CN108670935A - 一种用于消除皮肤妊娠纹的间充质干细胞的复合细胞因子冻干粉的制备方法 - Google Patents

一种用于消除皮肤妊娠纹的间充质干细胞的复合细胞因子冻干粉的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种用于消除皮肤妊娠纹的间充质干细胞的复合细胞因子冻干粉的制备方法，本发明涉及一种用于消除皮肤妊娠纹的间充质干细胞的复合细胞因子冻干粉的制备方法，本发明的目的是为了解决现有去除妊娠纹的方法效果不好以及有副作用的问题，本发明首先从脂肪组织中利用单克隆技术分离脂肪间充质干细胞并进行间充质干细胞相关指标的鉴定；将鉴定为间充质干细胞的单克隆细胞利用细胞工厂进行大规模扩增培养，并使用无血清培养体系无动物源成分，收集的上清液，制备成冻干粉。该复合细胞因子冻干粉含有大量有益于皮肤再生修复的生物活性因子，能够有效减轻甚至消除皮肤妊娠纹，且对皮肤无刺激等不良反应。本发明应用于细胞因子领域。

Description

一种用于消除皮肤妊娠纹的间充质干细胞的复合细胞因子冻 干粉的制备方法
技术领域
本发明涉及一种用于消除皮肤妊娠纹的间充质干细胞的复合细胞因子冻干粉的制备方法。
背景技术
妊娠纹的形成主要是由于妊娠期荷尔蒙的影响，加之腹部膨隆使皮肤的弹力纤维与胶原纤维损伤或断裂，腹部皮肤变薄变细，出现一些宽窄不同、长短不一的粉红色或紫红色的波浪状花纹。孕三月后，子宫的增大使得腹部皮肤的弹性纤维开始拉伸，腹部的肌肉也开始扩张。孕六个月左右的时候，腹部的皮肤弹性纤维无法承受来自子宫的压力而断裂，腹直肌腱也发生了一定程度上的分离，由此便在腹部留下了颜色深浅不一的纵形裂纹。分娩后，这些花纹会逐渐消失，留下白色或银白色的有光泽的瘢痕线纹，即妊娠纹。妊娠纹主要出现在腹壁上，也可能出现在大腿内外侧、臀部、胸部、后腰部及手臂等处。初产妇最为明显。一旦出现妊娠纹就不会消失，并伴随皮肤松弛、乳房下坠、腹部脂肪堆积，严重影响了妇女产后的体态和身心健康。目前，妊娠纹缺少有效的去除方法。市场上有采用外敷保健品例如按摩精油、果酸、水杨酸等，还有使用脉冲光或染料雷射照射、激光，再有是内服药物的方法，多因效果不够显著或伴有明显副作用等原因，不为多数人接受。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有去除妊娠纹的方法效果不好以及有副作用的问题，提供了一种用于消除皮肤妊娠纹的间充质干细胞的复合细胞因子冻干粉的制备方法。
本发明一种用于消除皮肤妊娠纹的间充质干细胞的复合细胞因子冻干粉的制备方法，按以下步骤进行：一、将脂肪颗粒在900-1200r/min的条件下离心4-8min，分别留取上层脂肪组织和下层细胞A，向脂肪组织中加入质量浓度为0.1％的胶原酶，放入37℃水浴摇床中消化25-35min，然后1800-2200r/min离心4-8min，留取下层细胞B；将下层细胞A和下层细胞B混匀，重悬，再1800-2200r/min离心4-8min，采用无血清成分培养基重悬细胞后，接种至六孔板培养，记为P0代；其中脂肪颗粒和胶原酶的体积比为(1-2)：1；
二、P0代培养40-50小时后，每三天进行一次换液，培养20-24d后，挑出克隆细胞，6孔板每个孔对应一个克隆细胞群，然后继续培养，记为P1代，P1代细胞融合率在80-90％进行传代培养，传代到T25培养瓶中培养，记为P2代；P2代细胞融合率在80-90％时，传代到T75培养瓶中培养，记为P3代，P3代细胞融合率在80-90％时，传代到T175培养瓶中培养，记为P4代；
三、对P4代的每一个克隆细胞群进行鉴定，将鉴定为脂肪间充质干细胞的克隆群进行混合传代培养，细胞数量达到3×107时，采用无血清培养体系和细胞工厂进行扩大培养，培养3-4d,收集上清液，上清液先采用滤膜过滤；然后进行过滤离心，取上清液进行超滤浓缩，然后冻干，赋形剂为质量浓度为3-5％的蔗糖，得到间充质干细胞的复合细胞因子冻干粉。
本发明的有益效果：
