CN108721606A - 一种基于干细胞生长因子的妊娠纹修复产品及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于干细胞生长因子的妊娠纹修复产品，其包括：体积分数为45％的脐带间充质干细胞细胞因子上清液、体积分数为50％的胎盘组织提取液、体积分数为5％的人血清白蛋白、终浓度为20IU/ml的维生素E、终浓度为50μg/ml的维生素C和终浓度为100μg/ml的维生素B5。本发明的妊娠纹修复产品结合了人间充质干细胞培养过程中分泌的多种细胞生长因子和人胎盘组织中萃取的活性成分，能够有效修复妊娠纹。
Description
技术领域
本发明属于干细胞与再生医学领域，具体涉及一种基于干细胞生长因子的妊娠纹修复产品及其制备方法。
背景技术
妊娠纹的形成主要是由于妊娠期荷尔蒙的影响，加之腹部膨隆使皮肤的弹力纤维与胶原纤维损伤或断裂，腹部皮肤变薄变细，出现一些宽窄不同、长短不一的粉红色或紫红色的波浪状花纹。分娩后，这些花纹会逐渐消失，留下白色或银白色的有光泽的瘢痕线纹，即妊娠纹。妊娠纹主要出现在腹壁上，也可能出现在大腿内外侧、臀部、胸部、后腰部及手臂等处，初产妇最为明显。已有的妊娠纹产品更多的是在孕期预防妊娠纹的生产，但效果并不理想，现有激光镭射方法治疗妊娠纹可以加速紫色纹路消退，增加皮下胶原纤维形成。
间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的干细胞，广泛分布于人体多种组织中，其中又以骨髓、脐带、脂肪等间充质组织中含量最丰富，间充质干细胞具有高增殖活性，低免疫源性和免疫调节能力，在再生医学领域中应用广泛。随着研究深入，其旁分泌功能越来越受到关注，间充质干细胞分泌的干细胞生长因子已成为研究的热点。脐带间充质干细胞在正常的生长过程中可以分泌多种细胞生长因子，有文献报道超过200余种，其中含量较高的有EGF、bFGF、TGF-β、VEGF等，这些生长因子可以有效的调控机体信号转到、活化机体已有细胞，进而达到修复机体损伤、衰老、病变的目的。
表皮生长因子(EGF)是一种由53个氨基酸组成的多肽，通过刺激表皮细胞增殖来更新替换衰老和死亡的细胞，此外还可以促进皮下胶原纤维沉积达到使表皮细胞变得饱满，恢复年轻状态。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对多种细胞增殖具有强烈刺激作用，能够改善皮肤细胞生长的微环境，促进皮肤成纤维细胞生长，修复皮肤中受损细胞；促进胶原纤维和弹性纤维合成，使皮肤具有弹性；降低皮肤中黑色素和有色细胞含量，减轻皮肤色素沉积。转化生长因子(TGF-β)能够有效促进皮肤伤口愈合，促进皮下胶原纤维沉积。血管内皮细胞生长因子(VEGF)在体内/外都可以有效促进血管内皮细胞生长，皮肤局部使用可以刺激皮下毛细血管再生，增加皮肤组织血流供应，为皮肤组织再生提供足够营养。此外，间充质干细胞分泌的外泌体中包含多种小RNA，具有促进皮肤细胞增殖、促进皮下胶原沉积、抗纤维化等独特的生物学活性。
胎盘组织是哺乳动物为胎儿提供养分的特殊组织，在分娩时排出体外，因其特殊的屏障功能和分泌，现代医学证明胎盘组织中含有多种活性成分，可以增强机体免疫力，活性成分以多肽方式存在，易于被机体吸收利用。中医讲炮制后的胎盘称为紫河车，现代药理学证明胎盘组织提取物中的多种活性成分具有抗氧化、抗衰老、增强机体免疫力的功能。
现有妊娠纹修复技术多采用激光照射腹部，而现有的各种妊娠纹产品也大多采用中成药制剂或化工类产品，效果有限，只针对妊娠纹早期加速紫色纹路消退，对于中后期妊娠纹没有明显的治疗效果。现有的妊娠纹修复霜、修复膏等都含有化工类产品，具有一定的毒副作用，在长期使用后，皮肤容易出现过敏反应或发炎，对皮肤伤害较大。此外，有些妊娠纹修复产品采用乳香、当归、党参等中药萃取成分，中药成分复杂，机理不明确。现有技术更多的只是促进皮下色素消退，对于断裂的胶原纤维无法修补，而早期妊娠纹的色素在自然条件下也会慢慢消退，
发明内容
本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种妊娠纹修复产品，用于修复初产孕妇的妊娠纹，消除皮肤纹路，促进皮下胶原纤维沉积，达到有效修复妊娠纹的目的。
