KR102100506B1

KR102100506B1 - 온도 감응성 키토산 하이드로겔 조성물 및 그를 포함하는 바이오 잉크 조성물

Info

Publication number: KR102100506B1
Application number: KR1020190077251A
Authority: KR
Inventors: 차미선; 김정주
Original assignee: 주식회사 메디팹
Priority date: 2019-06-27
Filing date: 2019-06-27
Publication date: 2020-04-13
Also published as: US11684694B2; CN113038975A; US20220202989A1; WO2020262817A1

Abstract

키토산, 글리세롤 및 인산기를 포함하고, 상기 키토산은 글리세롤, 인산기 또는 이의 조합에 의해 가교결합된 것인 키토산 하이드로겔 조성물에 관한 것으로, 인산기 및 글리세롤의 함량비에 따라 액체 상태의 조성물을 겔 상태로 유도할 수 있는 온도의 제어가 가능하며, 젤라틴 농도에 따라 프린트 특성 및 강도 등에 영향을 주므로 3D 프린트용 잉크로서 활용할 수 있다.

Description

온도 감응성 키토산 하이드로겔 조성물 및 그를 포함하는 바이오 잉크 조성물{Thermosentitive chitosan hydrogel composition and bioinks composition comprising the same}

온도 감응성 키토산 하이드로겔 조성물 및 그를 포함하는 바이오 잉크 조성물에 관한 것이다.

3D 바이오 프린팅은 3D 프린팅의 기술 중 한가지로, 살아 있는 세포를 원하는 구조 및 패턴으로 배열하여 조직이나 장기를 제작하는 기술이다. 현재 피부나 장기, 뼈 이식의 경우 대부분 기증을 받아서 사용하는데 이식의 경우 적합한 조직이나 장기를 찾기가 어려우며 이식 받더라도 자가면역 반응에 의한 문제점이 많다. 이러한 문제점을 극복하기 위해서 조직공학 및 지지체 분야에서 생분해성, 생체 적합성을 가진 고분자 물질을 이용하여 인공 뼈, 치과 보철, 인공 혈관, 인공 피부, 인공 장기, 바이오 칩 등 다양한 인공 대체물을 제작하는 연구가 활발히 이루어 지고 있다.

한편, 젤라틴, 키토산, 콜라겐, 히알루론산, 알지네이트 등과 같은 자연유래 고분자는 가공 및 조형이 쉽고 생체적합성이 높으며 인체에 도입 되었을 때 대부분 좋은 생리 활성을 갖고 세포 부착성이 좋으며 면역반응이 거의 일어나지 않으므로 3D 바이오 프린팅에 사용될 수 있다. 그러나, 상기 고분자는 내열성이 낮아 열에 의한 변성이 쉽게 일어나고 기계적 물성이 낮아서 몸에서 빠르게 분해되기 때문에 분해속도 조절이 어렵다는 단점이 있다.

따라서, 가교제의 종류 및 함량에 따라 온도 감응성 조절이 가능한 자연유래 고분자를 개발할 필요가 있다.

일 양상은 키토산, 글리세롤 및 인산기를 포함하고, 상기 키토산은 글리세롤, 인산기 또는 이의 조합과 가교결합된 것인 키토산 하이드로겔 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 하이드로겔 조성물을 포함하는 바이오 잉크 조성물을 제공하는 것이다.