在间充质干细胞分离过程中，采用了单克隆分离技术，将间充质细胞进行纯化，大大提高了间充质干细胞的纯度。并采用细胞工厂进行大规模培养，节省了人力和时间成本。且制备成的冻干粉可以长期储存，并方便长途运输。根据本发明实施例，复合细胞因子冻干粉含有数十种分泌型蛋白，包括bFGF、EGF、VEGF等促进皮肤再生修复的生长因子。这种包含多种生物活性因子的脂肪间充质干细胞分泌物本身能够有效减轻或消除妊娠纹。由于这些生物活性分子由正常细胞所产生，其浓度及相互间的比例更符合皮肤的生理所需，有助于皮肤再生修复，没有副作用。使用时，用纯化水将冻干粉溶解后，定期涂抹于皮肤妊娠纹处，可以有效的减轻和消除妊娠纹，使用12周，有效率可达83.3％。
附图说明
图1为本发明所用脂肪间充质干细胞贴壁培养显微镜下图；
图2为本发明实施例所用脂肪间充质干细胞表面特征性分子的表达；
图3为本发明实施例所用脂肪间充质干细胞经诱导后分化形成脂肪细胞；
图4为本发明实施例所用脂肪间充质干细胞经诱导后分化形成成骨细胞。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式，还包括各具体实施方式之间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式一种用于消除皮肤妊娠纹的间充质干细胞的复合细胞因子冻干粉的制备方法，按以下步骤进行：一、将脂肪颗粒在900-1200r/min的条件下离心4-8min，分别留取上层脂肪组织和下层细胞A，向脂肪组织中加入质量浓度为0.1％的胶原酶，放入37℃水浴摇床中消化25-35min，然后1800-2200r/min离心4-8min，留取下层细胞B；将下层细胞A和下层细胞B混匀，重悬，再1800-2200r/min离心4-8min，采用无血清成分培养基重悬细胞后，接种至六孔板培养，记为P0代；其中脂肪颗粒和胶原酶的体积比为(1-2)：1；
二、P0代培养40-50小时后，每三天进行一次换液，培养20-24d后，挑出克隆细胞，6孔板每个孔对应一个克隆细胞群，然后继续培养，记为P1代，P1代细胞融合率在80-90％进行传代培养，传代到T25培养瓶中培养，记为P2代；P2代细胞融合率在80-90％时，传代到T75培养瓶中培养，记为P3代，P3代细胞融合率在80-90％时，传代到T175培养瓶中培养，记为P4代；
三、对P4代的每一个克隆细胞群进行鉴定，将鉴定为脂肪间充质干细胞的克隆群进行混合传代培养，细胞数量达到3×107时，采用无血清培养体系和细胞工厂进行扩大培养，培养3-4d,收集上清液，上清液先采用滤膜过滤；然后进行过滤离心，取上清液进行超滤浓缩，然后冻干，赋形剂为质量浓度为3-5％的蔗糖，得到间充质干细胞的复合细胞因子冻干粉。
本实施方式脂肪颗粒制备方法：将抽取的脂肪经纱布过滤，去除已破坏的脂肪细胞、残留的较粗血丝和较大组织块，过滤，然后用无菌容器保存。
本实施方式克隆细胞的挑取方法为：脂肪贴壁细胞自从接种以后，在经过3周左右时间的培养形成细胞克隆，这样的细胞克隆均来源于单个细胞。脂肪贴壁细胞单克隆是由单个细胞增殖而来的，由于干细胞的基本特性(自我更新和多向分化)，再加上使用的MSC无血清培养基，可以初步认定这样得到的单克隆就是脂肪间充质干细胞。在倒置显微镜下对脂肪贴壁细胞单克隆进行观察，单克隆是由至少50个细胞组合而成的一个细胞群。单克隆中所有细胞均是贴壁生长，细胞呈梭形。观察到脂肪贴壁细胞单克隆后用记号笔在六孔板板盖上相应位置圆圈标记，记录每孔克隆数和克隆总数。将预备挑克隆的六孔板从CO2培养箱中取出移至生物安全柜中。将六孔板放置到解剖显微镜下，打开冷光源。取出新的6孔板，每孔加入2ml MSC无血清培养基，放置于解剖显微镜旁边。在解剖镜下找到细胞克隆，使用200μl移液器和黄枪头将克隆吸出，加入到6孔板的一个孔中，将细胞混匀。每个克隆对应一个孔，做好标记。
本实施方式的有益效果：
