CN112294847A - 一种祛妊娠纹产品及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学美容技术领域，具体公开了一种祛妊娠纹产品及其制备方法和应用，所述祛妊娠纹产品由干细胞因子冻干粉和海绵微针溶媒组成，其中，海绵微针溶媒由海绵微针、透明质酸钠和注射用水组成。本发明获得的祛妊娠纹产品可以短时间内在患区皮肤上形成微小通道，刺激皮肤，令细胞因子等活性成分有效渗入患区皮肤，提高吸收率。

Description

一种祛妊娠纹产品及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医学美容技术领域，具体涉及一种祛妊娠纹产品及其制备方法和应用。
背景技术
妊娠纹(stretch marks)是一种发生于孕期的腹部皮肤膨胀纹，与皮肤过度牵拉、内分泌水平及遗传因素等有关。早期表现为暗红色或紫红色的条纹，然后色素脱失、萎缩，最后稳定呈现出一种白色或银色的条纹。妊娠纹主要分布于腹部，亦可见于胸、背、臀部及四肢近端。妊娠纹的发生在女性中非常普遍，一旦发生可终生不退，给孕妇带来很大的心理负担。一般不需治疗，有治疗需求者，可通过药物、激光、射频或手术治疗等淡化、减小妊娠纹。
有研究显示，约60％～90％的孕妇受到妊娠纹的困扰，大多在妊娠24周左右开始出现。妊娠期间皮肤会随着皮下组织如脂肪和肌肉等组织的发展被逐渐地拉伸，导致真皮层结缔组织损伤，胶原纤维和弹性纤维的破坏，引起病灶处的伸展性和弹性减弱，从而产生条纹状的皮肤损害。妊娠过程中，孕妇体内的各种激素水平也会发生很大变化。如糖皮质激素的激增，可以抑制成纤维细胞的活性和增殖，使成纤维细胞合成的弹力纤维和胶原蛋白减少，从而阻碍真皮层内被破坏的结缔组织的完全修复。
现有的去除妊娠纹的办法主要有光电仪器治疗、外用的涂抹药物或化妆品，或仪器与药物联合应用等。光电仪器治疗包括点阵激光、微晶磨削、超声波治疗、微针治疗等，效果均不显著，并伴随有一系列副作用，比如治疗后皮肤发红、疼痛，给皮肤造成多重伤害。外用涂抹的药物或化妆品由于存在皮肤屏障，涂抹后存在吸收率低的问题，且使用时间较长，效果不明显甚至没有效果。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种祛妊娠纹产品及其制备方法和应用，可以短时间内在患区皮肤上形成微小通道，刺激皮肤，令细胞因子等活性成分有效渗入患区皮肤，提高吸收率。
本发明第一个目的是提供了一种祛妊娠纹产品，所述祛妊娠纹产品由干细胞因子冻干粉和海绵微针溶媒组成；
所述海绵微针溶媒由质量百分比为0.5％-1.5％、长度为30-500μm的海绵微针，质量百分比为0.01％-0.5％的透明质酸钠和余量的注射用水组成；
所述透明质酸钠由质量百分比为98-98.5％、分子量为10KD-500KD的低分子量透明质酸钠和质量百分比为1.5-2％、分子量为500KD-2000KD的中等分子量透明质酸钠混合而成；
所述干细胞因子冻干粉和海绵微针溶媒使用前分别封装，使用时，按照体积比2mL:5mL即时混合均匀后涂抹于妊娠纹区域。
本发明还提供了上述祛妊娠纹产品的制备方法，包括如下步骤：
S1，干细胞因子冻干粉的制备；
S1.1，人脐带间充质干细胞的原代分离：
无菌采集离体的脐带组织，用含双抗的缓冲液清洗离体的脐带组织，然后分离得到华通氏胶，剪碎后蘸取胎牛血清在细胞培养皿中于37℃，5％CO2下培养，4-6h后补加细胞培养基；
S1.2，人脐带间充质干细胞的培养与鉴定：
待组织块附近有大量的细胞爬出后，移除组织块，PBS清洗后，加入消化液消化，传代扩大，待细胞生长至P3-P5代时，加入流式抗体后进行细胞表面分子标记物鉴定；
S1.3，人脐带间充质干细胞的上清液收集：
选用鉴定成功的P2-P10代生长状态良好的人脐带间充质干细胞，每次细胞消化后用常规培养基培养至生长密度达到80％-85％时，弃掉原有培养基，清洗后加入无血清培养基培养48-72h，之后无菌收取细胞培养上清，过滤除菌后获得细胞培养液；