일 양상은 키토산, 글리세롤 및 인산기를 포함하고, 상기 키토산은 글리세롤, 인산기 또는 이의 조합이 의해 가교결합된 것인 키토산 하이드로겔 조성물을 제공한다. 다른 양상은 상기 하이드로겔 조성물을 포함하는 바이오 잉크 조성물을 제공하는 것이다. 상기 잉크 조성물은 캐스팅 잉크 조성물인 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "하이드로겔(hydrogel)"은 친수성 고분자가 공유 또는 비공유 결합으로 가교되어 만들어진 3차원 망상구조물을 의미할 수 있다. 구성 물질의 친수성으로 인해 수용액 내 및 수성 환경 하에서 많은 양의 물을 흡수하며 팽윤하지만 가교 구조에 의해 용해되지 않는 성질을 가지고 있다. 따라서 구성성분과 제조방법에 따라 다양한 형태와 성질을 가진 하이드로겔이 만들어질 수 있으며 일반적으로 다량의 수분을 함유하고 있으므로 액체와 고체의 중간성질을 갖는 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "바이오 잉크(bioinks)"는 바이오프린팅에 사용되는 하이드로겔 또는 하이드로겔과 세포의 혼합물 또는 하이드로겔과 생리활성물질의 혼합물을 의미할 수 있다. 따라서, 상기 바이오 잉크 조성물은 바이오 프린팅을 위한 것일 수 있다. 또한, 상기 바이오 잉크 조성물은 하이드로겔일 수 있다. 더욱 상세하게는 상기 바이오 잉크 조성물은 조직 재생용 지지체, 환자 맞춤형 지지체의 제작 또는 동물시험을 대체하기 위한 조직 및 인공장기의 개발의 위한 소재 등으로 이용될 수 있다. 구체적으로, 상기 조직 재생용 지지체는 세포 또는 성장인자(growth factor) 등을 생체재료와 혼합하여 피부, 각막, 골, 연골, 혈관 등을 제조할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "캐스팅 잉크(casting ink)"는 물성이 약한 하이드로겔 간의 가교역할을 할 수 있는, 가교제를 포함하는 하이드로겔 잉크를 의미한다. 상기 가교제는 화학적 가교제, 천연 가교제 등 그 종류에 제한이 없으며 예를 들어, β-글리세로 포스페이트(β-glycerophosphate, β-GP), 글루코즈 1-포스페이트(Glucose 1-phosphate, G1-P)등 일 수 있다. 구체적으로, 상기 캐스팅 잉크를 바이오 잉크 사이에 프린팅함으로써 프린팅 과정 중에 캐스팅 잉크에 함유된 가교제에 의해 바이오 잉크가 안정적으로 겔화되는 역할을 할 뿐만 아니라, 프린팅된 지지체 등의 복합한 구조와 형태를 보다 안정적으로 유지시키는 역할을 한다.

본 명세서에서 용어 "키토산(chitosan)"은 D-글루코사민과 N-아세틸글루코사민으로 이루어진 선형다당류를 의미할 수 있다. 상기 키토산은 하기 구조식 1로 표시될 수 있으며 대게, 새우와 갑각류 껍데기를 수산화나트륨 염기로 처리함으로써 수득할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 키토산은, 순수 키토산 외에, 키토산 유도체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키토산 유도체는 프탈화 키토산, 에스터화 키토산, 아미드화 키토산, 또는 포르밀화 키토산 중에서 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다:

[구조식 1]

.

본 명세서에서 용어 "젤라틴(gelatin)"은 동물의 뼈, 연골, 가죽 등 결합조직의 주요 단백질 성분인 콜라겐의 부분적인 가수분해에 의해 얻어지는 단백질을 의미할 수 있다. 상기 젤라틴은, 순수 젤라틴 외에, 젤라틴 유도체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 젤라틴 유도체는 프탈화 젤라틴, 에스터화 젤라틴, 아미드화 젤라틴, 또는 포르밀화 젤라틴 중에서 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다. 젤라틴과 관련하여, 그의 종류 (원천)은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 포유류, 어류, 예를 들면, 소 뼈, 소 피부, 돼지 뼈, 돼지 피부 등으로부터 유래된 다양한 젤라틴을 사용할 수 있다. 또한, 상기 젤라틴은 분자량이 40,000 내지 100,000, 40,000 내지 80,000, 또는 60,000 내지 80,000인 것일 수 있다. 또한, 상기 콜라겐은 분자량이 100,000 내지 250,000, 120,000 내지 240,000, 또는 150,000 내지 200,000 인 것일 수 있다.

