CN110075050A - 一种用于消除妊娠纹的间充质干细胞培养上清中细胞因子冻干粉的制备方法 - Google Patents

一种用于消除妊娠纹的间充质干细胞培养上清中细胞因子冻干粉的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于消除妊娠纹的间充质干细胞培养上清细胞因子冻干粉的制备方法，包括以下步骤：制备原代脂肪间充质干细胞及原代脐带间充质干细胞，建立细胞库；复苏P1代脂肪间充质干细胞、P1代脐带间充质干细胞，加入生理盐水，离心，收集细胞沉淀，接种于无血清培养液中，进行铺板培养；铺板培养4‑5天后细胞密度达到70％，收集培养上清，加入EDTA重组胰蛋白酶消化细胞，培养至P5代，收集培养上清；向含P5代细胞的细胞工厂中加入生理盐水，反复冻融后与收集的P2至P5间充质干细胞培养上清混合，离心去沉淀；添加海藻糖、甘露醇和透明质酸，进行超低温抽真空冻干，得到细胞因子冻干粉。

Description

一种用于消除妊娠纹的间充质干细胞培养上清中细胞因子冻 干粉的制备方法
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，具体涉及一种用于消除妊娠纹的间充质干细胞培养上清中细胞因子冻干粉的制备方法。
背景技术
妊娠纹的形成主要是妊娠期受荷尔蒙影响，腹部的膨隆使皮肤的弹力纤维与胶原纤维因外力牵拉而受到不同程度的损伤或断裂，皮肤变薄变细，腹壁皮肤会出现一些宽窄不同、长短不一的粉红色或紫红色的波浪状花纹。分娩后，这些花纹会逐渐消失，留下白色或银白色的有光泽的疤痕线纹，即妊娠纹。医疗美容技术可以通过增加胶原蛋白的生成、改善皮肤表皮的色泽及厚度、去除妊娠纹处皮肤等方式，减轻或消除妊娠纹。常用的技术有激光或光子照射、微晶磨削、果酸换肤、腹壁成形术等，但因效果不够显著或伴有明显副作用等原因，不为多数人接受。
发明内容
发明目的：本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于消除妊娠纹的间充质干细胞培养上清细胞因子冻干粉的制备方法。
技术方案：
一种用于消除妊娠纹的间充质干细胞培养上清细胞因子冻干粉的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：
a)三甲医院妇产科获得脐带组织，生理盐水清洗，取华通氏胶，接种于无血清培养液中，培养第15天，细胞密度达到50％，加入EDTA重组胰蛋白酶消化细胞，生理盐水清洗后离心收集细胞沉淀，加入冻存液-80℃冻存细胞；
b)三甲医院整形外科获得脂肪组织，生理盐水清洗，脂肪组织和Ⅰ型胶原酶按比例1:1混合，震荡水浴酶消化获得原代脂肪间充质干细胞，接种于无血清培养液中，培养第7天，细胞密度达到50％，加入EDTA重组胰蛋白酶消化细胞，生理盐水清洗后离心收集细胞沉淀，加入冻存液-80℃冻存细胞；
c)复苏P1代脂肪间充质干细胞、P1代脐带间充质干细胞，加入生理盐水中，离心，收集细胞沉淀，接种于无血清培养液中，进行铺板培养；
d)铺板培养4-5天后细胞密度达到70％，收集培养上清，加入EDTA重组胰蛋白酶消化细胞，生理盐水清洗后重新铺板，按照此方法培养至P5代，收集培养上清；
e)混合P2至P5代间充质干细胞培养上清，进行细胞裂解后，去除细胞碎片沉淀；
f)往步骤e)中去除细胞碎片沉淀的培养上清中，添加海藻糖、甘露醇和透明质酸；
g)将步骤f)中添加海藻糖、甘露醇和透明质酸的的培养上清混合液，进行超低温抽真空冻干，得到细胞因子冻干粉。
进一步的，步骤c)中P1代脂肪间充质干细胞、P1代脐带间充质干细胞的数量比为1:1。
进一步的，步骤c)中的铺板方法为，按照接种密度为4000-5000/cm2进行铺板，培养瓶中培养液体积/培养面积为2：3，培养箱环境为5％O2，37℃。
进一步的，步骤e)中细胞裂解方法为向含细胞的细胞工厂中加入1L生理盐水，-20℃条件下反复冻融细胞，使细胞裂解。
进一步的，步骤e)去除细胞碎片的方法为5000rpm，30min离心去沉淀，0.22um囊式滤芯过滤。
