CN108126243A - 一种快速凝胶化可注射多层凝胶支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种快速凝胶化可注射多层凝胶支架及其制备方法，所述的快速凝胶化多层凝胶支架界面清晰，相邻凝胶层吸附率比为1～4，以2～30％(g/mL)含酚基天然高分子或混合物溶液为层凝胶材料，与辣根过氧化物酶混合，冷冻，对接凝胶层，滴加H2O2，反复冻融滴加3～6次，浸泡H2O2，冻干。所述的快速凝胶化可注射多层凝胶支架以含0.5～50units/mL辣根过氧化物酶的层凝胶材料为原料，将底层凝胶原料注入模具，室温并行注射0.001～1mol/L H2O2及上层凝胶原料。所得支架可填充复杂形状及异形组织缺损，层凝胶组分、浓度可调，克服了现有多层凝胶支架存在界面过度区及外形难控制等问题。本发明制备过程简单，所需原料来源广泛、安全、成本低，产业化前景广阔。

Description

一种快速凝胶化可注射多层凝胶支架及其制备方法
技术领域
本发明属于高分子材料技术领域，特别涉及酶介导交联的快速凝胶化可注射多层凝胶支架及其制备方法。
背景技术
软组织缺损是整形外科所面临的难题，不仅影响美观，严重时甚至损害机体功能。目前临床上主要采用皮瓣移植、自体或异体组织移植等方法进行填充，常因供体短缺、供区畸形、免疫排斥、炎症反应及机体吸收等原因而影响修复效果。理想的软组织替代物在临床上有着巨大的需求。组织工程结合生物医学和工程学的方法，通过活体细胞或诱使内源细胞达到组织再生，修复病损组织或器官。支架是组织工程的三要素之一，天然高分子材料是支架构建常用材料。胶原、透明质酸、葡聚糖、壳聚糖、羧甲基纤维素等天然高分子，因其优良的生物相容性、可控的降解速率等，在组织器官的修复与重建方面得到了广泛的研究与应用。
哺乳动物组织大多是由蛋白质和聚多糖的交联网络组成，具有亲水性、高含水量及良好的渗透性。水凝胶网络具有微观结构可设计性，能吸收并保有大量水分，有利于营养物质和分泌物质的运输，在生物医学领域获得了广泛的应用。可注射水凝胶是新型水凝胶体系，可填充任意形状的伤口并形成与伤口形状吻合的人工基质，避免外科手术过程中的高度创伤性,加速愈合、减少病人痛苦、降低医疗费用。对于复杂形状的组织修复,可注射水凝胶具有自适应性,可体温固化，是一般水凝胶不可比拟的。相比与目前已市场化的可注射式填充剂，可注射水凝胶支架在填充缺损的同时，还可包覆生物活性物质实现智能释放及组织原位修复。可注射水凝胶是未来生物医用材料发展的重要方向。
高分子材料的快速凝胶化是可注射水凝胶的关键因素之一。物理交联凝胶化是通过非共价键(疏水作用、氢键、离子间作用力等)形成聚合物网络，如温敏型水凝胶通过体系粘度变化实现溶胶-凝胶转变。物理交联水凝胶通常稳定性较差、机械性能较差，而且环境因素(如温度、pH值和离子强度)变化易导致网络结构瓦解，在临床应用上具有一定的局限性。化学交联通过共价键形成聚合物网络，稳定性和机械性能较好。常用的化学交联方法有光引发聚合反应及化学功能基团反应。光引发交联所用的紫外线需严格控制光强，避免对细胞损伤及反应热造成的局部组织温度上升，同时紫外线无法穿透聚合物支架内部而导致成胶失败。功能基团反应交联是最常用的凝胶化方式，其成胶速度依赖与功能基团的反应活性。其中，酶介导的交联反应不使用化学引发剂和有机溶剂，具有反应条件温和、可控性好、产物易分离等优势，成为可注射水凝胶重点发展的方向。最具有代表性的辣根过氧化物酶(HRP)，能在H2O2存在下催化苯酚及其取代物发生偶联反应实现快速凝胶化，具有较大的应用前景。
仿生化构建是支架制备的常用方法之一。动物最基本结构单元可形象地概括为纤维、螺旋、梯度、分层、管状、蜂窝、缝合和重叠8种基元，这些基元的组合及系统化仿生构成了纷繁复杂的动物结构。其中，分层结构由多个复合材料组成，存在较清晰的界面，可通过生物矿化、逐层沉积自组装、生物模板、冻铸法及3D打印等技术加以制备。但是，传统方法很难获得预订的复杂形状和结构，而精准控制的3D打印技术对材料的粘弹响应及胶体体积等也有诸多苛刻要求。
