CN104845933A - 一种增强脂肪间充质干细胞免疫学性能和迁移能力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞治疗技术领域脂肪间充质干细胞技术领域，特别涉及一种增强脂肪间充质干细胞免疫调节功能和迁移能力的方法，将分离得到的脂肪间充质干细胞进行原代培养、传代培养后，用含有低浓度TLR3激活剂Poly(I:C)的培养基进行短时间培养。经过Poly(I:C)共刺激培养后，所得到的具有全新表型的脂肪间充质干细胞具备更强的迁移能力，并且分泌细胞因子和趋化因子的水平发生改变，总体表现出更强的免疫抑制功能。
Description
技术领域
本发明涉及细胞治疗技术领域脂肪间充质干细胞技术领域，特别涉及一种增强脂肪间充质干细胞免疫调节功能和迁移能力的方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)作为一类成人干细胞，凭借其独特的生物学特性，在免疫治疗和再生医学领域得到了广泛的研究。这种成纤维样细胞于1968年首次被发现，并在随后的研究中证实，MSCs能够从多种组织中分离得到，并且能够在体外培养扩增。
MSCs目前被广泛应用于组织工程、损伤修复以及自身免疫性疾病等领域，这源于MSCs所具备的以下特性：
1)能够在体内向组织损伤部位进行迁移；
2)具有多向分化潜能；
3)能够分泌多种生物活性因子，参与损伤修复和炎症抑制；
4)具备免疫耐受性和免疫调节功能。
对MSCs发挥组织修复、免疫抑制功能的分子机制的研究，有助于进一步推进MSCs在细胞治疗工程领域的应用。
MSCs具有向受损伤组织迁移的能力，也被称作归巢能力，通过迁移到特定的受损区域进而发挥修复功能。目前普遍认为MSCs是通过各种趋化因子、黏附分子及其受体之间的相互作用，从而对损伤或炎症组织作出回应，激活、迁移到损伤组织中，发挥修复功能。有研究证实，患有肿瘤或急性炎症的动物模型中，损伤部位会合成释放多种趋化因子，包括血管内皮生长因子、干细胞生长因子、SDF-1等，而表达相应受体的MSCs就会对此作出回应，向受损部位迁移。
MSCs主要的免疫学特性是低免疫原性和免疫抑制能力：不表达共刺激分子，低水平表达主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ类分子，非组成型表达MHCⅡ类分子[Sharma R R,et al.Transfusion,2014,54(5):1418-1437.]。Kong等研究表明MSCs能够影响各类T细胞亚群免疫性能，将MSCs与被激活的T细胞在体外共培养能导致促炎因子分泌量降低，包括干扰素(Interferon,IFN)γ、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)α、IL-6等，同时增加抗炎因子IL-4和IL-10的分泌水平，表明MSCs能够平衡Th1和Th2的分泌活动[Kong Q,et al.J NEUROIMMUNOL,2009,207(1):83-91.]。此外，MSCs还能够介导对B细胞增殖的影响，并抑制树突状细胞的分化、成熟。多种细胞分子参与了MSCs的免疫调节行为，包括肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)、前列腺素(Prostaglandin,PG)E2、转化生长因子(Transforming growth factor,TGF)β、IL-10、IL-6、吲哚胺2,3-过氧化酶(Indoleamine-2,3-dioxygenase,IDO)以及组织相容性白细胞抗原(Histocompatibility leukocyte antigen,HLA)G5等[Gesundheit B,et al.MEDHYPOTHESES,2014.]。