为此，本发明提供了以下技术方案。
一种基于干细胞生长因子的妊娠纹修复产品，其包括：体积分数为45％的脐带间充质干细胞细胞因子上清液、体积分数为50％的胎盘组织提取液、体积分数为5％的人血清白蛋白、终浓度为20IU/ml的维生素E、终浓度为50μg/ml的维生素C和终浓度为100μg/ml的维生素B5。
本发明还提供了所述妊娠纹修复产品的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备脐带间充质干细胞细胞因子上清液；
(2)制备胎盘组织提取液；
(3)按比例将脐带间充质干细胞细胞因子上清液、胎盘组织提取液、人血清白蛋白、维生素E、维生素C和维生素B5混合。
优选地，步骤(1)中，按照以下操作制备脐带间充质干细胞细胞因子上清液：用组织保护液清洗脐带组织表面血液，去除表皮和血管组织，取出华通胶清洗后剪碎，接种培养；待原代细胞生长至70％融合度时进行传代培养，选用生长状况良好的第二代脐带间充质干细胞接种培养，待细胞生长至90％融合度时吸出上清液，离心去除细胞碎片，收集上清液，超滤浓缩至原体积的一半，除菌，得到脐带间充质干细胞细胞因子上清液；
优选地，步骤(2)中，按照以下操作制备胎盘组织提取液：用组织保护液清洗胎盘组织表面血块和其他污物，剥离羊膜和蜕膜组织，分离出绒毛膜组织并剪碎，碎片用组织保护液清洗，离心去除上清液，将绒毛膜组织中血细胞清洗干净；清洗后的绒毛膜组织加入等体积预冷生理盐水匀浆，使组织研磨成糜乳状；匀浆后的胎盘组织离心后取上清液并除菌，得到胎盘组织提取液。
优选地，步骤(1)和步骤(2)中使用的组织保护液为生理盐水添加25ug/ml的硫酸庆大霉素和5ug/ml的两性霉素B配制。
本发明的妊娠纹修复产品结合了人间充质干细胞培养过程中分泌的多种细胞生长因子和人胎盘组织中萃取的活性成分，与现有妊娠纹修复产品相比，本发明通过将多种具有生物活性成分的细胞生长因子和胎盘萃取多肽成分导入皮肤深层激活细胞，促进皮下胶原纤维沉积，修补被撕裂的皮肤组织，能够有效防止癫痕形成，从根本上修复妊娠纹。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的详述，但本发明并不限于以下实施例。
制备妊娠纹修复液，步骤如下：
1、医院采集足月剖腹产人胎儿脐带组织，采集前签署客户知情同意书，组织于4℃冷藏无菌环境下运抵实验室，运输过程中使用组织保护液保护脐带组织生物学活性，组织保护液由生理盐水添加25ug/ml的硫酸庆大霉素和5ug/ml的两性霉素B配制，确保运输过程中无细菌和真菌污染；
2、实验室中用组织保护液清洗脐带组织表面血液，去除表皮和血管组织，取出华通胶清洗后剪碎成1-2mm3体积碎块，采用组织贴壁法接种于T75培养瓶中培养，使用无血清培养基(友康恒业生物科技(北京)有限公司，间充质干细胞无血清培养基，产品货号：NC0103)培养；
3、原代细胞经14天培养长至70％融合度进行传代培养；
4、选用生长状况良好的第二代脐带间充质干细胞，按10000/cm2密度接种于康宁T175培养瓶中，加入30ml无血清培养基(友康恒业生物科技(北京)有限公司，间充质干细胞无血清培养基，产品货号：NC0103)正常培养；
5、培养3-4天后细胞生长至90％融合度时吸出上清液用于收集细胞因子，间充质干细胞正常传代培养，根据细胞生长状态决定培养代次；
6、收集的细胞上清液3000转/分钟离心20分钟去除细胞碎片，收集上清液；
7、细胞上清液加入15ml超滤管中浓缩，超滤膜孔径10KD，4500转/分钟离心30分钟，去除多余水分使体积浓缩为原体积的一半，浓缩液过0.22μm滤膜除菌，得到脐带间充质干细胞细胞因子上清液；
8、医院采集足月剖腹产人胎儿胎盘组织，采集前签署客户知情同意书，组织于4℃冷藏无菌环境下运抵实验室，运输过程中使用组织保护液保护脐带组织生物学活性，组织保护液由生理盐水添加25ug/ml的硫酸庆大霉素和5ug/ml的两性霉素B配制，确保运输过程中无细菌和真菌污染；
9、实验室无菌环境中用组织保护液清洗胎盘组织表面血块和其他污物，剥离羊膜和蜕膜组织，分离出绒毛膜组织并剪碎，碎片用组织保护液清洗3次，每次低速离心(800rpmX1min)去除上清液，将绒毛膜组织中血细胞清洗干净；