在间充质干细胞分离过程中，采用了单克隆分离技术，将间充质细胞进行纯化，大大提高了间充质干细胞的纯度。并采用细胞工厂进行大规模培养，节省了人力和时间成本。且制备成的冻干粉可以长期储存，并方便长途运输。根据本发明实施例，复合细胞因子冻干粉含有数十种分泌型蛋白，包括bFGF、EGF、VEGF等促进皮肤再生修复的生长因子。这种包含多种生物活性因子的脂肪间充质干细胞分泌物本身能够有效减轻或消除妊娠纹。由于这些生物活性分子由正常细胞所产生，其浓度及相互间的比例更符合皮肤的生理所需，有助于皮肤再生修复，没有副作用。使用时，用纯化水将冻干粉溶解后，定期涂抹于皮肤妊娠纹处，可以有效的减轻和消除妊娠纹，使用12周，有效率可达83.3％。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中将脂肪颗粒在1000r/min的条件下离心5min。其他与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中放入37℃水浴摇床中消化30min，然后2000r/min离心5min。与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中将下层细胞A和下层细胞B混匀，重悬，再2000r/min离心5min。其他与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤一接种至六孔板培养的接种浓度为1×105-5×106个/mL。其他与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤一接种至六孔板培养和步骤二中的继续培养均是在37℃、5％CO2培养箱中培养。其他与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤二中的换液方法为：将培养细胞的六孔板拿出放置到生物安全柜中，用移液器吸出六孔板中的培养基弃掉；六孔板每孔加入2ml PBS，对六孔板进行轻微冲洗，吸取六孔板中的PBS，倒入废液缸中；使用移液器往六孔板中加入新鲜MSC无血清培养基，每孔2ml。其他与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤三对P4代的每一个克隆细胞群进行鉴定的方法为：流式检测和诱导分化试验。其他与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤三中上清液先采用0.22μm滤膜过滤。其他与具体实施方式一至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤三的过滤离心所用的离心滤膜为截留分子量为3.5kDa的分子滤膜。其他与具体实施方式一至九之一相同。
具体实施方式十一：本实施方式本实施方式与具体实施方式一至十之一不同的是：步骤三通过透析膜进行浓缩。其他与具体实施方式一至十之一相同。
采用以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例一：一种用于消除皮肤妊娠纹的间充质干细胞的复合细胞因子冻干粉的制备方法，按以下步骤进行：一、将脂肪颗粒在1000r/min的条件下离心5min，分别留取上层脂肪组织和下层细胞A，向脂肪组织中加入质量浓度为0.1％的胶原酶，放入37℃水浴摇床中消化30min，然后2000r/min离心5min，留取下层细胞B；将下层细胞A和下层细胞B混匀，重悬，再2000r/min离心5min，采用无血清成分培养基重悬细胞后，接种至六孔板培养，记为P0代；其中脂肪颗粒和胶原酶的体积比为1：1；脂肪颗粒制备方法：将抽取的脂肪经纱布过滤，去除已破坏的脂肪细胞、残留的较粗血丝和较大组织块，过滤，然后用无菌容器保存；