由于MSCs能够向损伤部位迁移，并具有强大的抗炎、免疫调节能力，使其在组织修复和自身免疫性疾病治疗等方面具有全新的思路和无限的潜能。自身免疫性疾病是由于宿主对自体抗原的免疫耐受缺失，伴随着一系列对自体特定的靶细胞和多器官系统的攻击，从而导致的一类慢性疾病[Anaya J M.Autoimmunity reviews,2012,11(11):781-784.]。包括1型糖尿病、类风湿性关节炎、炎症性肠病、移植宿主反应，以及系统性红斑狼疮等。自身免疫性疾病的传统治疗方案多以糖皮质激素和免疫抑制剂为主，虽能有效抑制异常的自身免疫，但是长期使用会引发患者的耐受性以及诸多不良反应。于文龙等将脐带间充质干细胞通过尾静脉注射入1型糖尿病小鼠，3个月后检测各组小鼠的血糖、每日胰岛素使用剂量、CD4+T细胞数量以及胰岛α和β细胞的数量和体积。结果发现脐带间充质干细胞干预组胰岛α、β细胞结构更完整，数量明显上升；CD4+T细胞数量、胰岛素用量和血糖水平明显降低[于文龙,徐薇,于江苏.中国组织工程研究,2013,17(19):3474-3480.]。Ma等进行的体内实验显示，MRL/lpr狼疮鼠的存活时间可通过移植MSCs发生明显改善，并且体内活化B细胞、浆细胞数量均出现明显下降[Ma X,et al.Cell transplantation,2013,22(12):2279-2290.]。Zheng等研究表明，MSCs能够显著抑制RA患者T细胞的增殖及激活抗原的表达，并且这种抑制呈剂量依赖性，而且MSCs可以抑制CD4+T细胞与CD8+T细胞分泌IFN-γ和TNF-α，同时上调IL-10的水平[Zheng ZH,et al.Rheumatology,2008,47(1):22-30.]。
脂肪间充质干细胞(Adipose-derived stem cells,ASCs)作为一类来源于脂肪组织的间充质干细胞，相较于其他来来源的间充质干细胞，在实验研究和临床应用中具备更多的优势：脂肪组织的取材方便、安全，通过简单的麻醉吸脂术或者皮下脂肪组织的剪切即可获得，对供体带来的疼痛和伤害更小；ASCs在脂肪组织中的含量更丰富，通过酶消化法等技术即可分离出大量的原代细胞，并且不存在伦理问题。此外，ASCs具备间充质干细胞共有的生物学特性，包括向骨细胞、脂肪细胞等分化的潜能，在体内向炎症部位的趋向性，更重要的是具备免疫调节能力。因此，ASCs将在组织工程、免疫性疾病治疗等领域有着重要的临床研究意义。而ASCs功能性的表达TLRs，表示被激活的TLRs可能通过启动信号通路级联反应，最终调控ASCs的免疫因子的分泌，改变其免疫学性能。
发明内容
本发明为了提升间充质干细胞在免疫性疾病中的应用效果，增强其在体内向损伤/炎症部位的迁移能力和发挥免疫调节功能，提出了一种通过激活功能性的表达于脂肪间充质干细胞表面的受体蛋白，上调脂肪间充质干细胞的免疫调节功能和迁移能力。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种增强脂肪间充质干细胞免疫学性能和迁移能力的方法，步骤如下：将分离提取的脂肪间充质干细胞原代培养至80％融合，再进行传代培养，选用生长良好的第三代细胞，用含有TLR3激活剂Poly(I:C)的细胞培养液进行共培养，最后进行实验组和对照组的Real-time PCR和趋化性实验对比检测；
(1)脂肪间充质干细胞的分离及原代培养
从小鼠腹股沟部剪取脂肪组织，用HBSS缓冲液冲洗，充分剪碎，加入0.1％I型胶原酶进行消化，然后过滤并离心10min得到的细胞生长培养液；对细胞生长培养液进行重悬沉淀得到细胞悬液，将细胞悬液接种到培养瓶中，置于5％CO2细胞培养箱中进行原代培养；
(2)脂肪间充质干细胞的传代培养
待步骤(1)原代培养至80％融合，用含0.25g/100mL EDTA的胰蛋白酶液进行消化，重悬细胞，然后接种到培养皿中传代培养；待细胞培养至80％融合后，进行传下一代培养，得到第三代脂肪间充质干细胞；
(3)POLY(I:C)对脂肪间充质干细胞的刺激
用含有TLR3激活剂Poly(I:C)的细胞生长培养液培养步骤(2)培养1h，得到的第三代脂肪间充质干细胞，然后用含0.25g/100mL EDTA的胰蛋白酶液进行消化，重悬细胞；所述的含有TLR3激活剂Poly(I:C)的细胞生长培养液中Poly(I:C)的含量为1μg/mL；细胞生长培养液中含有L-谷氨酸钠2mM、三抗的体积百分数1％、胎牛血清的体积百分数10％；含有TLR3激活剂Poly(I:C)的细胞生长培养液为DMEM/F121:1培养基；
