CN105331580A - 增强间充质干细胞趋化能力和趋化因子ccl5表达方法 - Google Patents
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Abstract
增强间充质干细胞趋化能力和趋化因子CCL5表达方法，涉及间充质干细胞。脐带间充质干细胞的分离及原代培养脐带间充质干细胞的传代；脐带间充质干细胞的鉴定；TNF-α和IFN-γ对hUC-MSCs的刺激；Real-Time？PCR检测CCL5的表达；ELISA检测CCL5的表达。使MSCs表达CCL5提高了924倍，能够获取大量天然的CCL5，相对于真核表达，不需要脂质体转染，便捷快速。TNF-α和IFN-γ的刺激，提升了间充质干细胞的迁移能力，提示间充质干细胞能够在体内更迅速的募集到组织损伤及炎症部位，发挥组织修复和免疫调节功能。
Description
技术领域
本发明涉及间充质干细胞，特别是涉及一种增强间充质干细胞趋化能力和趋化因子CCL5表达的方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymalstemcells)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，具有免疫调节，损伤修复，能够分泌多种活性因子，靶向损伤、肿瘤等部位；是研究和治疗组织损伤，抑制免疫等疾病的理想材料和工具。
趋化因子(chemokine)是指对于炎性细胞具有趋化作用的一类小分子蛋白，根据其分子结构中4个位点上的半胱氨酸残基的分布以及附近氨基酸残基的结构分为CXC，CC，C和CX3C4种类(BalkwillFR.TheJournalofpathology,2012；226(2):148-157)。趋化因子CCL5是CC家族成员，具有诱导细胞趋药性的因子，它不仅有炎症和免疫监督的功能，在肿瘤发展过程中也起到重要的作用(AldinucciDandColombattiA.Mediatorsofinflammation,2014；2014:292376)。从原发性的肿瘤部位、转移的肿瘤部位或者募集到肿瘤的正常细胞分泌的趋化因子可以促进肿瘤的转移和血管生成，或者诱导形成免疫微环境。CCL5能够诱导白细胞向炎症部位浸润，参与多种炎症反应；CCL5在很多疾病的病理生理过程中起着重要的作用，如糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、器官移植排斥、人类免疫缺陷病等。CCL5的基础和临床研究对治疗这些疾病有着重要的作用。然而，从天然组织中分离CCL5有限，难以满足对其生物学功能研究和临床应用的需要，因此提高CCL5的表达有利于对CCL5进行深入的基础和临床研究。
间充质干细胞具有分泌包括成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、人表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、趋化因子5(CCL5)、白细胞介素6(IL-6)等在内的多种细胞因子的潜能；在正常培养的条件下，多种细胞因子表现为低表达，比如IDO、CCL5；当炎症环境等因素刺激时，这些细胞因子表达迅速升高。将在组织工程、免疫性疾病治疗等领域有着重要的临床研究意义。而MSCs能够通过炎症因子的联合刺激启动信号通路级联反应，最终调控本身的免疫因子的分泌，促进迁移能力，增强了其趋化性能。
发明内容
本发明的目的在于提供可提升间充质干细胞的免疫调节效果，增强其表达和分泌CCL5的能力，促进迁移能力的一种增强间充质干细胞趋化能力和趋化因子CCL5表达的方法。
本发明包括以下步骤：
1)脐带间充质干细胞的分离及原代培养；
2)脐带间充质干细胞的传代；