S1.4，超滤浓缩：
将细胞培养液于1500rpm离心5-10min，获得条件培养液，条件培养液先后经过50KD和5KD的超滤浓缩包处理，获得浓缩液；
S1.5，冻干：
浓缩液中加入冻干保护剂，过滤后分装，冷冻干燥，获得冻干粉制剂；
所述冻干保护剂由8％-10％甘露醇、0.1％-1％海藻糖、0.1％-0.5％葡聚糖组成；
S2，海绵微针溶媒的制备；
所述海绵微针溶媒的制备过程为：将质量分数为0.01-0.5％％，分子量为10KD-2000KD的透明质酸钠与98％-99.49％的注射用水搅拌混匀后，加入质量分数为0.5％-1.5％，长度为30-500μm的海绵微针混合均匀后分装。
优选的，S1.1中，所述组织储运液为含体积分数1％-10％青链霉素的α-MEM培养基。
优选的，S1.1中，所述含双抗的缓冲液为含体积分数1％-5％青链霉素的生理盐水缓冲液。
优选的，补加的所述细胞培养基为含体积分数10％-15％FBS的α-MEM培养基。
优选的，S1.2中，所述消化液为不含EDTA的0.25g/100mL的胰蛋白酶消化液，消化时间控制在3-5min。
优选的，S1.2中，所述细胞表面分子标记物为CD29、CD73、CD45R、CD90和HLA-DR。
优选的，S1.3中，所述常规培养基为：以体积分数计，10％FBS+90％α-MEM；
所述无血清培养基为不含胎牛血清的α-MEM培养液。
优选的，S1.4中，所述条件培养液需先经过0.22μm过滤除菌，之后经过50KD的超滤浓缩膜包，收集透过液，之后透过液再经过5KD的超滤浓缩膜包，收集截留液，此液体即为浓缩液。
本发明的第三个目的是提供所述的一种祛妊娠纹产品制备妊娠纹祛除药物中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明提供的一种含干细胞因子和海绵微针的祛妊娠纹产品的制备方法，是将低代次的人脐带间充质干细胞条件培养液经过超滤浓缩，富集了大量的有益于皮肤生长及更新的细胞因子，其浓度与相互间的比例更符合皮肤生理所需，加速妊娠纹皮肤代谢及再生；
2、本发明所获得的干细胞因子冻干粉能极大地保留了干细胞生物活性因子，具有室温保存、运输方便的优势；
3、本发明所获得的海绵微针溶媒中含有透明质酸钠，能有效的保湿，改善细胞代谢的微环境，调节细胞内外渗透压，具有强大的保湿保水功效，调节皮肤渗透压，促进妊娠纹患区皮肤细胞代谢；
本发明中的透明质酸钠为低分子量透明质酸钠(10KD-500KD)和中等分子量透明质酸钠(500KD-2000KD)的混合物，一方面低分子量的透明质酸钠既能保证患区皮肤湿润，另一方面中等分子量的透明质酸钠由于黏度较大，可以有效包裹海绵微针，使海绵微针均匀分布在溶媒中。
4、所获得的海绵微针溶媒中含有一定量的海绵微针，海绵微针能深入表皮层，激活肌肤新生活性，可以短时间内在患区皮肤上形成超过几百万个微小通道，刺激皮肤，令细胞因子等活性成分有效渗入患区皮肤，提高吸收率；
5、本发明获得的祛妊娠纹产品，不添加任何香精、防腐剂、使用方便，可作为居家产品使用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中人脐带间充质干细胞示意图；
图2为本发明实施例1中流式鉴定脐带间充质干细胞表面标记示意图；
图3为本发明实施例1制备获得的干细胞因子冻干粉示意图；
观察发现，获得的冻干粉外观介于淡粉色和白色之间，产品外形饱满、表面平整不萎缩、色泽均匀、多孔性好；
图4为本发明实施例1中制备的海绵微针溶媒示意图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
本实施例提供了一种祛妊娠纹产品，所述祛妊娠纹产品由干细胞因子冻干粉和海绵微针溶媒组成；
所述干细胞因子冻干粉和海绵微针溶媒使用前分别封装，使用时，将二者即时混合均匀后涂抹于妊娠纹区域，按摩吸收即可。
