CN103619328A - 囊封治疗产品的方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及囊封方法，所述囊封方法包括用于生物材料或治疗剂的免疫保护和长期发挥功能的藻酸盐基微囊化。生物材料或治疗剂被通过使藻酸盐聚合物胶凝而形成的膜包围。具体而言，尽管绝非排他性地，囊封系统预期用于同种或异种移植。所述膜提供囊封材料的保护性屏障，确保了寿命并且防止来自屏障外部的不希望的影响，例如炎性反应或免疫响应。本发明还涉及产生和提供用于细胞疗法的囊封产品的方法。通过囊封方法得到的治疗产品可提供改善或治疗一系列病症的方法。

Description

囊封治疗产品的方法及其用途

技术领域

本发明涉及囊封方法，所述囊封方法包括用于活细胞或治疗剂的免疫保护和长期发挥功能的藻酸盐基微囊化。具体而言，尽管绝非排他性地，囊封系统用于同种或异种移植。本发明还涉及制造和使用囊封系统的方法，以及囊封细胞产品在细胞疗法中的用途。

背景技术

细胞移植在实验上和临床上正变得越来越成功。其利用材料科学、细胞生物学和药物递送方面的发展来开发微囊化和大囊化的细胞疗法平台。这些构思允许受控递送治疗分子以治疗急性和慢性疾病，但它们的广泛使用受到以下几方面的阻碍：频繁施用易侵蚀材料的需要，以及不可降解材料的取回和长期生物相容性问题。在可生物降解材料的情况下，囊封的细胞疗法的成功将在很大程度上取决于对材料在移植后的稳定性的理解，并最终取决于该稳定性如何影响移植物支持细胞存活、蛋白质分泌和扩散、免疫分离、生物相容性、物理放置和固定、降解的能力，以及分泌产物的功效和药效学。细胞（微）囊封是一个良好建立的概念，其可被实施用于许多应用，例如细胞疗法、细胞生物传感器、用于蛋白质和抗体生产的细胞固定化、食品工业或营养品的益生菌囊封。使用活细胞来治疗病理病症的细胞疗法可能是治疗性蛋白质递送中遇到的困难的解决方案。实际上，由于蛋白质的物理化学和生物特性，蛋白质的生产和施用是具有挑战性的。

微囊化是其中例如生物来源的小的离散物质变成被膜包封的过程，所述膜优选与其被放置在其中的受体相容。

所产生的膜为半透膜，其允许细胞代谢必需的分子（营养物、氧气、生长因子等）流入，并允许治疗性蛋白质和废物向外扩散。同时，免疫系统的细胞和较大分子被保持在远处，避免终身暴露于高毒性的免疫抑制药物。已经提出了许多装置类型，但包埋在基质中显示出显著的优点，因为这样的装置由于具有高表面与内部体积比而使质量转移优化，高表面与内部体积比对于细胞成活率和对外部信号的快速分泌响应是至关重要的。尽管这样的人工装置并不直接连接到宿主身体和器官（血管外装置），但它们表现出支持截留的细胞代谢、生长和分化。此外，将基质包埋的物质沉积在特定的身体隔室中可获得蛋白质的高且持续的局部浓度，降低可能的副作用。基质和中空球可通过用于药物递送和其它非药理学应用的良好描述的许多技术来有效地产生。但是，在细胞囊封应用中，必须满足复杂并且相冲突的要求。不仅需要重复性非常好的方法用于制备具有非常精确的参数（渗透性、大小、表面）的装置，而且这些方法还应在囊封过程中和植入后额外地支持细胞完整性和成活率。最后，制备方法必须确保对于细胞存活和功能而言足够的跨粒子膜流量，以及与宿主组织的长期生物相容性，而没有相关的炎性反应（包括有效的新血管形成）。

虽然将这样的囊封材料移植到患者内以在受体患者内部执行该材料的特定功能的尝试已取得了部分成功，但患者身体常常以通过身体中的成纤维细胞或该物质的其它炎症相关的过度生长来损害装置活性的方式做出反应。用于诱导成纤维细胞的可能机制是巨噬细胞的活化和因此粒子物质对细胞因子的刺激。细胞因子是身体对一组新的抗原作出响应而分泌的分子，并且对于囊封的细胞来说往往是有毒的。某些细胞因子继而刺激患者的免疫系统。因此，在囊封材料的有效寿命中，免疫响应仍然可以是限制因素。此外，成纤维细胞倾向于使装置过度生长，显然也是对新释放的细胞因子作出的响应。成纤维细胞的这种生长使得装置的孔隙度降低。因此，装置内部的细胞材料不能接收到营养物，并且细胞材料的产物不能透过装置壁。这可造成囊封的活材料死亡，并且能削弱该装置作为递送系统的有效性。

生物材料的性质对于移植的装置的成活率来说是至关重要的。描述了适用于囊封细胞的各种生物相容性材料。实例例如为琼脂、藻酸盐、角叉菜胶、纤维素及其衍生物、壳聚糖、胶原蛋白、明胶、环氧树脂、可光交联的树脂、聚丙烯酰胺、聚酯、聚苯乙烯和聚氨酯、聚乙二醇（PEG）。