3)脐带间充质干细胞的鉴定；
4)TNF-α和IFN-γ对hUC-MSCs的刺激；
5)Real-TimePCR检测CCL5的表达；
6)ELISA检测CCL5的表达。
在步骤1)中，所述脐带间充质干细胞的分离及原代培养的具体方法可为：
取婴儿脐带组织，浸泡于MSC培养基MSCM(stemcell公司)，在超净台内用PBS清洗残留的血液，去除脐静脉、脐动脉及脐带外膜，剥离Wharton胶，剪碎成1～2mm3大小的组织块；将组织块放移至0.1％Ⅱ型胶原酶中，加入少许MSCM，在37℃恒温振荡仪内消化，直至Wharton胶全部消化(消化过夜)；将含有细胞的消化液吸入无菌离心管，以30倍体积的MSCM吹打细胞，用2000r/min离心10min，弃上清液；用添加有10％胎牛血清的α-MEM培养基重悬细胞，接种到培养瓶中，置于5％二氧化碳细胞培养箱中进行培养。细胞贴壁后，第五天首次换液，弃去未贴壁的细胞，以后每3～4天换液一次。
在步骤2)中，所述脐带间充质干细胞的传代的具体方法可为：
待细胞培养至80％融合，用含有0.25％EDTA的胰蛋白酶溶液消化细胞，重悬细胞，然后接种到新的培养皿中，传代细胞。待细胞长至90％融合后，进行下一次传代培养。
在步骤3)中，所述脐带间充质干细胞的鉴定的具体方法可为：
采用流式细胞术检测CD29、CD34、CD44、CD45、CD90；同时进行成脂肪细胞和成骨细胞的诱导鉴定。
在步骤4)中，所述TNF-α和IFN-γ对hUC-MSCs的刺激
用含有TNF-α和IFN-γ的α-MEM的培养基培养hUC-MSCs12h。所述的TNF-α和IFN-γ的浓度分别为20ng/ml、50ng/ml；细胞生长的培养基只含有青霉素和氯霉素体积百分比为1％，胎牛血清的体积百分数为1％。
在步骤5)中，所述Real-TimePCR检测CCL5的表达的具体方法可为：
hUC-MSCs经炎症因子TNF-α和IFN-γ刺激6h后，提取总RNA进行反转录，同时以未加处理的hUC-MSCs作为对照试验，进行Real-TimePCR实验，检测CCL5的转录情况；
①6孔板每孔加入1mlTrizol，迅速吹打混匀至通亮，转到1.5mlRNasefree的EP管中，静置5min，使核蛋白体分解；
②每1mlTrizol加入0.2ml氯仿，用力摇晃15s，静置5min；
③12000g离心15min，离心后分3层，RNA存在于上层水样层中，大约为所加Trizol容量的60％；
④将上层转移至试管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀，静置10min；12000g离心10min，RNA成胶片状沉淀附着于管底；
⑤移去上层液体，用75％乙醇1ml(-20℃预冷，用DEPC水配)洗涤RNA沉淀一次；涡旋振荡混合样品在4℃、7500g，离心5min；
⑥弃去上清，空气干燥5～10min(不能完全干燥)，溶于20μLDEPC水中；
⑦用核酸定量仪测定RNA的浓度；
⑧用以上提取的总RNA作为模板，采用Takara的反转录试剂盒进行反转录，反转录体系参见表1；
表1
x:1μgRNA的体积。
⑨按表2配制PCR反应混合液，并分至各反应管，然后加入2μL模板(DNA模板的添加量为50μg)。
表2
其中Real-timePCR引物的序列如表3所示；
表3
在步骤6)中，所述ELISA检测CCL5的表达的具体方法可为：
hUC-MSCs经炎症因子TNF-α和IFN-γ刺激12h后，吸去培养基，用磷酸缓冲液PBS洗涤两次，然后添加无血清的细胞培养基，24h后取上清，进行ELISA检测CCL5的表达。
本发明将人脐带间充质干细胞培养，长至80％～90％融合是传代，取第6～12代的细胞，用含有炎症因子TNF-α和IFN-γ的培养液进行培养，最后进行实验组和对照组的CCL5的real-timePCR和ELISA的对比检测。