上述祛妊娠纹产品的制备方法，包括如下步骤：
S1，干细胞因子冻干粉的制备：
S1.1，人脐带间充质干细胞的原代分离：
无菌采集离体的脐带组织置于脐带组织储运液中，1h内低温运输至实验室，用含双抗的缓冲液充分清洗离体的脐带组织，沿血管生长方向剪开脐带，剥离脐静脉和脐动脉后分离得到华通氏胶，将华通氏胶剪碎为1-3mm3大小，轻轻蘸取胎牛血清，贴附于一次性细胞培养皿中，置于37℃，浓度为5％CO2培养箱培养，5h后补加细胞培养基，间隔3d换液；
所述脐带组织储运液为含体积分数5％青链霉素的α-MEM培养基；
所述含双抗的缓冲液为含体积分数2.5％青链霉素的生理盐水缓冲液；
所述细胞培养基为含体积分数12.5％FBS的α-MEM培养基；
S1.2，人脐带间充质干细胞的培养与鉴定：
待组织块附近有大量的细胞爬出后，移除组织块，PBS清洗后，加入消化液消化，最终按照1：3的比例传代扩大，待细胞生长至P3-P5代时(图1)，加入流式抗体后进行细胞表面分子标记物鉴定(鉴定结果如图2所示)；
所述消化液为不含EDTA的0.25g/100mL的胰蛋白酶消化液，消化时间控制在4min；
流式鉴定时，所述细胞表面分子标记物为CD29、CD73、CD45R、CD90及HLA-DR。
S1.3，人脐带间充质干细胞的上清液收集：
选用鉴定成功的P2-P10代生长状态良好的人脐带间充质干细胞，每一代次细胞消化后，用常规培养基(以体积分数计，10％FBS+90％α-MEM)培养至生长密度达到82％时，弃掉原有培养基，PBS清洗两遍后，加入无血清培养基培养6h，之后无菌收取细胞培养上清，0.22μm的无菌滤膜过滤除菌后，收滤过液，获得细胞培养液，-20℃低温保存；
所述无血清培养基为不含胎牛血清的α-MEM培养液。
S1.4，超滤浓缩：
收集的细胞培养液经过经过1500rpm离心7.5min，收集上清，获得条件培养液，条件培养液经过超滤浓缩包处理，获得的最终液体为浓缩液；
上述超滤浓缩时，条件培养液需先经过0.22μm过滤除菌，之后经过50KD的超滤浓缩膜包，收集透过液，之后透过液再经过5KD的超滤浓缩膜包，收集截留液，此液体即为浓缩液。
S1.5，冻干：
浓缩液中按照适当比例加入冻干保护剂，之后定容至10L，搅拌均匀至澄清，0.22μm过滤后，滤液按照每支西林瓶(7mL)装样2mL进行分装，分装结束后半加胶塞，进行冷冻干燥，获得冻干粉制剂(如图3所示)；
所述冻干保护剂由9％甘露醇、0.5％海藻糖、0.5％葡聚糖组成，预冻干的液体总量10L中除去浓缩液用量和冻干保护剂的使用量，其余用纯化水补齐，计算出纯化水用量，称量纯化水，加入冻干保护剂并加热至65℃搅拌溶解，溶解后放至室温才可加入浓缩液，搅匀后使用；
所述西林瓶、硅胶管等耗材需要提前进行高压蒸汽灭菌。
S2，海绵微针溶媒的制备：
将质量分数为0.05％的透明质酸钠与98.95％注射用水搅拌混匀后，加入质量分数为1％、长度为30-500μm的海绵微针混匀；
所述透明质酸钠由分子量为10KD-500KD的低分子量透明质酸钠和分子量为500KD-2000KD的中等分子量透明质酸钠按照质量百分比98％:2％混合而成；
获得海绵微针溶媒，灌装至7ml西林瓶中，每瓶装样5ml，加胶塞，封口机封口(如图4所示)，然后进行高温灭菌处理。
实施例2
一种祛妊娠纹产品，具体制备步骤与实施例1基本相同，区别在于：
S1.1中，CO2培养箱培养中培养后4h后补加细胞培养基；
所述脐带组织储运液为含体积分数1％青链霉素的α-MEM培养基；
所述含双抗的缓冲液为含体积分数1％青链霉素的生理盐水缓冲液；
所述细胞培养基为含体积分数10％FBS的α-MEM培养基；
S1.2中，传代培养扩大比例为1:2；
消化时间为3min；
S1.3中，细胞消化后用常规培养基培养至生长密度达到80％时，弃掉原有培养基，PBS清洗两遍后，加入无血清培养基培养48h；
S1.4中，收集的细胞培养液经过经过1500rpm离心5min；
