CN105331580B - 增强间充质干细胞趋化能力和趋化因子ccl5表达方法 - Google Patents
增强间充质干细胞趋化能力和趋化因子ccl5表达方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105331580B CN105331580B CN201510916083.3A CN201510916083A CN105331580B CN 105331580 B CN105331580 B CN 105331580B CN 201510916083 A CN201510916083 A CN 201510916083A CN 105331580 B CN105331580 B CN 105331580B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- ccl5
- expression
- mscs
- added
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 19
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 title claims abstract description 7
- 102000001327 Chemokine CCL5 Human genes 0.000 title claims abstract description 7
- 102100032367 C-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 101000797762 Homo sapiens C-C motif chemokine 5 Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 36
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 13
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 12
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 8
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 7
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 7
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 claims description 6
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 claims description 6
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 6
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 claims description 6
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 claims description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 6
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 claims description 6
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000003292 glue Substances 0.000 claims description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 6
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 6
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims description 5
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 5
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 4
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 claims description 3
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 claims description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 3
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 claims description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 3
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000001921 nucleic acid quantification Methods 0.000 claims description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 3
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 claims 2
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 claims 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 abstract description 30
- 238000012546 transfer Methods 0.000 abstract description 7
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 abstract description 6
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 abstract description 3
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 abstract description 3
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 abstract description 2
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 abstract description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 239000005482 chemotactic factor Substances 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 235000019628 coolness Nutrition 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 241000992182 Polyommatus mediator Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002293 adipogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000010523 cascade reaction Methods 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 230000034196 cell chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229940088592 immunologic factor Drugs 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
增强间充质干细胞趋化能力和趋化因子CCL5表达方法，涉及间充质干细胞。脐带间充质干细胞的分离及原代培养脐带间充质干细胞的传代；脐带间充质干细胞的鉴定；TNF‑α和IFN‑γ对hUC‑MSCs的刺激；Real‑Time PCR检测CCL5的表达；ELISA检测CCL5的表达。使MSCs表达CCL5提高了924倍，能够获取大量天然的CCL5，相对于真核表达，不需要脂质体转染，便捷快速。TNF‑α和IFN‑γ的刺激，提升了间充质干细胞的迁移能力，提示间充质干细胞能够在体内更迅速的募集到组织损伤及炎症部位，发挥组织修复和免疫调节功能。
Description
技术领域
本发明涉及间充质干细胞，特别是涉及一种增强间充质干细胞趋化能力和趋化因子CCL5表达的方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，具有免疫调节，损伤修复，能够分泌多种活性因子，靶向损伤、肿瘤等部位；是研究和治疗组织损伤，抑制免疫等疾病的理想材料和工具。
趋化因子(chemokine)是指对于炎性细胞具有趋化作用的一类小分子蛋白，根据其分子结构中4个位点上的半胱氨酸残基的分布以及附近氨基酸残基的结构分为CXC，CC，C和CX3C 4种类(Balkwill FR.The Journal of pathology,2012；226(2):148-157)。趋化因子CCL5是CC家族成员，具有诱导细胞趋药性的因子，它不仅有炎症和免疫监督的功能，在肿瘤发展过程中也起到重要的作用(Aldinucci D and Colombatti A.Mediators ofinflammation,2014；2014:292376)。从原发性的肿瘤部位、转移的肿瘤部位或者募集到肿瘤的正常细胞分泌的趋化因子可以促进肿瘤的转移和血管生成，或者诱导形成免疫微环境。CCL5能够诱导白细胞向炎症部位浸润，参与多种炎症反应；CCL5在很多疾病的病理生理过程中起着重要的作用，如糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、器官移植排斥、人类免疫缺陷病等。CCL5的基础和临床研究对治疗这些疾病有着重要的作用。然而，从天然组织中分离CCL5有限，难以满足对其生物学功能研究和临床应用的需要，因此提高CCL5的表达有利于对CCL5进行深入的基础和临床研究。
