JP2022520025A - タンパク質ヒドロゲル、調製方法、及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
加えて、本発明の極めて重要な特徴は、経済的側面である。第一に、GTAをゼラチンと反応させて、このような低濃度でヒドロゲルを作製することが可能である。その上、本発明で使用される比較的安価な試薬は、コストを有意に削減する一方で、製造の効率及び費用対効果を高め、特許請求される製品をはるかに大規模に機能させることが可能である。
(a)好ましくはdH2O、PBS、HBSSの群から選択され、最も好ましくはPBSである、ゼラチン又はコラーゲンである適切な量の試薬Aを水溶液に添加することと、
(b)工程(a)の混合物を加熱して、ゲルを溶解させることと、
(c)必要に応じて、該ゲルを初期に安定化させることと、
(d)架橋剤でありGTAである試薬Bを水溶液中に溶解し、冷却することによって、調製することと、
(e)工程(d)で調製した試薬Bを、工程(c)で調製した該ゲルに添加することと、
(f)必要に応じて、得られた該混合物を混合することと、
(g)架橋と
(h)必要に応じて、過剰な試薬Bの該ヒドロゲルを精製することと、を含み、
試薬Aが0.15重量%~1.5重量%の最終濃度で存在し、ここで該ヒドロゲルの一部分における試薬Aと試薬Bとの比が0.375~4.5mg対0.01~0.15mgであって、該ゲルが温度0℃~12℃に達し、かつその持続時間が少なくとも約5分間である場合に、該ゲルの該初期安定化が起こり、工程(d)~工程(g)が約0℃~約12℃の低温で行われ、工程(g)では該架橋の持続時間が少なくとも12時間であることを特徴とする。
0.4%の濃度の60個のヒドロゲル部分を生成するために、0.06gのA型ブルーム300ゼラチンを秤量し、14.94mLのPBS溶液中に溶解した。各ヒドロゲル部分は0.001gのゼラチンを含有していた。溶液を37℃で加熱してゲルを溶解し、次いで濾過によって滅菌した。この様式で調製したゲルを、250μL/ウェルで48ウェルプレートにピペッティングし、冷蔵庫に入れて冷却し、次いで冷蔵庫で45分間安定化させた。残り12個のゲル部分は未使用のままであった。0.03mgのGTAを回収し、30μLのdH2Oに補充することによって、dH2O中の0.1%GTA溶液を先に調製し、冷蔵庫で30分間冷却した。冷却し安定化させたが、ゲル化していないゲルに、30μLのGTA溶液を添加した。GTAの添加は氷上で行った。各ヒドロゲル部分には約0.03mgのGTAが存在していた。次いで、GTAを添加したゲルを有するプレートを冷蔵庫に72時間入れた。その後、得られたヒドロゲルを、L-リジンを添加することによるヒドロゲル中和によって、過剰GTAから精製した。PBS中に10倍濃度で溶解したL-リジンを使用した。リジンをヒドロゲルと24時間インキュベートさせた。この様式で調製したヒドロゲルは更なる使用の準備ができている。
0.7%の濃度の50個のヒドロゲル部分を生成するために、0.105gのA型ブルーム300ゼラチンを秤量し、14.895mLのPBS溶液中に溶解した。各ヒドロゲル部分は0.0021gのゼラチンを含有していた。溶液を37℃で加熱してゲルを溶解し、次いで濾過によって滅菌した。ゲルを48ウェルプレートに300μL/ウェルでピペッティングした。残り2個のゲル部分は未使用のままであった。この様式で調製したプレートを冷蔵庫に2時間置いた。0.06mgのGTAを回収し、300μLのdH2Oに補充することによって、dH2O中の0.02%GTA溶液を先に調製し、冷蔵庫で最低でも30分間冷却した。ゲル化したゲルの表面に300μLのGTA溶液を静かに注ぎ、冷蔵庫に24時間置いた。GTAの添加は氷上で行った。各ヒドロゲル部分には約0.06mgのGTAが存在していた。その後、得られたヒドロゲルを、PBSで3回すすぐことによって過剰GTAから精製した。この様式で調製したヒドロゲルは更なる使用の準備ができている。