S1.5中，所述冻干保护剂由8％甘露醇、0.1％海藻糖、0.1％葡聚糖组成；
溶解温度为60℃；
S2中，将质量分数为0.01％的透明质酸钠与99.49％注射用水搅拌混匀后，加入质量分数为0.5％，长度为30-500μm的海绵微针混匀，获得海绵微针溶媒；
所述透明质酸钠由质量百分比为98.3％的低分子量透明质酸钠(10KD-500KD)和质量百分比为1.7％的中等分子量透明质酸钠(500KD-2000KD)混合而成。
实施例3
一种祛妊娠纹产品，具体制备步骤与实施例1基本相同，区别在于：
S1.1中，CO2培养箱培养中培养后6h后补加细胞培养基；
所述脐带组织储运液为含体积分数10％青链霉素的α-MEM培养基；
所述含双抗的缓冲液为含体积分数5％青链霉素的生理盐水缓冲液；
所述细胞培养基为含体积分数15％FBS的α-MEM培养基；
S1.2中，传代培养扩大比例为1:4；
消化时间为5min；
S1.3中，细胞消化后用常规培养基培养至生长密度达到85％时，弃掉原有培养基，PBS清洗两遍后，加入无血清培养基培养72h；
S1.4中，收集的细胞培养液经过经过1500rpm离心10min；
S1.5中，所述冻干保护剂由10％甘露醇、1％海藻糖、1％葡聚糖组成；
溶解温度为70℃；
S2中，将质量分数为0.5％的透明质酸钠与98％注射用水搅拌混匀后，加入质量分数为1.5％，长度为30-500μm的海绵微针混匀，获得海绵微针溶媒；
所述透明质酸钠由质量百分比为98.5％的低分子量透明质酸钠(10KD-500KD)和质量百分比为1.5％的中等分子量透明质酸钠(500KD-2000KD)混合而成。
以上实施例1-3为本发明制备祛妊娠纹产品的具体实施例，本发明获得的祛妊娠纹产品的使用方式为：
使用时，打开铝箔盖，按照一瓶冻干粉对应一瓶溶媒配合使用，也就是按照体积比2mL:5mL将干细胞因子冻干粉与含海绵微针的溶媒充分混匀后，使用无菌喇叭头涂抹在妊娠纹区域，按摩吸收即可。
选择30名志愿者对本发明进行有效验证，评定标准为：测量患者患区面积，妊娠纹颜色变淡且患区面积缩小20％以上判定为有效，妊娠纹颜色不变淡且缩小范围低于20％判定为无效，有效率＝有效人数/总人数*100％。
按照上述标准，另选30名志愿者，将市售商品化祛妊娠纹产品(袋鼠妈妈鲜护舒纹橄榄油)用于上述志愿者，并连续使用90天，每个月月底记录效果，评定标准与本发明所用评定标准相同，结果如表2所示：
以实施例1为例，将实施例1制备获得的祛妊娠纹产品同时用于30名有妊娠纹的志愿者，每月记录一次效果，具体结果见表1。
表1本发明获得的祛妊娠纹产品使用效果评定表
使用时间 有效人数 有效率
30天 10 33.3％
60天 20 66.7％
90天 25 83.3％
由表1可以看出，本发明制备得到的祛妊娠纹产品使用三个月的有效率高达83.3％，对于妊娠纹的缓解和治疗有明显的效果。
表2市售商品化祛妊娠纹产品使用效果评定表
使用时间 有效人数 有效率
30天 5 16.7％
60天 11 36.7％
90天 16 53.3％
由表2可以看出，选用的商品化祛妊娠纹产品使用90天后最大有效率为53.3％，远远低于本发明所制备的祛妊娠纹产品(83.3％)。
需要说明的是，本发明中流式鉴定用的是p3-p5代细胞，在S1.3，人脐带间充质干细胞的上清液收集中使用的是p2-p10代的细胞，流式鉴定只是为了鉴定本批次分离的细胞是不是预期想要的细胞，一般在P0代细胞比较杂，混有其他细胞，随着代数增加，细胞逐渐纯化，在p3-p5代细胞相对比较稳定，因此只要鉴定出来所分离的细胞是间充质干细胞，后面的代数就可以放心使用，因此，我们在人脐带间充质干细胞的上清液收集中选用的是p2-p10代的细胞。
还需要说明的是，本发明所使用的脐带组织是产科丢弃的，我们把其回收利用。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种祛妊娠纹产品，其特征在于，所述祛妊娠纹产品由干细胞因子冻干粉和海绵微针溶媒组成；