进一步的，步骤f)中添加海藻糖、甘露醇和透明质酸的质量份比例分别为5％、8％、1％。
进一步的，步骤g)中的冻干方法如下：
1)添加海藻糖、甘露醇和透明质酸的培养上清为冻干混合原液；
2)分装冻干混合原液至西林瓶，快速预冻，设置预冻温度为-40℃-50℃；
3)待半成品预冻温度达到-40℃-50℃，保温2-5小时；
4)抽真空5-10P，保持温度在-40℃-50℃，至水线完全消失；
5)逐步升高干燥温度，6-10小时后制备成冻干粉成品。
有益效果：脂肪间充质干细胞与脐带间充质干细胞混合接种，优化了培养上清中细胞因子种类；5％O2，37℃的间充质干细胞培养条件提高了培养上清中细胞因子的含量；海藻糖、甘露醇为冻干粉提供更好的支架及蛋白保护所用；透明质酸作为辅助原料增强皮肤的保水性能和弹性；超低温抽真空冻干工艺，有效的保证了细胞因子的活性，提高了冻干粉的保存时间，为间充质干细胞培养上清中细胞因子在妊娠纹消除方面的应用提供了保障。
附图说明
图1为本发明所用间充质干细胞贴壁培养显微镜下图样；
图2a为本发明所用间充质干细胞表面阳性分子标志物CD29、CD73；
图2b为本发明所用间充质干细胞表面阳性分子标志物CD90、CD105、CD166；
图2c为本发明所用间充质干细胞表面阴性分子标志物CD31、HLA-DR；
图2d为本发明所用间充质干细胞阴性表面分子标志物CD45；
图2e为本发明所用间充质干细胞表面分子标志物CD34；
图3a为本发明所用间充质干细胞成脂诱导分化图；
图3b为本发明所用间充质干细胞成骨诱导分化图；
图3c为本发明所用间充质干细胞成软骨诱导分化图；
图4a为未使用本发明冻干粉前的妊娠纹图片；
图4b为使用本发明冻干粉后妊娠纹修复的图片。
具体实施方式
本发明技术方案通过以下实施例进行说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
实施例1：一种用于消除妊娠纹的间充质干细胞培养上清细胞因子冻干粉的制备方法，按照以下步骤进行：
a)三甲医院妇产科获得脐带组织，生理盐水清洗至无明显红细胞，剪刀将脐带剪成2cm左右的小段，并沿静脉血管将组织剖开，组织镊去除静脉血管壁和动脉血管，取条状华通氏胶，剪刀剪碎成1-2mm3的小块，接种于无血清培养液中，每隔5天半换液，培养第15天，细胞密度达到50％，加入EDTA重组胰蛋白酶消化细胞，生理盐水清洗后离心收集细胞沉淀，加入冻存液-80℃冻存细胞；
b)三甲医院整形外科获得脂肪组织，生理盐水清洗至无明显红细胞，脂肪组织和Ⅰ型胶原酶按1:1比例混合，震荡水浴酶消化20min获得原代脂肪间充质干细胞，接种于无血清培养液中，每隔2天半换液，培养第7天，细胞密度达到50％，加入EDTA重组胰蛋白酶消化细胞，生理盐水清洗后离心收集细胞沉淀，加入冻存液-80℃冻存细胞；
c)收获的P1代脐带间充质干细胞和P1代脂肪间充质干细胞分别上流式机器检测，其中P1代脐带间充质干细胞表型检测如下：CD29：98％，CD73:99％，CD90:96％，CD105:95％，CD166:95％，CD31:1％，CD34：2％，CD45：0％，HLA-DR：0％；
d)其中P1代脂肪间充质干细胞表型检测如下：CD29：95％，CD73:96％，CD90:98％，CD105:99％，CD166:99％，CD31:2％，CD34：0％，CD45：0％，HLA-DR：0％；
e)收获的P1代脐带间充质干细胞和P1代脂肪间充质干细胞分别做成脂成骨成软骨诱导分化实验，其中成脂实验均可见明显脂滴，成骨实验均可见明显钙结节，成软骨实验均可见软骨球；
f)从液氮罐中取出一支P1代脐带间充质干细胞，一支P1代脂肪间充质干细胞，保持两种细胞数量一致，迅速转移至37℃水浴锅中；
g)待冻存细胞即将完全融化时，用巴氏吸管转移两支细胞至含有30ml生理盐水的离心管中，1500rpm离心5min，重复此步骤两次，收集细胞沉淀；
h)含4％血清替代物的α-MEM培养基重悬步骤g)细胞沉淀，按照4000-5000/cm2密度铺板，培养瓶中培养液体积：培养面积为2:3，培养箱环境为5％O2，37℃；