일 양상에 따른 조성물은 키토산, 글리세롤 및 인산기를 포함하고, 상기 키토산은 글리세롤, 인산기 또는 이의 조합이 의해 가교결합된 것일 수 있다. 상기 키토산은 제1 키토산 및 제2 키토산이 글리세롤, 인산기 또는 이의 조합과 가교결합되어 키토산 중합체를 형성하는 것일 수 있다. 상기 가교결합은 공유결합 또는 비공유 결합인 것일 수 있다. 도 1은 일 양상에 따른 온도 감응성 키토산 하이드로겔의 가교결합 특성을 나타낸 모식도이다. 일 구체예에서, 상기 제1 키토산 및 제2 키토산은 글리세롤에 의해 공유결합을 형성하는 것일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 제1 키토산 및 제2 키토산은 인산기에 의해 비공유 결합을 형성하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 키토산 중합체는 인산기와의 비공유결합 및 글리세롤과의 공유결합을 모두 포함할 수 있다. 즉, 일 양상에 따른 키토산 하이드로겔 조성물은 제1 키토산 및 제2 키토산이 글리세롤 및/또는 인산기에 의해 공유결합 및/또는 비공유 결합을 형성함에 따라 가교제의 종류 및 함량 조절을 통해 조성물의 강도를 조절할 수 있다. 상기 글리세롤 및 인산기는 1:10 내지 10:1의 몰비로 포함된 것일 수 있다. 예를 들어, 1:10 내지 10:1, 1:8 내지 8:1, 1:5 내지 5:1, 2:7 내지 7:2, 3:6 내지 6:3, 2.5:7.5 내지 7.5:2.5, 4:5 내지 5:4, 또는 1:4 내지 1:1의 몰비로 포함된 것일 수 있다. 이때, 글리세롤 및 인산기의 비율이 상기 범위 미만인 경우, 겔화된 잉크의 물성이 약하기 때문에 적층 구조를 만들기 어려운 바, 3D 프린팅 및 복잡한 구조로의 구현이 어렵다는 문제점이 있고 상기 범위를 초과하는 경우, 세포 또는 성장인자가 재료에 혼합되어 있을 때 세포 독성을 나타내거나 또는 증식 및 분화에 영향을 끼칠 수 있다는 문제점이 있다. 즉, 상기 키토산 중합체는 글리세롤 및 인산기의 함량을 조절함으로써 키토산 분자들의 결합 강도를 조절할 수 있다. 또한, 상기 글리세롤 및 인산기는 조성물 총 중량에 대하여 1 내지 30중량%로 포함된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 글리세롤 및 인산기의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 1 내지 30중량%, 2 내지 20 중량%, 2 내지 18중량%, 2 내지 15중량%, 2 내지 9중량%, 5 내지 18중량%, 5 내지 15중량%, 8 내지 19중량%, 12 내지 18중량% 또는 16 내지 19중량%인 것일 수 있다. 이때, 글리세롤 및 인산기의 함량이 상기 범위 미만인 경우, 조성물이 겔화되지 않거나 겔화 후 물성이 약하여 적층 구조를 만들기 어려운 바, 3D 프린팅에 부적합하다는 문제점이 있으며, 상기 조성물을 세포와 혼합할 경우, 빠른 분해로 인해 3차원 배양이 어렵다는 문제점이 있다. 또한 상기 범위를 초과하는 경우, 조성물의 겔화가 빨리 일어나 세포나 성장인자의 프린팅시 점도가 높아져 공압 조절이 어렵다는 문제점이 있다.

