KR101290602B1

KR101290602B1 - 저산소 상태에서 배양된 중간엽 줄기세포가 코팅된 혈관 형성 촉진용 또는 췌도 세포 이식용 생분해성 고분자 지지체 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101290602B1
Application number: KR1020120118034A
Authority: KR
Inventors: 박정규; 김정식
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2012-10-23
Filing date: 2012-10-23
Publication date: 2013-07-29

Abstract

본 발명은 저산소 상태에서 배양된 줄기세포가 코팅된 혈관 형성 촉진용 또는 췌도 세포 이식용 생분해성 고분자 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 저산소 상태에서 배양된 줄기세포가 코팅된 생분해성 고분자 지지체는, 독성이 없고, 이식 후 피하에 선혈관 형성을 촉진시키며, 간편한 췌도 세포 이식 및 제거가 가능하고, 적은 양의 췌도 세포로도 혈당 조절이 가능한 우수한 효과를 가지고 있어, 혈관 형성 촉진 또는 당뇨병 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

저산소 상태에서 배양된 중간엽 줄기세포가 코팅된 혈관 형성 촉진용 또는 췌도 세포 이식용 생분해성 고분자 지지체 및 이의 제조방법 {Biodegradable polymer scaffold coated by hypoxia-conditioned mesenchymal stem cell for promoting angiogenesis or islet transplantation}

본 발명은 저산소 상태에서 배양된 줄기세포가 코팅된 혈관 형성 촉진용 또는 췌도 세포 이식용 생분해성 고분자 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

당뇨병은 췌장소도(췌도)에서 분비되는 호르몬인 인슐린이 부족하거나 없을 경우에 발생하는 병으로, 크게 인슐린 의존형인 제 1형 당뇨병과 인슐린 비의존형인 제 2형 당뇨병으로 나뉠 수 있다.

제 1형 당뇨병은 대개 30~40세 이전의 젊거나 어린 연령층에서 갑작스럽게 발생하고, 심한 체중감소, 의식장애 등을 호소하게 된다. 환자들은 대부분 마른 체형을 갖고 있으며, 당뇨병성 급성 합병증의 일종인 당뇨병성 케톤산혈증이 발생되기 쉽다. 또한, 제 1형 당뇨병은 췌장에서 인슐린이 거의 만들어지지 않아서 인슐린을 사용하지 않는 경우 생명의 위험을 초래하게 되므로, 반드시 인슐린의 사용과 더불어 식사조절, 적절한 운동으로 치료해야 한다.

제 2형 당뇨병은 주로 40세 이후에 많이 발생하고, 췌장의 인슐린 분비능력이 정상보다 감소되어 있거나 인슐린 분비는 정상이지만 비만 등의 이유로 인슐린의 작용이 저하되어 나타난다. 제 2형 당뇨병은 임상증상이 뚜렷하지 않은 경우가 많으며, 초기에는 인슐린 분비의 감소에 앞서서 인슐린 저항성의 증가로 인하여 대사 장애가 나타나고, 특수한 경우 이외에는 당뇨병성 케톤산혈증을 일으키지 않는 것이 특징이다. 따라서, 초기에 식사와 운동요법에 의하여 체중을 감량하면 당뇨병이 호전되는 경우가 많다.

제 1형 당뇨병은 현재의 치료방법으로는 완치를 기대할 수 없는 만성 질환으로 일단 발생하면 일생 동안 철저한 자가관리가 필요하고, 거의 정상에 가까운 혈당조절만이 당뇨병성 만성 합병증을 예방할 수 있다. 그러나, 현재의 치료법인 인슐린 주사요법과 함께 운동요법 및 식이요법으로는 완치가 불가능하고 합병증의 위험이 여전히 존재하는 등 한계가 있다. 또한 제 1형 당뇨병 환자의 일부에서는 반복적인 저혈당 발생과 저혈당 인지능 부족으로 철저한 혈당 조절이 불가능하다. 제 2형 당뇨병 역시 최종적으로는 제 1형 당뇨병 환자와 같이 인슐린 주사요법을 수행하여야 한다. 따라서 당뇨병 환자에게서 정상에 가까운 혈당을 유지시킬 수 있는 가장 근본적이고 이상적인 치료방법으로는 인슐린의 분비가 생리적으로 조절되는 췌장 혹은 췌도 이식이라고 할 수 있다.