本发明的有益效果：
(1)本发明使MSCs表达CCL5提高了924倍，能够获取大量天然的CCL5，相对于真核表达，不需要脂质体转染，便捷快速。
(2)本发明中，TNF-α和IFN-γ的刺激，提升了间充质干细胞的迁移能力，提示间充质干细胞能够在体内更迅速的募集到组织损伤及炎症部位，发挥组织修复和免疫调节功能。
附图说明
图1为MSCs的流式鉴定(CD29)；
图2为MSCs的流式鉴定(CD34)；
图3为MSCs的流式鉴定(CD44)；
图4为MSCs的流式鉴定(CD45)；
图5为MSCs的流式鉴定(CD90)；
图6为MSCs的诱导分化鉴定；
图7为CCL5在实验组MSCs和对照组MSCs中的mRNA转录水平对比；
图8为CCL5在实验组MSCs和对照组MSCs中的分泌水平对比；
图9为实验组MSCs和对照组MSCs体外趋化性实验结果对比。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
(1)脐带间充质干细胞的分离及原代培养
取婴儿脐带组织，浸泡于MSCs培养基MSCM(stemcell公司)，在超净台内用PBS清洗残留的血液，去除脐静脉、脐动脉及脐带外膜，剥离Wharton胶，剪碎成1～2mm3大小的组织块；将组织块放移至0.1％Ⅱ型胶原酶中，加入少许MSCM，在37℃恒温振荡仪内消化过夜，直至Wharton胶全部消化；将含有细胞的消化液吸入无菌离心管，以30倍体积的MSCM吹打细胞，用2000r/min离心10min，弃上清液；用添加有10％胎牛血清的-MEM培养基重悬细胞，接种到培养瓶中，置于5％二氧化碳细胞培养箱中进行培养。细胞贴壁后，第五天首次换液，弃去未贴壁的细胞，以后每3～4天换液一次。
(2)脐带间充质干细胞的传代
待细胞培养至80％融合时，用含有0.25％EDTA的胰蛋白酶溶液消化细胞，重悬细胞，然后接种到新的培养皿中，传代细胞。待细胞长至90％融合后，进行下一次传代培养。
脐带间充质干细胞的鉴定方法如下：
采用流式细胞术检测CD29、CD34、CD44、CD45、CD90；同时进行成脂肪细胞和成骨细胞的诱导鉴定。
①流式鉴定细胞表面marker：培养MSCs细胞，长至融合状态；收集MSCs，用胰酶消化后重悬，成1.0×106/ml的单细胞悬液，每个流式管取0.lml；分别加入荧光标记抗体CD29-FITC、CD44-FITC、CD90-FITC、CD45-FITC、IgG1、IgG2b，室温避光孵育15min；PBS洗去未结合的抗体，然后加入100μL的PBS重悬细胞；上机检测，检测前要用200目的尼龙膜过滤。CD44以IgG2b为同型对照，CD29、CD90、CD45以IgG1作为同型对照，MSCs的流式鉴定CD29、CD34、CD44、CD45、CD90见图1～5。
②MSCs诱导分化鉴定：采用广州赛业的MSCs成脂诱导培养基和成骨诱导培养基经行诱导鉴定，MSCs的诱导分化鉴定参见图6。
(3)TNF-α和IFN-γ对hUC-MSCs的刺激
1取生长至80％-90％融合的第6～12代细胞，吸去培养基，用PBS清洗一次，然后用含有TNF-α和IFN-γ的α-MEM的培养基(添加1％的胎牛血清)培养hUC-MSCs12h。所述的TNF-α和IFN-γ的浓度分别为20ng/ml、50ng/ml；细胞生长的培养基中含有青霉素和氯霉素体积百分比为1％；培养条件为饱和湿度、37℃、5％CO2标准条件。
212h后，吸去培养基，PBS清洗两次，然后加入含有1％胎牛血清的α-MEM培养基，继续培养24h，收集上清。
(4)Real-TimePCR检测CCL5的表达
hUC-MSCs经炎症因子TNF-α和IFN-γ刺激6h后，提取总RNA进行反转录，同时以未加处理的hUC-MSCs作为对照试验，进行Real-TimePCR实验，检测CCL5的转录情况。