상기 키토산은 탈아세틸화 된 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 조성물은 15 내지 60℃에서 겔화가 이루어지는 것일 수 있다. 예를 들어 상기 겔화가 이루어지는 온도는 15 내지 60℃, 15 내지 57℃, 20 내지 57℃, 20 내지 50℃, 20 내지 45℃, 37 내지 57℃, 또는 30 내지 45℃인 것일 수 있다. 이때, 겔화가 이루어지는 온도가 상기 범위 미만인 경우, 겔화가 이루어지지 않거나 가교결합이 형성되기 전 젤라틴에 의해 조성물이 굳어버리는 문제점이 있으며 상기 범위를 초과하는 경우, 조성물의 겔화가 원하는 시간보다 빠르게 진행되는 문제점이 있다. 또한, 상기 조성물은 10분 내지 30시간 이내에 겔화가 이루어지는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 겔화가 이루어지는 시간은 10분 내지 30시간, 10분 내지 24시간, 30분 내지 20시간, 30분 내지 16시간, 1 내지 12시간, 3 내지 8시간, 또는 10 내지 30분인 것일 수 있다. 이때, 겔화가 이루어지는 시간이 상기 범위 미만인 경우, 겔화가 일어나지 않거나 가교결합이 일부분에만 형성되어 조성물이 불안정한 형태로 생성되는 문제점이 있으며 상기 범위를 초과하는 경우, 온도 변화를 주지 않는 한 상 변화가 일어나지 않는다는 문제점이 있다. 상기 조성물은 pH가 6.6 내지 6.9인 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물의 pH는 6.6 내지 6.9, 6.6 내지 6.8, 6.6 내지 6.7 또는 6.7 내지 6.8인 것일 수 있다. 이때, pH가 상기 범위 미만인 경우, 온도 또는 시간의 변화를 주어도 겔화가 일어나지 않는다는 문제점이 있으며 상기 범위를 초과하는 경우, 가교제를 첨가하는 도중에 겔화가 일어나는 바, 온도 감응성 바이오 잉크로서의 활용이 어렵다는 문제점이 있다.

일 구체예에서, 상기 조성물은 젤라틴이 추가로 포함된 것일 수 있다. 상기 젤라틴은 상기 조성물을 바이오 잉크로 활용하기 위하여 프린트 특성 및 강도 등에 영향을 주는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 젤라틴은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 10 중량%로 포함되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 젤라틴은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 10 중량%, 0.5 내지 8 중량%, 0.5 내지 6 중량%, 1 내지 5 중량%, 2 내지 5 중량%, 2 내지 4.5 중량%, 또는 3.5 내지 4.5 중량%로 포함될 수 있다. 이때, 젤라틴의 함량이 상기 범위 미만인 경우, 세포부착이나 증식과 같은 세포적합성이 떨어지는바 바이오 잉크로서의 활용도가 감소하는 문제점이 있으며 상기 범위를 초과하는 경우, 바이오 잉크의 강도가 낮아질 뿐만 아니라, 가교역할을 하는 키토산의 상대적 함량이 감소하므로 겔화가 잘 일어나지 않는다는 문제점이 있다.

상기 조성물은 염을 추가로 포함함으로써, 캐스팅 잉크로서 이용될 수 있다. 예를 들어, 염화칼슘, 황산칼슘, 탄산칼슘, 염화바륨, 황산바륨 또는 이의 조합을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 즉, 상기 염을 추가로 포함함으로써 바이오잉크와의 교차 적층시 잉크의 강도를 증가시키는 바, 다층 구조로의 프린팅이 가능하다는 이점이 있으며 프린팅 후에도 적층 형태를 유지할 수 있다.

일 양상에 따른 키토산 하이드로겔 조성물은 인산기 및 글리세롤을 가교제로 사용함으로써 세포 특성을 유지하면서 세포 반응에 역할을 하는 β-글리세로포스파트(beta-glycerophosphate)를 대체할 수 있다. 또한, 인산기 및 글리세롤의 함량비에 따라 액체 상태의 조성물을 겔 상태로 유도할 수 있는 온도의 제어가 가능하며, 젤라틴 농도에 따라 프린팅 특성 및 강도 등에 영향을 주므로 3D 프린트용 잉크로서 활용할 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 키토산 하이드로겔 조성물은 다른 종류의 하이드로겔 사이에 가교 역할을 함으로써 캐스팅 잉크로서 활용할 수 있다.