二、P0代培养48小时后，每三天进行一次换液，培养21d后，挑出克隆细胞，6孔板每个孔对应一个克隆细胞群，然后继续培养，记为P1代，P1代细胞融合率在80-90％进行传代培养，传代到T25培养瓶中培养，记为P2代；P2代细胞融合率在80-90％时，传代到T75培养瓶中培养，记为P3代，P3代细胞融合率在80-90％时，传代到T175培养瓶中培养，记为P4代；其中克隆细胞挑取的方法为：脂肪贴壁细胞单克隆是由单个细胞增殖而来的，由于干细胞的基本特性(自我更新和多向分化)，再加上使用的MSC无血清培养基，可以初步认定这样得到的单克隆就是脂肪间充质干细胞。在倒置显微镜下对脂肪贴壁细胞单克隆进行观察，单克隆是由至少50个细胞组合而成的一个细胞群。单克隆中所有细胞均是贴壁生长，细胞呈梭形。观察到脂肪贴壁细胞单克隆后用记号笔在六孔板板盖上相应位置圆圈标记，记录每孔克隆数和克隆总数。将预备挑克隆的六孔板从CO2培养箱中取出移至生物安全柜中。将六孔板放置到解剖显微镜下，打开冷光源。取出新的6孔板，每孔加入2ml MSC无血清培养基，放置于解剖显微镜旁边。在解剖镜下找到细胞克隆，使用200μl移液器和黄枪头将克隆吸出，加入到6孔板的一个孔中，将细胞混匀。每个克隆对应一个孔，做好标记；
三、对P4代的每一个克隆细胞群进行鉴定，将鉴定为脂肪间充质干细胞的克隆群进行混合传代培养，细胞数量达到3×107时，采用无血清培养体系和细胞工厂进行扩大培养，培养3-4d,收集上清液，上清液先采用0.22μm滤膜过滤；然后进行过滤离心，所用离心滤膜为截留分子量为3.5kDa的分子滤膜，取上清液采用Slide-A-Lyzer浓缩2-20倍，然后冻干，赋形剂为质量浓度为4％的蔗糖，得到间充质干细胞的复合细胞因子冻干粉。
考虑经济原因，本实施例中培养3-4d,收集上清液，然后换液继续培养，待显微镜下观察细胞长满到70-80％左右即可进行细胞传代，先收集上清液，再进行传代，可将多次收集的上清液混合，统一冻干。
换液的方法为：在生物安全柜中，将白色盖子拧松、蓝色的盖子拧开，收集上清液，向4层的细胞工厂的入液口中加入200mlPBS进行清洗，将废液从出液口倒入废液缸中，向4层的细胞工厂的入液口中加入无血清培养体系。
传代方法为：在生物安全柜中，收集上清液，每个细胞工厂入液口中加入200mlPBS清洗后，将PBS从出液口倒入废液缸。再向每个细胞工厂入液口中加入240ml PBS后，从入液口加入0.25％胰酶60ml，充分混匀后，在CO2培养箱中消化5-8分钟，待细胞变圆，用力拍打细胞工厂使细胞消化彻底，每瓶从入液口加入50ml FBS终止消化，用移液枪和25ml移液管从入液口吸出所有液体加入到50ml离心管中，从入液口加入200ml PBS润洗后，从入液口用移液枪和25ml移液管吸出所有液体加入到50ml离心管中，放入离心机中，1200rpm离心10分钟，然后用30ml PBS重悬细胞，将所有的细胞悬液集中到一个50ml离心管中。用移液枪和移液管取重悬后的细胞血液1-2滴到2mlEP管中，取10μl细胞悬液进行细胞计数。使用细胞计数仪计数。离心管放入离心机中，1200rpm离心10分钟，弃掉上清。然后用无血清培养体系重悬细胞，接种到细胞工厂中。
脂肪间充质干细胞贴壁培养显微镜下图，如图1所示，由图1可知，对脂肪间充质干细胞的流式和分化鉴定，具体方法如下：
脂肪间充质干细胞的鉴定，将每一个脂肪干细胞克隆P4代进行鉴定：
(1)流式检测取对数生长期的待测细胞，进行消化。用PBS重悬细胞，分装成4管(2mlEP管)细胞，每管细胞数为2×105，细胞悬液体积为500μl。分组，其中一管为空白对照，一管加入CD73-PE抗体10μl和CD90-FITC抗体10μl，一管加入CD34-PE抗体10μl和CD45-FITC抗体10μl，一管加入CD105-PE抗体10μl，混匀。将EP管室温下避光孵育30分钟。孵育结束，每管加入PBS至1.5ml，重悬进行洗涤除去多余抗体，2000rpm离心10分钟，倒掉上清。每管再加入PBS 1.5ml，重悬进行洗涤除去多余抗体，2000rpm离心10分钟，倒掉上清。流式细胞仪上机进行检测。脂肪间充质干细胞的表面表达CD90、CD105、CD73，不表达CD45、CD34如图2。