1)6孔板每孔加入1mlTrizol，迅速吹打混匀至通亮，转到1.5mlRNasefree的EP管中，室温静置5min，使核蛋白体分解。
2)每1mlTrizol加入0.2ml氯仿，用力摇晃15s，室温静置5min。
3)12000g离心15min，离心后分3层，RNA存在于上层水样层中，大约为所加Trizol容量的60％。
4)将上层小心转移至一个干净的试管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀，室温静置10min。12000g离心10min，RNA成胶片状沉淀附着于管底。
5)移去上层液体，用75％乙醇1ml(-20℃预冷，用DEPC水配)洗涤RNA沉淀一次。涡旋振荡混合样品在4℃、7500g，离心5min。
6)弃去上清，空气干燥5～10min(不能完全干燥)，溶于20μLDEPC水中。
7)用核酸定量仪测定RNA的浓度。
8)用以上提取的总RNA作为模板，采用Takara的反转录试剂盒进行反转录。反转录体系如表1所示。CCL5在实验组MSCs和对照组MSCs中的mRNA转录水平对比参见图7。
9)按表2配制PCR反应混合液，并分至各反应管，然后加入2μl模板(DNA模板的添加量为50μg)。其中PCR引物的序列如表3所示。
(5)ELISA检测CCL5的表达
取步骤(2)得到的培养基上清100μl用ELISA的方法检测CCL5的表达。
①取相应数目的酶标反应孔，其中一孔作为空白反应孔。将标准评按照倍比稀释法稀释成1000～15.6pg/ml，1孔加入样品稀释液作为零孔；待测样品每孔加入100ml。盖上96孔板，37℃，反应90min。
②甩干酶标板内的液体，不洗。加入准备好的抗体工作液(空白孔除外)，每孔100μl，37℃反应60min。
③吸去反应孔内的液体，加入1×的PBS350μl，洗涤3次，每次1min。
④将准备好的ABC工作液(室温平衡30min)加入酶标反应孔中，每孔100μl，37℃反应30min。
⑤吸去反应液，用1×PBS缓冲液洗涤5次，每次2min；然后每孔加入90μlTMB显色液，37℃避光反应25min左右。
⑥每孔加入100μlTMB终止液，此时蓝色转变为黄色；然后用酶标仪测定样品在450nm处的OD值。
⑦制作标准曲线；再根据标准曲线算出样品对应的浓度(如果样品稀释了，实际浓度应该乘以相应的倍数)。
(6)体外趋化性实验检测迁移能力
①24孔transwell小室(孔径为8μm)铺细胞，MSCs细胞10cm培养皿长至融合状态，胰酶消化后重悬，用细胞计数仪计数，每孔加入细胞105/孔，体积为加100μl。下室加入培养基600μl(含10％的血清)。37℃培养16～24h。
②用棉签将小室内的细胞擦去，PBS清洗1次，10min。
③在下室加入4％的多聚甲醛600μl，室温10min。
④弃去固定液，倒置小室，自然风干。
⑤结晶紫染液染色10min。
⑥蒸馏水洗三遍，风干。
⑦显微镜下观察计数，每个小室取5个视野，分别计数然后取平均值。
CCL5在实验组MSCs和对照组MSCs中的分泌水平对比参见图8；实验组MSCs和对照组MSCs体外趋化性实验结果对比参见图9。
Claims (7)
1.增强间充质干细胞趋化能力和趋化因子CCL5表达方法，其特征在于包括以下步骤：
1)脐带间充质干细胞的分离及原代培养；
2)脐带间充质干细胞的传代；
3)脐带间充质干细胞的鉴定；
4)TNF-α和IFN-γ对hUC-MSCs的刺激；
5)Real-TimePCR检测CCL5的表达；
6)ELISA检测CCL5的表达。