间充质干细胞具有分泌包括成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、人表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、趋化因子5(CCL5)、白细胞介素6(IL-6)等在内的多种细胞因子的潜能；在正常培养的条件下，多种细胞因子表现为低表达，比如IDO、CCL5；当炎症环境等因素刺激时，这些细胞因子表达迅速升高。将在组织工程、免疫性疾病治疗等领域有着重要的临床研究意义。而MSCs能够通过炎症因子的联合刺激启动信号通路级联反应，最终调控本身的免疫因子的分泌，促进迁移能力，增强了其趋化性能。
发明内容
本发明的目的在于提供可提升间充质干细胞的免疫调节效果，增强其表达和分泌CCL5的能力，促进迁移能力的一种增强间充质干细胞趋化能力和趋化因子CCL5表达的方法。
本发明包括以下步骤：
1)脐带间充质干细胞的分离及原代培养；
2)脐带间充质干细胞的传代；
3)脐带间充质干细胞的鉴定；
4)TNF-α和IFN-γ对hUC-MSCs的刺激；
5)Real-Time PCR检测CCL5的表达；
6)ELISA检测CCL5的表达。
在步骤1)中，所述脐带间充质干细胞的分离及原代培养的具体方法可为：
取婴儿脐带组织，浸泡于MSC培养基MSCM(stem cell公司)，在超净台内用PBS清洗残留的血液，去除脐静脉、脐动脉及脐带外膜，剥离Wharton胶，剪碎成1～2mm3大小的组织块；将组织块放移至0.1％Ⅱ型胶原酶中，加入少许MSCM，在37℃恒温振荡仪内消化，直至Wharton胶全部消化(消化过夜)；将含有细胞的消化液吸入无菌离心管，以30倍体积的MSCM吹打细胞，用2000r/min离心10min，弃上清液；用添加有10％胎牛血清的α-MEM培养基重悬细胞，接种到培养瓶中，置于5％二氧化碳细胞培养箱中进行培养。细胞贴壁后，第五天首次换液，弃去未贴壁的细胞，以后每3～4天换液一次。
在步骤2)中，所述脐带间充质干细胞的传代的具体方法可为：
待细胞培养至80％融合，用含有0.25％EDTA的胰蛋白酶溶液消化细胞，重悬细胞，然后接种到新的培养皿中，传代细胞。待细胞长至90％融合后，进行下一次传代培养。
在步骤3)中，所述脐带间充质干细胞的鉴定的具体方法可为：
采用流式细胞术检测CD29、CD34、CD44、CD45、CD90；同时进行成脂肪细胞和成骨细胞的诱导鉴定。
在步骤4)中，所述TNF-α和IFN-γ对hUC-MSCs的刺激
用含有TNF-α和IFN-γ的α-MEM的培养基培养hUC-MSCs 12h。所述的TNF-α和IFN-γ的浓度分别为20ng/ml、50ng/ml；细胞生长的培养基只含有青霉素和氯霉素体积百分比为1％，胎牛血清的体积百分数为1％。
在步骤5)中，所述Real-Time PCR检测CCL5的表达的具体方法可为：
hUC-MSCs经炎症因子TNF-α和IFN-γ刺激6h后，提取总RNA进行反转录，同时以未加处理的hUC-MSCs作为对照试验，进行Real-Time PCR实验，检测CCL5的转录情况；
①6孔板每孔加入1ml Trizol，迅速吹打混匀至通亮，转到1.5ml RNase free的EP管中，静置5min，使核蛋白体分解；
②每1ml Trizol加入0.2ml氯仿，用力摇晃15s，静置5min；
③12000g离心15min，离心后分3层，RNA存在于上层水样层中，大约为所加Trizol容量的60％；
④将上层转移至试管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀，静置10min；12000g离心10min，RNA成胶片状沉淀附着于管底；
⑤移去上层液体，用75％乙醇1ml(-20℃预冷，用DEPC水配)洗涤RNA沉淀一次；涡旋振荡混合样品在4℃、7500g，离心5min；
⑥弃去上清，空气干燥5～10min(不能完全干燥)，溶于20μL DEPC水中；
⑦用核酸定量仪测定RNA的浓度；
⑧用以上提取的总RNA作为模板，采用Takara的反转录试剂盒进行反转录，反转录体系参见表1；
表1
x:1μg RNA的体积。
⑨按表2配制PCR反应混合液，并分至各反应管，然后加入2μL模板(DNA模板的添加量为50μg)。
表2
其中Real-time PCR引物的序列如表3所示；
表3
在步骤6)中，所述ELISA检测CCL5的表达的具体方法可为：
hUC-MSCs经炎症因子TNF-α和IFN-γ刺激12h后，吸去培养基，用磷酸缓冲液PBS洗涤两次，然后添加无血清的细胞培养基，24h后取上清，进行ELISA检测CCL5的表达。
本发明将人脐带间充质干细胞培养，长至80％～90％融合是传代，取第6～12代的细胞，用含有炎症因子TNF-α和IFN-γ的培养液进行培养，最后进行实验组和对照组的CCL5的real-time PCR和ELISA的对比检测。
本发明的有益效果：
(1)本发明使MSCs表达CCL5提高了924倍，能够获取大量天然的CCL5，相对于真核表达，不需要脂质体转染，便捷快速。