i)培养至第4-5天，观察细胞融合度达到70％，收集细胞培养上清，生理盐水清洗培养瓶2-3次，加入重组胰蛋白酶37℃条件下消化60s，细胞变形后迅速加入等体积的细胞培养上清，终止酶消化，收集细胞悬液至50ml离心管中，生理盐水清洗细胞2-3次。按照步骤h)重新铺板，记为P3代细胞；
j)重复上述传代步骤培养间充质干细胞至P5代，混合P2至P5代间充质干细胞培养上清，5000rpm离心30min，去除细胞碎片沉淀；
k)0.22um囊式滤芯过滤混合培养上清，按5％、8％、1％的比例分别添加海藻糖、甘露醇、透明质酸，混匀，制备成冻干混合原液；
l)分装冻干混合原液至西林瓶，快速预冻，设置预冻温度为-50℃；
m)待半成品预冻温度达到-50℃，保温3-5小时；
n)抽真空5-10P，保持温度在-50℃，至水线完全消失；
o)逐步升高干燥温度，6-10小时后制备成冻干粉成品。
高通量MSD检测结果显示，脐带间充质干细胞与脂肪间充质干细胞混合培养所得上清中含有两种细胞分泌的细胞因子，两种细胞之间的共刺激作用，使培养上清中相比单一间充质干细胞获得上清有更高的细胞因子含量。
5％O2、37℃的低氧环境条件培养间充质干细胞，可以明显提升培养上清中VEGF含量，用人脐带静脉内皮细胞(HUVE)检测血管内皮生长因子(VEGF)活性：
1)分离HUVE：取明胶包被的48孔细胞培养板，每孔加6000个细胞，含15mmol/LHepes、20％胎牛血清和抗生素的199培养液，以及用同样培养液系列稀释的待测样品，总体积0.4ml，在37℃5％CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养12小时。
2)加入0.64μCi(23.68kBq)[3H]脱氧胸苷，继续培养60小时，用含1％BSA的pH7.5Hank液洗涤各孔，用含0.1mol/L NaOH的0.2mol/L Na2CO3溶液溶解细胞，释放DNA，溶解物在液体闪烁计数仪上计数放射性掺入量。
3)数据显示5％O2环境中VEGF的分泌量是5％CO2环境的10倍。
市面上普通冻干粉的塑形剂为蔗糖或者甘露醇，该技术方法中加入医用级海藻糖，为粉剂提供更好的骨架，且同时在超低温抽真空干燥环境中，可将冻干粉中含水量控制在0.5％以下，冻干粉有效期加速试验显示，因子含量及活性的半衰期在2年，充分证明了该制备工艺中细胞因子的稳定性。
实施例2：一种用于消除妊娠纹的间充质干细胞培养上清细胞因子冻干粉的制备方法，按照以下步骤进行：
a)至j)步骤同实施例1，培养的P5代细胞收集上清后细胞工厂加入1L生理盐水，-20℃条件下反复冻融细胞，使细胞裂解。
f)将细胞裂解液5000rpm离心30min，去除细胞碎片沉淀，与收集的细胞培养上清混合均匀，0.22um囊式滤芯过滤混合培养上清，按5％、8％、1％的比例分别添加海藻糖、甘露醇、透明质酸，混匀，制备成冻干混合液。
g)分装冻干混合原液分装至西林瓶，快速预冻，设置预冻温度为-40℃。
h)待半成品预冻温度达到-40℃，保温2小时。
i)抽真空5-10P，保持温度在-40℃，至水线完全消失，继续保温2小时。
j)逐步升高干燥温度，6-10小时后制备成冻干粉成品。
高通量MSD检测细胞因子含量显示bFGF因子含量较实例1提升5倍。
本发明制备的冻干粉，在消除妊娠纹时，有以下两种方式：
用4.5ml注射用水(1支)复溶100mg冻干粉(1支)。
使用方法一：滚针破坏妊娠纹表皮，注射用水复溶冻干粉后涂抹于该处。
使用方法二：注射用水复溶冻干粉，采用注射器点针注射至妊娠纹凹坑中，多点密集均匀注射。
根据妊娠纹纹路的深浅不同，有效结合两种使用方法，可以减轻和消除妊娠纹。
对45名妊娠纹女性进行产品的使用，使用时间3周、6周、12周，对治疗前后妊娠纹颜色、面积、松弛度及弹性差异进行对比。孕产妇进行腹部妊娠纹的严重程度评分,具体评分标准如下:孕产妇腹部无任何皮肤条纹为0分,下腹部两侧出现淡红色纤细的条纹为1分；腹部两侧或中间出现紫色或淡红色较，宽的弹力纤维断裂时为2分,腹部两侧或中间出现较宽的弹力纤维断裂并出现着色较深的褐色为3分；在3分基础上弹力纤维断裂处出现皮肤隆起为4分疗效判定标准：有效为腹部评分降低1分；无效为腹部评分未见降低。将有效和无效的使用后的结果进行总结，表1为冻干粉使用后的效果对比结果：
