至溶液澄清。
（4）将步骤（2）中得到的载酶BC膜渍于步骤（3）得到的澄清溶液中，并于4℃冰箱中放置24h，使其达到吸附平衡；
（5）将步骤（4）得到的膜片取出并用蒸馏水反复冲洗，以去除表面吸附的物质，再将膜片放入40℃的恒温水浴中反应6h，进行原位自由基聚合反应。聚合完成后，即得到的载酶复合水凝胶BC/NC3。
实施例3
本实施例的载酶细菌纤维素基复合抗菌水凝胶敷料的制备方法如下：
（1）取活化好的木醋杆菌1.1812菌株接入种子培养基，32℃振荡培养24h，摇床转速为150rpm。再取出10mL培养好的种子接入200mL灭菌后发酵培养基中（盛装在500mL的锥形瓶中），接种时需充分振荡，使菌株分离出来并充分分散在发酵培养基中，32℃恒温静置培养8天得到具有一定厚度的BC薄膜。将生成的BC取出后，用去离子水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质。再将膜浸泡于1%的NaOH溶液，煮沸6h，去除液膜中的菌体和残留培养基，然后用去离子水多次冲洗并平衡至中性。
（2）将上述步骤得到的BC膜机械除水，使其厚度为原来的1/5，，再在膜上滴加一定量溶菌酶与溶葡萄球菌酶组成的复合酶水溶液，使复合水凝胶中溶葡萄球菌酶的含量为100U/g， 4℃冷藏放置12h，使其达到吸附平衡。
（3）在50 ml去离子水中通氮气3 小时以上以除去其中溶解的氧气，N将6 gN-异丙基丙烯胺与5g无机粘土溶解于除氧去离子水中，在冰水浴中搅拌至溶液澄清。
（4）将步骤（2）中得到的载酶BC膜渍于步骤（3）得到的澄清溶液中，并于4℃冰箱中放置24h，使其达到吸附平衡。
（5）将步骤（4）得到的膜片取出并用蒸馏水反复冲洗，以去除表面吸附的物质，再将膜片放入40℃的恒温水浴中反应6h，进行原位自由基聚合反应。聚合完成后，即得到的载酶复合水凝胶BC/NC5。
实施例4
本实施例的载酶细菌纤维素基复合抗菌水凝胶敷料的制备方法如下：
（1）取活化好的木醋杆菌1.1812菌株接入种子培养基，32℃振荡培养24h，摇床转速为150rpm。再取出10mL培养好的种子接入200mL灭菌后发酵培养基中（盛装在500mL的锥形瓶中），接种时需充分振荡，使菌株分离出来并充分分散在发酵培养基中，32℃恒温静置培养8天得到具有一定厚度的BC薄膜。将生成的BC取出后，用去离子水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质。再将膜浸泡于1%的NaOH溶液，煮沸6h，去除液膜中的菌体和残留培养基，然后用去离子水多次冲洗并平衡至中性。
（2）将上述步骤得到的BC膜机械除水，使其厚度为原来的1/5，再在膜上滴加一定量溶葡萄球菌酶水溶液，使复合水凝胶中溶葡萄球菌酶的含量为100U/g， 4℃冷藏放置12h，使其达到吸附平衡。
（3）在50 ml去离子水中通氮气3 小时以上以除去其中溶解的氧气，N将6 gN-异丙基丙烯胺与7g无机粘土溶解于除氧去离子水中，在冰水浴中搅拌至溶液澄清。
（4）将步骤（2）中得到的载酶BC膜渍于步骤（3）得到的澄清溶液中，并于4℃冰箱中放置24h，使其达到吸附平衡；
（5）将步骤（4）得到的膜片取出并用蒸馏水反复冲洗，以去除表面吸附的物质，再将膜片放入40℃的恒温水浴中反应6h，进行原位自由基聚合反应。聚合完成后，即得到的载酶复合水凝胶BC/NC7。
实施例5
载酶复合水凝胶力学性能、体外释放及抑杀菌检测实验