이에, 최근에는 췌장 이식 및 췌도 이식을 통한 당뇨병 치료가 많이 시행되고 있다. 그러나, 췌장 이식의 경우 공여자의 절대 부족, 높은 수술 합병증, 지속적인 면역억제제의 투여를 비롯한 이식 후 관리의 어려움 등의 문제점이 있다. 췌도 이식은 췌장 이식과 달리 비교적 간편한 수술로 합병증 없이 쉽게 이식이 가능하며, 췌도 세포에 대한 수술 전 면역조절 등을 통해 면역관용(immune tolerance)을 유발하여 면역억제제 사용에 따른 부작용의 감소를 기대할 수 있고, 분리된 췌도 세포를 체외에서 배양 유지함으로써 가장 적절한 이식수술을 수행할 수 있는 장점이 있으나, 췌도 이식도 췌장 이식과 마찬가지로 공여자의 절대적 부족으로 인해 이식을 통한 당뇨병 치료에 어려움이 있다. 따라서, 췌도 이식을 통한 당뇨병 치료에 있어서 공여자의 절대적 부족 문제를 해결하기 위하여 베타세포의 시험관 내 증식방법, 성체 줄기세포인 췌관 세포의 분화 유도, 배아 줄기세포의 분화 유도, 태아 췌도 세포의 증식 방법 등 다양한 인체 췌도 세포의 증식방법과 함께 인간 이외의 동물 조직을 이용한 이종 이식(xenotransplantation)이 모색되고 있다.

이종 이식의 공급원으로 가장 이상적이라고 알려진 동물은 돼지이다. 이는 돼지의 인슐린이 오랜 기간 인체에 부작용없이 사용되어온 점을 비롯하여, 돼지의 인슐린 대사가 사람과 유사하고, 식용으로 널리 이용되고 있어 거부감이 적으며, 비교적 다루기가 쉽고, 많은 양의 췌도 세포를 가지고 있다는 장점이 있기 때문이다. 따라서, 사람과 유사한 인슐린 대사능력이 있는 베타세포를 가진 돼지의 췌도 세포를 이종이식의 공급원으로 사용할 수 있도록 하는 연구가 세계적으로 진행되고 있다(Wang, T., et al., 2008. Elliott, R.B., et al., 2007).

현재 이용되고 있는 췌도 이식 부위는 간문맥으로, 이를 통해 췌도 세포를 이식할 경우 상당한 혈액 매개 염증 반응이 생겨나는 문제점이 있으며, 이로 인해 이식된 췌도의 약 70% 정도가 생착 하기 전 사멸한다. 피하는 간문맥에 비해 이런 혈액매개 염증 반응이 없고 이식이 간편하며 부작용이 덜하다는 장점이 있는 반면에, 기 형성된 혈관의 양이 부족하여 상대적으로 많은 양의 췌도를 이식해야 하는 단점이 있다.

이에, 본 발명자는 상기와 같은 문제점을 해결한 새로운 췌도 세포 이식용 조성물을 개발하기 위해 노력한 결과, 저산소 상태에서 배양된 줄기세포가 코팅된 췌도 세포 이식용 생분해성 고분자 지지체가 생체 이식 후 혈관 형성을 촉진하고, 췌도 이식 시 적은 양의 세포로도 혈당 조절이 가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 저산소 상태에서 배양된 줄기세포가 코팅된 혈관 형성 촉진용 또는 췌도 세포 이식용 생분해성 고분자 지지체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 저산소 상태에서 배양된 줄기세포를 생분해성 고분자 지지체에 코팅하는 단계;를 포함하는 혈관 형성 촉진용 또는 췌도 세포 이식용 생분해성 고분자 지지체의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 저산소 상태에서 배양된 줄기세포가 코팅된 혈관 형성 촉진용 또는 췌도 세포 이식용 생분해성 고분자 지지체를 제공한다.