10、清洗后的绒毛膜组织置于50ml离心管中并加入等体积预冷生理盐水，使用电动组织匀浆器匀浆，使组织研磨成糜乳状，注意匀浆过程应保存低温状态；
11、匀浆后的胎盘组织离心(4000rpm×20min)取上清液并过0.22μm滤膜除菌，得到胎盘组织提取液；
12、将步骤7得到的脐带间充质干细胞细胞因子上清液和步骤11得到的胎盘组织提取液混合，并添加适量辅料，比例为：体积分数为45％的脐带间充质干细胞细胞因子上清液、体积分数为50％的胎盘组织提取液、体积分数为5％的人血清白蛋白、终浓度为20IU/ml的维生素E、终浓度为50μg/ml的维生素C和终浓度为100μg/ml的维生素B5。
13、妊娠纹修复液分装于10ml无菌西林瓶中并于-20℃冷冻保存。
效果实施例
筛选产后3-6个月妊娠纹患者试用本发明的妊娠纹产品，受试者腹部清洁后用75％医用酒精消毒，将以上冷冻保存的妊娠纹修复液解冻后通过水光针的方式于受试者腹部皮内注射，深度约为0.5-1.5mm，每周使用2次，连续使用4周，在0天、7天、14天、21天、28天使用CBS-807皮肤分析系统检测腹部皮肤毛孔大小、皮肤弹性、肤色、皮肤光泽度、皮肤凹陷程度、皱纹大小等。
受试者在1周后可以看到皮肤改善，连续使用4周后皮肤改善明显。
| 0天 | 7天 | 14天 | 21天 | 28天 | |
| 皮肤毛孔大小 | + | ++ | ++ | +++ | ++++ |
| 皮肤弹性 | ++ | +++ | +++ | ++++ | ++++ |
| 肤色 | ++ | ++ | ++ | +++ | +++ |
| 皮肤光泽度 | + | ++ | +++ | +++ | ++++ |
| 皮肤凹陷程度 | +++++ | ++++ | ++++ | +++ | ++ |
| 皱纹大小 | +++++ | ++++ | ++++ | +++ | ++ |
Claims (5)
1.一种基于干细胞生长因子的妊娠纹修复产品，其特征在于包括：体积分数为45％的脐带间充质干细胞细胞因子上清液、体积分数为50％的胎盘组织提取液、体积分数为5％的人血清白蛋白、终浓度为20IU/ml的维生素E、终浓度为50μg/ml的维生素C和终浓度为100μg/ml的维生素B5。
2.权利要求1所述妊娠纹修复产品的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)制备所述脐带间充质干细胞细胞因子上清液；
(2)制备所述胎盘组织提取液；
(3)按比例将所述脐带间充质干细胞细胞因子上清液、所述胎盘组织提取液、所述人血清白蛋白、所述维生素E、所述维生素C和所述维生素B5混合。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，按照以下操作制备所述脐带间充质干细胞细胞因子上清液：用组织保护液清洗脐带组织表面血液，去除表皮和血管组织，取出华通胶清洗后剪碎，接种培养；待原代细胞生长至70％融合度时进行传代培养，选用生长状况良好的第二代脐带间充质干细胞接种培养，待细胞生长至90％融合度时吸出上清液，离心去除细胞碎片，收集上清液，超滤浓缩至原体积的一半，除菌，得到所述脐带间充质干细胞细胞因子上清液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，按照以下操作制备所述胎盘组织提取液：用组织保护液清洗胎盘组织表面血块和其他污物，剥离羊膜和蜕膜组织，分离出绒毛膜组织并剪碎，碎片用组织保护液清洗，离心去除上清液，将绒毛膜组织中血细胞清洗干净；清洗后的绒毛膜组织加入等体积预冷生理盐水匀浆，使组织研磨成糜乳状；匀浆后的胎盘组织离心后取上清液并除菌，得到胎盘组织提取液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)和所述步骤(2)中使用的所述组织保护液为生理盐水添加25ug/ml的硫酸庆大霉素和5ug/ml的两性霉素B配制。
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