力学性能实验：
将复合水凝胶膜剪成宽15 mm、长30 mm的长方形试样，在每个样品上的五个位置处使用精密电子厚度仪测量其厚度，取平均值。室温条件下，在Instron1122万能材料试验机上进行拉伸测试，测得应力-应变关系进而得到拉伸强度、弹性模量和断裂伸长率。其中拉伸速率为15 mm/min，每组试样不低于5个。
单体浓度对复合水凝胶机械性能能的影响。从图3中可以看出，随着单体浓度的增加，复合水凝胶的机械性能呈明显提升趋势。复合水凝胶的应力应变曲线的斜率随着单体浓度的增加而逐步加大，故杨氏模量呈增高趋势，由右图可知，拉伸断裂应力基本随单体浓度加大而上升；拉伸断裂应变呈略微下降趋势；当单体浓度达到7mol/l时，杨氏模量由BC的4.7Mpa提升到6.0Mpa，提升了近30%。这是由于加入单体后形成的网络复合材料结构内部纤维相互贯穿缠结，结构较纯BC更加紧凑，材料更不容易发生形变，使得复合水凝胶的抗拉强度及硬度提高，而断裂伸长率略有减低，机械性能得到一定程度的提升。
体外释放实验：
溶葡萄球菌酶从复合水凝胶中的释放试验在PBS(pH 7.4)介质中进行，摇床（90rpm），37℃。将适量水凝胶浸没在15mlPBS中，定时从介质中取出1ml样品，并补充同量的新鲜PBS，测定溶葡萄球菌酶酶活，并计算累积释放率。
对载酶水凝胶体外释放的研究发现，如图4所示，复合水凝胶载酶后可以很好的控制溶葡萄球菌酶的缓慢释放，因此载酶复合水凝胶会为伤口持续提供保护环境而不会因为药物局部浓度过高产生不良反应。另外，酶的释放速率主要取决于复合水凝胶中第二组分的浓度，在纯BC水凝胶中，300min内约有63%的溶葡萄球菌酶释放出来，而第二组分浓度的增加，酶的释放量随之降低，300min后的释放量分别约为55%、45%和40%，这个释放量仍能够满足抑制金黄色葡萄球菌滋生的目的。
抑杀菌实验：
将浸有菌液的滤纸片与含有溶葡萄球菌酶浓度的复合水凝胶孵育不同时间后，将滤纸片用无菌生理盐水洗脱，将洗下的菌液稀释后，计数并计算杀菌率，结果如下表所示。
Figure 234463DEST_PATH_IMAGE002
从表中数据看出，随着载酶复合水凝胶与金黄色葡萄球菌接触时间延长其杀菌率也增大，当接触时间为半小时时，几乎可以清除所有金葡菌，可见载酶水凝胶的作用非常迅速。
本发明利用微生物发酵得到的纳米级细菌纤维素为基体材料，从物理、化学、机械性能来看，具有独特的性质，是世界上公认的性能优异的新型生物学材料。
本发明以细菌纤维素为基体，在其骨架中原位引入生物抗菌剂，能够高效直接裂解病原菌，作用机理不同于传统的抗生素，不易产生耐药性。由于其独特的杀菌机理，即使是耐药性金黄色葡萄球菌、MRSA及“超级细菌”，该抗菌剂也同样有很强的杀菌作用，而且不易诱导产生耐药菌株。
本发明引入温敏性物质聚N-异丙基丙烯酰胺构建互穿双网络结构，基于这种温敏特性它在药物的控制释放、酶的固定化、物质分离以及循环吸收剂等方面有着诱人的应用前景。另外该物质通过原位聚合制得，并以无机粘土“Laponite XLS”为物理交联剂，可以避免化学交联剂对酶活性的影响。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (8)

1.一种载酶细菌纤维素基复合抗菌水凝胶敷料的制备方法，其特征在于：利用细菌纤维素天然的纳米三维网络结构，在其骨架中引入聚N-异丙基丙烯酰胺网络，制备出机械性能更优的互穿双网络水凝胶，并以此为载体负载生物抗菌剂，从而获得具有高效保湿抗菌功能的载酶细菌纤维素基复合抗菌水凝胶敷料，具体包括以下步骤：