所述海绵微针溶媒由质量百分比为0.5％-1.5％、长度为30-500μm的海绵微针，质量百分比为0.01％-0.5％的透明质酸钠和余量的注射用水组成；
所述透明质酸钠由质量百分比为98-98.5％、分子量为10KD-500KD的低分子量透明质酸钠和质量百分比为1.5-2％、分子量为500KD-2000KD的中等分子量透明质酸钠混合而成；
所述干细胞因子冻干粉和海绵微针溶媒使用前分别封装，使用时，按照体积比2mL:5mL混合均匀后涂抹于妊娠纹区域。
2.一种祛妊娠纹产品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，干细胞因子冻干粉的制备；
S1.1，人脐带间充质干细胞的原代分离：
离体的脐带组织用含双抗的缓冲液清洗离体的脐带组织，然后分离得到华通氏胶，剪碎后蘸取胎牛血清在细胞培养皿中于37℃，5％CO2下培养，4-6h后补加细胞培养基；
S1.2，人脐带间充质干细胞的培养与鉴定：
待组织块附近有大量的细胞爬出后，移除组织块，PBS清洗后，加入消化液消化，传代扩大，待细胞生长至P3-P5代时，加入流式抗体后进行细胞表面分子标记物鉴定；
S1.3，人脐带间充质干细胞的上清液收集：
选用鉴定成功的P2-P10代生长状态良好的人脐带间充质干细胞，每次细胞消化后用常规培养基培养至生长密度达到80％-85％时，弃掉原有培养基，清洗后加入无血清培养基培养48-72h，之后无菌收取细胞培养上清，过滤除菌后获得细胞培养液；
S1.4，超滤浓缩：
将细胞培养液于1500rpm离心5-10min，获得条件培养液，条件培养液先后经过50KD和5KD的超滤浓缩包处理，获得浓缩液；
S1.5，冻干：
浓缩液中加入冻干保护剂，过滤后分装，冷冻干燥，获得冻干粉制剂；
所述冻干保护剂由8％-10％甘露醇、0.1％-1％海藻糖、0.1％-0.5％葡聚糖组成；
S2，海绵微针溶媒的制备；
所述海绵微针溶媒的制备过程为：将质量分数为0.01-0.5％，分子量为10KD-2000KD的透明质酸钠与98％-99.49％的注射用水搅拌混匀后，加入质量分数为0.5％-1.5％，长度为30-500μm的海绵微针混合均匀后分装。
3.如权利要求2所述的一种祛妊娠纹产品的制备方法，其特征在于，S1.1中，离体的脐带组织置于脐带组织储运液中，送至实验室后用含双抗的缓冲液清洗，所述组织储运液为含体积分数1％-10％青链霉素的α-MEM培养基。
4.如权利要求2所述的一种祛妊娠纹产品的制备方法，其特征在于，S1.1中，所述含双抗的缓冲液为含体积分数1％-5％青链霉素的生理盐水缓冲液。
5.如权利要求2所述的一种祛妊娠纹产品的制备方法，其特征在于，补加的所述细胞培养基为含体积分数10％-15％FBS的α-MEM培养基。
6.如权利要求2所述的一种祛妊娠纹产品的制备方法，其特征在于，S1.2中，所述消化液为不含EDTA的0.25g/100mL的胰蛋白酶消化液，消化时间控制在3-5min。
7.如权利要求2所述的一种祛妊娠纹产品的制备方法，其特征在于，S1.2中，所述细胞表面分子标记物为CD29、CD73、CD45R、CD90和HLA-DR。
8.如权利要求2所述的一种祛妊娠纹产品的制备方法，其特征在于，S1.3中，所述常规培养基为：以体积分数计，10％FBS+90％α-MEM；
所述无血清培养基为不含胎牛血清的α-MEM培养液。
9.如权利要求2所述的一种祛妊娠纹产品的制备方法，其特征在于，S1.4中，所述条件培养液需先经过0.22μm过滤除菌，之后经过50KD的超滤浓缩膜包，收集透过液，之后透过液再经过5KD的超滤浓缩膜包，收集截留液，此液体即为浓缩液。
10.如权利要求1所述的一种祛妊娠纹产品制备妊娠纹祛药物中的应用。
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