已使用藻酸盐进行了大量的工作，藻酸盐被认为是用于细胞微囊化的高度有效的生物材料。藻酸盐为天然聚合物，其可以从藻类中提取到。

藻酸盐包含一类异质的1-4连接的β-D-甘露糖醛酸与其C-5差向异构体α-L-古洛糖醛酸的线性二元共聚物。藻酸盐长期以来被作为生物材料在宽范围的生理和治疗应用中进行研究。在1964年在人工扩展血浆体积的手术作用中首次探讨了藻酸盐作为生物相容性植入材料的可能性（Murphy等人，Surgery.56:1099-108,1964）。在过去的二十年中，用于治疗例如糖尿病等疾病的藻酸盐细胞微囊化取得了显著进展。

尽管在许多动物模型和临床同种移植中取得了成功，但仍然存在影响扩散、免疫分离、并最终导致移植物存活降低和排斥的可变的降解动力学。从严格的材料角度来看，对藻酸盐粒子的体内稳定性的总体认识是有限的，并且这继而限制了它们的使用。

尽管已做出了某些尝试来通过改善其生物相容性和稳定性而优化粒子的性能（参考例如Sun等人，（1987）），但对于使粒子的主聚合物组分（藻酸盐）的分子结构和大小与得到的粒子的功能性质相关联的工作却做得相对较少。

数个专利和专利申请已试图完善囊封的材料和方法：

WO91/09119公开了用藻酸盐凝胶将生物材料、更具体而言为胰岛细胞囊封在珠粒中的方法，所述珠粒随后被第二层、优先为聚L-赖氨酸和由藻酸盐组成的第三层囊封。

US5,084,350提供了一种将生物活性材料囊封在大基质中、随后进行微囊的液化的方法。

US4,663,286公开了一种通过使微囊胶凝并随后通过水合作用使微囊膨胀以控制囊的渗透性来制造微囊的方法。

由于需要将芯液化而使得囊的结构完整性受损，因此，现有技术的囊具有影响其寿命的数个问题。此外，解凝（dejelly）对于活细胞来说是一个严酷的处理。而且，若暴露可造成纤维化的聚赖氨酸涂层不像本来那样紧密地结合于藻酸钙内层。此外，囊芯的解凝可导致未结合的聚赖氨酸或溶解的藻酸盐浸出，对微囊造成纤维化反应。而且，装置的形状和结构在植入后在囊封的生物材料的成活率方面起到同等作用。由囊封系统所引起的显著并发症为氧气、营养物和代谢废物扩散入和扩散出装置的效率降低。球倾向于在体腔内形成大的聚集体，因此，由于缺乏营养物，在这些聚集体中心的细胞更易于细胞死亡和坏死。最后，所设想的植入物效应将严重降低或甚至丧失。本发明的目的在于克服现有技术中上文提到的问题中的至少一部分。

发明内容

本发明的目的在于改善藻酸盐基生物装置的稳定性，并且产生基于这些生物装置的可用于体内应用的治疗产品。

与现有技术的藻酸盐聚阳离子囊相比，本发明的囊封方法表现出数种改善的特性，即（i）更高的机械和化学稳定性；（ii）在受体中不引起炎性反应或者很低的炎性反应；（iii）允许用于植入的低影响手术过程；（iv）通过降低坏死的风险而增强微装置在植入后的耐久性。

通过根据所希望的化学结构和分子大小来选择用于囊封的材料（及其胶凝离子），以及通过控制基质形成的动力学，来进行本发明的藻酸盐基囊封（具有改善的机械和化学稳定性以及生物相容性）。本发明的装置优选地由富含古洛糖醛酸的藻酸盐制成。该装置的特征还在于确定比率的藻酸钙/藻酸钡。可产生藻酸盐装置的各种形状。在优选实施方式中，该装置由长丝形状构成。通过使用长丝形式的囊封的细胞，确保了植入物的寿命。本发明人发现，植入长丝形式的微粒子具有以下优点：囊封的细胞不太易于细胞死亡和坏死，因为长丝并不像现有技术中其它形状已知的那样倾向于在植入后形成大的聚集体。大的聚集体的形成损害了营养物流入到聚集体的内部细胞，这造成这些内部细胞饿死并最终丧失这些内部细胞。此外，外科医生可以更容易地处理所述长丝，并通过手术或腹腔镜方式将其移植在除了腹膜之外的位点，所述位点为例如但不限于脂肪、网膜或皮下位点。在临床并发症的情况下，它们也可能比常见藻酸盐囊更易于被移除。