도 1은 일 양상에 따른 온도 감응성 키토산 하이드로겔의 가교결합 특성을 나타낸 모식도이다.
도 2a는 실시예 1에서 제조한 키토산 하이드로겔의 사진이다.
도 2b는 실시예 2에서 제조한 키토산 하이드로겔의 사진이다.
도 2c는 실시예 3에서 제조한 키토산 하이드로겔의 사진이다.
도 2d는 실시예 4에서 제조한 키토산 하이드로겔의 사진이다.
도 2e는 실시예 5에서 제조한 키토산 하이드로겔의 사진이다.
도 2f는 실시예 6에서 제조한 키토산 하이드로겔의 사진이다.
도 3a는 실시예 5에서 제조한 키토산 하이드로겔에 분주한 세포의 세포 부착능을 확인한 그래프이다.
도 3b는 실시예 5에서 제조한 키토산 하이드로겔에서 배양한 세포의 세포 증식능을 확인한 그래프이다.
도 4는 실시예 7에서 제조한 키토산 하이드로겔의 3D 바이오 프린트 특성을 확인한 사진이다.
도 5는 일 양상에 따른 키토산 하이드로겔의 캐스팅 잉크로서의 활용가능성을 확인한 사진이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1.

젤라틴 0.675g를 HCL 0.1N 15 ㎖에 넣어 60℃에서 1시간 동안 500 rpm으로 뒤섞어 젤라틴 용액을 제조하였다. 이후, 상기 젤라틴 용액에 키토산 0.6 g을 추가하여 준 뒤 디소듐 포스페이트(disodium phosphate, Na₂HPO₄) 0.5M 및 글리세롤 0.5M 혼합 용액 0.3㎖를 천천히 드롭(drop)하여 pH 7로 맞춰주었다. 이후, 상기 용액을 57℃에서 1일 동안 보관하여 겔이 된 것을 확인하였다(도 2a).

실시예 2.

젤라틴 0.25 g를 HCL 0.1N 10 ㎖에 넣어 60℃에서 1시간 동안 500 rpm으로 교반하여 젤라틴 용액을 제조하였다. 이후, 상기 젤라틴 용액에 키토산 0.3 g을 추가하여 준 뒤 디소듐 포스페이트(disodium phosphate, Na₂HPO₄) 0.5M 및 글리세롤 0.5M 혼합 용액을 천천히 드롭(drop)하여 pH 6.8로 맞춰주었다. 이후, 상기 용액을 57

에서 10분 동안 보관하여 겔이 된 것을 확인하였다(도 2b).

실시예 3.

젤라틴 0.35 g를 HCL 0.1N 10 ㎖에 넣어 60

에서 1시간 동안 500 rpm으로 교반하여 젤라틴 용액을 제조하였다. 이후, 상기 젤라틴 용액에 키토산 0.3 g을 추가하여 2000 rpm으로 4시간 동안 교반한 뒤 디소듐 포스페이트(disodium phosphate, Na₂HPO₄) 0.5M 및 글리세롤 0.5M 혼합 용액을 천천히 드롭(drop)하여 pH 6.8로 맞춰주었다. 이후, 상기 용액을 상온에서 1일 동안 보관하여 겔이 된 것을 확인하였다(도 2c).

실시예 4.

