CN105288749A - 一种缓释多肽生长因子生物材料支架的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种缓释多肽生长因子生物材料支架的制备方法。本发明的方法包括如下步骤：1)将生物材料、多肽生长因子和水混匀，反应，使所述生物材料溶胀，并且所述水以结合水、中间态水和自由水三种状态存在于所述生物材料中，得到共混体系；2)将所述共混体系进行冷冻处理，得到冷冻后产物；3)将所述冷冻后产物进行冷冻恢复处理，得到释放多肽生长因子的生物材料支架。本发明的缓释多肽生长因子生物材料支架可以为多肽生长因子提供支撑作用，将多肽生长因子长时程缓释出来，在最大程度保证多肽生长因子生物活性的同时，还能够提供长时程的多肽生长因子缓释，为缺损组织提供整个再生过程中生长所需的多肽生长因子。

Description

一种缓释多肽生长因子生物材料支架的制备方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种缓释多肽生长因子生物材料支架的制备方法。

背景技术

多肽生长因子是生物体胚胎发生、发育、分化以及人体各种组织损伤后再生修复过程中起重要作用的具有生物活性的多肽。人体组织损伤后的修复依赖于多肽生长因子群体的营养和支持作用。一般地说，多肽生长因子与细胞相互作用时，生长因子作为配体与相应的受体相结合形成复合体。该复合体凝聚在细胞膜表面，而后囊泡化进入细胞内，因溶酶体的存在而分解，多肽生长因子在体内半衰期极短。

多肽生长因子具有优越的生物活性，但是由于多肽生长因子在体内半衰期短，不足以在受损组织恢复过程中提供营养作用，因此直接体内注射多肽生长因子的方法并不能达到良好的治疗效果，需要将多肽生长因子包封在生物高分子载体中，目前，一般是将游离的多肽生长因子通过交联剂或者在有机溶剂中被包封到高分子材料中，使之呈缓释状态，以延长其作用时间。但是在制备多肽生长因子-生物高分子载体体系过程中，其制备条件、物理因素(如温度、机械搅拌剧烈程度等)、化学因素(溶剂的pH值、缓冲液的离子强度等)以及所使用的交联剂等会对多肽生长因子的生物活性产生一定的影响。因此如何制备一种生物材料支架，能够为多肽生长因子提供长时程缓释，同时最大程度上保证多肽生长因子的活性，是医学上的一个难点。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种释放多肽生长因子的生物材料支架的制备方法。

本发明提供的释放多肽生长因子的生物材料支架的制备方法包括如下步骤：

1)将生物材料、多肽生长因子和水混匀，反应，使所述生物材料溶胀，并且所述水以结合水、中间态水和自由水三种状态存在于所述生物材料中，得到共混体系；

2)将所述共混体系进行冷冻处理，得到冷冻后产物；

3)将所述冷冻后产物进行冷冻恢复处理，得到释放多肽生长因子的生物材料支架。

上述方法中，所述冷冻恢复处理就是解除冷冻状态或者融化。

上述方法中，所述步骤1)中，所述反应的条件为0-4℃反应6-72h；

所述步骤2)中，所述冷冻处理的条件为-80℃至-20℃处理12-48h；

所述步骤3)中，所述冷冻恢复处理的条件为4℃处理10-24h。

上述方法中，所述步骤1)中，所述反应的条件为4℃反应48h；

所述步骤2)中，所述冷冻处理的条件为-20℃处理24h；

所述步骤3)中，所述冷冻恢复处理的条件为4℃处理24h。

上述方法中，所述生物材料为水凝胶类生物医用高分子材料；所述水凝胶类生物医用高分子材料具体为壳聚糖、聚乳酸、聚乳酸羟基乙酸、明胶或藻酸盐。

上述方法中，所述生物材料为在水中不溶解但能够吸水的凝胶类物质或含有羟基、羧基、氨基等亲水性基团的生物医用高分子材料。

上述方法中，所述多肽生长因子为神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养素-3、神经营养素-4、神经营养素-5、神经营养素-6、神经营养素-7、碱性成纤维细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、红细胞生成素、胶质细胞株源性神经营养因子、睫状神经营养因子、运动神经元营养因子-1、运动神经元营养因子-2、骨形成蛋白、Nogo的抗体或硫酸软骨素抗体。