(2)本发明中，TNF-α和IFN-γ的刺激，提升了间充质干细胞的迁移能力，提示间充质干细胞能够在体内更迅速的募集到组织损伤及炎症部位，发挥组织修复和免疫调节功能。
附图说明
图1为MSCs的流式鉴定(CD29)；
图2为MSCs的流式鉴定(CD34)；
图3为MSCs的流式鉴定(CD44)；
图4为MSCs的流式鉴定(CD45)；
图5为MSCs的流式鉴定(CD90)；
图6为MSCs的诱导分化鉴定；
图7为CCL5在实验组MSCs和对照组MSCs中的mRNA转录水平对比；
图8为CCL5在实验组MSCs和对照组MSCs中的分泌水平对比；
图9为实验组MSCs和对照组MSCs体外趋化性实验结果对比。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
(1)脐带间充质干细胞的分离及原代培养
取婴儿脐带组织，浸泡于MSCs培养基MSCM(stem cell公司)，在超净台内用PBS清洗残留的血液，去除脐静脉、脐动脉及脐带外膜，剥离Wharton胶，剪碎成1～2mm3大小的组织块；将组织块放移至0.1％Ⅱ型胶原酶中，加入少许MSCM，在37℃恒温振荡仪内消化过夜，直至Wharton胶全部消化；将含有细胞的消化液吸入无菌离心管，以30倍体积的MSCM吹打细胞，用2000r/min离心10min，弃上清液；用添加有10％胎牛血清的-MEM培养基重悬细胞，接种到培养瓶中，置于5％二氧化碳细胞培养箱中进行培养。细胞贴壁后，第五天首次换液，弃去未贴壁的细胞，以后每3～4天换液一次。
(2)脐带间充质干细胞的传代
待细胞培养至80％融合时，用含有0.25％EDTA的胰蛋白酶溶液消化细胞，重悬细胞，然后接种到新的培养皿中，传代细胞。待细胞长至90％融合后，进行下一次传代培养。
脐带间充质干细胞的鉴定方法如下：
采用流式细胞术检测CD29、CD34、CD44、CD45、CD90；同时进行成脂肪细胞和成骨细胞的诱导鉴定。
①流式鉴定细胞表面marker：培养MSCs细胞，长至融合状态；收集MSCs，用胰酶消化后重悬，成1.0×106/ml的单细胞悬液，每个流式管取0.l ml；分别加入荧光标记抗体CD29-FITC、CD44-FITC、CD90-FITC、CD45-FITC、IgG1、IgG2b，室温避光孵育15min；PBS洗去未结合的抗体，然后加入100μL的PBS重悬细胞；上机检测，检测前要用200目的尼龙膜过滤。CD44以IgG2b为同型对照，CD29、CD90、CD45以IgG1作为同型对照，MSCs的流式鉴定CD29、CD34、CD44、CD45、CD90见图1～5。
②MSCs诱导分化鉴定：采用广州赛业的MSCs成脂诱导培养基和成骨诱导培养基经行诱导鉴定，MSCs的诱导分化鉴定参见图6。
(3)TNF-α和IFN-γ对hUC-MSCs的刺激
1取生长至80％-90％融合的第6～12代细胞，吸去培养基，用PBS清洗一次，然后用含有TNF-α和IFN-γ的α-MEM的培养基(添加1％的胎牛血清)培养hUC-MSCs 12h。所述的TNF-α和IFN-γ的浓度分别为20ng/ml、50ng/ml；细胞生长的培养基中含有青霉素和氯霉素体积百分比为1％；培养条件为饱和湿度、37℃、5％CO2标准条件。
2 12h后，吸去培养基，PBS清洗两次，然后加入含有1％胎牛血清的α-MEM培养基，继续培养24h，收集上清。
(4)Real-Time PCR检测CCL5的表达
hUC-MSCs经炎症因子TNF-α和IFN-γ刺激6h后，提取总RNA进行反转录，同时以未加处理的hUC-MSCs作为对照试验，进行Real-Time PCR实验，检测CCL5的转录情况。
1)6孔板每孔加入1ml Trizol，迅速吹打混匀至通亮，转到1.5ml RNase free的EP管中，室温静置5min，使核蛋白体分解。
2)每1ml Trizol加入0.2ml氯仿，用力摇晃15s，室温静置5min。
3)12000g离心15min，离心后分3层，RNA存在于上层水样层中，大约为所加Trizol容量的60％。
4)将上层小心转移至一个干净的试管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀，室温静置10min。12000g离心10min，RNA成胶片状沉淀附着于管底。
5)移去上层液体，用75％乙醇1ml(-20℃预冷，用DEPC水配)洗涤RNA沉淀一次。涡旋振荡混合样品在4℃、7500g，离心5min。
6)弃去上清，空气干燥5～10min(不能完全干燥)，溶于20μL DEPC水中。
7)用核酸定量仪测定RNA的浓度。
8)用以上提取的总RNA作为模板，采用Takara的反转录试剂盒进行反转录。反转录体系如表1所示。CCL5在实验组MSCs和对照组MSCs中的mRNA转录水平对比参见图7。
9)按表2配制PCR反应混合液，并分至各反应管，然后加入2μl模板(DNA模板的添加量为50μg)。其中PCR引物的序列如表3所示。
(5)ELISA检测CCL5的表达
取步骤(2)得到的培养基上清100μl用ELISA的方法检测CCL5的表达。
①取相应数目的酶标反应孔，其中一孔作为空白反应孔。将标准评按照倍比稀释法稀释成1000～15.6pg/ml，1孔加入样品稀释液作为零孔；待测样品每孔加入100ml。盖上96孔板，37℃，反应90min。
