CN110227058A - 多效因子组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医学美容技术领域，尤其涉及一种多效因子组合物，包括：0.01％～1％的低氧预处理的多效因子溶液，0.05％～1％的透明质酸钠，2％～10％的甘露糖醇，0.5％～2％的抗坏血酸钠，0.5％～2％泛醇，0.05％～0.2％的苯氧乙醇，余量为水。本发明提供的多效因子组合物不仅可以对肌肤进行营养和组织填充，同时多效因子组合中的细胞因子簇还可在皮下深层组织参与基底细胞的修复，使本发明实施例提供的多效因子组合物的修复作用更加明显。

Description

多效因子组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医学美容技术领域，尤其涉及一种多效因子组合物及其制备方法和应用。

背景技术

衰老，一直是人类生存史上的永恒话题，尤其是随着年龄的增长，人体对外呈现的皮肤，包括面部、颈部、手部等各部位的皮肤也会随着年龄的不断增长而发生巨大变化，最直观的表现便是皮肤发生褶皱、松弛，皮肤色泽变暗，纹理斑点增多。另外，环境因素、不健康饮食和生存压力等因素的影响也会加剧皮肤状况的恶化。目前市面上各种具有抗衰、去皱、美白等功效的化妆品和保养品琳琅满目，但是由于表皮只能透过小分子物质，且经由皮肤的扩散作用十分缓慢，故而这些化妆品中的有效成分真正能深入皮层发挥功效的微乎其微。皮肤中的胶原决定了皮肤的弹性，其占皮肤干重的70％，以胶原纤维的形式存在。

20世纪50年代，法国医生麦克.皮斯特提出了一种中胚层疗法，启发了医学美容界。经过多年的研发开发出了水光针技术，水光针通过采用超微渗透技术，定位、定层、定量的把含有多种营养成分的皮肤营养成份直接透过表皮输送到皮下深层组织，这就解决了各种美容保养产品很难被皮肤吸收的弱点。目前市场上水光针注射的成分以玻尿酸为主，由于是浅表层注射，要求注射物有一定的流动性，推挤力不可过大，故所用的玻尿酸绝大部分是未经交联过的透明质酸或单组分细胞因子。但其注射后效果比较单一、维持时间较短，若要达到较好的效果则需要多次注射。同时，现有水光针产品均为微观无序结构，与皮肤中胶原纤维的微观有序聚集结构相去甚远，无法诱导细胞迁移和增殖。因而没有基底细胞损伤修复功能，只是单纯填充或炎症修复作用。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种用于水光治疗的多效因子组合物，旨在解决水治疗效果药物单一、维持时间较短、只是单纯填充或炎症修复作用而没有基底细胞损伤修复功能的技术问题。

本发明实施例的另一目的在于提供一种多效因子组合物的制备方法。

本发明实施例的又一目的在于提供一种皮肤护理产品。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种多效因子组合物，以所述多效因子组合物的质量为100％计，包括：

优选地，所述低氧预处理的多效因子溶液包含低氧预处理的间充质干细胞的提取液，所述间充质干细胞选自：脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞中的一种；