上述方法中，所述生物材料、所述多肽生长因子和所述水的配比为1-1000mg：10-200ng：1ml。

上述方法中，所述生物材料、所述多肽生长因子和所述水的配比为10mg：30ng：10ml。

上述方法中，所述生物材料为壳聚糖；所述多肽生长因子为神经生长因子。

本发明的另一个目的是提供上述方法制备得到的释放多肽生长因子的生物材料支架。

上述生物材料支架中，所述释放多肽生长因子的生物材料支架的释放时间达16周。

本发明的最后一个目的是提供上述释放多肽生长因子的生物材料支架的新用途。

本发明提供了上述释放多肽生长因子的生物材料支架在制备重建或修复组织或器官缺损的产品中的应用。

上述应用中，所述组织为神经组织。

本发明利用水分子作为制孔剂，先将水分子以结合水、中间态水、自由水三种状态在溶胀过程中进入到生物材料结构网络中；再在冷冻过程中利用水变成冰这个物理过程产生的体积膨胀使得生物材料的孔径变大、孔隙率增高，更多的多肽生长因子得以进入到生物材料结构网络中；最后在冷冻恢复过程中，利用冰变成水这个物理过程产生的体积收缩，使生物材料的孔径回缩，将已经进入到材料结构网络中的多肽生长因子包封在生物材料结构中，得到长时程缓释神经生长因子的壳聚糖材料支架。本发明的长时程缓释神经生长因子的壳聚糖材料支架中的多肽生长因子与生物材料之间以氢键连接，生物材料支架为多肽生长因子提供支撑作用，将多肽生长因子长时程缓释出来，本发明的材料在最大程度保证多肽生长因子生物活性的同时，还能够提供长时程的多肽生长因子缓释，为缺损组织提供整个再生过程中生长所需的多肽生长因子。

附图说明

图1为壳聚糖材料支架反应前、冷冻后以及冷冻恢复后的表面形貌(扫描电子显微镜照片)。图1A为生物材料支架反应前的表面形貌；图1B为生物材料支架冷冻后的表面形貌；图1C为生物材料冷冻恢复后的表面形貌。

图2为壳聚糖材料支架缓释神经生长因子的ELISA曲线。

图3为鸡胚背根神经节(DRG)在壳聚糖材料支架作用下生长的神经纤维(显微镜照片)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、一种包封神经生长因子的壳聚糖缓释支架的制备方法

神经生长因子(NGF)是神经营养因子家族的成员之一，是最早被发现的神经营养因子，在神经元细胞存活、轴突再生以及在神经损伤之后调节施万细胞(Schwanncell,SC)分化和轴突髓鞘再生过程都起到重要作用。中枢神经系统的轴突可以在合适的微环境下再生，可以部分恢复受损轴突的功能，但是神经生长因子在成年大鼠体内的半衰期只有7.2min。本实施例以神经生长因子为试验对象，制备一种包封神经生长因子的壳聚糖缓释支架，以延长的神经生长因子缓释时间。具体步骤如下：

1、壳聚糖材料与神经生长因子共混溶胀

将10ml蒸馏水、10mg的片状壳聚糖(图1A)和30ng的神经生长因子混匀，得到共混体系，将其在4℃下环境下反应48小时(反应时用磁力搅拌器进行搅拌)，使壳聚糖在共混体系中溶胀；在溶胀过程中，水分子进入到壳聚糖材料结构中，以结合水、中间态水以及自由水三种状态存在；

2、共混体系的冷冻处理

将上述共混体系在-20℃环境下进行冷冻处理24h，得到冷冻处理后的共混体系；在冷冻过程中，中间态水和自由水能够结冰，利用水变成冰这个物理过程产生的体积膨胀，使壳聚糖的孔径变大、孔隙率增高(图1B)，进而使更多的神经生长因子得以进入到壳聚糖结构网络中；

3、共混体系的冷冻恢复处理

将上述冷冻处理后的共混体系在4℃环境下进行冷冻恢复处理24小时(摇床震荡)，得到包封神经生长因子的壳聚糖缓释支架(图1C)；在冷冻恢复过程中，冰融化成水，利用冰变成水这个物理过程产生的体积收缩，使壳聚糖的孔径回缩，将已经进入到壳聚糖结构网络中的神经生长因子包封在壳聚糖的结构中。

实施例2、包封神经生长因子的壳聚糖缓释支架的生物活性验证

为了验证按照实施例1中的方法制备的包封神经生长因子的壳聚糖缓释支架是否破坏了神经生长因子的活性、是否还具有其营养神经元的作用，本发明以鸡胚背根神经节(DRG)为试验对象，用鸡胚背根神经节(DRG)培养法对实施例1获得的包封神经生长因子的壳聚糖缓释支架的神经生长因子活性的进行验证。具体步骤如下：