②甩干酶标板内的液体，不洗。加入准备好的抗体工作液(空白孔除外)，每孔100μl，37℃反应60min。
③吸去反应孔内的液体，加入1×的PBS 350μl，洗涤3次，每次1min。
④将准备好的ABC工作液(室温平衡30min)加入酶标反应孔中，每孔100μl，37℃反应30min。
⑤吸去反应液，用1×PBS缓冲液洗涤5次，每次2min；然后每孔加入90μl TMB显色液，37℃避光反应25min左右。
⑥每孔加入100μl TMB终止液，此时蓝色转变为黄色；然后用酶标仪测定样品在450nm处的OD值。
⑦制作标准曲线；再根据标准曲线算出样品对应的浓度(如果样品稀释了，实际浓度应该乘以相应的倍数)。
(6)体外趋化性实验检测迁移能力
①24孔transwell小室(孔径为8μm)铺细胞，MSCs细胞10cm培养皿长至融合状态，胰酶消化后重悬，用细胞计数仪计数，每孔加入细胞105/孔，体积为加100μl。下室加入培养基600μl(含10％的血清)。37℃培养16～24h。
②用棉签将小室内的细胞擦去，PBS清洗1次，10min。
③在下室加入4％的多聚甲醛600μl，室温10min。
④弃去固定液，倒置小室，自然风干。
⑤结晶紫染液染色10min。
⑥蒸馏水洗三遍，风干。
⑦显微镜下观察计数，每个小室取5个视野，分别计数然后取平均值。
CCL5在实验组MSCs和对照组MSCs中的分泌水平对比参见图8；实验组MSCs和对照组MSCs体外趋化性实验结果对比参见图9。
Claims (3)
1.增强间充质干细胞趋化能力和趋化因子CCL5表达方法，其特征在于包括以下步骤：
1)脐带间充质干细胞的分离及原代培养，具体方法为：取婴儿脐带组织，浸泡于MSC培养基MSCM，在超净台内用PBS清洗残留的血液，去除脐静脉、脐动脉及脐带外膜，剥离Wharton胶，剪碎成1～2mm3大小的组织块；将组织块移至0.1％Ⅱ型胶原酶中，加入MSCM，在37℃恒温振荡仪内消化，至Wharton胶全部消化；将含有细胞的消化液吸入无菌离心管，以30倍体积的MSCM吹打细胞，用2000r/min离心10min，弃上清液；用添加有10％胎牛血清的α-MEM培养基重悬细胞，接种到培养瓶中，置于5％二氧化碳细胞培养箱中进行培养，细胞贴壁后，第5天首次换液，弃去未贴壁的细胞，以后每3～4天换液一次；
2)脐带间充质干细胞的传代，具体方法为：待细胞培养至80％融合，用含有0.25％EDTA的胰蛋白酶溶液消化细胞，重悬细胞，然后接种到新的培养皿中，传代细胞，待细胞长至90％融合后，进行下一次传代培养；
3)脐带间充质干细胞的鉴定，具体方法为：采用流式细胞术检测CD29、CD34、CD44、CD45、CD90；同时进行成脂肪细胞和成骨细胞的诱导鉴定；
4)TNF-α和IFN-γ对hUC-MSCs的刺激，具体方法为：用含有TNF-α和IFN-γ的α-MEM的培养基培养hUC-MSCs 12h，所述的TNF-α和IFN-γ的浓度分别为20ng/ml、50ng/ml；细胞生长的培养基只含有青霉素和氯霉素体积百分比为1％，胎牛血清的体积百分数为1％；
5)Real-Time PCR检测CCL5的表达；
6)ELISA检测CCL5的表达。
2.如权利要求1所述增强间充质干细胞趋化能力和趋化因子CCL5表达方法，其特征在于在步骤5)中，所述Real-Time PCR检测CCL5的表达的具体方法为：
hUC-MSCs经炎症因子TNF-α和IFN-γ刺激6h后，提取总RNA进行反转录，同时以未加处理的hUC-MSCs作为对照试验，进行Real-Time PCR实验，检测CCL5的转录情况；
①6孔板每孔加入1ml Trizol，迅速吹打混匀至通亮，转到1.5ml RNase free的EP管中，静置5min，使核蛋白体分解；
②每1ml Trizol加入0.2ml氯仿，用力摇晃15s，静置5min；
③12000g离心15min，离心后分3层，RNA存在于上层水样层中，大约为所加Trizol容量的60％；
④将上层转移至试管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀，静置10min；12000g离心10min，RNA成胶片状沉淀附着于管底；
⑤移去上层液体，用75％乙醇1ml洗涤RNA沉淀一次；涡旋振荡混合样品在4℃、7500g，离心5min；
⑥弃去上清，空气干燥5～10min，溶于20μL DEPC水中；
⑦用核酸定量仪测定RNA的浓度；
⑧用提取的总RNA作为模板，采用Takara的反转录试剂盒进行反转录，反转录体系参见表1；
表1
x:1μg RNA的体积
⑨按表2配制PCR反应混合液，并分至各反应管，然后加入2μL模板；
表2
其中Real-time PCR引物的序列如表3所示；
表3
3.如权利要求1所述增强间充质干细胞趋化能力和趋化因子CCL5表达方法，其特征在于在步骤6)中，所述ELISA检测CCL5的表达的具体方法为：
hUC-MSCs经炎症因子TNF-α和IFN-γ刺激12h后，吸去培养基，用磷酸缓冲液PBS洗涤两次，然后添加无血清的细胞培养基，24h后取上清，进行ELISA检测CCL5的表达。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510916083.3A CN105331580B (zh) | 2015-12-10 | 2015-12-10 | 增强间充质干细胞趋化能力和趋化因子ccl5表达方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510916083.3A CN105331580B (zh) | 2015-12-10 | 2015-12-10 | 增强间充质干细胞趋化能力和趋化因子ccl5表达方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105331580A CN105331580A (zh) | 2016-02-17 |