実施例Iで調製したヒドロゲル上に、内皮(HUVEC)細胞を48ウェルプレートの15,000細胞/ウェルの密度で播種した(特定の細胞株バッチ及び細胞分裂数に応じて、播種細胞の密度は48ウェルプレートの5,000細胞/ウェルから50,000細胞/ウェルまで変動し得る)。内皮細胞をEGM(商標)-2 BulletKit(商標)Lonza培地で培養した。実験結果は、内皮細胞によってヒドロゲルの表面に形成された管腔であった(図1)。
実施例IIで調製したヒドロゲル上に、新生物4T1(マウス乳がん)細胞を、48ウェルプレートの10,000細胞/ウェルの密度で播種した。細胞をRPMI+10%FBS培地で培養した。実験結果は、新生細胞によって形成されたスフェロイドであった(図2)。
ヒドロゲルを先行技術(Bigiら)に開示されている方法に従ってヒドロゲルを生成するアッセイを実施した。その目的のために、5%A型ブルーム300ゼラチン(質量)、及び表1~表8に記載された質量濃度のGTAの組成物のヒドロゲルを調製した。表1、表2、表3、及び表4に示した実験では、タンパク質ヒドロゲルを24時間乾燥させた(この乾燥はBigiらの刊行物の記載に従った)が、一方で表5、表6、表7、及び表8では、調製したタンパク質ヒドロゲルを24時間架橋させた。ここで、Aとはヒドロゲルをすすがなかったことを意味し、BとはdH2Oで5回すすいだことを意味し、CとはPBSで5回すすいだことを意味する。すすぎ工程は引用文献に記載されていない。実験後、得られた細胞を評価した:0-扁平細胞なし;おそらく全て死亡;1-扁平細胞が少数存在;2-扁平細胞が多数存在。以下の表は得られた結果を示す。
0.3%の濃度の50個のヒドロゲル部分(各300μL)を生成するために、0.045gのA型ブルーム300ゼラチンを秤量し、14.955mLのdH2O中に溶解した。各ヒドロゲル部分は0.0009gのゼラチンを含有していた。溶液を37℃で30分間加熱してゲルを溶解し、次いで濾過によって滅菌した。この様式で調製したゲルを、300μL/ウェルで48ウェルプレートにピペッティングした。2個の部分は廃棄するためピペッティングされずに残った。48個のゲル部分を有する48ウェルプレートを冷蔵庫に入れて冷却し、次いで冷蔵庫温度で23時間安定化させた。0.0105mgのGTAを回収し、300μLのdH2Oに補充することによって、dH2O中の0.0035%(質量)のGTA溶液を先に調製し、冷蔵庫内で最低でも30分間放置することによって、その温度を冷蔵庫温度まで下げた。冷却し、安定化し、ゲル化したゲルの表面に、冷却したGTA溶液300μLを添加した。GTAの添加は氷上で行った。次いで、GTAを注いだゲルを有するプレートを冷蔵庫に72時間入れた。各ヒドロゲル部分には約0.0105mgのGTAが存在していた。その後、得られたヒドロゲルを、PBSで3回すすぐことによって過剰GTAから精製した。この様式で調製したヒドロゲルは更なる使用の準備ができている。
0.6%の濃度の50個のヒドロゲル部分(各250μL)を生成するために、0.075gのA型ブルーム300ゼラチンを秤量し、12.425mLのPBS中に溶解した。各ヒドロゲル部分は0.0015gのゼラチンを含有していた。溶液を37℃で30分間加熱してゲルを溶解し、次いで濾過によって滅菌した。この様式で調製したゲルを、250μL/ウェルで48ウェルプレートにピペッティングした。2個の部分は廃棄するためピペッティングされずに残った。48個のゲル部分を有する48ウェルプレートを冷蔵庫に入れて冷却し、次いで冷蔵庫温度で60分間安定化させた。0.018mgのGTAを回収し、30μLのdH2Oに補充することによって、dH2O中の0.06%(質量)のGTA溶液を先に調製し、冷蔵庫内で最低でも30分間放置することによって、その温度を冷蔵庫温度まで下げた。冷却し安定化させたが、ゲル化していないゲルに、各30μLの冷却GTA溶液を添加した。GTAの添加は氷上で行った。次いで、GTAを添加したゲルを有するプレートを冷蔵庫に72時間入れた。各ヒドロゲル部分には約0.018mgのGTAが存在していた。この様式で調製したヒドロゲルは更なる使用の準備ができている。