发明内容
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明利用含酚基天然高分子可酶介导的快速凝胶化优势，提供一种快速凝胶化可注射多层凝胶支架及其制备方法。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种快速凝胶化多层凝胶支架，所述支架具有多层凝胶结构，层凝胶是以2～30％(g/ml)含酚基天然高分子材料为原料制备而得，层间界面清晰，吸水质量与多层支架的质量比为4～20，吸附牛血清白蛋白质量与多层支架的质量比为7～30。
优选地，所述含酚基天然高分子材料为含酚基天然高分子或混合物，相邻凝胶层的含酚基天然高分子材料的浓度比为1～15。
更优选地，所述含酚基天然高分子包括但不限于明胶(GEL)、透明质酸(HA)、羧甲基纤维素(CMC)及葡聚糖(DEX)的改性物。
本发明还提供了上述快速凝胶化多层凝胶支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)将葡聚糖在冰浴条件下溶解于碱性溶液，加氯代脂肪酸，50～70℃反应30～60min，产物用甲醇或乙醇提纯，调pH为1，得羧基化葡聚糖。其中，所述的氯化脂肪酸为氯乙酸、氯丙酸，葡聚糖与氯化脂肪酸的摩尔比为1:(50～500)。
(2)将含羧基天然高分子溶于2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)，与含氨基苯酚混合，加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌，得含酚基天然高分子。其中，所述的含羧基天然高分子为明胶、透明质酸、羧甲基纤维素、羧基化葡聚糖；所述的含氨基苯酚为邻/对羟基苯胺、邻/对羟基乙胺、邻/对羟基苯丙胺，含羧基天然高分子与含氨基苯酚的摩尔比为1:(3～12)。
(3)将2～30％(g/ml)含酚基天然高分子或混合物溶液，加0.5～50units/mL HRP，移入模具，冷冻得凝胶层；将凝胶层对接，在4～10℃下于界面处滴加0.001～1mol/L H2O2，反复冻融滴加3～6次；将冷冻的多层支架，与0.001～1mol/L H2O2混合，室温反应3～10min，冻干，即得快速凝胶化多层凝胶支架。其中，所述的含酚基天然高分子或混合物溶液可另添加0.001～0.1μg/ml生长因子；所述的模具为内筒壁有孔、外筒壁无孔的双套筒，凝胶层冷冻采用内外套筒共用模式，滴加H2O2采用单独内筒模式。
本发明还提供了上述快速凝胶化可注射多层凝胶支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)将2～30％(g/ml)含酚基天然高分子或混合物溶液，加0.5～50units/mL HRP，室温搅拌5～10min，作为凝胶原料。其中，所述的含酚基天然高分子或混合物溶液可另添加0.001～0.1μg/ml生长因子；
(2)将底层凝胶原料注入模具，采用双注射方式，室温并行注射0.001～1mol/LH2O2及上层凝胶原料，得快速凝胶化可注射多层凝胶支架。其中，所述的模具为任何形状；所述的并行注射为按行或列推进模式；所述的并行注射针头间距<0.5～1mm；所述的并行注射H2O2与上层凝胶原料的速度比1:(2～5)。
与现有技术相比，本发明的快速凝胶化可注射多层凝胶支架的制备具有以下优点：
1)本发明选用天然高分子作为凝胶支架的原料，来源广泛，安全，具有一定的生物活性、良好的生物相容性和可降解性；
2)本发明的原料经修饰引入苯酚基团，经HRP/H2O2催化，交联时间低至1min，远低于EDC/NHS交联的反应时间，且产物具有良好的生物相容性和可降解性；