优选地，所述透明质酸钠选自：分子量为100～180万道尔顿的中分子量透明质酸钠，和/或分子量为40～100万道尔顿的小分子量透明质酸钠。

相应地，一种多效因子组合物的制备方法，包括以下步骤：

获取低氧预处理的多效因子溶液；

获取配方量的水，灭菌处理，得到灭菌水；

获取配方量的透明质酸钠添加到温度为60℃～75℃的所述灭菌水中，搅拌溶解获得透明质酸钠水溶液；

获取配方量的甘露糖醇、低氧预处理的多效因子溶液、抗坏血酸钠、泛醇和苯氧乙醇，添加到降温至28℃～33℃的所述透明质酸钠水溶液中，混合均匀得到多效因子组合物。

优选地，所述获取低氧预处理的多效因子溶液的方法为：

获取间充质干细胞，于4～6v/v％的CO₂，温度为36℃～38℃，pH值为7.2～7.4，相对饱和湿度为95％～98％的环境下培养68～75小时；

将上述间充质干细胞于氧含量为5～10％的环境下培养16～18小时，获得低氧预处理的间充质干细胞；

收集上述低氧预处理的间充质干细胞的上清液，对所述上清液依次进行离心处理和过滤处理，得到低氧预处理的多效因子溶液。

优选地，所述离心处理的条件为：离心转速为1800～3000rpm，离心时间为15～20min，收集上清液；和/或，

所述过滤处理的条件为：使用孔径为10nm～50nm的滤膜对离心后的所述上清液进行过滤，收集滤液；和/或，

所述间充质干细胞选自：脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞中的一种。

优选地，所述灭菌处理的方法为：将配方量的水加热至80℃～88℃，保温20分钟～60分钟。

优选地，包括以下步骤：

获取所述低氧预处理的多效因子溶液；

获取配方量的水，灭菌处理，得到灭菌水；

获取配方量的所述透明质酸钠添加到温度为60℃～75℃的所述灭菌水中，搅拌溶解获得透明质酸钠水溶液；

获取配方量的所述甘露糖醇、所述低氧预处理的多效因子溶液、所述抗坏血酸钠和所述泛醇，添加到降温至28℃～33℃的所述透明质酸钠水溶液中，混合均匀得到多效因子组合物；

将所述多效因子组合物装瓶，冻干处理，获得多效因子组合物冻干粉。

优选地，所述冻干处理的方法为：

将所述多效因子组合物冻至-50℃～-40℃，保持2小时，抽真空至10～12Pa；

降温至-80℃～-90℃，抽真空至10～12Pa，冻干20小时～25小时至所述多效因子组合物中水分≤2％。

进一步地，一种皮肤护理产品，所述皮肤护理产品包含上述多效因子组合物。

本发明实施例提供的多效因子组合物，包括低氧预处理的多效因子、透明质酸钠、甘露糖醇、抗坏血酸钠、泛醇、苯氧乙醇等组分。本发明实施例提供的低氧预处理的多效因子溶液是一种经过特殊处理所得到的细胞因子簇，经过低氧预处理的多效因子溶液中细胞活性更高，增殖能力和多向分化潜能也更好。因而本发明实施例提供的低氧预处理的多效因子溶液，相对于没有进行低氧预处理的多效因子溶液，对皮肤组织有更好的修复功能和促进细胞生长效果。另外，通过低氧预处理的多效因子溶液，提高皮下深层组织细胞的活性，从而促进了促进组织细胞对透明质酸钠、抗坏血酸钠、泛醇、甘露糖醇等营养物质的吸收。低氧预处理的多效因子溶液配合透明质酸钠、抗坏血酸钠、泛醇、甘露糖醇等其他修复和抗氧化成分，通过各组分之间的协同作用，复配使用效果远高于各自单独使用的效果或者各组分各自效果的简单叠加，协同效果明显。本发明实施例提供的多效因子组合物不仅可以对肌肤进行营养和组织填充，同时，多效因子组合中的细胞因子簇还可在皮下深层组织参与基底细胞的修复，使本发明实施例提供的多效因子组合物的修复作用更加明显。

本发明提供的多效因子组合物的制备方法，获取低氧预处理的多效因子溶液后，首先对水进行灭菌处理，然后在适宜的水温下依次添加透明质酸钠，甘露糖醇、抗坏血酸钠、泛醇、苯氧乙醇以及获得的低氧预处理的多效因子溶液，再通过搅拌溶解即可获得多效因子组合物。本发明提供的多效因子组合物的制备工艺简单，易于保存和实现工业化生产。

本发明提供的皮肤护理产品由于含有上述低氧预处理的多效因子组合物，不仅可以对肌肤进行营养和组织填充，同时多效因子组合中的细胞因子簇还可在皮下深层组织参与基底细胞的修复。

附图说明

图1是本发明实施例提供的低氧预处理的多效因子组、未低氧处理的多效因子组和玻尿酸组人体试验后，采用VISIA仪器检测面部斑点情况图。

图2是本发明实施例提供的低氧预处理的多效因子组、未低氧处理的多效因子组和玻尿酸组人体试验后，采用VISIA仪器检测面部毛孔情况图。

图3是本发明实施例提供的低氧预处理的多效因子组、未低氧处理的多效因子组和玻尿酸组人体试验后，采用VISIA仪器检测面部皱纹情况图。

图4是本发明实施例提供的低氧预处理的多效因子组、未低氧处理的多效因子组和玻尿酸组人体试验后，采用VISIA仪器检测面部紫外线色斑情况图。

图5是本发明实施例提供的低氧预处理的多效因子组、未低氧处理的多效因子组和玻尿酸组人体试验后，采用VISIA仪器检测面部棕色斑情况图。

图6是本发明实施例提供的低氧预处理的多效因子组、未低氧处理的多效因子组和玻尿酸组人体试验后，采用VISIA仪器检测面部红色区情况图。

图7是本发明实施例提供的低氧预处理的多效因子组、未低氧处理的多效因子组和玻尿酸组人体试验后，采用VISIA仪器检测面部纹理情况图。

图8是本发明实施例提供的低氧预处理的多效因子组、未低氧处理的多效因子组和玻尿酸组人体试验后，采用VISIA仪器检测面部紫质情况图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