不同于许多现有技术装置，并不存在本发明的粒子的藻酸盐芯的解凝，因为这损害了细胞成活率。

而且，由于在优选实施方式中，内部芯藻酸盐由钡离子和钙离子交联的藻酸盐制成，因此，其比现有技术的藻酸钙更稳定，并且比现有技术的藻酸钡具有更低的毒性。

虽然钡具有更强的亲和性，但它在量大时是有毒的，并因此造成不希望的安全风险。然而，根据本发明，出乎意料地发现，在特定浓度范围内的钡和钙的组合具有高亲和性的益处，而无高毒性风险的缺点。

附图说明

图1为与未经治疗的糖尿病动物和未经治疗的非糖尿病对照相比，利用2.9M囊封的人β细胞治疗的糖尿病Nod/Scid小鼠中的非空腹的血葡萄糖水平。数据表示平均值（在适合的情况下）±SD。

图2为在将2.9M囊封的人β细胞植入到糖尿病Nod/Scid小鼠中后，实验组和对照组中的人C肽水平。

图3为治疗对小鼠体重的影响。

图4为用于获取长丝形式的囊封的细胞的喷嘴类型的实例。

具体实施方式

本发明涉及用于活细胞和治疗剂的囊封系统，当囊封的细胞和治疗剂被植入到受体内时，所述系统具有改善的生物稳定性。这种改进的制剂使得囊封的细胞和治疗剂能够在活体内保持功能比目前情况更长的时间，这导致治疗剂的递送改善并因此导致治疗功效改善。

除非另外限定，否则在公开本发明中所使用的所有术语，包括科技术语，具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。作为进一步指导，术语的定义被包括在内以便更好地认识本发明的教导。

在本文中使用时，术语生物材料包括DNA、RNA、蛋白质、细胞器、抗体、免疫蛋白、肽、激素、活组织，或者活的原核或真核细胞。

在本文中使用时，术语生物相容性基质包含选自下列的化合物：琼脂、藻酸盐、角叉菜胶、纤维素及其衍生物、壳聚糖、胶原蛋白、明胶、环氧树脂、可光交联的树脂、聚丙烯酰胺、聚酯、聚苯乙烯和聚氨酯、聚乙二醇（PEG）。

在本文中使用时，术语藻酸盐结合物可以包括但不限于藻酸盐-胶原蛋白、藻酸盐-层粘连蛋白、藻酸盐-弹性蛋白、藻酸盐-纤连蛋白、藻酸盐-胶原蛋白-层粘连蛋白和藻酸盐-透明质酸，其中胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白-层粘连蛋白或透明质酸共价键结合（或未结合）到藻酸盐。

在本文中使用时，不带具体数量的指称包括单数和复数两者，除非上下文清楚指明不是如此。例如，“隔室”指一个或大于一个隔室。

在本文中用于指例如参数、量、时距等可测量值时，“约”是指涵盖指定值的+/-20%或更小，优选地+/-10%或更小，更优选地+/-5%或更小，甚至更优选地+/-1%或更小，并且还更优选地+/-0.1%或更小的变化，到目前为止，这样的变化适合于在所公开的本发明中执行。但是，应了解，修饰词“约”所指的值本身也被具体公开。

在本文中使用时，“包括”和“由……构成”与“包含”、“含有”同义，并且是闭合式或开放式术语，其规定存在其后所跟随的内容例如组分，并且不排除或预先排除存在本领域已知或本文中所公开的附加的未列举的组分、特征、元件、构件、步骤。

以端点列举数值范围包括在该范围内的所有数字和包含在该范围内的所有分数，以及所列举的端点。

在此处和整个说明书中，除非另外限定，否则表述“重量%”（重量百分比）指基于制剂的总重量，相应组分的相对重量。

在第一方面，本发明提供一种囊封系统，其包含富含古洛糖醛酸的藻酸盐。藻酸盐为线性多糖，其由(1→4)连接的β-D-甘露糖醛酸酯（M）与其C-5差向异构体α-L-古洛糖醛酸（G）组成。单体可表现为连续G-残基（G嵌段）、连续M残基（M嵌段）、交替M和G-残基（MG嵌段）或随机组织的嵌段的均聚物嵌段。由于据显示，藻酸盐的纯度决定藻酸盐基粒子的生物相容性，因此，提供纯度的细节是强制性的。根据装置植入的FDA要求，内毒素的含量必须低于每个患者350EU（对于CNS应用而言，低于15EU）。由于内毒素的化学性质与藻酸盐非常相似，它们的移除曾经是具有挑战性的工作，但现在，具有低于100EU/g的指定内毒素含量的纯化的藻酸盐是可商购的。GMP要求根据ASTM指南2064通过经验证的方法来表征藻酸盐。每个批次应授予一证书。本发明提供了一种组合物，其包含古洛糖醛酸含量为至少60%的高古洛糖醛酸藻酸盐，以及阳离子。