3)本发明的快速凝胶化多层凝胶支架及可注射凝胶支架的制备过程简单，无需复杂设备，方便使用；
4)本发明的快速凝胶化多层凝胶支架具有清晰界面，层凝胶的组分、浓度可调，相邻层凝胶吸附率比为1～4；
5)本发明的快速凝胶化可注射多层凝胶支架，在复杂形状及异形组织缺损的修复方面具有极大的优势。
附图说明
图1为实施例1中快速凝胶化明胶的红外吸收光谱。
图2为实施例2中快速凝胶化透明质酸的红外吸收光谱。
图3为实施例3中葡聚糖(a)及快速凝胶化葡聚糖(b)的紫外吸收光谱。
图4实施例4中羧甲基纤维素和快速凝胶化羧甲基纤维素的热重曲线。
图5实施例1中快速凝胶化明胶的差示扫描量热分析。
图6实施例1中快速凝胶化明胶的凝胶化时间与HRP和H2O2浓度的关系。
图7实施例4中快速凝胶化羧甲基纤维素溶液对细胞增殖的影响(*代表p<0.05)。
图8实施例8中双层支架对水及BSA的吸附率。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1
快速凝胶化明胶(GELg)的合成。8g明胶溶于400mL 50mM MES缓冲液，加4.5g对羟基苄胺，40℃搅拌2h，依次加NHS、HOBt和EDC(质量比，GEL:NHS:HOBt:EDC＝1:0.26:0.88:0.70)，室温反应24h，去离子水透析96h(截留分子量3500Da)，冷冻干燥，得GELg并进行红外检测，结果如图1所示。图中，1247.3cm-1处为苯酚基团中C-O的强伸缩振动峰，1330.2cm-1处为苯酚基团中O-H的面内弯曲振动，1403.1和1449.6cm-1处为苯环骨架振动；明胶1643.9cm-1处酰胺I带(反对称羧基或C＝O振动)和1554.8cm-1处酰胺II带(CN伸缩或NH弯曲振动)与苯环骨架振动叠加形成2个宽峰。结果表明，GELg中引入了苯酚基团。
实施例2
快速凝胶化透明质酸(HAg)的合成。取400mL去离子水，依次加10mmol透明质酸(数均分子量1万)和4.8mmol对羟基苄胺，室温搅拌，加入10mmol EDC和10mmol NHS，室温搅拌过夜，100mmol/L NaCl溶液透析2d，蒸馏水:乙醇(体积比3:1)溶液透析1d，蒸馏水透析1d(截留分子量1000Da)，浓缩，冷冻干燥，进行红外检测(图2)。图中，3449.6cm-1处为C-H、O-H和N-H的伸缩振动，后两者因与氢键缔合变为宽且强的缔合峰；2890.3cm-1处为C-H伸缩振动峰；1652.0cm-1处为游离N-H的剪切弯曲振动峰；1620.9cm-1处为苯环骨架振动峰与C＝O不对称伸缩振动峰叠加；1563.2cm-1处为苯环骨架振动峰；1412.3cm-1处为C＝O对称伸缩振动峰；1146.0cm-1处为C-O-C不对称伸缩振动峰；1039.4cm-1处为C-OH伸缩振动峰；804.2cm-1处为对苯的苯环取代峰。结果表明，除了HA的特征峰外，HAg还存在对羟基苄胺的吸收峰。
实施例3
快速凝胶化葡聚糖(DEXg)的合成。将0.25mmol葡聚糖溶于80mL 6M NaOH溶液，加107mmol氯代乙酸，60℃反应50min，甲醇过滤，沉淀物溶于100mL水，调节pH为1。取0.025mmol产物溶于250mL 50mM MES缓冲液，加0.016mol对羟基苄胺，室温搅拌4h，依次加入NHS、HOBt和EDC(质量比DEX:NHS:HOBt:EDC＝1:0.26:0.70:0.68)，室温搅拌24h，去离子水透析4d(截留分子量3500)，浓缩，冷冻干燥。图3为DEXg的紫外吸收图谱。与不含酚基的DEX(a)的紫外吸收图谱相比，本实施例得到的DEXg(b)在275nm出现酚基的紫外吸收特征峰。
实施例4