本发明实施例提供了一种多效因子组合物，以所述多效因子组合物的质量为100％计，包括：

本发明实施例提供的多效因子组合物，包括低氧预处理的多效因子、透明质酸钠、甘露糖醇、抗坏血酸钠、泛醇、苯氧乙醇等组分。本发明实施例提供的低氧预处理的多效因子溶液是一种经过特殊处理所得到的细胞因子簇，经过低氧预处理的多效因子溶液中细胞活性更高，增殖能力和多向分化潜能也更好。因而本发明实施例提供的低氧预处理的多效因子溶液，相对于没有进行低氧预处理的多效因子溶液，对皮肤组织有更好的修复功能和促进细胞生长效果。另外，通过低氧预处理的多效因子溶液，提高皮下深层组织细胞的活性，从而促进了促进组织细胞对透明质酸钠、抗坏血酸钠、泛醇、甘露糖醇等营养物质的吸收。低氧预处理的多效因子溶液配合透明质酸钠、抗坏血酸钠、泛醇、甘露糖醇等其他修复和抗氧化成分，通过各组分之间的协同作用，复配使用效果远高于各自单独使用的效果或者各组分各自效果的简单叠加，协同效果明显。本发明实施例提供的多效因子组合物不仅可以对肌肤进行营养和组织填充，同时，多效因子组合中的细胞因子簇还可在皮下深层组织参与基底细胞的修复，使本发明实施例提供的多效因子组合物的修复作用更加明显。

具体地，上述低氧预处理的多效因子溶液是一种经过特殊处理所得到的细胞因子簇，它的组成成分、成分配比都类似于内源性细胞在体分泌的组分，具有修复损伤组织、促进细胞生长等多种功能具有多效性、重叠性、拮抗性、协同性等多种生理特性，形成了十分复杂的细胞因子调节网络。由于低氧环境可影响细胞的分化，并可调节低氧诱导因子等信号通路，影响低氧相关microRNA表达等途径影响细胞的活性和功能。且低氧环境也可影响细胞代谢，增强细胞的负向调控能力。因此，低氧预处理的细胞有更强大的自我更新增殖能力和多向分化潜能，其分泌的多效因子溶液有更好的修复性能。并且，通过低氧预处理的多效因子溶液与透明质酸钠、抗坏血酸钠、泛醇、甘露糖醇等其他修复和抗氧化成分配合协同作用，不仅可以使组合物中各营养组分发挥更好的功效，对肌肤进行营养和组织填充，同时能使多效因子组合中的细胞因子簇在皮下深层组织发挥更好的基底细胞的修复功效，使本发明实施例提供的多效因子组合物的修复作用更加明显。

具体地，上述透明质酸钠本身是人体皮肤的构成之一，是人体内分布最广的一种酸性黏糖，存在于结缔组织的基质中，具有良好的保湿作用。将其用于化妆品中，能起到独特的保护皮肤作用，可保持皮肤滋润光滑，细腻柔嫩，富有弹性，具有防皱、抗皱、美容保健和恢复皮肤生理功能的作用。配合低氧预处理的多效因子溶液、甘露糖醇、抗坏血酸、泛醇等营养组分，通过对组织的包的修复和细胞活性的增强，使组织细胞对组合物中营养组分有更好的吸收消化功能，从而增强了本发明实施例多效因子组合物的保湿、防皱、抗皱、恢复皮肤生理功能等功效。

具体地，上述甘露糖醇是一种非还原性单糖，存在于众多动植物体(尤其是海藻和蘑菇)内。甘露糖醇对人体内常见的过氧亚硝基阴离子自由基有很高的清除能力。人体内过量的自由基是人衰老的主要元凶之一，过氧亚硝基阴离子是超氧自由基和亚硝基离子的结合，也是一种体内常见的自由基，此自由基与色素沉着相关，甘露糖醇对它的消除有利于皮肤的调理和抗衰，对皮肤过敏也有一定程度的抑制作用。因此，甘露糖醇可抑制对皮肤的光伤害和光老化，并有保湿功能。另外，通过配合能有效增加细胞活性、修复细胞损伤的低氧预处理的多效因子溶液，在甘露糖醇消除自由基的同时，也增加了细胞自身对自由基的修复能力，从而使本发明实施例提供的多效因子组合物具有更好的防止色素沉积，抗光伤害老化等功效。