| CN105331580B true CN105331580B (zh) | 2019-01-08 |
Family
ID=55282347
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510916083.3A Expired - Fee Related CN105331580B (zh) | 2015-12-10 | 2015-12-10 | 增强间充质干细胞趋化能力和趋化因子ccl5表达方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105331580B (zh) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105779386B (zh) * | 2016-04-06 | 2019-09-20 | 南京大学 | 一种间充质干细胞在制备治疗m5型白血病药物中的应用 |
| KR101971323B1 (ko) * | 2016-10-17 | 2019-04-23 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | 면역질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별방법 |
| CN108865991A (zh) * | 2018-08-14 | 2018-11-23 | 广州市番禺区中心医院 | 一种模拟糖尿病足炎症微环境的培养基的制备工艺 |
| CN112662618B (zh) * | 2020-12-01 | 2021-12-21 | 暨南大学 | 脐带间充质干细胞及其制备方法 |
| CN114292810B (zh) * | 2021-09-29 | 2023-06-02 | 深圳市北科生物科技有限公司 | 含有IFN-γ，IL1β，IL6，IL10，IL15中至少两种的细胞因子组合物 |
| CN113980896B (zh) * | 2021-10-27 | 2023-10-20 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | Irf1在调控间充质干细胞免疫调节作用及产品上的应用 |
| CN114395609A (zh) * | 2022-02-09 | 2022-04-26 | 湖南源品细胞生物科技有限公司 | 一种具有高免疫调节潜力的人间充质干细胞的筛选方法 |
| CN114874982B (zh) * | 2022-07-07 | 2022-09-30 | 山东省齐鲁干细胞工程有限公司 | 一种增强脐带间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的培养方法 |
| CN116083362B (zh) * | 2023-03-17 | 2024-05-10 | 晟造源生物科技有限公司 | 一种人脂肪干细胞转分化为神经干细胞的方法及应用 |
| CN117603909B (zh) * | 2024-01-19 | 2024-04-12 | 四川新生命干细胞科技股份有限公司 | 高免疫抑制的UCMSCs及其培养方法、试剂与应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102168065A (zh) * | 2011-02-17 | 2011-08-31 | 暨南大学 | 一种体外诱导人脐带间充质干细胞成为肝细胞的方法与应用 |
| CN103619177A (zh) * | 2011-04-25 | 2014-03-05 | 南加州大学 | 通过抑制干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α来改善组织再生的方法和组合物 |
| CN104845933A (zh) * | 2015-05-15 | 2015-08-19 | 大连理工大学 | 一种增强脂肪间充质干细胞免疫学性能和迁移能力的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130203166A1 (en) * | 2012-02-06 | 2013-08-08 | Protobios Llc | Stimulation of multipotency of mesenchymal stem cells by chemokine ccl5 |
-
2015
- 2015-12-10 CN CN201510916083.3A patent/CN105331580B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102168065A (zh) * | 2011-02-17 | 2011-08-31 | 暨南大学 | 一种体外诱导人脐带间充质干细胞成为肝细胞的方法与应用 |