快速凝胶化羧甲基纤维素(CMCg)的合成及热重分析。取250mL 50mM MES缓冲液，加0.020mol对羟基苄胺，室温搅拌1h，加0.008mmol羧甲基纤维素钠(10CMC、20CMC、30CMC分别表示数均分子量10万、20万和30万)，搅拌至溶解，依次加NHS、HOBt和EDC(质量比，CMC:NHS:HOBt:EDC＝1:0.26:0.70:0.45)，室温搅拌24h，去离子水透析4d(截留分子量3500Da)，浓缩，冷冻干燥。图4为本实施例制备的CMCg的热重分析TG和DTG曲线。CMCg热降解过程会发生一系列复杂反应，产生H2,CO2,CO,CH4,C2H6,C2H4气体以及水蒸气等。图中，所有的快速凝胶化CMCg在低于103℃时均出现了物理吸附水的蒸发引发的失重；在250～335℃范围内出现快速且显著的失重,DTG曲线出现一个较为明显的峰，可能发生葡萄糖环的去氢等热降解反应，最大失重峰的峰值温度明显比10CMC高。随着分子量增大，CMCg最大失重峰的峰值温度增加。在190℃和530℃附近新出现2个小峰，为对羟基苄胺的热降解。CMCg的残余重量比10CMC小，但随着分子量增加，CMCg的残余重量不断增大。
实施例5
针对实施例1中制备的快速凝胶化明胶进行差示扫描量热分析，结果见图5所示。其中，92.6℃处的峰反映了快速凝胶化明胶去折叠过程，峰值温度较明胶明显降低；213.0℃为快速凝胶化明胶的熔点，明显高于明胶。上述结果表明，合成过程中明胶发生一定程度的去折叠化，但局部交联使熔点增加。
实施例6
针对实施例1制备得到的快速凝胶化明胶进行凝胶化时间研究。取24孔细胞培养板，每孔加1mL 5％(wt％)快速凝胶化明胶溶液，按预定配比加HRP和H2O2。倾斜孔板，以不加HRP和H2O2的快速凝胶化明胶溶液(对照组)刚溢出的角度为标准，超过此角度无溢流视为已凝胶化，记录凝胶化时间，结果如图6所示。图中，随着HRP浓度增加，凝胶化时间降低，在1mMH2O2及100units/mL HRP条件下，凝胶化时间可低至13s；随着H2O2浓度增加，凝胶化时间增加。
实施例7
针对实施例4制备得到的快速凝胶化羧甲基纤维素(分子量10万)进行细胞毒性研究。取96孔细胞培养板，加入100μL ATDC5细胞悬液(P7，3000cells/well，10％FBS培养基)，培养1d，待细胞贴壁，吸除原培养基，加100μL不同浓度CMCg溶液，每2d换液，分别于1、3、5及7d行CCK-8测试，结果如图7所示。培养1d时，除100％CMCg外，所有样品均与Control组(空白板)有显著差异(p<0.05)；与0％CMCg相比，80％及100％CMCg有显著差异；与20％CMCg相比，80％及100％CMCg有显著差异；与40％CMCg相比，100％CMCg有显著差异；与60％CMCg相比，100％CMCg有显著差异；与80％CMCg相比，100％CMCg差异不显著。培养3d，仅0％CMCg与Control组及其他样品组存在显著差异。对比1d和3d，仅20％、40％、60％CMCg存在显著差异。培养至5d，所有CMCg与Control组无显著差异。上述结果表明，低浓度CMCg对细胞增殖无明显的抑制作用。延长培养时间，细胞增殖会受到一定抑制。
实施例8
双层凝胶支架的构建及吸附性研究。取案例4中制备的CMCg配制5％(g/ml)及10％(g/ml)溶液，取案例1中制备的GELg配制5％(g/ml)溶液，分别加20units/mL HRP；将CMCg和GELg置于双套筒，分别冷冻，对接凝胶层，滴加0.9mol/L H2O2，反复冻融3次；将冰冻的双层支架浸入0.9m/L双氧水，室温放置10min，冷冻干燥，分别记为5/5-CMCg/GELg(5％CMCg-5％GELg)和10/5-CMCg/GELg(10％CMCg-5％GELg)。取CMCg、5/5-CMCg/GELg、10/5-CMCg/GELg和GELg支架，分别浸入去离子水及5％(g/ml)牛血清白蛋白(BSA)溶液2h，吸附率结果如图8所示。无论对于水或BSA，CMCg支架的吸附率均高于GELg支架。冷冻干燥的10/5-CMCg/GELg双层凝胶支架的外形整齐均匀，成型较好，相邻界面清晰。吸水或BSA溶液后，由于CMC和GEL溶胀率的差异，上层GELg凝胶层的溶胀率较小，下层CMCg凝胶层的溶胀率较高，但界面未出现明显的破损现象。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种快速凝胶化多层凝胶支架，其特征在于：所述快速凝胶化多层支架具有多层凝胶结构，相邻层凝胶吸附率比为1～4。