将包封神经生长因子的壳聚糖缓释支架与从8日龄鸡胚中提取的鸡胚背根神经节共培养，48h后，光学显微镜下观察DRG神经轴突的生长情况。

结果如图3所示：鸡胚背根神经节在神经生长因子的作用下有明显的长突起，突起从神经元出发，呈现放射状生长。证明包封神经生长因子的壳聚糖缓释支架缓释出的神经生长因子具有生物活性。

实施例3、包封神经生长因子的壳聚糖缓释支架的缓释曲线

脊髓损伤后，造成损伤后神经再生障碍的重要原因是胶质瘢痕的形成。胶质瘢痕阻碍轴突再生的屏障作用主要体现在两方面：1、由星形胶质细胞形成的机械性屏障；2、由硫酸软骨素蛋白聚糖组成的化学性屏障。阻碍轴突再生的机械性屏障于脊髓损伤后的2个月开始进入稳定期，并于损伤后3个月最终达到稳定；阻碍轴突再生的化学性屏障于损伤之后的1个月开始缓和，并于3个月达到稳定。一旦脊髓损伤进入陈旧性脊髓损伤阶段，稳定形成的胶质瘢痕以及损伤的局部环境已经趋于不发生变化，这个阶段要想对受损部位进行修复变得更加棘手。因此，要想脊髓损伤之后得到很好的恢复效果，最佳时间是在过渡到陈旧性脊髓损伤之前，即脊髓损伤三个月内的时间里，介入相应的治疗。为了解决上述问题，本实施例将实施例1制备的包封神经生长因子的壳聚糖缓释支架与从新生大鼠脊髓中分离提取的神经干细胞共培养，通过酶联免疫ELISA试剂盒测定包封神经生长因子的壳聚糖缓释支架中神经生长因子的释放时间，具体步骤如下：

本实施例将实施例1制备的包封神经生长因子的壳聚糖缓释支架与从新生大鼠脊髓中分离提取的神经干细胞共培养，培养体系为1ml，每3天进行半量换液，分别在共培养1h、6h、1d、1w、2w、4w、6w、8w、10w、12w、14w和16w通过酶联免疫ELISA试剂盒测定上清液中神经生长因子的浓度，并以检测时间为横坐标、以上清液中神经生长因子的浓度为纵坐标绘制时间-NGF浓度曲线。

结果如图2所示：随着培养时间的增加，神经生长因子能够不断从包封神经生长因子的壳聚糖缓释支架，缓释时间长达16w。说明本发明制备的包封神经生长因子的壳聚糖缓释支架能够在长达16w的时间里，缓释神经生长因子，为整个损伤恢复过程中神经元的修复再生创立有利的再生微环境，提供营养与支撑作用。

Claims (10)

1.一种能够释放或缓释多肽生长因子的生物材料支架的制备方法，包括如下步骤：

1)将生物材料、多肽生长因子和水混匀，反应，使所述生物材料溶胀，并且所述水以结合水、中间态水和自由水三种状态存在于所述生物材料中，得到共混体系；

2)将所述共混体系进行冷冻处理，得到冷冻后产物；

3)将所述冷冻后产物进行冷冻恢复处理，得到释放多肽生长因子的生物材料支架。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于：

所述步骤1)中，所述反应的条件为0-4℃反应6-72h；

所述步骤2)中，所述冷冻处理的条件为-80℃至-20℃处理12-48h；

所述步骤3)中，所述冷冻恢复处理的条件为0-4℃处理10-24h。

3.根据权利要求1-2中任一所述的方法，其特征在于：所述生物材料为水凝胶类生物医用高分子材料；所述水凝胶类生物医用高分子材料具体为壳聚糖、聚乳酸、聚乳酸羟基乙酸、明胶或藻酸盐；

所述多肽生长因子为神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养素-3、神经营养素-4、神经营养素-5、神经营养素-6、神经营养素-7、碱性成纤维细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、红细胞生成素、胶质细胞株源性神经营养因子、睫状神经营养因子、运动神经元营养因子-1、运动神经元营养因子-2、骨形成蛋白、Nogo的抗体或硫酸软骨素抗体。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述生物材料、所述多肽生长因子和所述水的配比为1-1000mg：10-200ng：1ml。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述生物材料、所述多肽生长因子和所述水的配比为10mg：30ng：10ml。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述生物材料为壳聚糖；所述多肽生长因子为神经生长因子。

7.权利要求1-6中任一所述的方法制备得到的释放多肽生长因子的生物材料支架。

8.根据权利要求7所述的生物材料支架，其特征在于：所述释放多肽生长因子的生物材料支架的释放时间达16周。

9.权利要求7或8所述的释放多肽生长因子的生物材料支架在制备重建或修复组织或器官缺损的产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述组织为神经组织。