实验时间 有效人数 有效百分比％ 无效人数 无效百分比％
3周 21 46.7 24 53.3
6周 33 73.3 12 26.7
12周 39 87.7 6 12.3
由此可知，60妊娠纹治疗案例中，3周有效率为46.7％，6周有效率为73.3％，12周有效率为87.7％。
本发明所制备冻干粉用注射用水复溶后，在2-8℃条件下可保存2年。
如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。

Claims (7)

1.一种用于消除妊娠纹的间充质干细胞培养上清细胞因子冻干粉的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：
a)三甲医院妇产科获得脐带组织，生理盐水清洗，取华通氏胶，接种于无血清培养液中，培养第15天，细胞密度达到50％，加入EDTA重组胰蛋白酶消化细胞，生理盐水清洗后离心收集细胞沉淀，加入冻存液-80℃冻存细胞；
b)三甲医院整形外科获得脂肪组织，生理盐水清洗，脂肪组织和Ⅰ型胶原酶按比例1:1混合，震荡水浴酶消化获得原代脂肪间充质干细胞，接种于无血清培养液中，培养第7天，细胞密度达到50％，加入EDTA重组胰蛋白酶消化细胞，生理盐水清洗后离心收集细胞沉淀，加入冻存液-80℃冻存细胞；
c)复苏P1代脂肪间充质干细胞、P1代脐带间充质干细胞，加入生理盐水中，离心，收集细胞沉淀，接种于无血清培养液中，进行铺板培养；
d)铺板培养4-5天后细胞密度达到70％，收集培养上清，加入EDTA重组胰蛋白酶消化细胞，生理盐水清洗后重新铺板，按照此方法培养至P5代，收集培养上清；
e)混合P2至P5代间充质干细胞培养上清，进行细胞裂解后，去除细胞碎片沉淀；
f)往步骤e)中去除细胞碎片沉淀的培养上清中，添加海藻糖、甘露醇和透明质酸；
g)将步骤f)中添加海藻糖、甘露醇和透明质酸的的培养上清混合液，进行超低温抽真空冻干，得到细胞因子冻干粉。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤c)中P1代脂肪间充质干细胞、P1代脐带间充质干细胞的数量比为1:1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤c)中的铺板方法为，按照接种密度为4000-5000/cm2进行铺板，细胞工厂中培养液体积/培养面积为2：3，培养箱环境为5％O2，37℃。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤e)去除细胞碎片的方法为5000rpm，30min离心去沉淀，0.22um囊式滤芯过滤。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤f)中添加海藻糖、甘露醇和透明质酸的质量份比例分别为5％、8％、1％。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤g)中的冻干方法如下：
1)添加海藻糖、甘露醇和透明质酸的培养上清为冻干混合原液；
2)分装冻干混合原液至西林瓶，快速预冻，设置预冻温度为-40℃-50℃；
3)待半成品预冻温度达到-40℃-50℃，保温2-5小时；
4)抽真空5-10P，保持温度在-40℃-50℃，至水线完全消失；
5)逐步升高干燥温度，6-10小时后制备成冻干粉成品。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤e)中细胞裂解方法为向含细胞的细胞工厂中加入1L生理盐水，-20℃条件下反复冻融细胞，使细胞裂解。
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