2.如权利要求1所述增强间充质干细胞趋化能力和趋化因子CCL5表达方法，其特征在于在步骤1)中，所述脐带间充质干细胞的分离及原代培养的具体方法为：取婴儿脐带组织，浸泡于MSC培养基MSCM，在超净台内用PBS清洗残留的血液，去除脐静脉、脐动脉及脐带外膜，剥离Wharton胶，剪碎成1～2mm3大小的组织块；将组织块移至0.1％Ⅱ型胶原酶中，加入MSCM，在37℃恒温振荡仪内消化，至Wharton胶全部消化；将含有细胞的消化液吸入无菌离心管，以30倍体积的MSCM吹打细胞，用2000r/min离心10min，弃上清液；用添加有10％胎牛血清的α‐MEM培养基重悬细胞，接种到培养瓶中，置于5％二氧化碳细胞培养箱中进行培养，细胞贴壁后，第5天首次换液，弃去未贴壁的细胞，以后每3～4天换液一次。
3.如权利要求1所述增强间充质干细胞趋化能力和趋化因子CCL5表达方法，其特征在于在步骤2)中，所述脐带间充质干细胞的传代的具体方法为：
待细胞培养至80％融合，用含有0.25％EDTA的胰蛋白酶溶液消化细胞，重悬细胞，然后接种到新的培养皿中，传代细胞，待细胞长至90％融合后，进行下一次传代培养。
4.如权利要求1所述增强间充质干细胞趋化能力和趋化因子CCL5表达方法，其特征在于在步骤3)中，所述脐带间充质干细胞的鉴定的具体方法为：采用流式细胞术检测CD29、CD34、CD44、CD45、CD90；同时进行成脂肪细胞和成骨细胞的诱导鉴定。
5.如权利要求1所述增强间充质干细胞趋化能力和趋化因子CCL5表达方法，其特征在于在步骤4)中，所述TNF‐α和IFN‐γ对hUC‐MSCs的刺激的具体方法为：用含有TNF‐α和IFN‐γ的α‐MEM的培养基培养hUC‐MSCs12h，所述的TNF‐α和IFN‐γ的浓度分别为20ng/ml、50ng/ml；细胞生长的培养基只含有青霉素和氯霉素体积百分比为1％，胎牛血清的体积百分数为1％。
6.如权利要求1所述增强间充质干细胞趋化能力和趋化因子CCL5表达方法，其特征在于在步骤5)中，所述Real-TimePCR检测CCL5的表达的具体方法为：
hUC-MSCs经炎症因子TNF-α和IFN-γ刺激6h后，提取总RNA进行反转录，同时以未加处理的hUC-MSCs作为对照试验，进行Real-TimePCR实验，检测CCL5的转录情况；
①6孔板每孔加入1mlTrizol，迅速吹打混匀至通亮，转到1.5mlRNasefree的EP管中，静置5min，使核蛋白体分解；
②每1mlTrizol加入0.2ml氯仿，用力摇晃15s，静置5min；
③12000g离心15min，离心后分3层，RNA存在于上层水样层中，大约为所加Trizol容量的60％；
④将上层转移至试管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀，静置10min；12000g离心10min，RNA成胶片状沉淀附着于管底；
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⑥弃去上清，空气干燥5～10min，溶于20μLDEPC水中；
⑦用核酸定量仪测定RNA的浓度；
⑧用提取的总RNA作为模板，采用Takara的反转录试剂盒进行反转录，反转录体系参见表1；
表1
⑨按表2配制PCR反应混合液，并分至各反应管，然后加入2μL模板；
表2
其中Real-timePCR引物的序列如表3所示；
表3
7.如权利要求1所述增强间充质干细胞趋化能力和趋化因子CCL5表达方法，其特征在于在步骤6)中，所述ELISA检测CCL5的表达的具体方法为：
hUC-MSCs经炎症因子TNF-α和IFN-γ刺激12h后，吸去培养基，用磷酸缓冲液PBS洗涤两次，然后添加无血清的细胞培养基，24h后取上清，进行ELISA检测CCL5的表达。
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