(4)Real-time PCR检测细胞因子和趋化因子的表达
利用Real-time PCR方法分别对经过Poly(I:C)共培养后的脂肪间充质干细胞和未经Poly(I:C)刺激的脂肪间充质干细胞进行对比实验，对二者IL-6、TGF-β、MCP-1、KC、Eotaxin-1、VEGF细胞因子或趋化因子mRAN表达水平进行检测；
(5)体外趋化性试验
利用transwell小室进行细胞侵袭试验，分别取生长至80％融合的经过Poly(I:C)共培养后的脂肪间充质干细胞和未经Poly(I:C)刺激的脂肪间充质干细胞，接种于小室滤膜上方；下室中加入占小孔体积25％的细胞生长培养液，过夜孵育，然后取下小室，用PBS缓冲液小心淋洗滤膜下层，棉签擦去滤膜上层细胞及杂质；钙黄绿素染色，进行荧光分析。
本发明的有益效果：
(1)本发明中，TLR3的活化，导致脂肪间充质干细胞中IL-6、TGF-β表达水平上调；MCP-1、KC、Eotaxin-1表达水平下降。诱导脂肪间充质干细胞向免疫抑制表型转化。提示ASC2具有更强大的免疫抑制能力，可以在组织损伤修复和自身免疫性疾病治疗中发挥更好效果。
(2)本发明中，TLR3的活化，提升了脂肪间充质干细胞分泌TGF-β和VEGF的水平。提示ASC2可能在促血管新生方面具有更出色的应用。
(3)本发明中，TLR3的活化，提升了脂肪间充质干细胞的迁移能力，提示我们ASC2能够在体内更迅速的募集到组织损伤及炎症部位，发挥组织修复和免疫调节功能。
附图说明
图1为IL-6在实验组ASC2和对照组ASCs中的分泌水平对比。
图2为TGF-β在实验组ASC2和对照组ASCs中的分泌水平对比。
图3为MCP-1在实验组ASC2和对照组ASCs中的分泌水平对比。
图4为KC在实验组ASC2和对照组ASCs中的分泌水平对比。
图5为Eotaxin-1在实验组ASC2和对照组ASCs中的分泌水平对比。
图6为VEGF在实验组ASC2和对照组ASCs中的分泌水平对比。
图7为实验组ASC2和对照组ASCs体外趋化性实验结果对比。
具体实施方式
(1)脂肪间充质干细胞的分离及原代培养
①取6周C57BL/6J雄性小鼠，用乙醚进行麻醉致死；酒精对其全身消毒；
②无菌条件下切取腹股沟部位的白色脂肪组织，放入含有双抗(青霉素+链霉素)的HBSS缓冲液中，反复冲洗以清除其中的血液及毛发等杂物。再用含双抗的PBS缓冲液洗涤2遍。
③利用已消毒手术剪将脂肪组织充分剪碎，加入2倍体积的0.1％I型胶原酶，在37℃下恒温震荡消化4个小时。
④将消化完成的悬液用孔径为70μm的尼龙细胞筛网进行过滤，滤掉组织悬浮物，并将滤液转移至15mL离心管中，室温下，500rcf离心10分钟。
⑤离心完成后，吸除上清及悬浮物，用细胞生长培养液悬浮细胞沉淀，接种到细胞培养瓶中，于饱和温度、37℃、5％CO2标准条件下进行原代培养。
⑥培养12小时后，进行首次换液。吸除原培养液，用PBS缓冲液洗涤2-3遍，加入预热至37℃的新鲜细胞生长培养液，在标准条件下进行培养。此后，每2-3天更换一次新鲜培养液，直至细胞生长至80％融合。
(2)脂肪间充质干细胞的传代培养
①吸除原培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞2-3遍，随后加入5mL含EDTA的0.25％胰蛋白酶液，并放置于37℃细胞培养箱中，进行消化2-3分钟。
②取出培养瓶，在显微镜下观察，细胞皱缩变形，加入5mL基础培养液终止消化，用吸管反复进行吹打，使细胞与瓶壁分离，制成细胞悬液。
③以100细胞/cm2的密度，接种于100cm2培养皿中，于饱和湿度、37℃、5％CO2标准条件下进行传一代培养。
④每隔2-3天更换一次新鲜细胞生长培养液，待生长至80％融合后，重复以上步骤，进行下一代传代培养。
(3)POLY(I:C)对脂肪间充质干细胞的刺激
①取生长至80％融合的第三代ASCs，吸除原培养液，并用PBS缓冲液洗涤2-3遍。
②将TLR3激活剂Poly(I:C)以1μg/mL的浓度加入到新鲜的细胞生长培养液中，并与①中的ASCs共培养1个小时。培养条件为饱和湿度、37℃、5％CO2标准条件。