具体地，上述抗坏血酸钠，又称维生素C钠，维生素C是一种多羟基化合物，具有很强的还原性，很容易被氧化成脱氢维生素C。维生素C为抗体及胶原形成的高效抗氧化剂，在人体内可用来减轻抗坏血酸过氧化物酶基底的氧化应力，能够抗氧化，抗自由基，抑制酪氨酸酶的形成，从而达到美白，淡斑的功效。另外，维生素C能促进组织修补，促进苯丙氨酸、酪氨酸、叶酸的代谢，促进铁、碳水化合物的利用，促进脂肪、蛋白质的合成，维持免疫功能，保持血管的完整，促进非血红素铁吸收等功效。通过低氧预处理的多效因子溶液、甘露糖醇等营养组分的配合，使本发明实施例提供的多效因子组合物的抗氧化、抗自由基等功效更显著，在防止色素沉积、抗光损伤老化的基础上，兼具美白、淡斑的效果。

具体地，上述泛醇，又称维生素原B5，主要用作保湿剂和皮肤调理剂，经皮肤吸收后可增加皮肤中透明质酸含量，促进人体蛋白质、脂肪、糖类的代谢，保护皮肤和黏膜，防治小皱纹，炎症、日晒，是不黏腻的保湿成分。具有强效保湿效果，且与皮肤皮脂膜相近，易于吸收渗透及浸润肌肤表面的角质层，使肌肤柔软，有效预防肌肤粗糙现象，达到肌肤保湿与组织修复的功效，给予皮肤光泽。经皮肤吸收后可增加皮肤中透明质酸含量，促进人体蛋白质、脂肪、糖类的代谢，保护皮肤和黏膜，防治小皱纹，炎症、日晒，是不黏腻的保湿成分，具有强效保湿效果，且与皮肤皮脂膜相近，易于吸收渗透及浸润肌肤表面的角质层，使肌肤柔软，有效预防肌肤粗糙现象，达到肌肤保湿与组织修复的功效，给予皮肤光泽。泛醇与能有效增加细胞活性、修复细胞损伤的低氧预处理的多效因子溶液、抗坏血酸、透明质酸钠等营养成分的配合，促进了皮肤对透明质酸等营养物质的的吸收，因而使本发明实施例提供的多效因子组合物有更好的保湿、防治小皱纹、防治炎症、抗光伤害和老化等作用，能更好的实现肌肤保湿与组织修复功效，给予皮肤光泽。

具体地，上述苯氧乙醇是具有抗菌功效的化妆品中常见的防腐剂，属于相对比较安全的防腐剂之一，能够抑制微生物在化妆品中的生长和繁殖，保持化妆品的性质稳定，使其不易变质，延长保存时间。苯氧乙醇防腐剂能有效保持多效因子、甘露醇、透明质酸钠、抗坏血酸钠、泛醇等各组分稳定不变质，便于本发明实施例提供的多效因子组合物保存运输以及批量化生产。

作为优选实施例，所述低氧预处理的多效因子溶液包含低氧预处理的间充质干细胞的提取液，所述间充质干细胞选自：脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞中的一种或几种。在低氧条件下，可以提高间充质干细胞的生存能力和减少细胞凋亡，但对间充质干细胞的表型和分化能力没有影响。在低氧环境下，细胞通过提高表达缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)来增强细胞自噬调节。因此，低氧预处理增强了细胞活性，提高了存活率，减少了凋亡。间充质干细胞更强大的自我更新增殖能力和多向分化潜能使低氧预处理的多效因子溶液的治疗、修复潜能也随之增强。具体地，间充质干细胞是属于中胚层的一种多能干细胞，主要存在于多种组织，如骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织等，以骨髓组织中含量最为丰富。它具有干细胞的所有共性，具有强大的自我更新增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。间充质干细胞通过细胞间的相互作用及产生细胞因子促进促炎型巨噬细胞M1向抗炎型巨噬细胞M2的转化，从而发挥免疫重建的功能。本发明实施例提取低氧预处理的间充质干细胞天然分泌的复合因子作为多效因子溶液添加到组合物中，通过低氧预处理的间充质干细胞强大的自我更新增殖能力和多向分化潜能，使组合物具有多效协同修复的效果。另外，复合甘露糖醇、泛醇、抗坏血酸钠等其他修复和抗氧化成分，在修复基底细胞抗衰的同时可以提亮、美白、稳定肌肤。