또한, 본 발명은 저산소 상태에서 배양된 줄기세포를 생분해성 고분자 지지체에 코팅하는 단계;를 포함하는 혈관 형성 촉진용 또는 췌도 세포 이식용 생분해성 고분자 지지체의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 저산소 상태에서 배양된 줄기세포가 코팅된 생분해성 고분자 지지체는, 독성이 없고, 이식 후 피하에 선혈관 형성을 촉진시키며, 간편한 췌도 세포 이식 및 제거가 가능하고, 적은 양의 췌도 세포로도 혈당 조절이 가능한 우수한 효과를 가지고 있어, 혈관 형성 촉진 또는 당뇨병 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 PLGA 지지체의 코팅 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 저산소 상태에서 배양된 줄기세포가 코팅된 PLGA 지지체의 내, 외부를 나타낸 도이다.
도 3은 정상 산소 상태에서 배양된 줄기세포 (N-MSC) 및 저산소 상태에서 배양된 줄기세포 (H-MSC) 의 표면 항원 발현을 나타낸 도이다.
도 4는 저산소 상태에서 배양된 줄기세포가 코팅된 PLGA 지지체 (HPLGA)를 마우스 피하에 이식하고 1달 후, 혈관 형성 정도를 나타낸 도이다 (PLGA : 세포 코팅 안함, NPLGA : 정상 산소 상태에서 배양된 줄기세포 코팅).
도 5는 저산소 상태에서 배양된 줄기세포가 코팅된 PLGA 지지체 (HPLGA)를 마우스 피하에 이식하고 1달 후, PLGA 지지체 무게당 헤모글로빈의 양을 나타낸 도이다 (PLGA only: 세포 코팅 안함, NPLGA : 정상 산소 상태에서 배양된 줄기세포 코팅).
도 6은 저산소 상태에서 배양된 줄기세포가 코팅된 PLGA 지지체를 마우스 피하에 이식한 후, 시간에 따른 PLGA 지지체 무게당 헤모글로빈의 양의 변화를 나타낸 도이다.
도 7 은 저산소 상태에서 배양된 줄기세포가 코팅된 PLGA 지지체를 마우스 피하에 이식한 후, 시간에 따른 PLGA 지지체의 무게 변화를 나타낸 도이다.
도8 은 저산소 상태에서 배양된 줄기세포가 코팅된 PLGA 지지체를 마우스 피하에 이식한 후, 시간에 따른 혈관형성 정도를 나타낸 도이다.
도9 는 본 발명의 저산소 상태에서 배양된 줄기세포가 코팅된 PLGA 지지체를 이용한 췌도 세포 이식 과정을 나타낸 모식도이다.
도 10 은 저산소 상태에서 배양된 줄기세포가 코팅된 PLGA 지지체 (H-MSC)를 마우스 피하에 이식하고, 당뇨를 유발시킨 후, PLGA 지지체 내에 췌도 세포를 이식하여 시간에 따른 혈당 변화를 나타낸 도이다 (PLGA only : 세포 코팅 안함, N-MSC : 정상 산소 상태에서 배양된 줄기세포 코팅).
도 11은 저산소 상태에서 배양된 줄기세포가 코팅된 PLGA 지지체 (H-MSC)를 마우스 피하에 이식하고, 당뇨를 유발시킨 후, PLGA 지지체 내에 췌도 세포를 이식하여 정상 혈당으로 도달하는 정도를 % [(정상혈당으로 돌아온 마우스 수 / 이식한 마우스 전체수) X 100]로 나타낸 도이다 (PLGA only : 세포 코팅 안함, N-MSC : 정상 산소 상태에서 배양된 줄기세포 코팅).
도12 는 저산소 상태에서 배양된 줄기세포가 코팅된 PLGA 지지체를 마우스 피하에 이식하고, 당뇨를 유발시킨 후, PLGA 지지체 내에 돼지 췌도 (5000,3000, 2000 IEQs)를 이식하였을 때, 각 마우스의 60일간의 평균 혈당을 나타낸 도이다.
도 13은 돼지 췌도 (3,000, 2,500, 2,000, 1500 IEQs)를 다혈관 기관인 신장내막에 이식하였을 때, 각 마우스의 60일간의 평균 혈당을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 저산소 상태에서 배양된 줄기세포가 코팅된 혈관 형성 촉진용 또는 췌도 세포 이식용 생분해성 고분자 지지체를 제공한다.