（1）制备细菌纤维素水凝胶；
（2）将步骤（1）得到的细菌纤维素水凝胶机械除水，使其厚度为原来的1/5，再在膜上滴加一定量生物抗菌剂水溶液，4℃冷藏放置12h，使其达到吸附平衡得到载酶细菌纤维素水凝胶；
（3）在去离子水中通氮气 3 小时以上以除去其中溶解的氧气，将N-异丙基丙烯酰胺与无机粘土溶解于除氧去离子水，在冰水浴中搅拌至溶液澄清；
（4）将步骤（2）中得到的载酶细菌纤维素水凝胶渍于步骤（3）得到的澄清溶液中，并于4℃冰箱中放置24h，使其达到吸附平衡；
（5）将步骤（4）得到的水凝胶取出并用蒸馏水反复冲洗，以去除表面吸附的物质，再将水凝胶放入40℃的恒温水浴中反应6h，进行原位自由基聚合反应，聚合完成后，得到载酶细菌纤维素基复合抗菌水凝胶敷料；
所述步骤（2）中的生物抗菌剂为溶菌酶或溶葡萄球菌酶中的一种或二者组成的复合酶溶液，酶用量为10U/g~1000 U/g。
2.根据权利要求1所述的载酶细菌纤维素基复合抗菌水凝胶敷料的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）细菌纤维素水凝胶的制备方法如下：取活化好的木醋杆菌1.1812菌株接入种子培养基，再取出一定量培养好的种子接入灭菌后发酵培养基中，接种时需充分振荡，使菌株分离出来并充分分散在发酵培养基中，32℃恒温静置培养8天得到具有一定厚度的细菌纤维素水凝胶。
3.根据权利要求2所述的载酶细菌纤维素基复合抗菌水凝胶敷料的制备方法，其特征在于：细菌纤维素水凝胶的制备方法如下：取活化好的木醋杆菌1.1812菌株接入种子培养基，32℃振荡培养24h，摇床转速为150rpm，再取出10mL培养好的种子接入200mL灭菌后发酵培养基中，32℃恒温静置培养8天得到具有一定厚度的细菌纤维素水凝胶，将生成的细菌纤维素水凝胶取出后，用去离子水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质，再将膜浸泡于1%的NaOH溶液，煮沸6h，去除膜中的菌体和残留培养基，然后用去离子水多次冲洗并平衡至中性。
4.根据权利要求2或3所述的载酶细菌纤维素基复合抗菌水凝胶敷料的制备方法，其特征在于：所用的发酵培养基碳源选自葡萄糖、麦芽糖、蔗糖其中的一种或几种，碳源占培养基溶液的质量分数为2%~10%。
5.根据权利要求1所述的载酶细菌纤维素基复合抗菌水凝胶敷料的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中N-异丙基丙烯酰胺与无机粘土的投料比为6:1~6:7。
6.根据权利要求1所述的载酶细菌纤维素基复合抗菌水凝胶敷料的制备方法，其特征在于：在所述载酶细菌纤维素基复合抗菌水凝胶敷料上表面还设有具有防水透气功能的硅胶保护膜。
7.根据权利要求6所述的载酶细菌纤维素基复合抗菌水凝胶敷料的制备方法，其特征在于：所述硅胶保护膜采用厚度为0.02-0.1mm的有机硅氧烷薄膜。
8.根据权利要求6或7所述的载酶细菌纤维素基复合抗菌水凝胶敷料的制备方法，其特征在于：将载酶细菌纤维素基复合抗菌水凝胶敷料与硅胶保护膜之间贴合后进行包装灭菌，即得到最终产品。
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