作为优选实施例，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。脐带间充质干细胞是以人脐带血血清为主体培养体系的脐带间充质干细胞培养扩增的方法。脐带间充质干细胞具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。从人脐带中分离出脐带间充质干细胞，细胞含量、增殖能力优于骨髓、脂肪等其他间充质干细胞，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点。另外，与其他应用也较为广泛的脂肪和骨髓间充质干细胞相比，脐带间充质干细胞是非侵入性收获程序所需的，满足间充质干细胞的标准，并且表现出比来自其他来源的间充质干细胞更显著的细胞因子分泌概况。

作为优选实施例，所述透明质酸钠选自：分子量为100～180万道尔顿的中分子量透明质酸钠，和/或分子量为40～100万道尔顿的小分子量透明质酸钠。中分子量的透明质酸钠具有紧致肌肤，长久保湿的功效。小分子量的透明质酸能渗入真皮，具有轻微扩张毛细血管，增加血液循环、改善中间代谢、促进皮肤营养吸收作用，具有较强的消皱功能，可增加皮肤弹性，延缓皮肤衰老。更优选地，所述透明质酸钠选自分子量为40～100万道尔顿的小分子量透明质酸钠。小分子量的透明质酸钠可以轻松地进入到皮肤表皮的基底层，能更好的补充真皮层缺失的水分，起到深层锁水、保水的功效，发挥更好的修复损伤肌肤，保湿嫩肤的作用。

本发明实施例还提供了一种多效因子组合物的制备方法，包括以下步骤：

S10.获取低氧预处理的多效因子溶液；

S20.获取配方量的水，灭菌处理，得到灭菌水；

S30.获取配方量的透明质酸钠添加到温度为60℃～75℃的所述灭菌水中，搅拌溶解获得透明质酸钠水溶液；

S40.获取配方量的甘露糖醇、低氧预处理的多效因子溶液、抗坏血酸钠、泛醇和苯氧乙醇，添加到降温至28℃～33℃的所述透明质酸钠水溶液中，混合均匀得到多效因子组合物。

本发明实施例提供的多效因子组合物的制备方法，获取低氧预处理的多效因子溶液后，首先对水进行灭菌处理，然后在适宜的水温下依次添加透明质酸钠，甘露糖醇、抗坏血酸钠、泛醇、苯氧乙醇以及获得的低氧预处理的多效因子溶液，再通过搅拌溶解即可获得多效因子组合物。本发明实施例提供的多效因子组合物的制备工艺简单，易于保存和实现工业化生产。

具体地，上述步骤S10中，获取低氧预处理的多效因子溶液的方法为：

S11.获取间充质干细胞，于4～6v/v％的CO₂，温度为36℃～38℃，pH值为7.2～7.4，相对饱和湿度为95％～98％的环境下培养68～75小时；

S12.将上述间充质干细胞于氧含量为5～10％的环境下培养16～18小时，，获得低氧预处理的间充质干细胞；

S13.收集上述低氧预处理的间充质干细胞的上清液，对所述上清液依次进行离心处理和过滤处理，得到低氧预处理的多效因子溶液。

具体地，上述步骤S11中，获取间充质干细胞，于4～6v/v％的CO₂，温度为36℃～38℃，pH值为7.2～7.4，相对饱和湿度为95％～98％的环境下培养68～75小时。该培养环境是模拟形成一个类似细胞/组织在生物体内的生长环境。优选地，每毫升培养液中接种1.0*10⁵个干细胞，在CO₂浓度为5v/v％，温度为37℃，pH值为7.2，相对饱和湿度为95％的培养箱中培养72小时。CO₂浓度为5v/v％是在一定温度和湿度条件下平衡培养瓶中培养液pH值的，细胞生长的pH是有个最佳的范围的。

优选地，所述间充质干细胞为第三代间充质干细胞，第三代间充质干细胞以均一长梭形的细胞为主，细胞周边有较多的丝状伪足，并形成毗邻细胞之间的网状连接，此时细胞核较大，核膜清晰，含两三个核仁，核质比较小，此时干细胞生命力旺盛，细胞增殖和分化能力强。而干细胞在4代后端粒酶长度明显变短，细胞衰老速度加快，因此采用第三代间充质干细胞为培养对象，接种培养后得到第4代细胞进行使用。

具体地，上述步骤S12中，将上述间充质干细胞于氧含量为5～10％的环境下培养16～18小时，获得低氧预处理的间充质干细胞。在一些实施例中，采用第三代间充质干细胞为培养对象，每毫升培养液中接种1.0*10⁵个干细胞，在条件为CO₂浓度为5v/v％，温度为37℃，pH值为7.2，相对饱和湿度为95％的培养箱中，培养72小时。调节低氧状态至氧含量5～10％，并将所述间充质干细胞在低氧状态下培养16～18小时。当间充质干细胞的数量能够达到5×10⁵～2×10⁶个/mL时，表明低氧预处理有促进干细胞的生长，此时的干细胞为有效的低氧预处理的间充质干细胞。