상기 저산소 상태는 정상 산소 상태인 20 농도% 보다 낮은 상태를 의미하는 것으로, 바람직하게는 1 내지 5 농도%이며, 보다 바람직하게는 3 농도%이다.

상기 줄기세포는 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 배아줄기세포 또는 중간엽 줄기세포일 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 골수(bone marrow), 재대혈, 혈액, 진피, 골막, 지방, 태반, 신경, 근육, 양수 등에서 분리될 수 있고, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 중간엽 줄기세포를 혈관내피세포 등으로 분화시켜 이용할 수도 있다.

상기 생분해성 고분자는 폴리글리콜산 (PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리락트산 (PLA)-폴리(L)라이신 공중합체, 폴리-ε-카프로락톤(PCL), 폴리아미노산 및 이들의 유도체와 공중합체를 포함하며 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA)를 이용하였다.

상기 생분해성 고분자 지지체는 저산소 상태에서 배양된 줄기세포의 코팅 전 콜라겐 코팅이 더 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 저산소 상태에서 배양된 줄기세포가 코팅된 생분해성 고분자 지지체는 독성이 없고, 이식 후 피하에 선혈관 형성을 촉진시키며, 간편한 췌도 세포 이식 및 제거가 가능하고, 적은 양의 췌도 세포로도 혈당 조절이 가능한 우수한 효과를 가지고 있어, 혈관 형성 촉진 또는 당뇨병 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 저산소 상태에서 배양된 줄기세포가 코팅된 췌도 세포 이식용 생분해성 고분자 지지체의 제조

1-1. 저산소 상태에서 중간엽 줄기세포의 배양

중간엽 줄기세포는 C57BL/6 (H2-K^b) 마우스의 골수에서 기존에 공지된 방법에 따라 수득하였다. 보다 구체적으로, 마우스의 대퇴골(femur)과 경골(tibia)의 골수로부터 단핵 세포를 수득하고, 이를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 DMEM (high-glucose Dulbecco modified Eagles medium)에서 배양하였다. 배양 72 시간 후 바닥에 붙지 않은 세포를 제거하고, 새로운 배지로 교체한 후 붙어있는 세포를 5-6 세대가 될 때까지 5% CO₂, 20 % O₂, 37 ℃의 배양 조건에서 계대 배양하였다.

저산소 상태에서 배양된 줄기세포를 수득하기 위하여, 상기 과정을 통해 수득한 5-6 세대의 중간엽 줄기세포를 5% CO₂, 3 % O₂, 37 ℃에서 7일간 배양하였다. 정상 산소 상태에서 배양한 대조군은 5% CO₂, 20 % O₂, 37 ℃에서 같은 기간 동안 배양하였다.

1-2. PLGA 지지체의 제조

PLGA (Poly (lactide-co-glycolide)) 지지체를 제조하기 위하여, PLGA 분말 (Mw= 97,000, 8.5wt %; BoehringerIngelheim,Ingelheim, Germany) 및 NaCl (지름= 300-500 μm, 91.5wt%)을 준비하였다. 상기 PLGA 분말 및 NaCl을 균질하게 섞은 후, 디스크 몰드에 넣고, 150MPa의 압력으로 상온에서 3분간 수압 프레스 (hydraulic press)를 이용하여 처리하여 PLGA 지지체를 형성하였다. 상기 PLGA디스크를 210°C에서 30분간 열처리하였다. NaCl 입자는 멸균수에서 침출하여 지지체로부터 제거되었다.