젤라틴 0.2 g를 HCL 0.1N 10 ㎖에 넣어 60℃에서 1시간 동안 500 rpm으로 교반하여 젤라틴 용액을 제조하였다. 이후, 상기 젤라틴 용액에 키토산 0.25 g을 추가하여 2000 rpm으로 4시간 동안 교반한 뒤 디소듐 포스페이트(disodium phosphate, Na₂HPO₄) 0.5M 및 글리세롤 0.5M 혼합 용액을 천천히 드롭(drop)하여 pH 6.8로 맞춰주었다. 이후, 상기 용액을 상온에서 1일 동안 보관하여 겔이 된 것을 확인하였다(도 2d).

실시예 5.

젤라틴 0.2 g를 HCL 0.1N 10 ㎖에 넣어 60℃에서 1시간 동안 500 rpm으로 교반하여 젤라틴 용액을 제조하였다. 이후, 상기 젤라틴 용액에 키토산 0.25 g을 추가하여 2000 rpm으로 4시간 동안 교반한 뒤 디소듐 포스페이트(disodium phosphate, Na₂HPO₄) 0.5M 및 글리세롤 2M 혼합 용액을 천천히 드롭(drop)하여 pH 6.5로 맞춰주었다. 이후, 상기 용액을 37℃에서 1시간 동안 보관하여 겔이 된 것을 확인하였다(도 2e).

실시예 6.

젤라틴 0.2 g를 HCL 0.1N 10 ㎖에 넣어 60℃에서 1시간 동안 500 rpm으로 교반하여 젤라틴 용액을 제조하였다. 이후, 상기 젤라틴 용액에 키토산 0.25 g을 추가하여 2000 rpm으로 4시간 동안 교반한 뒤 디소듐 포스페이트(disodium phosphate, Na₂HPO₄) 1M 및 글리세롤 4M 혼합 용액 1.34 ㎖를 천천히 드롭(drop)하여 pH 6.5로 맞춰주었다. 이후, 상기 용액을 37℃에서 30분 동안 보관하여 겔이 된 것을 확인하였다(도 2f).

실시예 7.

젤라틴 0.525 g를 HCL 0.1N 15 ㎖에 넣어 60

에서 20분 동안 800 rpm으로 교반하여 젤라틴 용액을 제조하였다. 이후, 상기 젤라틴 용액에 키토산 0.45 g을 추가하여 2000 rpm으로 4시간 동안 교반한 뒤 디소듐 포스페이트(disodium phosphate, Na₂HPO₄) 1M 및 글리세롤 4M 혼합 용액을 천천히 드롭(drop)하여 pH 7.1로 맞춰주었다. 이후, 상기 용액을 4℃에서 1일 동안 보관하여 겔이 된 것을 확인하였다.

[실험예]

실험예 1. 키토산 하이드로겔의 세포부착능 및 세포독성 확인

상기 실시예 5에서 제조한 키토산 하이드로겔을 24 웰 크기의 막 형태로 만든 후 젤화 시켰다. 구체적으로, 상기 실시예 5를 500 ㎕ 씩 24 웰에 넣은 후, 37℃에서 1시간 동안 겔화 반응 시켰다. 이후, 상기 겔에 Raw와 E1 세포를 각각 1x10⁴ 세포/웰 씩 분주하였다. 이후, 4시간 후에 세포부착 정도를 확인하였다. 또한, 1, 2 및 3일차에 각각 WST 방법으로 2시간 동안 반응하여 흡광도를 확인함으로써 세포 증식여부를 확인하였다.

도 3a는 실시예 5에 분주한 세포의 부착력을 OD 값으로 나타낸 그래프이고, 도 3b는 실시예 5에서 배양한 세포의 세포 증식력을 OV 값으로 나타낸 그래프이다.