具体地，上述步骤S13中，收集上述低氧预处理的间充质干细胞的上清液，对所述上清液依次进行离心处理和过滤处理，得到低氧预处理的多效因子溶液。

在一些实施例中，所述离心处理的条件为：离心转速为1800～3000rpm，离心时间为15～20min，收集上清液。通过离心处理分离低氧预处理的间充质干细胞和所述干细胞分泌的上清液。

在一些实施例中，所述过滤处理的条件为：使用孔径为10nm～50nm的滤膜对离心后的所述上清液进行过滤，收集滤液。进一步滤除上清液中的小分子杂质、细胞间质等杂质。

在一些实施例中，所述间充质干细胞选自：脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞中的一种。

在一些实施例中，所述离心处理的条件为：离心转速为1800～3000rpm，离心时间为15～20min，收集上清液。所述过滤处理的条件为：使用孔径为10nm～50nm的滤膜对离心后的所述上清液进行过滤，收集滤液。所述间充质干细胞选自：脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞中的一种。

具体地，上述步骤S20中，获取配方量的水，灭菌处理，降温至55℃～65℃得到灭菌水。首先对水进行灭菌处理，除去水中的细菌、微生物等营养体，避免水中微生物营养体对后续多效因子组合物各组分的感染，同时也防止微生物污染组合物，使组合物容易变质。本发明实施例对灭菌处理的方式不做具体的限定，只要能达到上述灭菌效果即可。

在一些实施例中，所述灭菌处理的方法为：将配方量的水加热至80℃～88℃，保温20分钟～60分钟。将水加热至80～88℃，在该温度范围内，可以杀灭水中的绝大多数细菌和微生物，再通过保温20分钟～60分钟确保水中细菌、微生物等营养体全部杀灭。

具体地，上述步骤S30中，获取配方量的透明质酸钠添加到温度为60℃～75℃的所述灭菌水中，搅拌溶解获得透明质酸钠水溶液。透明质酸钠是具有较好的配伍性、相容性的高粘度大分子，其溶解相对较慢。升高水温至60℃～75℃，有利于加速透明质酸钠在水中的溶解，再结合搅拌进一步加速透明质酸的溶解速度。搅拌的方式对透明质酸钠的溶解速度影响也很重要。在一些实施例中，搅拌需能使液体翻腾，形成湍流，尤其是在透明质酸钠的添加过程，持续搅拌20～60分钟即可使透明质酸钠完全溶解在水中。

具体地，上诉步骤S40中，获取配方量的甘露糖醇、低氧预处理的多效因子溶液、抗坏血酸钠、泛醇和苯氧乙醇，添加到降温至28℃～33℃的所述透明质酸钠水溶液中，混合均匀得到多效因子组合物。本发明实施例添加的甘露糖醇、低氧预处理的多效因子溶液、抗坏血酸钠、泛醇和苯氧乙醇等组分，与水溶液具有较好的相容性。将透明质酸钠水溶液降温至28℃～33℃，再添加配方量的甘露糖醇、低氧预处理的多效因子溶液、抗坏血酸钠、泛醇和苯氧乙醇等组分，避免水温过高破坏各营养组分，使营养组分失活无法发挥功效。

作为优选实施例，所述多效因子组合物的制备方法包括以下步骤：

S10.获取所述低氧预处理的多效因子溶液；

S20.获取配方量的水，灭菌处理，得到灭菌水；

S30.获取配方量的所述透明质酸钠添加到温度为60℃～75℃的所述灭菌水中，搅拌溶解获得透明质酸钠水溶液；

S40.获取配方量的所述甘露糖醇、所述低氧预处理的多效因子溶液、所述抗坏血酸钠和所述泛醇，添加到降温至28℃～33℃的所述透明质酸钠水溶液中，混合均匀得到多效因子组合物；S50.将所述多效因子组合物装瓶，冻干处理，获得多效因子组合物冻干粉。通过冻干处理将多效因子组合物制成冻干粉，易于保存、运输。在低温下进行冻干处理，物质中的挥发性成分损失很小，活性组分在低温环境下不会被破坏，能保持原有的性状，且经冻干处理后的多效因子组合物能长期有效地保存，不需要添加防腐剂。