2.根据权利要求1所述的快速凝胶化多层凝胶支架，其特征在于：所述凝胶材料是酚基修饰的明胶、透明质酸、羧甲基纤维素、葡聚糖及其混合物，相邻层天然高分子材料的质量比为1～15。
3.一种用于制备权利要求1～2所述的快速凝胶化多层凝胶支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将2～30％(g/ml)含酚基天然高分子或混合物溶液，加0.5～50units/mL辣根过氧化物酶，移入模具，冷冻得凝胶层；
(2)将凝胶层对接，在4～10℃下于界面处滴加0.001～1mol/L H2O2，反复冻融滴加3～6次；
(3)将冷冻的多层支架，与0.001～1mol/L H2O2混合，室温反应3～10min，冻干即得快速凝胶化多层凝胶支架。
4.根据权利要求3所述的快速凝胶化多层凝胶支架的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中所述的模具为内筒壁有孔、外筒壁无孔的双套筒，凝胶层冷冻采用内外套筒共用模式，滴加H2O2采用单独内筒模式。
5.一种快速凝胶化可注射多层凝胶支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将2～30％(g/ml)含酚基天然高分子或混合物溶液，加0.5～50units/mL辣根过氧化物酶，室温搅拌5～10min，作为层凝胶原料；
(2)将底层凝胶原料注入任何形状模具，采用双注射方式，室温并行注射0.001～1mol/L H2O2及上层凝胶原料，即得快速凝胶化可注射多层凝胶支架。
6.根据权利要求5所述的快速凝胶化可注射多层凝胶支架的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中所述的双注射方式为按行或列推进模式，并行注射针头间距<0.5～1mm，并行注射H2O2与上层凝胶原料的速度比1:(2～5)。
7.根据权利要求3和5所述的快速凝胶化多层凝胶支架及可注射多层凝胶支架的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中所述的含酚基天然高分子或混合物溶液可另添加0.001～0.1μg/ml生长因子，所述的含酚基天然高分子的制备方法为：将含羧基天然高分子溶于2-(N-吗啡啉)乙磺酸，与含氨基苯酚混合，加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌，透析，冷冻干燥。
8.根据权利要求7所述的快速凝胶化多层凝胶支架及可注射多层凝胶支架的制备方法，其特征在于，所述的含羧基天然高分子为明胶、透明质酸、羧甲基纤维素、羧基化葡聚糖，含氨基苯酚为邻/对羟基苯胺、邻/对羟基乙胺、邻/对羟基苯丙胺，含羧基天然高分子与含氨基苯酚的摩尔比1:(3～12)。
9.根据权利要求8所述的快速凝胶化多层凝胶支架及可注射多层凝胶支架的制备方法，其特征在于，所述的羧基化葡聚糖的制备方法为：将葡聚糖在冰浴条件下溶于碱性溶液，加氯代脂肪酸，50～70℃反应30～60min，产物用甲醇或乙醇提纯，调pH为1，干燥。
10.根据权利要求9所述的快速凝胶化多层凝胶支架及可注射多层凝胶支架的制备方法的制备方法，其特征在于，所述的氯化脂肪酸为氯乙酸、氯丙酸，葡聚糖与氯化脂肪酸的摩尔比为1:(50～500)。
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