CN107384864A - 将脐带间充质干细胞诱导成神经干细胞的细胞培养液及其使用方法 - Google Patents

将脐带间充质干细胞诱导成神经干细胞的细胞培养液及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于将脐带间充质干细胞诱导成神经干细胞的细胞培养液及其使用方法。本发明采用含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子和黄芪甲苷的诱导培养液，利用间歇性低氧诱导的方法，在短时间内将UC‑MSC高效诱导成NSC，可有效弥补现有技术诱导时间过长的技术缺陷，有利于在临床上的大规模推广。

Description

将脐带间充质干细胞诱导成神经干细胞的细胞培养液及其使 用方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于将脐带间充质干细胞诱导成神经干细胞的细胞培养液及其使用方法。
背景技术
神经干细胞(Neural Stem Cell，NSC)是一群能自我更新并具有多种分化潜能的细胞，它来源于神经组织并可生成神经组织，在适当条件下可分化成神经元、少突胶质细胞和星形细胞。
过去很长一段时间的观点认为，成年哺乳动物中枢神经系统内的神经再生非常有限，而且随着年龄的增长，神经元数量会逐渐减少。然而，随着干细胞技术的不断发展，科学家已经证实，成年哺乳动物中枢神经系统内仍然存在神经发生。目前已明确的部位有海马齿状回、室管膜下区。这些部位的内源性NSC具有增殖、迁移并分化为神经元和神经胶质细胞的能力，能够在损伤的情况下激活、迁移来参与损伤的修复。这提示我们，中枢神经系统可通过自身内源性NSC来修复，只是由于条件不足而没有足够的新生细胞。最近的研究表明，中枢神经系统中原始NSC数量稀少，且处于静止状态，由于缺乏标志而不能高度纯化分离，很难克隆化。因此，外源性NSC的移植为研究人员提供了一个新的思路。
目前，用于移植的外源性NSC主要从胚胎干细胞诱导或直接从发育中和成体神经组织中分离培养获得。但是伦理学、安全性问题以及细胞来源和数量的有限，在一定程度上都限制了NSC的移植应用。因此，很有必要寻找其它能够获得NSC的途径来克服这些限制。
脐带间充质干细胞(Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell，UC-MSC)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。UC-MSC的细胞含量、增殖能力优于骨髓MSC，免疫原性比骨髓MSC低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景，因此越来越受到研究工作者们的关注。
目前体外诱导干细胞神经分化的方法主要有化学制剂诱导法和细胞生长因子诱导法。化学制剂诱导法虽然速度快，效果明显，但由于化学制剂的毒性效应，往往导致细胞存活时间短。细胞因子诱导方法一般为EGF和bFGF在体外低氧环境下直接诱导，EGF和bFGF是体外培养NSC时所需要的生长因子，但在低氧环境下诱导3天后，也会造成约1/3的细胞死亡。后来研究发现，在含有2％NZ/B27的neurobasal medium中添加EGF和bFGF也可以直接载体外诱导MSC转化为NSC。这种培养体系中的N2添加剂是神经元无血清培养常用的添加剂，含有硒、腐胺、铁传递蛋白和孕酮等成分。B27添加剂是在N2的基础上进一步添加了激素、抗氧化剂等成分，由于N2和B27成分复杂，且这种方法需要较长时间的培养才能将MSC诱导成NSC，不利于临床上的大规模推广。
中药黄芪具有补气升阳、利水退肿等功效，作为一种传统中药被广泛应用于治疗缺血性脑血管病。近来的研究发现，黄芪在神经元保护和修复方面也显示了一定的作用。黄芪甲苷(Astragaloside A,AS)是从黄芪总苷中分离得到的一类单体化合物，是黄芪的主要活性成分之一。有研究表明，黄芪有效提取成份黄芪甲苷可明显提高体外培养NSCs神经球形成率。
本发明开发了一种可在短时间内将UC-MSC高效诱导成NSC的方法，可有效弥补现有技术诱导时间过长的技术缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以将UC-MSC高效诱导成NSC的培养液以及使用该培养液的方法。
在第一方面，本发明提供了一种细胞培养液，所述细胞培养液含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子和黄芪甲苷。
在本发明的实施方案中，所述细胞培养液包含10μg/ml-400μg/ml的黄芪甲苷，优选地50μg/ml-200μg/ml的黄芪甲苷，更优选地100μg/ml的黄芪甲苷。
在本发明的实施方案中，所述细胞培养液包含20ng/ml-40ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子。
在本发明的实施方案中，所述细胞培养液包含20ng/ml-40ng/ml的表皮细胞生长因子。
在本发明的实施方案中，所述细胞培养液包含α-MEM培养基、灭活的脐带血清。
在第二方面，本发明提供了一种将脐带间充质干细胞诱导成神经干细胞的方法，所述方法包括使用根据第一方面所述的细胞培养液诱导培养所述脐带间充质干细胞。