本发明实施例将多效因子组合物制成的冻干粉，在使用时通过纯水、注射用水、生理盐水、缓冲溶液、动植物或人体的体液、组织培养液、细胞培养液，或者其它不以有机溶剂为主体介质的水溶液，溶解成多效因子组合液进行注射、涂膜等形式的使用。优选地，多效因子组合物制成的冻干粉选用注射用水、生理盐水或磷酸缓冲溶液溶解成多效因子组合液使用。

在一些实施例中，所述冻干处理的方法为：将所述多效因子组合物冻至-50℃～-40℃，保持2小时，抽真空至10～12Pa；降温至-80℃～-90℃，抽真空至10～12Pa，冻干20小时～25小时至所述多效因子组合物中水分≤2％。真空环境下进行低温冻干处理，含水、氧量极少，保护了多效因子组合物中各组分不被氧化，能实现多效因子组合物在没有添加防腐剂的情况下长期有效的保存、使用。

本发明实施例还提供了一种皮肤护理产品，所述皮肤护理产品包含上述多效因子组合物。

本发明实施例提供的皮肤护理产品可用于人体的面部、眼部、颈部或其他需要进行护理的皮肤。本发明实施例提供的皮肤护理产品由于含有上述低氧预处理的多效因子组合物，不仅可以对肌肤进行营养和组织填充，同时多效因子组合中的细胞因子簇还可在皮下深层组织参与基底细胞的修复。本发明实施例提供的皮肤护理产品可以是水光针剂、面霜、眼霜、精华等形式，只要能实现上述皮肤护理效果即可。

以下通过多个实施例来举例说明上述技术方案。

实施例1

制备脐带间充质干细胞的低氧预处理的多效因子溶液。

在超净工作台中进行操作，取新鲜足月的健康胎儿脐带，用含2倍100U/mL青霉素和链霉素的生理盐水冲洗去除血渍；

将华尔通氏胶剥离，将剥离后的华尔通氏胶剪成1立方毫米以下块状，将块状的华尔通氏胶均匀涂布在细胞培养器底部，向细胞培养器中缓慢加入10mL无血清培养基，置37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养。

将原代细胞培养7天后，更换无血清培养液，培养至细胞达到70％的融合，移去无血清培养液，添加浓度分别为0.25％和0.1％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸钠(EDTA)消化1min，脐带间充质干细胞收缩脱离瓶壁；

加入先前移去的培养上清液，中和胰蛋白酶-EDTA溶液，并使用移液管轻轻吹打，将脐带间充质干细胞悬液移入50mL离心管，1000rpm离心5min，去除上清液；

重新加入无血清完全培养基将间充质干细胞重悬，并计数。按照1传1.5接种10cm培养皿。间充质干细胞培养融合70％左右时参照上述方法传代培养。

将第三代脐带间充质干细胞，以每毫升培养液接种1×10⁵个细胞，置于5v/v％CO₂、37℃、pH值为7.2、相对饱和湿度为95％的培养箱中培养72h。调节低氧状态至氧含量5～10％，并将所述间充质干细胞在低氧状态下培养16～18小时，测量培养的间充质干细胞数量，如果间充质干细胞的数量能够达到5×10⁵～2×10⁶个/mL，表明获得有效的低氧预处理的间充质干细胞。

收集上述低氧预处理的间充质干细胞的上清液，以离心转速为1800～3000rpm，离心时间15min，收集离心后的上清液；再使用10nm～50nm的滤膜对离心后的上清液进行过滤，收集滤液得到间充质干细胞上清液，制成脐带间充质干细胞的低氧预处理的多效因子溶液。

实施例2

制备多效因子组合物。

将水升温至85℃高温，保温20分钟灭菌，得到灭菌水；

将上述灭菌水降温至60℃，加入透明质酸钠，充分搅拌至溶解，获得透明质酸钠水溶液；

将上述透明质酸钠水溶液降温至30℃，分别加入甘露糖醇、透明质酸钠、间充质干细胞低氧预处理的多效因子溶液、抗坏血酸钠、泛醇、苯氧乙醇，混合均匀，得到多效因子组合物。

实施例3

本实施例通过人体实验考察多效因子组合物对皮肤斑点、皱纹、纹理、毛孔、红色区等问题的作用。

选取30名40-50岁女性，分为：低氧预处理的多效因子组、未低氧处理的多效因子组和玻尿酸组三组。分别给三组试验成员进行为期3个月的对应水光针面部导入，每月1次，实验者在每次水光针导入前进行面部VISIA仪器检测。使用VISIA仪器检测面部斑点、皱纹、纹理、毛孔、紫外线色斑、棕色斑、红色区、紫质等数据分析，与使用之前的面部检测数据作对比，在6个月的时候再检测一次，检测后取各项百分位数的平均值。