在本发明的优选实施方式中，使用囊封方法制备的生物相容性藻酸盐基基质组合了微滴发生器和胶凝缓冲剂，以将目标生物材料囊封在非均质的藻酸盐-Ca2+/Ba2+微粒子中。在挤出通过微滴发生器后，通过空气剪切与蠕动泵的机械压力的组合而产生滴状物。可选地，静电珠粒发生器可用于产生滴状物。含有微滴的生物材料随后被收集到具有缓冲剂的阳离子交联溶液中（pH7.2-7.4）。当与此缓冲剂接触时，微滴胶凝。阳离子交联剂可选自下列盐，Ag⁺、Al³⁺、Ba²⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、H⁺、K⁺、Li⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Na⁺、NH₄ ⁺、Ni²⁺、Pb²⁺、Sn²⁺和Zn²⁺。优选地，阳离子交联剂为氯化钡和氯化钙的组合。交联剂优选地是过量的，例如1mM至20mM的氯化钡和1mM和20mM的氯化钙。更优选地，10mM氯化钡和10mM氯化钙。

之后，利用林格氏溶液（Ringer'Solution）洗涤微滴三次，并将其在37℃和5%CO₂下保持在无血清的Ham’s F-10培养基中直到移植。微滴的大小在200μm至800μm之间变化。微滴可呈现许多形式，例如颗粒、球、片状物或长丝状结构。在最优选的实施方式中，通过使用略微修改的方法使微滴呈现藻酸盐基长丝的形式。

当所形成的微滴被放置于体外生理条件下约一个月以上时，其体积膨胀约10%以上。这些藻酸盐基质的膨胀被认为是由过剩的二价阳离子造成的，过剩的二价阳离子造成渗透梯度，导致吸水。本发明的球和长丝是高度稳定的。据预期，本发明的微滴能够在受试者的体内保持功能显著长的时间，当然，多达4个月以上的时间。

在另一个优选实施方式中，囊封的生物材料由细胞构成，例如但不限于胰岛细胞、肝细胞、神经元细胞、脑垂体细胞、嗜铬细胞、软骨细胞、生殖细胞和能够分泌因子的细胞。根据适合的方法来处理所述细胞（例如，对于胰岛细胞而言，EP1146117和相关文献中描述的方法），并将其与1.8%无菌超纯藻酸盐溶液混合以得到在10-30×10⁶细胞/mL藻酸盐之间的最终细胞密度。

在特别优选的实施方式中，囊封的生物材料包含源自未成熟猪胰腺的胰腺内分泌细胞池，其能分泌可用于治疗糖尿病的胰岛素。可选地，所述细胞可包含能分泌可用于治疗肝疾病或病症的肝分泌因子的肝细胞或非肝细胞。可选地，所述细胞可包含神经元细胞，例如脉络丛、脑垂体细胞、嗜铬细胞、软骨细胞和能够分泌可用于治疗神经元疾病的神经元因子的任何其它细胞，所述神经元疾病例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、癫痫、亨廷顿氏病（Huntington's disease）、中风、赖特尔神经元疾病（Reiter neuron disease）、肌萎缩性侧索硬化症（ALS）、多发性硬化症、老化、血管疾病、门克斯卷发综合征（MenkesKinky Hair Syndrome）、威尔逊氏病（Wilson's disease）、神经系统的创伤或损伤。

在另一个优选实施方式中，囊封的生物材料可以是产生治疗性蛋白质的基因工程化的细胞，所述治疗性蛋白质例如但不限于红细胞生成素、胰岛素、IGF-1、IL-2、细胞色素P450、CNTF、NGF、BMP、BDNF、GDNF、VEGF、凝血因子、干扰素、多巴胺、内皮抑素、神经纤毛蛋白-1、GH3和抗体。

在另一个实施方式中，囊封的生物材料可包含干细胞或祖细胞。干细胞和祖细胞具有分化为各种细胞谱系的潜能，因此在再生医学的细胞疗法中具有巨大潜力。但是，组织再生和重塑的失败部分地是由于缺乏对干细胞和祖细胞针对于外来因素的保护而造成的。微囊化可固定干细胞以为干细胞存活和发挥功能提供有利的微环境，因此形成生物人工干细胞巢，其模拟正常干细胞巢的特定物理化学和生化特性。

本发明还提供一种改善或治疗包括人在内的动物中的疾病或病症的方法，所述方法包括将有效量的本发明的含细胞的藻酸盐基质移植到所述动物内，其中所述细胞分泌有效地改善或治疗所述疾病或病症的治疗剂。

本发明还提供一种改善或治疗包括人在内的动物中的疾病或病症的方法，所述方法包括将有效量的本发明的涂覆有免疫保护膜的含细胞的不可降解的细胞递送构建物移植到所述动物内，其中所述细胞分泌有效地改善或治疗所述疾病或病症的治疗剂。

本发明还提供一种改善或治疗包括人在内的动物中的疾病或病症的方法，所述方法包括将有效量的本发明的含治疗剂的藻酸盐基质移植到所述动物内，其中所述治疗剂有效地改善或治疗所述疾病或病症。

在这些治疗方法中，可以以一定的量施用本发明的基质或涂覆的递送构建物，所述量会递送足够的治疗剂以有效地对抗疾病。例如，在治疗糖尿病中，植入的最小量为每千克受体体重一百万个囊封的胰岛素产生细胞。