1-3. PLGA 지지체에 콜라겐 및 저산소 상태에서 배양된 줄기세포 코팅

상기 실시예 1-2에서 수득한 PLGA 지지체에 세포 부착을 촉진하기 위하여 세포 코팅 전 콜라겐 코팅을 수행하였다. 먼저 PLGA 지지체 (length: width: height=10:5:2mm)를 콜라겐 용액 (1mg/ml, type 1 from rat tail, BD bioscience)으로 충분히 적신 후, 상온에서 1시간 동안 교반 배양하였다. PLGA 지지체의 내부를 코팅하기 위하여 콜라겐 용액을 포함하고 있는 주사기를 이용하였다. 이를 3시간 동안 말린 후, PBS 완충액으로 완전하게 세척하고, 4℃에서 보관하였다.

상기 콜라겐 코팅된 PLGA 지지체에 상기 실시예 1-1에서 수득한 저산소 상태에서 배양된 중간엽 줄기세포를 코팅하였다. 먼저 2.5 X 10⁵ 개의 세포를 주사기를 이용하여 PLGA 지지체의 내부를 코팅하고, 밤새 저산소 상태에서 배양된 중간엽 줄기세포 하에서 배양하였다.

이상의 제조과정을 도 1에 모식도로 나타내었다.

또한, GFP를 발현하는 중간엽 줄기세포를 이용하여, 최종적으로 형성된 저산소 상태에서 배양된 중간엽 줄기세포를 코팅한 PLGA 지지체의 내, 외부를 관찰하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 PLGA 지지체의 내, 외부에 모두 저산소 상태에서 배양된 중간엽 줄기세포가 고르게 분포하고 있는 것을 확인하였다.

실험예 1. 저산소 상태에서 배양된 줄기세포의 표면 항원 분석

상기 실시예 1-1에서 수득한 저산소 상태 (3 % O₂)에서 배양된 중간엽 줄기세포의 특성을 확인하기 위하여, 줄기세포 특이 표면 항원의 존재여부를 유세포 분석을 통해 확인하였다. 대조군으로 정상 산소 상태 (20 % O₂)에서 배양된 중간엽 줄기세포를 이용하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 저산소 상태에서 배양된 줄기세포는 정상 산소 상태에서 배양된 중간엽 줄기세포의 표면 항원과 크게 다르지 않음을 확인하였다.

실험예 2. 저산소 상태에서 배양된 줄기세포가 코팅된 췌도 세포 이식용 생분해성 고분자 지지체의 피하 이식 시 선혈관 형성 촉진 효과 검증

상기 실시예 1에서 수득한 저산소 상태에서 배양된 줄기세포가 코팅된 췌도 세포 이식용 생분해성 고분자 지지체의 피하 이식 시 선혈관 형성 촉진 효과를 검증하기 위하여, 면역 결핍 모델인 NOD-SCID 마우스의 측복근 (lateral abdominal) 내 피하에 PLGA 지지체 (length : width : height = 10 cm : 5 cm : 2 cm)를 이식하였다. 대조군으로 세포를 코팅하지 않은 PLGA 지지체 및 정상 산소 상태에서 배양된 중간엽 줄기세포를 코팅한 PLGA 지지체를 이용하였다. 이식 1주일 후 결합 조직이 본 발명의 다공성 PLGA 지지체를 관통하고, 덮는 것을 확인하였다. 이식 1 달 후, 이식된 PLGA 지지체를 분리하여 혈관 형성 정도를 현미경 및 면역 조직학적 분석을 통해 확인하였으며, PLGA 지지체 내의 헤모글로빈 양을 측정하였다. 그 결과를 각각 도 4 및 도 5에 나타내었다. 실험 기간 동안 PLGA 지지체의 이식은 어떠한 감염이나 암 발병 등의 영향을 미치지 않았다.