在本发明的实施方案中，所述脐带间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。
在本发明的实施方案中，所述脐带间充质干细胞为对数生长期的第二次传代后的脐带间充质干细胞。
在本发明的实施方案中，使用所述细胞培养液诱导培养所述脐带间充质干细胞8-12天。
在本发明的实施方案中，所述方法包括在培养期间每天将所诱导的脐带间充质干细胞置于3％的低氧环境下诱导培养1h后转入正常的37℃、5％CO2、饱和湿度条件的细胞培养箱中继续培养。
有益效果：
本发明大大缩短了将UC-MSC诱导成NSC的时间，并且所得到的NSC各项指标都非常好，神经干细胞比例高，特性明显，细胞存活率高。
附图说明
通过以下参照附图对本发明实施例的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优点将更为清楚，在附图中：
图1显示人脐带间充质干细胞培养结果。
图2显示对分离培养获得的人脐带间充质干细胞进行鉴定的结果。
图3显示采用本发明的细胞培养液对人脐带间充质干细胞进行诱导培养的细胞统计结果。
图4显示采用本发明的细胞培养液对人脐带间充质干细胞进行诱导培养过程中细胞的形态变化。
图5显示对诱导培养所获得神经干细胞进行鉴定的结果。
具体实施方式
以下基于实施例对本发明进行描述，但是本发明并不仅仅限于这些实施例。
实施例1
取新鲜健康脐带及脐血，收集脐血离心后取上层血清灭活后备用。用PBS冲洗干净后，用剪刀镊子剔去脐血管，剥出里面的华氏胶组织，将所得组织充分剪碎至1mm3大小，加入α-MEM培养液置于37℃，5％的CO2培养箱培养，培养液中含10％灭活的脐血清，100U/ml链霉素，100U/ml青霉素。脐带组织培养5-8天后，可见有部分细胞从组织块周围爬出，形态呈细小的梭形，一周后，细胞开始迅速增殖，形成大小不等的细胞集落，待细胞长满后，用0.25％胰蛋白酶消化传代。如图1所示，人脐带间充质干细胞呈类纤维细胞贴壁生长，且细胞形态均一，呈梭形，并有一定方向性，漩涡状生长。
实施例2
取对数生长期的P3代UC-MSC，用胰酶消化后，调整细胞密度为1x106个/ml后将细胞转入9个流式管中，每管1ml，600g离心3min，弃上清，加入1ml PBS冲洗2遍。200μl PBS重悬细胞后，分别加入各5μL的CD19-FITC、CD34-FITC、CD45-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE和HLA-DR-PE鼠抗人单克隆抗体，并分别加入5μL抗鼠IgG1-FITC和抗鼠IgG1-PE于另外2管作为同型对照。4℃避光孵育30min后，PBS洗涤3次，弃上清后PBS重悬细胞，通过流式细胞仪检测检测细胞表型。
结果如图2所示，分离培养获得的UC-MSC完全符合鉴定标准，即高表达CD73，CD90，CD105，低表达或不表达CD19、CD34、CD45和HLA-DR。
实施例3
取对数生长期的P3代UC-MSC，用胰酶消化后，调整细胞密度为1x105个/ml后接种于6孔板中，每孔2ml，24h后更换为新鲜培养液，并随机分为A、B、C、D、E、F、G共7组，按表一添加诱导因子。EGF和bFGF的浓度按文献报道的浓度20ng/ml添加，AS的浓度分别为0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml。各组每天均置于3％的低氧环境下诱导培养1h后，转入正常的37℃、5％CO2、饱和湿度条件的细胞培养箱中继续培养，如此间歇性的低氧诱导10天。每天在倒置相差显微镜下观察一次细胞的生长情况及其形态学变化。每组中随机选择10个非重叠视野，观察其中的总细胞数、神经样细胞的数量及间充质干细胞的形态，计算神经样细胞占总细胞的百分比。
表一
分组 AS(μg/ml) EGF(ng/ml) bFGF(ng/ml)
A 0 0 0
B 0 20 20
C 10 20 20
D 50 20 20
E 100 20 20
F 200 20 20
G 400 20 20
结果如图3所示，F组和G组神经样细胞在第6天时比例最高，但第6天后脱落速度较快，在第10天时，神经样细胞比例低于E组。E组，即AS为100μg/ml时，第10天时的神经样细胞比例最高。
对E组细胞进行拍照分析发现，与未诱导的UC-MSC相比，诱导2-3天的细胞变小，漩涡样结构排列(图4A-4B)。培养至4-5天时，细胞聚集并开始形成小的球形细胞簇，但仍有小部分细胞贴壁生长(图4C)。随着细胞簇逐渐变大，这些球形结构逐渐离开培养瓶底，形成悬浮的细胞团，形态规则，无突起生长，成神经干细胞球样生长(图4D)。继续培养至7-8天可见细胞向一侧或两侧伸出较长的突起，突起逐渐伸长(图4E)，培养至第10天可见细胞伸出较长的突起，且突起及其分支数量增多，并可见邻近细胞间相互连接成网状，呈现出典型神经细胞样改变(图4F)；
实施例4
为了进一步鉴定所诱导的神经干细胞特性，我们用qPCR检测神经干细胞标志基因Nestin和NeuroD1基因的表达以及在UC-MSC中高表达的FN基因的表达情况。