本领域技术人员能够在体外测试特定治疗剂从藻酸盐基质分泌的速率，并且对于任何特定患者的需要，能够计算有效治疗该特定患者所需要的球或长丝的量。

取决于活细胞和/或治疗剂的来源，本发明的基质可被配制用于同种或异种移植。本发明的基质可被移植到身体组织内或者被移植到身体的充满体液的空间内，取两者中在可接近性和功效方面最适合的。更具体而言，植入或移植位点可以是皮下、肌内、器官内、静脉内、器官的动脉/静脉血管、脑脊液和淋巴液。例如，如果基质内的活细胞为β细胞，则它们可被移植到腹膜腔内。在优选实施方式中，囊封的细胞被植入到网膜内，网膜是腹膜腔内高度血管化的结构。在藻酸盐基质具有安全性问题的情况下，可执行简单的网膜切除术，安全地移除基质。其它植入位点包括脂肪和皮下位点。同样，在临床并发症的情况下，它们可以被容易地移除。

在一个实施方式中，该装置可被提供为可注射的形式，其允许简单的植入或移植。可选地，装置可被配制用于口服或局部施用，特别是当它们含有治疗性生物活性剂例如抗生素时。

现参考实施例更详细地描述本发明，所述实施例不是非限制性的。

实施例

实施例1：囊封在藻酸盐微粒子中的人胰岛-小鼠中的正常化（normalization）。

同轴气流装置（微滴发生器）与钡/钙胶凝缓冲剂的组合被用于将人胰岛囊封在非均质的藻酸盐-Ca2+/Ba2+微粒子中。

a）在囊封之前的细胞制备

-将人胰岛悬浮液在270g离心(在Beckman GS-6R中以1100RPM）；3分钟；15–30℃

-移除上清液（Ham F10）。

-通过中间离心，利用NaCl0.9%洗涤细胞两次：270g(在BeckmanGS-6R中以1100RPM）；3分钟；15–30℃

-使用移液管将细胞团块与藻酸盐1.8%轻柔地混合，直到得到均质悬浮液。将人胰岛与1.8%无菌超纯藻酸盐溶液混合以在50ml Falcon管中得到5至50×10⁶个细胞/ml藻酸盐之间的最终细胞密度。

-允许此混合物在冰上冷却至少5分钟。

b）囊封

随后使用以下设置通过同轴气流装置来处理上文所描述的细胞-藻酸盐混合物：

-流速泵：0.5-1,5ml/min

-空气流量计：2,5-3L/min

-压力阀1：0.2MPa

-压力阀2：0.1MPa

取决于希望产生的粒子的大小，这些设置将不同（更高或更低）。

使用蠕动泵，使用金属毂针（hub needle）（16号）从50ml Falcon管吸出细胞-藻酸盐混合物，并且朝着22号喷气针向前通过管道。在挤出通过22号喷气针后，通过空气剪切与蠕动泵的机械压力的组合而产生滴状物。由挤出（0.5-1.5ml/min）通过22号喷气针（空气流量2.5-3l/min）来产生在藻酸盐中含有胰岛的滴状物。

滴状物降落2cm进入含有50mM CaCl₂和1mM BaCl₂（在10mMMOPS中，0.14M甘露醇和0.05%吐温20，pH7.2-7.4）的溶液作为胶凝溶液的20ml烧杯中。在与这种缓冲剂接触后，微滴胶凝（Qi等人；2008）。取决于所使用的泵流速和空气流量，滴状物的大小在200-800μm之间变化。

将滴状物在BaCl₂-胶凝溶液中静置7分钟。之后，通过将这种含有胶凝溶液的囊倾倒在底部具有22目网格的圆柱形筛上而从胶凝溶液移除所述囊。

之后，通过将含有粒子的圆柱形筛重复地浸渍于填充有林格氏溶液或Hanks平衡盐溶液的玻璃容器中来轻柔地洗涤所述囊。重复这个步骤三次，每次完全更新洗涤溶液。

在取得用于QC的样品后，在无白蛋白或者含白蛋白或Ham F-10培养基中在37℃和5%CO₂下培养所述囊直到移植。

可选地，静电珠粒发生器可用于产生滴状物。

c）移植和结果：在移植后正常化。

通过利用50mg/kg单水合四氧嘧啶(2,4,5,6-四氧嘧啶、2,4,5,6-嘧啶四酮，葡萄糖类似物）进行处理，在免疫-缺陷Nod/Scid小鼠中诱导糖尿病。在进入研究之前，监测动物的稳定糖尿病状态。使用健康的小鼠作为对照。在四氧嘧啶处理后2天执行移植。五只动物在腹膜腔中被植入290万个藻酸盐囊封的人β细胞/动物（19M个β细胞/ml藻酸盐）。在动物的腹壁和腹膜中沿着白线做出小切口。随后使用填充有4ml缓冲溶液的5ml移液管将囊封的细胞转移到腹膜腔内。两只糖尿病动物并未接受植入。然后监测动物长达258天。在非空腹条件下进行血葡萄糖测量。