도 3a에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여 키토산 젤에 분주한 세포의 부착력은 유의적으로 낮은 것을 알 수 있다. 구체적으로, 세포 부착의 경우, 대조군의 흡광도를 1(100%)로 하였을 때, 키토산 겔에 분주한 Raw 세포 및 E1 세포의 흡광도는 각각 0.92(92%) 및 0.76(76%)임을 확인할 수 있었다. 또한, 세포 증식력의 경우, 대조군의 흡광도를 1(100%)로 하였을 때, 키토산 겔에 분주한 Raw 세포 및 E1 세포의 흡광도는 각각 0.71(71%) 및 0.89(89%)임을 확인할 수 있었다. 즉, 도 3b에 나타난 바와 같이, 키토산 하이드로겔에서 배양한 세포의 세포 증식력은 시간이 경과함에 따라 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있으며, 이는 대조군에서 배양한 세포의 세포 증식력과 비교하여 세포 증가율이 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있다. 즉, 일 양상에 따른 키토산 하이드로겔은 세포의 부착 및 증식이 대조군 대비 70~80% 이상의 수준을 유지하는 것을 알 수 있다.

실험예 2. 키토산 젤의 프린트 특성 확인

상기 실시예 7에서 제조한 키토산 하이드로겔의 3D 프린팅 특성을 확인하였다. 구체적으로, 상기 키토산 하이드로겔을 10㎖ luer lock 주사기(BD사)에 각각 1 내지 5㎖의 적당량으로 담고 4℃에서 20 내지 30분 간 겔화하였다. 겔화된 주사기를 압출기에 고정하였다. 이때, 프린팅 과정 중에 물성 변화를 방지하기 위해 프린터 내부 온도를 4℃로 유지하였다. 프린팅 샘플은 10x10x2(㎜)의 천장과 바닥면이 없는 뚫린 형태도 3D 몰딩하여 최적 프린팅 조건을 설정하였다. 설정값은 층 높이는 0.1㎜(적층된 층 중 한 층의 두께), 노즐 크기는 0.21㎜로 설정하여 25G 니들(약 0.241㎜)과 조건을 비슷하게 설정하였다. 또한, 사각형 내부 인필(infill)은 20 내지 25%로, 내부에 적당한 메쉬를 형성하였으며 프린팅 속도는 10㎜/초로 설정하였다. 프린팅 도중의 압력은 psi 45 내지 55로 설정하였다.

도 4는 키토산 하이드로겔의 3D 바이오 프린트 특성을 확인한 사진이다. 도 4에 나타난 바와 같이, 일 양상에 따른 키토산 하이드로겔은 프린트하고자 하는 크기나 형태의 변화에 상관없이 20층까지 적층 가능함을 확인하였다. 따라서, 일 양상에 따른 키토산 하이드로겔은 일반적인 하이드로겔이 물성이 약하여 고층까지 적층하기 어렵다는 단점을 극복하였는바 3D 프린트용 잉크로서 활용할 수 있다.

실험예 3. 키토산 하이드로겔의 캐스팅 잉크로서의 활용 가부 확인

서로 다른 종류의 하이드로겔을 프린팅할 때, 가교제 또는 가교 역할을 할 수 있는 물질을 최하 층에 깔고 프린팅을 하게 되는데, 이 경우 표현이 균일하게 형성되기 어렵다. 따라서, 프린팅 산물의 형태가 일정하지 않고 가교제에 의해 세포 독성이 야기되거나 또는 구조체가 무너질 수 있는 단점이 있다. 따라서, 일 양상에 따른 키토산 하이드로겔의 캐스팅 잉크로서의 활용 가능성을 확인하기 위하여 키토산 하이드로겔과 바이오 잉크의 적층 구조물을 제조하였다.