其中，VISIA是唯一能对皮肤进行病理学特征进行定量分析的仪器，能够深层检测到表皮最下层的基底层存在的问题；Proter&Gamble两大国际权威皮肤资料库，提供海量临床数据进行科学分析。VISIA可以通一次拍照得到皮肤的8个指标，数值定量显示皮肤表面和皮下的真实状况(特征计数、分值、百分位数等)。本发明选用了百分位数作为衡量标准，百分位数越大代表皮肤状况越好。

如附图1～8所示，各实验组每月进行一次导入，3次导入后，未有不良事件发生。在每次导入前和首次导入6个月后进行VISIA检测。经4次VISIA检测后，采用本发明实施例提供的低氧预处理的多效因子组，皮肤的斑点、皱纹、纹理、毛孔、红色区、棕色斑、紫外线色斑、紫质都得到了明显改善。不仅如此，长期注射使用本发明实施例提供的低氧预处理的多效因子组，去除斑点、收缩毛孔、去皱、去除紫外线色斑、去除棕色斑等效果，明显优于未低氧处理的多效因子组和玻尿酸处理组。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种多效因子组合物，其特征在于，以所述多效因子组合物的质量为100％计，包括：

2.根据权利要求1所述的多效因子组合物，其特征在于，所述低氧预处理的多效因子溶液包含低氧预处理的间充质干细胞的提取液，所述间充质干细胞选自：脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞中的一种。

3.根据权利要求1所述的多效因子组合物，其特征在于，所述透明质酸钠选自：分子量为100～180万道尔顿的中分子量透明质酸钠，和/或分子量为40～100万道尔顿的小分子量透明质酸钠。

4.一种如权利要求1～3任意一项所述的多效因子组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

获取低氧预处理的多效因子溶液；

获取配方量的水，灭菌处理，得到灭菌水；

获取配方量的透明质酸钠添加到温度为60℃～75℃的所述灭菌水中，搅拌溶解获得透明质酸钠水溶液；

获取配方量的甘露糖醇、低氧预处理的多效因子溶液、抗坏血酸钠、泛醇和苯氧乙醇，添加到降温至28℃～33℃的所述透明质酸钠水溶液中，混合均匀得到多效因子组合物。

5.根据权利要求4所述的多效因子组合物的制备方法，其特征在于，所述获取低氧预处理的多效因子溶液的方法为：

获取间充质干细胞，于4～6v/v％的CO₂，温度为36℃～38℃，pH值为7.2～7.4，相对饱和湿度为95％～98％的环境下培养68～75小时；

将上述间充质干细胞于氧含量为5～10％的环境下培养16～18小时，获得低氧预处理的间充质干细胞；

收集上述低氧预处理的间充质干细胞的上清液，对所述上清液依次进行离心处理和过滤处理，得到低氧预处理的多效因子溶液。

6.根据权利要求5所述的多效因子组合物的制备方法，其特征在于，所述离心处理的条件为：离心转速为1800～3000rpm，离心时间为15～20min，收集上清液；和/或，

所述过滤处理的条件为：使用孔径为10nm～50nm的滤膜对离心后的所述上清液进行过滤，收集滤液；和/或，

所述间充质干细胞选自：脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞中的一种。

7.根据权利要求4所述的多效因子组合物的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理的方法为：将配方量的水加热至80℃～88℃，保温20分钟～60分钟。

8.根据权利要求4～7任意一项所述的多效因子组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

获取所述低氧预处理的多效因子溶液；

获取配方量的水，灭菌处理，得到灭菌水；

获取配方量的所述透明质酸钠添加到温度为60℃～75℃的所述灭菌水中，搅拌溶解获得透明质酸钠水溶液；

获取配方量的所述甘露糖醇、所述低氧预处理的多效因子溶液、所述抗坏血酸钠和所述泛醇，添加到降温至28℃～33℃的所述透明质酸钠水溶液中，混合均匀得到多效因子组合物；

将所述多效因子组合物装瓶，冻干处理，获得多效因子组合物冻干粉。

9.根据权利要求8所述的多效因子组合物的制备方法，其特征在于，所述冻干处理的方法为：

将所述多效因子组合物冻至-50℃～-40℃，保持2小时，抽真空至10～12Pa；

降温至-80℃～-90℃，抽真空至10～12Pa，冻干20小时～25小时至所述多效因子组合物中水分≤2％。

10.一种皮肤护理产品，其特征在于，所述皮肤护理产品包含权利要求1～4任意一项所述的多效因子组合物。