实验被分成三个实验组：

·组1（在附图中以三角形描绘）：在腹膜腔中植入囊封的人β细胞的糖尿病小鼠（n=5）

·组2（在附图中以正方形描绘）：未被移植人β细胞的糖尿病小鼠（n=2）

·组3（在附图中以菱形描绘）：非糖尿病小鼠，阴性对照（n=1）。在此组中仅包括一只动物，因为有足够的历史数据用于该组。

从动物抽血以测量血葡萄糖、C肽和胰岛素原水平。也测量动物的体重。在动物处死后（在第5周和第37周），回收自由浮动的囊，并使用光学显微镜（H&E）、半薄切片、超薄切片和电子显微镜来分析细胞和囊两者以确定细胞的成活率、胰岛素的产生和胰高血糖素的产生。

使用电子显微镜来估算细胞成活率（通过计数1000个细胞），并且表明在囊封后，成活率为81%，而未囊封的细胞的成活率为88%。还在即将植入前测量成活率，并且据发现为62%，而以类似方式处理的未囊封的细胞表现出94%的成活率。在植入前，囊的平均直径为620μm。在动物处死后，在第35天和第258天，发现大部分的囊在腹膜腔内都是自由浮动的，并通过冲洗所述腔来收集。在植入后，囊的大小略微减小，在第35天和第258天囊的直径分别减小7%和8%。活细胞的百分比在动物之间表现出显著变化，但总是大于57%，即使在258天后。尽管活细胞的百分比变化，但胰岛素和胰高血糖素阳性细胞的百分比保持更恒定，分别为55%和15.5%。无法对囊封的细胞的总数进行定量。

在植入之前，与非糖尿病对照（组3）相比，两个糖尿病组（组1&2）表现出高水平的血葡萄糖。这是在糖尿病患者中所观察到的丧失葡萄糖控制的特性。在24小时执行第一植入后血葡萄糖测量，据显示，在组2的所有五只动物（利用囊封的人β细胞治疗）中都表现出血葡萄糖高度显著地降低到与正常非糖尿病对照所观察到的水平相当的水平（图1）。在至少110天的时段中维持血葡萄糖的正常化。在该初始阶段后，在动物之间以及时间点之间观察到血葡萄糖水平的变化，表明人β细胞的治疗优势在逐渐丧失。但血葡萄糖水平仍显著低于糖尿病对照（组2）的水平。对于未植入人β细胞的糖尿病动物而言，非空腹血葡萄糖水平仍然是高的。

为了进一步表征血葡萄糖水平的正常化，监测循环的人C肽和人胰岛素原的水平。所使用的测定法能够将人与啮齿动物寡肽区分开，因此提供了人β细胞功能的直接测量。在所测试的最初时间点（一周），在植入囊封的人β细胞的所有五只动物中检测循环的人C肽。在植入后的前8周中，C肽表现出逐渐增加。在该研究的其余时间，循环的人C肽的水平表现出显著的波动，保持高于3ng/ml。这个数据与2中的血葡萄糖数据一致。在未植入人β细胞的小鼠中未检测到C肽。这证实了该试验对人C肽的特异性。认为在此实验中观察到的人C肽水平是生理相关的，因为它们高于正常健康人中循环的人C肽水平（0.9-1.8ng/ml）。

当表征人胰岛素原的循环水平时观察到类似数据。在第一周的时间点，用人β细胞治疗的所有五只糖尿病动物都表现出可定量水平的胰岛素原。仅含有植入的囊封人细胞的组1动物表现出高于试验的检测限的一致的胰岛素原表达（在整个研究的持续时间中都大于14pmol/l）（图2）。

还在整个研究中监测动物的体重，以便测量与糖尿病状态和/或治疗相关联的任何毒性（图3）。用囊封的人β细胞治疗的所有动物（组1）维持或甚至略微增加其体重，表明不存在与植入相关联的毒性效应。未经治疗的糖尿病组（组2）在大部分的研究中维持体重，但在研究的后期表现出体重降低，这与糖尿病的病理学相关。令人意外的是，正常对照动物（组3）在研究的早期表现出体重降低并被排除。这在历史数据中早先并未观察到，并被认为与该实验不相关。在此研究中并未观察到不良事件的其它迹象。

实施例2：将细胞囊封在藻酸盐长丝中

使用移液管将人或猪β细胞与藻酸盐1.8%混合直到得到均质悬浮液。将人胰岛与1.8%无菌超纯藻酸盐溶液混合以在50ml Falcon管中得到5-50×10⁶个细胞/ml藻酸盐之间的最终细胞密度。允许这种混合物在冰上冷却至少5分钟。

随后使用蠕动泵，使用金属毂针（16号）从50ml Falcon管吸出细胞-藻酸盐混合物，并且朝着22号针向前通过管道。将针尖置于胶凝溶液中。

在挤出通过22号针后，藻酸盐立即与胶凝溶液接触（在10mMMOPS中的50mM CaCl₂和1mM BaCl₂，0.14M甘露醇和0.05%吐温20，pH7.2-7.4），立即形成含有细胞的圆柱形长丝。因此能生成数米长的不中断的长丝。