도 4및 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 저산소 상태에서 배양된 중간엽 줄기세포를 코팅한 PLGA 지지체는 세포가 코팅되지 않은 PLGA 지지체 및 세포가 정상 산소 상태에서 배양된 중간엽 줄기세포를 코팅한 PLGA 지지체에 비해 현저하게 선혈관 형성이 촉진되며, 헤모글로빈을 다량 포함하고 있음을 확인하였다.

또한, 췌도 세포 이식에 적합한 최적의 시기를 결정하기 위하여, PLGA 지지체 이식 후 혈관 형성 정도 및 PLGA 지지체의 분해 정도를 시간에 따라 분석하였다. 그 결과를 도 6 내지 도 8에 나타내었다.

도 6 내지 도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 저산소 상태에서 배양된 중간엽 줄기세포를 코팅한 PLGA 지지체의 총 헤모글로빈 양은 이식 4주 후 최대치였으며, 생분해성 고분자인 PLGA의 가수분해로 인해 PLGA 지지체의 크기가 감소하여, 무게당 헤모글로빈의 양은 이식 후 6주까지 증가하였다. 이를 통해, 혈관 형성 정도 및 PLGA 지지체의 물리적 강도를 종합적으로 고려하여 PLGA 지지체 이식 4-5주 후가 췌도 세포 이식에 적합한 시기임을 확인하였다.

실험예 3. 저산소 상태에서 배양된 줄기세포가 코팅된 췌도 세포 이식용 생분해성 고분자 지지체의 당뇨 모델에서 혈당 조절 효과 검증

상기 실시예 1에서 수득한 저산소 상태에서 배양된 줄기세포가 코팅된 췌도 세포 이식용 생분해성 고분자 지지체의 당뇨 모델에서 혈당 조절 효과를 검증하기 위하여, 당뇨병이 유도된 마우스의 피하에 저산소 상태에서 배양된 중간엽 줄기세포를 코팅한 PLGA 지지체를 이식하여 선혈관 형성을 촉진하고, 돼지의 췌도 세포를 이식하여 혈당 조절 효과를 확인하였다. 보다 구체적으로, 췌도 세포 이식을 위한 공간을 만들기 위하여, 저산소 상태에서 배양된 중간엽 줄기세포의 코팅 전 PLGA 지지체 (length: width: height=10:5:2mm) 내에 직경 1mm 정도의 원통형 구멍을 2개 만들고, 여기에 Teflon stopper를 넣어 구멍을 메웠다. 상기 PLGA 지지체를 상기 실시예 1-3과 동일한 방법으로 콜라겐 및 저산소 상태에서 배양된 중간엽 줄기세포를 코팅하고, 마우스의 측복근 내 피하에 이식하였다. 이식 1달 후, 상기 마우스에 당뇨를 유발하기 위하여, 125 mg/kg/day의 스트렙토조토신 (streptozotocin, STZ; Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA)을 2일간 정맥 주사하였다. 1 주일 후, PLGA 지지체 내의 Teflon stopper를 제거하고, 이로 인해 생긴 구멍에 5,000 IEQs 의 돼지 췌도 세포를 이식하였다. 췌도 세포 이식 후 1주일에 두 번씩 비공복 혈당을 측정하였으며, 이식 70일 후 PLGA 지지체를 제거하였다. 대조군으로 세포를 코팅하지 않은 PLGA 지지체 및 정상 산소 상태에서 배양된 중간엽 줄기세포를 코팅한 PLGA 지지체를 이용하였다.

이상의 실험 과정을 도 9에 모식도로 나타내었으며, 실험기간 동안의 혈당치 및 췌도 세포 이식 후 당뇨가 치료된 비율을 각각 도 10 및 도 11에 나타내었다.