(2)成脂肪诱导分化试验，按照10000/cm2的细胞密度将脂肪间充质干细胞接种到六孔板中，接种3个孔。待第二天细胞贴壁后，更换诱导液。弃掉培养液，然后其中一孔为对照组，添加MSC完全培养基2ml/孔。其中两孔为实验组，添加MSC脂肪诱导培养基2ml/孔。每三天换一次液，诱导时间为两周。换液时，以一个孔为例。用移液器吸弃液体，加入2ml PBS进行冲洗后吸弃。加入2ml相对应的培养基。染色鉴定，配制染色液，0.5％油红储存液：去离子水＝3:2，室温放置10min，滤纸过滤。吸弃培养基，用PBS洗涤1遍2ml/孔。加12％中性甲醛2ml/孔固定5min后去除。加2ml/孔的染色液，室温避光染色30min。吸去培养板孔中的染色液，加2ml/孔蒸馏水。观察并照相脂肪间充质干细胞可以诱导分化成脂肪细胞如图3。
(3)成骨诱导分化试验，按照5000/cm2的细胞密度将脂肪间充质干细胞接种到六孔板中，接种3个孔。待第二天细胞贴壁后，更换诱导液。弃掉培养液，然后其中一孔为对照组，添加MSC完全培养基2ml/孔。其中两孔为实验组，添加MSC成骨诱导培养基2ml/孔。每三天换一次液，诱导时间为两周。换液时，以一个孔为例。用移液器吸弃液体，加入2ml PBS进行冲洗后吸弃。加入2ml相对应的培养基。染色鉴定,吸去培养板孔中的培养液体，PBS洗2ml/孔。将提前配制的固定液(40μl柠檬酸+2ml水+3ml丙酮酸)，每孔加入约1.5-2ml，30s后去除。蒸馏水洗2ml/孔。取提前配制好的染色液(125μl fastblue+6ml水+250μl AS-MX溶液)，每孔加入1.5-2ml，避光30min。吸去培养板孔中的染色液，加蒸馏水2ml/孔。观察并照相，脂肪间充质干细胞可以诱导分化成脂肪细胞如图4。
(4)干细胞上清液所含分泌型蛋白的分析，用基于抗体的蛋白质芯片(antibody-based protein array)结合质谱法测定脂肪干细胞培养上清液中的分泌型蛋白的成分和含量。基于抗体的蛋白质芯片(Human Cytokine Antibody Array G-Series 4000)购自华大基因，质谱法检测蛋白种类委托上海芯超公司，具体测定方法按生产商提供的方法进行。表1为脂肪干细胞复合因子含有的分泌型蛋白，由表1可知，脂肪干细胞培养上清液中含有数十种分泌型蛋白，包括bFGF、EGF、VEGF等促进皮肤再生修复的生长因子。
表1
(5)使用方法，用纯化水将冻干粉溶解后，定期涂抹于皮肤妊娠纹处。可以有效的减轻和消除妊娠纹。对30名妊娠纹女性进行了产品的使用，使用时间4周、8周、12周，每天早晚各涂抹1次。对涂抹治疗前后妊娠纹颜色、面积、松弛度及弹性差异进行对比。孕产妇进行腹部妊娠纹的严重程度评分,具体评分标准如下:孕产妇腹部无任何皮肤条纹为O分,下腹部两侧出现淡红色纤细的条纹为1分；腹部两侧或中间出现紫色或淡红色较宽的弹力纤维断裂时为2分,腹部两侧或中间出现较宽的弹力纤维断裂并出现着色较深的褐色为3分；在3分基础上弹力纤维断裂处出现皮肤隆起为4分.疗效判定标准:有效为腹部评分降低1分；无效为腹部评分未见降低。将有效和无效的使用后的结果进行总结，表2为脂肪干细胞复合因子使用后的效果对比结果：
表2
实验时间 有效人数(例) 有效百分比(％) 无效人数(例) 无效百分比(％)
4周 11 36.7 19 63.3
8周 17 56.7 13 43.3
12周 25 83.3 5 16.7
由表2可知，30例有妊娠纹产妇经本复合因子涂抹治疗后，总有效率为83.3％，其中涂抹治疗4周时，有效11例(36.7％)，无效19例(63.3％)；涂抹治疗8周时，有效17例(56.7％)，无效13例(43.3％)。涂抹治疗12周时，有效25例(83.3％)，无效5例(16.7％)。