为了得到长丝的平滑表面，优选使用高烧杯（优选超过20cm高）作为胶凝溶液的容器。

取决于所使用的泵流速和针号或针的内径，长丝的直径可在50-1200μm之间变化。优选地，长丝直径保持低于800μm，以便不对营养物和气体与环境的交换产生负面影响。

将长丝在BaCl₂胶凝溶液中静置7分钟。之后，通过将该含有胶凝溶液的长丝倾倒在底部具有22目网格的圆柱形筛上来从胶凝溶液移除长丝。

之后，通过将含有长丝的圆柱形筛重复地浸渍于填充有林格氏溶液或Hanks平衡盐溶液的玻璃容器中来轻柔地洗涤长丝。将这个步骤重复三次，每次完全更新洗涤溶液。

在取得用于QC的样品后，在无白蛋白或者含白蛋白或Ham F-10培养基中在37℃和5%CO₂下培养粒子直到移植。

作为针的替代，可使用“内部（in house）”发展的喷嘴。这个喷嘴包括圆柱形塑料或树脂玻璃件（1），其可插入于管道（2）的尾端。已利用激光器烧制出穿过该塑料或树脂玻璃件的矩形或卵形孔（3）。当管道的尖端（含有树脂或塑料喷嘴）被放置在钡/钙胶凝缓冲剂表面下方时，并且当藻酸盐或细胞-藻酸盐混合物被推动穿过该喷嘴件（4）（使用蠕动泵）时，也可产生长丝。取决于激光器在该部件中做出的穿孔的宽度，长丝的形状可在圆柱形到片状（束）样之间变化。

存在长丝形状本身固有的优点：可以更容易地对它们进行处理，并通过手术或腹腔镜方式将其移植到除了腹膜之外的位点，所述位点例如但不限于脂肪、网膜、皮下。在临床并发症的情况下，它们也可能比常见藻酸盐囊更容易被移除。

实施例3：通过连续轮的囊封来生成双壁的囊。

细胞可以被囊封在双壁的藻酸盐囊中。这样做时，在第一轮囊封后被截留在囊壁中或囊壁附近的细胞或细胞簇将在第二轮囊封期间被第二层藻酸盐覆盖。通过这样做，囊封的细胞直接向身体的暴露甚至更加受限。因此可以排除对单轮囊封后从囊挤出的细胞的直接免疫响应。

在第一轮囊封中，如下对细胞进行囊封：使用蠕动泵，使用金属毂针（16号）从50ml Falcon管吸出细胞-藻酸盐混合物，并朝着25号喷气针向前通过管道。在挤出通过25号喷气针后，通过空气剪切与蠕动泵的机械压力的组合而产生滴状物。由挤出（1.2-1.5ml/min）通过22号喷气针（空气流量2.5-3l/min）来产生在藻酸盐中含有胰岛的滴状物。

滴状物降落2cm进入含有50mM CaCl₂和1mM BaCl₂（在10mMMOPS中，0.14M甘露醇和0.05%吐温20，pH7.2-7.4）的溶液作为胶凝溶液的20ml烧杯中。在与这种缓冲剂接触后，微滴胶凝（Qi等人；2008）。取决于所使用的泵流速和空气流量，粒子的大小在200-800μm之间变化。

将粒子在BaCl₂-溶液中静置7分钟。之后，通过将这种含有凝胶溶液的粒子倾倒在底部具有22目网格的圆柱形筛上而从胶凝溶液移除粒子。

之后，通过将含有粒子的圆柱形筛重复地浸渍于填充有林格氏溶液或Hanks平衡盐溶液的玻璃容器中来轻柔地洗涤粒子。将这个步骤重复三次，每次完全更新洗涤溶液。

以此方式得到的囊随后经历第二轮囊封。因此再次使用移液管使第一轮囊封期间生成的囊与藻酸盐1.8%混合直到得到均质悬浮液。

以与第一轮类似的方式进行第二轮囊封，区别在于，对于第二轮囊封，藻酸盐加上粒子混合物被挤出通过22号针。

针号大小（gauge size）并不限于上文所利用的组合（25号和22号）。在第一轮囊封后产生的粒子的直径和第二藻酸盐层的厚度（在第二轮囊封期间生成）主要由两个针的内径决定。

在第一轮囊封期间使用的藻酸盐可为高G藻酸盐或者高M藻酸盐。在第二轮囊封期间使用的藻酸盐可为高G藻酸盐或高M藻酸盐。

第一轮囊封和第二轮囊封期间的藻酸盐浓度可以在1.4%与2%之间变化。

实施例4：藻酸盐基质中细胞的成熟

围产期猪胰岛可以被囊封在含单独和组合的基底膜蛋白质IV型胶原蛋白和层粘连蛋白的藻酸盐基质中，其总蛋白质浓度为10-200μg/ml。可以预期到的是，与被囊封在无这些基底膜蛋白质的藻酸盐粒子中的胰岛相比，胰岛的胰岛素分泌将增加。