0.4%の濃度の60個のヒドロゲル部分(各250μL)を生成するために、0.06gのB型ゼラチンを秤量し、14.940mLのPBS溶液中に溶解した。各ヒドロゲル部分は0.001gのゼラチンを含有していた。溶液を37℃で30分間加熱してゲルを溶解し、次いで濾過によって滅菌した。この様式で調製したゲルを、250μL/ウェルで48ウェルプレートにピペッティングした。12個の部分は廃棄するためピペッティングされずに残った。48個のゲル部分を有する48ウェルプレートを冷蔵庫に入れて冷却し、次いで冷蔵庫温度で50分間安定化させた。0.045mgのGTAを回収し、30μLのdH2Oに補充することによって、dH2O中の0.15%(質量)のGTA溶液を先に調製し、その温度を冷蔵庫温度まで下げた。冷却し、部分的に安定化させたが、ゲル化していないゲルに、30μLの冷却GTA溶液を添加した。GTAの添加は氷上で行った。各タンパク質ヒドロゲル部分には約0.045mgのGTAが存在していた。次いで、GTAを注いだゲルを有するプレートを冷蔵庫に72時間入れた。その後、得られたタンパク質ヒドロゲルを、PBSで3回すすぐことによって過剰GTAから精製した。この様式で調製したヒドロゲルは更なる使用の準備ができている。
0.4%の濃度の50個のヒドロゲル部分(各250μL)を生成するために、0.05gのA型ブルーム300ゼラチンを秤量し、12.45mLのPBS中に溶解した。各ヒドロゲル部分は0.001gのゼラチンを含有していた。溶液を37℃で30分間加熱してゲルを溶解し、次いで濾過によって滅菌した。この様式で調製したゲルを、250μL/ウェルで48ウェルプレートにピペッティングした。2個の部分は廃棄するためピペッティングされずに残った。48個のゲル部分を有する48ウェルプレートを冷蔵庫に入れて冷却し、次いで冷蔵庫温度で40分間安定化させた。0.03mgのGTAを回収し、30μLのdH2Oに補充することによって、dH2O中の0.1%(質量)のGTA溶液を先に調製し、冷蔵庫内で最低でも30分間放置することによって、その温度を冷蔵庫温度まで下げた。冷却し安定化させたが、ゲル化していないゲルに、各30μLの冷却GTA溶液を添加した。GTAの添加は氷上で行った。次いで、GTAを添加したゲルを有するプレートを冷蔵庫に72時間入れた。各ヒドロゲル部分には約0.03mgのGTAが存在していた。この様式で調製したタンパク質ヒドロゲルをPBSで3回すすいだ。タンパク質ヒドロゲルを10個の別々の生産バッチで調製し、毎回4度の複製を行った。
A-細胞は良好な形の管腔を形成する
B-細胞が管腔を形成し始める
Claims (16)
- ゼラチン又はコラーゲンである試薬Aと、架橋剤でありGTAである試薬Bと、溶媒と、を含むタンパク質ヒドロゲルであって、試薬Aは0.15重量%~1.5重量%の最終濃度で存在し、試薬Aと試薬Bとの比は前記ヒドロゲルの一部分において0.375~4.5mg対0.01~0.15mgであることを特徴とする、タンパク質ヒドロゲル。
- 前記試薬Aの最終濃度が0.25重量%~1重量%であり、前記ヒドロゲルの一部分における試薬Aと試薬Bとの比が0.625~3mg対0.0135~0.075mgであることを特徴とする、請求項1に記載のタンパク質ヒドロゲル。
- 前記試薬Aの最終濃度が0.3重量%~0.8重量%であり、前記ヒドロゲルの一部分における試薬Aと試薬Bとの比が0.75~2.4mg対0.021~0.045mgであることを特徴とする、請求項2に記載のタンパク質ヒドロゲル。
- ゼラチンが、少なくとも225のブルーム値、好ましくは300のブルーム値のゼラチンであることを特徴とする、請求項1~3のいずれか一項に記載のタンパク質ヒドロゲル。
- 前記溶媒が、水溶液であり、より好ましくはdH2O、PBS、HBSSの群からであり、最も好ましくはPBSであることを特徴とする、請求項1~4のいずれか一項に記載のタンパク質ヒドロゲル。
- 請求項1~5で定義されるような前記タンパク質ヒドロゲルを生成する方法であって、