③1小时后，取出培养瓶，吸除原培养液，用PBS缓冲液洗涤2-3遍。随后加入5mL含EDTA的0.25％胰蛋白酶液，并放置于37℃细胞培养箱中，进行消化2-3分钟。
④取出培养瓶，在显微镜下观察，细胞皱缩变形，加入5mL基础培养液终止消化，用吸管反复进行吹打，使细胞与瓶壁分离，制成细胞悬液。
(4)Real-time PCR检测细胞因子和趋化因子的表达
①吸除ASCs和ASC2原培养液，用PBS缓冲液洗涤2-3遍。
②加入1mL的Trizol试剂，室温下静置5分钟，裂解细胞。
③加入1/5体积的氯仿，用力震荡混匀，静置5分钟后离心。
④吸取上层水相至新的离心管，加入0.5mL异丙醇，充分混匀，静置5分钟后再次离心。
⑤弃上清，加入75％乙醇(DEPC水配制)，洗涤沉淀，离心并弃上清，自然干燥后，加入DEPC水溶解沉淀。
⑥反转录采用20μL体积，按照说明书要求逐步进行操作。反转录体系如表1所示。
表1 反转录体系
Tab.1 Reverse transcription system
⑦Real-time PCR反应体系为20μL，按照说明书要求逐步操作。反应体系如表2所示。
表2 反应体系
Tab.2 Reaction system
(5)体外趋化性实验检测迁移能力
①利用transwell小室进行细胞侵袭实验，人工基质胶预涂于小室滤膜(孔径为8μm)上层，以模仿细胞外基质。
②分别取生长至80％融合的ASCs和ASC2，以6×104细胞/孔的密度接种于滤膜上方。
③下室加入750μL细胞生长培养液，过夜孵育。
④第二天，取下小室，用PBS缓冲液小心淋洗滤膜下层，棉签擦去滤膜上层细胞及杂质。
⑤钙黄绿素染色，进行荧光分析。
Claims (1)
1.一种增强脂肪间充质干细胞免疫学性能和迁移能力的方法，其特征在于，步骤如下：将分离提取的脂肪间充质干细胞原代培养至80％融合，再进行传代培养，选用生长良好的第三代细胞，用含有TLR3激活剂Poly(I:C)的细胞培养液进行共培养，最后进行实验组和对照组的Real-time PCR和趋化性实验对比检测；
(1)脂肪间充质干细胞的分离及原代培养
从小鼠腹股沟部剪取脂肪组织，用HBSS缓冲液冲洗，充分剪碎，加入0.1％I型胶原酶进行消化，然后过滤并离心10min得到的细胞生长培养液；对细胞生长培养液进行重悬沉淀得到细胞悬液，将细胞悬液接种到培养瓶中，置于5％CO2细胞培养箱中进行原代培养；
(2)脂肪间充质干细胞的传代培养
待步骤(1)原代培养至80％融合，用含0.25g/100mL EDTA的胰蛋白酶液进行消化，重悬细胞，然后接种到培养皿中传代培养；待细胞培养至80％融合后，进行传下一代培养，得到第三代脂肪间充质干细胞；
(3)POLY(I:C)对脂肪间充质干细胞的刺激
用含有TLR3激活剂Poly(I:C)的细胞生长培养液培养步骤(2)培养1h，得到的第三代脂肪间充质干细胞，然后用含0.25g/100mL EDTA的胰蛋白酶液进行消化，重悬细胞；所述的含有TLR3激活剂Poly(I:C)的细胞生长培养液中Poly(I:C)的含量为1μg/mL；细胞生长培养液中含有L-谷氨酸钠2mM、三抗的体积百分数1％、胎牛血清的体积百分数10％；含有TLR3激活剂Poly(I:C)的细胞生长培养液为DMEM/F121:1培养基；
(4)Real-time PCR检测细胞因子和趋化因子的表达
利用Real-time PCR方法分别对经过Poly(I:C)共培养后的脂肪间充质干细胞和未经Poly(I:C)刺激的脂肪间充质干细胞进行对比实验，对二者IL-6、TGF-β、MCP-1、KC、Eotaxin-1、VEGF细胞因子或趋化因子mRAN表达水平进行检测；
(5)体外趋化性试验
利用transwell小室进行细胞侵袭试验，分别取生长至80％融合的经过Poly(I:C)共培养后的脂肪间充质干细胞和未经Poly(I:C)刺激的脂肪间充质干细胞，接种于小室滤膜上方；下室中加入占小孔体积25％的细胞生长培养液，过夜孵育，然后取下小室，用PBS缓冲液小心淋洗滤膜下层，棉签擦去滤膜上层细胞及杂质；钙黄绿素染色，进行荧光分析。
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