먼저, 키토산 하이드로겔 잉크를 제조하였다. 구체적으로, 젤라틴 0.2 g을 HCl 0.1N 10㎖에 넣어 60℃에서 1시간 동안 500 rpm으로 교반하여 젤라틴 용액을 제조한 후, CaCl₂를 0.147g 첨가하였다. 이후, 상기 젤라틴 용액에 키토산 0.25g을 추가하여 2000 rpm으로 4시간 동안 교반한 뒤, 상기 용액을 4℃에서 30분 동안 보관하여 겔이 형성된 것을 확인하였다. 다음으로, 바이오 잉크를 제조하였다. 구체적으로, 글리세롤 0.5㎖을 PBS 10㎖에 넣어 5분 동안 300 rpm으로 교반한 후, 덱스트란40 0.25g을 추가하여 5분 동안 300 rpm으로 교반하였다. 이후, 젤라틴 0.5g을 넣고 15분 동안 60℃에서 500 rpm으로 교반하고 알지네이트 0.3g을 넣고 40분 동안 60℃에서 500 rpm으로 교반한 후 4℃에서 20 내지 30 분 동안 겔화 하였다. 이후, 상기 키토산 하이드로겔을 층 높이는 0.1 ㎜, 노즐 직경 25G(0.241 ㎜), 프린트 속도 10 ㎜/s로 하여 4개의 층으로 듀얼 프린트하고, 상기 바이오 잉크를 동일한 조건으로 하여 4개의 층으로 프린팅 한 후, 키토산 하이드로겔 4개의 층을 추가로 프린팅하였다. 상기 키토산 하이드로겔; 바이오 잉크 및 키토산 하이드로겔의 적층 구조물이 겔화 된 것을 확인하였다. 겔화 된 프린팅 산물을 1 일 동안 4℃에서 보관한 후에 PBS 1㎖에 넣어 겔이 유지되는지 확인하였다.

도 5는 키토산 하이드로겔의 캐스팅 잉크로서의 활용가능성을 확인한 사진이다. 도 5에 나타난 바와 같이, CaCl₂를 포함하는 키토산 하이드로겔의 경우, 바이오 겔과 분리되지 않고 적층 구조를 유지하는 것을 확인할 수 있었으나, CaCl₂를 포함하지 않는 키토산 하이드로겔의 경우 바이오겔과 분리되는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 일 양상에 따른 키토산 하이드로겔은 CaCl₂를 추가로 포함함으로써 캐스팅 잉크로서 활용할 수 있다.

Claims

키토산, 글리세롤 및 인산기를 포함하고, 상기 키토산은 제1 키토산 및 제2 키토산이 가교결합된 것이고, 상기 글리세롤 및 인산기는 1:1 내지 1:4의 몰비로 포함된 것인 키토산 하이드로겔 조성물로서, 상기 조성물은 15 내지 60℃에서 겔화가 이루어지는 것인 키토산 하이드로겔 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 제1 키토산 및 제2 키토산은 공유결합 또는 비공유결합에 의해 가교된 것인 키토산 하이드로겔 조성물.
청구항 2에 있어서, 상기 공유결합은 제1 키토산 및 제2 키토산이 글리세롤에 의해 가교된 것인 키토산 하이드로겔 조성물.
청구항 2에 있어서, 상기 비공유결합은 제1 키토산 및 제2 키토산이 인산기에 의해 가교된 것인 키토산 하이드로겔 조성물.
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청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 10분 내지 30시간 이내에 겔화가 이루어지는 것인 키토산 하이드로겔 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 pH가 6.6 내지 6.9인 것인 키토산 하이드로겔 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 글리세롤 및 인산기는 조성물 총 중량에 대하여 1 내지 30중량%로 포함된 것인 키토산 하이드로겔 조성물.
청구항 1에 있어서, 젤라틴을 추가로 포함하는 것인 키토산 하이드로겔 조성물.
청구항 10에 있어서, 상기 젤라틴은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 10중량%로 포함된 것인 키토산 하이드로겔 조성물.
청구항 1에 있어서, 염화칼슘, 황산칼슘, 탄산칼슘, 염화바륨, 및 황산바륨으로 구성된 군에서 선택되는 염을 추가로 포함하는 것인 키토산 하이드로겔 조성물.
청구항 1의 하이드로겔 조성물을 포함하는 바이오 잉크 조성물.