| CN103619177A (zh) * | 2011-04-25 | 2014-03-05 | 南加州大学 | 通过抑制干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α来改善组织再生的方法和组合物 |
| CN104845933A (zh) * | 2015-05-15 | 2015-08-19 | 大连理工大学 | 一种增强脂肪间充质干细胞免疫学性能和迁移能力的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Human Mesenchymal Stem Cells Constitutively Express Chemokines and Chemokine Receptors That Can Be Upregulated by Cytokines, IFN-β, and Copaxone;JULIANA CROITORU-LAMOURY等;《JOURNAL OF INTERFERON & CYTOKINE RESEARCH》;20070101;第27卷(第1期);53-64 * |
| Synthetic construct Homo sapiens gateway clone IMAGE:100016641 3" read CCL5 mRNA;Rual J.F.等;《GeneBank》;20080219 * |
| 人脐带和骨髓源间充质干细胞生物学特征的对比研究;吕璐璐等;《中国实验血液学杂志》;20080215;第1卷;306-307 * |
| 人脐带间充质干细胞体外分离、纯化及鉴定;王娟等;《暨南大学学报(医学版)》;20091117;第30卷(第4期);367-372 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105331580A (zh) | 2016-02-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105331580B (zh) | 增强间充质干细胞趋化能力和趋化因子ccl5表达方法 | |
| CN102676452B (zh) | 一种含人脐带间充质干细胞分泌液的培养基及其制备方法和应用 | |
| CN105420183A (zh) | 一种从脐带华通氏胶组织中分离培养脐带间充质干细胞的方法 | |
| CN108300690A (zh) | 一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法和无血清培养基 | |
| CN105420184A (zh) | 一种从脐带外层羊膜组织中分离培养脐带间充质干细胞的方法 | |
| CN104450611A (zh) | 一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法 | |
| CN107254432A (zh) | 一种同时分离尿源性干细胞两种亚群的培养基、分离方法及应用 | |
| CN107164319A (zh) | 一种原代培养犬脐带来源的间充质干细胞的方法 | |
| CN109136174A (zh) | 一种延缓衰老的干细胞来源外泌体制剂 | |
| CN104762257A (zh) | 一种从脐带制备间充质干细胞的方法 | |
| CN108670935A (zh) | 一种用于消除皮肤妊娠纹的间充质干细胞的复合细胞因子冻干粉的制备方法 | |
| CN107267452B (zh) | 一种牙髓干细胞复苏液及牙髓干细胞的复苏方法 | |
| CN109439616A (zh) | 一种干细胞外泌体在促进胚胎卵裂和增加孵化率的方法 | |
| CN106244533A (zh) | 牙龈间充质干细胞的原代分离方法 | |
| CN105505865A (zh) | 一种脐带间充质干细胞的分离方法 | |
| CN107083359A (zh) | 干细胞培养基及干细胞分离方法 | |
| CN105886462A (zh) | 用于ADSCs培养的组合物及ADSCs培养方法 | |
| CN103271943B (zh) | 干细胞在制备治疗帕金森病的制剂中的用途 | |
| CN107384864A (zh) | 将脐带间充质干细胞诱导成神经干细胞的细胞培养液及其使用方法 | |
| CN105112359A (zh) | 小鼠脐带间充质干细胞的分离培养方法 | |
| CN105420187B (zh) | 一种用于分步培养hUC-MSC的试剂盒及采用所述试剂盒获得的hUC-MSC | |
| CN106834217A (zh) | 一种促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法及应用 | |
| CN103215218A (zh) | 一种分离培养内皮克隆形成细胞的方法 | |
| CN105755136B (zh) | 一种人12号染色体着丝粒探针试剂盒及其制备方法和应用 | |
| CN115975918A (zh) | 一种皮肤组织来源外泌体的提取方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20190108 |