도 10및 도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 저산소 상태에서 배양된 중간엽 줄기세포를 코팅한 PLGA 지지체는 세포가 코팅되지 않은 PLGA 지지체 및 세포가 정상 산소 상태에서 배양된 중간엽 줄기세포를 코팅한 PLGA 지지체에 비해 당뇨 모델에서 췌도 세포 이식을 통해 혈당 조절 효과가 현저하게 우수함을 확인하였다. 특히, 본 발명의 저산소 상태에서 배양된 중간엽 줄기세포를 코팅한 PLGA 지지체를 이용하여 췌도 세포 이식을 한 마우스는 비공복 혈당이 200 mg/dl 이하로 유지되어, 당뇨가 100% 치료됨을 확인하였다. 또한, PLGA 지지체의 제거 후, 다시 고혈당이 발생하는 것을 통해 상기와 같은 혈당 조절 효과는 오직 췌도가 이식된 PLGA 지지체 단독에 의해 이루어지는 것임을 확인하였다.

실험예4 . 저산소 상태에서 배양된 줄기세포가 코팅된 췌도 세포 이식용 생분해성 고분자 지지체에 의한 췌도 이식 요구량 감소 효과 확인

상기 실시예 1에서 수득한 저산소 상태에서 배양된 줄기세포가 코팅된 췌도 세포 이식용 생분해성 고분자 지지체에 의한 췌도 이식 요구량 감소 효과를 검증하기 위하여, 상기 실험예 3과 동일한 방법으로 마우스 피하에 본 발명의 PLGA 지지체를 이식한 후, 췌도 이식 최소 요구량 (Marginal islet mass required for diabetes control)을 확인하였다. 대조군은 다혈관 기관인 신장 내막에 췌도를 이식하였다. 그 결과를 도 12 및 도 13에 나타내었다.

도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 저산소 상태에서 배양된 중간엽 줄기세포를 코팅한 PLGA 지지체를 마우스 피하에 이식하여 선혈관을 형성하게 한 후, 췌도를 이식할 경우에는 췌도 이식 최소 요구량이 2,000 IEQ임을 확인하였다. 이러한 결과는 다혈관 기관인 신장 내막에 췌도를 이식했을 때와 비슷한 수준으로, 지금까지 알려진 간문맥에 췌도를 이식했을 때 (신장 내막에 이식하는 경우의 5~6배 높게 요구, (H.I. Kim, J.E. Yu, C.G. Park, S.J. Kim, Comparison of four pancreatic islet implantation sites, Journal of Korean medical science, 25 (2010) 203-210.))에 비해 췌도 이식 요구량이 현저하게 감소한 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 저산소 상태에서 배양된 중간엽 줄기세포가 코팅된 췌도 세포 이식용 생분해성 고분자 지지체를 이용할 경우, 적은 양의 췌도 세포로도 우수한 당뇨 치료 효과를 얻을 수 있다.

Claims

1 내지 5농도%의 저산소 상태에서 배양된 중간엽 줄기세포가 코팅된 혈관 형성 촉진용 또는 췌도 세포 이식용 생분해성 고분자 지지체.

삭제

제 1항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 폴리글리콜산 (PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리락트산 (PLA)-폴리(L)라이신 공중합체, 폴리-ε-카프로락톤(PCL) 및 폴리아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 혈관 형성 촉진용 또는 췌도 세포 이식용 생분해성 고분자 지지체.

제 1항에 있어서, 상기 생분해성 고분자 지지체는 중간엽 줄기세포의 코팅 전 콜라겐 코팅이 더 이루어지는 것을 특징으로 하는, 혈관 형성 촉진용 또는 췌도 세포 이식용 생분해성 고분자 지지체.

제 1항에 있어서, 상기 췌도 이식은 피하에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 혈관 형성 촉진용 또는 췌도 세포 이식용 생분해성 고분자 지지체.

1 내지 5농도%의 저산소 상태에서 배양된 중간엽 줄기세포를 생분해성 고분자 지지체에 코팅하는 단계; 를 포함하는 혈관 형성 촉진용 또는 췌도 세포 이식용 생분해성 고분자 지지체의 제조방법.