本实施例冻干粉可以长期储存，并方便长途运输。根据本发明实施例，复合细胞因子冻干粉含有数十种分泌型蛋白，包括bFGF、EGF、VEGF等促进皮肤再生修复的生长因子。这种包含多种生物活性因子的脂肪间充质干细胞分泌物本身能够有效减轻或消除妊娠纹。由于这些生物活性分子由正常细胞所产生，其浓度及相互间的比例更符合皮肤的生理所需，有助于皮肤再生修复，没有副作用。使用时，用纯化水将冻干粉溶解后，定期涂抹于皮肤妊娠纹处，可以有效的减轻和消除妊娠纹，使用12周，有效率可达83.3％。

Claims (10)

1.一种用于消除皮肤妊娠纹的间充质干细胞的复合细胞因子冻干粉的制备方法，其特征在于该制备方法按以下步骤进行：一、将脂肪颗粒在900-1200r/min的条件下离心4-8min，分别留取上层脂肪组织和下层细胞A，向脂肪组织中加入质量浓度为0.1％的胶原酶，放入37℃水浴摇床中消化25-35min，然后1800-2200r/min离心4-8min，留取下层细胞B；将下层细胞A和下层细胞B混匀，重悬，再1800-2200r/min离心4-8min，采用无血清成分培养基重悬细胞后，接种至六孔板培养，记为P0代；其中脂肪颗粒和胶原酶的体积比为(1-2)：1；
二、P0代培养40-50小时后，每三天进行一次换液，培养20-24d后，挑出克隆细胞，6孔板每个孔对应一个克隆细胞群，然后继续培养，记为P1代，P1代细胞融合率在80-90％进行传代培养，传代到T25培养瓶中培养，记为P2代；P2代细胞融合率在80-90％时，传代到T75培养瓶中培养，记为P3代，P3代细胞融合率在80-90％时，传代到T175培养瓶中培养，记为P4代；
三、对P4代的每一个克隆细胞群进行鉴定，将鉴定为脂肪间充质干细胞的克隆群进行混合传代培养，细胞数量达到3×107时，采用无血清培养体系和细胞工厂进行扩大培养，培养3-4d,收集上清液，上清液先采用滤膜过滤；然后进行过滤离心，取上清液进行超滤浓缩，然后冻干，赋形剂为质量浓度为3-5％的蔗糖，得到间充质干细胞的复合细胞因子冻干粉。
2.根据权利要求1所述的一种用于消除皮肤妊娠纹的间充质干细胞的复合细胞因子冻干粉的制备方法，其特征在于步骤一中将脂肪颗粒在1000r/min的条件下离心5min。
3.根据权利要求1所述的一种用于消除皮肤妊娠纹的间充质干细胞的复合细胞因子冻干粉的制备方法，其特征在于步骤一中放入37℃水浴摇床中消化30min，然后2000r/min离心5min。
4.根据权利要求1所述的一种用于消除皮肤妊娠纹的间充质干细胞的复合细胞因子冻干粉的制备方法，其特征在于步骤一中将下层细胞A和下层细胞B混匀，重悬，再2000r/min离心5min。
5.根据权利要求1所述的一种用于消除皮肤妊娠纹的间充质干细胞的复合细胞因子冻干粉的制备方法，其特征在于步骤一接种至六孔板培养的接种浓度为1×105-5×106个/mL。
6.根据权利要求1所述的一种用于消除皮肤妊娠纹的间充质干细胞的复合细胞因子冻干粉的制备方法，其特征在于步骤一接种至六孔板培养和步骤二中的继续培养均是在37℃、5％CO2培养箱中培养。
7.根据权利要求1所述的一种用于消除皮肤妊娠纹的间充质干细胞的复合细胞因子冻干粉的制备方法，其特征在于步骤二中的换液方法为：将培养细胞的六孔板拿出放置到生物安全柜中，用移液器吸出六孔板中的培养基弃掉；六孔板每孔加入2ml PBS，对六孔板进行轻微冲洗，吸取六孔板中的PBS，倒入废液缸中；使用移液器往六孔板中加入新鲜MSC无血清培养基，每孔2ml。
8.根据权利要求1所述的一种用于消除皮肤妊娠纹的间充质干细胞的复合细胞因子冻干粉的制备方法，其特征在于步骤三对P4代的每一个克隆细胞群进行鉴定的方法为：流式检测和诱导分化试验。
9.根据权利要求1所述的一种用于消除皮肤妊娠纹的间充质干细胞的复合细胞因子冻干粉的制备方法，其特征在于步骤三中上清液先采用0.22μm滤膜过滤。
10.根据权利要求1所述的一种用于消除皮肤妊娠纹的间充质干细胞的复合细胞因子冻干粉的制备方法，其特征在于步骤三的过滤离心所用的离心滤膜为截留分子量为3.5kDa的分子滤膜。
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