(a)ゼラチン又はコラーゲンである適切な量の試薬Aを水溶液に添加する工程であって、前記水溶液は好ましくはdH2O、PBS、HBSSの群から選択され、最も好ましくはPBSである、工程と、
(b)工程(a)の混合物を加熱して、ゲルを溶解させる工程と、
(c)必要に応じて、前記ゲルを初期に安定化させる工程と、
(d)架橋剤でありGTAである試薬Bを水溶液中に溶解し、冷却することによって、調製する工程と、
(e)工程(d)で調製した試薬Bを、工程(c)で調製した前記ゲルに添加する工程と、
(f)必要に応じて、得られた前記混合物を混合する工程と、
(g)架橋と
(h)必要に応じて、過剰な試薬Bの前記ヒドロゲルを精製する工程と、を含み、
前記試薬Aが0.15重量%~1.5重量%の最終濃度で存在し、ここで前記ヒドロゲルの一部分における前記試薬Aと前記試薬Bとの比が0.375~4.5mg対0.01~0.15mgであり、前記ゲルが温度0℃~12℃に達し、かつその持続時間が少なくとも約5分間である場合に、前記ゲルの前記初期安定化が起こり、工程(d)~工程(g)が約0℃~約12℃の低温で行われ、工程(g)では、前記架橋の持続時間が少なくとも12時間であることを特徴とする、方法。 - 前記試薬Aの前記最終濃度が0.25重量%~1重量%であり、前記ヒドロゲルの一部分における前記試薬Aと前記試薬Bとの比が0.625~3mg対0.0135~0.075mgであることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- 前記試薬Aの前記最終濃度が0.3重量%~0.8重量%であり、前記ヒドロゲルの一部分における前記試薬Aと前記試薬Bとの比が0.75~2.4mg対0.021~0.045mgであることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 前記初期安定化の持続時間が、30分~48時間、最も好ましくは45分~24時間であることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- 前記架橋の持続時間が、48時間超、最も好ましくは72時間超であることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- 工程(h)において前記ヒドロゲルの前記精製が行われる場合、水溶液、好ましくは細胞培養のための水溶液、好ましくはPBSですすぐことによって、又は中和試薬B、好ましくはL-リジンを添加することによって行われることを特徴とする、請求項6~10のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養のための、請求項1~5に定義される前記タンパク質ヒドロゲルの使用。
- 三次元細胞培養のための、請求項12に記載の使用。
- 工程(c)における前記初期安定化の前記持続時間が、10~90分、好ましくは15~60分、最も好ましくは40~55分であり、前記低温における前記架橋反応の前記持続時間が60時間を超え、前記試薬Aの前記最終濃度が約0.35~0.55重量%であり、ここで、前記ヒドロゲルの一部分における前記試薬Aと前記試薬Bとの比が、0.875~1.375mg対0.024~0.036mgである、血管新生アッセイを実施するための、請求項6に定義される前記方法によって生成される前記タンパク質ヒドロゲルの使用。
- 前記ヒドロゲルの一部分における前記試薬Aと前記試薬Bとの比が、1~1.25mg対0.027~0.033mgである、請求項14に記載の使用。
- 前記ヒドロゲルの一部分における前記試薬Aと前記試薬Bとの比が、1~0.03mg対0.01~0.15mgであり、このような割合は、1mgの量の前記試薬Aの質量に対して0.03mgの前記試薬Bとなるように前記ヒドロゲルの一部分において維持される、請求項15に記載の使用。
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