藻酸盐结合物可以包括但不限于藻酸盐-胶原蛋白、藻酸盐-层粘连蛋白、藻酸盐-弹性蛋白、藻酸盐-纤连蛋白、藻酸盐-胶原蛋白-层粘连蛋白和藻酸盐-透明质酸，其中胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白-层粘连蛋白或透明质酸共价键结合（或未结合）到藻酸盐。可用于使藻酸盐构建物胶凝的盐的实例包括但不限于氯化钙（CaCl₂）、氯化钡（BaCl₂）或氯化锶（SrCl₂）。

层粘连蛋白和I型胶原蛋白可增加积聚的胰岛素释放，而纤连蛋白可导致细胞增殖增加。

实施例5：囊封β细胞和脂肪细胞以改善功能。

结果表明，移植在脂肪组织中可有益于β细胞的功能。Chen等人（2009）表明，利用植入在附睾脂肪垫中的同源胰岛的治疗团块，然后通过在肾小囊下植入来自于年轻（3个月）或老年（24个月）小鼠的25个胰岛的亚治疗团块，可以使链脲霉素诱导的糖尿病FVB/NJ小鼠的血糖正常。在第二次移植后三周，移除包含胰岛的脂肪垫以重新引入高血糖症。

在利用胶原酶消化进行组织解离，通过150μm尼龙膜过滤和离心（5分钟，300rpm）后，可以从白色附睾脂肪垫制备脂肪细胞。分离的脂肪细胞可以在37℃下在补充有链霉素/青霉素（各100μg/ml）的最小DMEM培养基（Life Technologies）中进行培养。

随后可以将不同百分比的β细胞和新鲜分离或培养的脂肪细胞的混合物囊封在1.8%无菌超纯藻酸盐溶液中以得到在5-50×10⁶个细胞/ml藻酸盐之间的最终细胞密度。这样做时，与β细胞共同囊封的脂肪细胞可以为β细胞提供适当的基质，并且在体内启动或刺激这些囊封的β细胞的功能。

Claims (15)

1.用于囊封生物材料的方法，其包括以下步骤：

a）形成所述生物材料与生物相容性基质组合物的混合物，

b）向包含钙阳离子交联剂和钡阳离子交联剂的溶液提供所述混合物；

c）通过使生物相容性基质组合物胶凝而在步骤b）中得到的混合物中形成微滴；

d）在水性缓冲剂中漂洗所述微滴并且将所述微滴保持在无血清的营养缓冲剂中直到移植。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物相容性基质组合物选自：琼脂、藻酸盐、角叉菜胶、纤维素及其衍生物、壳聚糖、胶原蛋白、明胶、环氧树脂、可光交联的树脂、聚丙烯酰胺、聚酯、聚苯乙烯或聚氨酯、聚乙二醇；优选地，所述生物相容性基质组合物至少包含藻酸盐或藻酸盐结合物。

3.根据前述权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述微滴被成形为颗粒、球或长丝，更优选地为长丝。

4.根据权利要求1至3所述的方法，其中所述微滴的大小在200μm与800μm之间。

5.根据权利要求1至4所述的方法，其中所述生物材料包含DNA、RNA、细胞器、激素、活组织和/或活细胞、蛋白质，例如抗体、免疫蛋白和肽。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述生物材料包含活细胞，优选为哺乳动物细胞、祖细胞和祖细胞衍生的细胞、干细胞和干细胞衍生的细胞或基因工程化的细胞。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述细胞选自胰岛细胞、肝细胞、神经元细胞、脑垂体细胞、嗜铬细胞、软骨细胞或能够分泌因子的任何其它细胞类型，所述因子优选为胰岛素。

8.根据权利要求1至7所述的方法，其中所述微滴包含每ml藻酸盐10×10⁶至30×10⁶个细胞的细胞密度。

9.能根据前述权利要求1至8中任一项得到的囊封产品。

10.根据权利要求9所述的产品，其为长丝形式。

11.根据权利要求9或10所述的产品，其作为适用于改善或治疗动物中的病症的治疗剂，所述动物包括人类，优选地，待治疗或改善的所述病症为糖尿病，优选为人类中的糖尿病。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的产品，其为可植入、可移植或可注射的形式。

13.根据权利要求9至12中任一项所述的产品，其中所述生物材料包含哺乳动物来源的胰腺内分泌细胞。

14.根据权利要求13中任一项所述的产品，其中所述胰腺内分泌细胞源自未成熟猪胰腺，优选为能够产生分泌因子胰岛素的未成熟猪胰腺。

15.根据前述权利要求9至14中任一项所述的产品，其作为植入材料或移植材料，其中植入位点或移植位点选自皮下、肌内、器官内、静脉内、器官的动脉/静脉血管、脑脊液和淋巴液。

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