分别收集1x106个UC-MSC及E组诱导分化10天后获得的神经干细胞，400×g离心5min，仔细吸弃上清液。加入1ml TRIzol，反复吸打。室温(15-30℃)放置5min后，加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3min。2-8℃10000×g离心15分钟，转移上层水相至新的RNase-free离心管中。加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。2-8℃10000×g离心10分钟，移去上清。75℅乙醇洗涤RNA沉淀。室温放置5-10min干燥RNA。加入80μl无RNase的H2O溶解RNA，质量鉴定及浓度测定后将RNA逆转录为cDNA，qPCR检测。引物序列如下：
Nestin正向引物:5’-AGCTGGCGCACCTCAAGATG-3’，Nestin反向引物:5’-AGGGAAGTTGGGCTCAGGAC-3’；
NeuroD1正向引物:5’-CGCTGGAGCCCTTCTTTGA-3’，NeuroD1反向引物:5’-GCGGACGGTTCGTGTTTGA-3’；
FN1正向引物:5’-TGTAGTGAGTGTCTCCAGTG-3’，FN1反向引物:5’-TCTCGAGGTCTCCCACTGA-3’；
GAPDH正向引物:5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，GAPDH反向引物:5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。
结果如图5所示，相比于未诱导的UC-MSC，UCMSC诱导10天后，神经干细胞的标志基因Nestin和NeuroD1表达升高，而在UC-MSC中高表达的FN1则在诱导后表达下调。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种改动和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种细胞培养液，所述细胞培养液含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子和黄芪甲苷。
2.根据权利要求1所述的细胞培养液，其中所述细胞培养液包含10μg/ml-400μg/ml的黄芪甲苷，优选地50μg/ml-200μg/ml的黄芪甲苷，更优选地100μg/ml的黄芪甲苷。
3.根据权利要求1或2所述的细胞培养液，其中所述细胞培养液包含20ng/ml-40ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子。
4.根据权利要求1或2所述的细胞培养液，其中所述细胞培养液包含20ng/ml-40ng/ml的表皮细胞生长因子。
5.根据权利要求1或2所述的细胞培养液，其中所述细胞培养液包含α-MEM培养基、灭活的脐带血清。
6.一种脐带间充质干细胞诱导成神经干细胞的方法，所述方法包括使用根据权利要求1-5中任一项所述的细胞培养液诱导培养所述脐带间充质干细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述脐带间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述脐带间充质干细胞为对数生长期的第二次传代后的脐带间充质干细胞。
9.根据权利要求6或7所述的方法，其中使用所述细胞培养液诱导培养所述脐带间充质干细胞8-12天。
10.根据权利要求6或7所述的方法，所述方法包括在培养期间每天将所诱导的脐带间充质干细胞置于3％的低氧环境下诱导培养1h后转入正常的37℃、5％CO2、饱和湿度条件的细胞培养箱中继续培养。
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Address after: 518000 dormitories in Daqian industrial plant, zone 67, Xingdong community, Xin'an street, Bao'an District, Shenzhen City, Guangdong Province 105, 106

Applicant after: WoXin Biotechnology (Shenzhen) Co., Ltd

Address before: Shenzhen City, Guangdong province Baoan 518000 Liuxian Road Industrial Park 2 Gaoxinqi Building 1 floor B block 7

Applicant before: SHENZHEN TAVA CELL ENGINEERING CO., LTD.

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Effective date of registration: 20211104

Address after: 518126 commercial and residential building 311, No. 480, Xixiang section, national highway 107, Taoyuan community, Xixiang street, Bao'an District, Shenzhen, Guangdong

Patentee after: Shenzhen woyingda Life Science Co.,Ltd.

Address before: 518000 dormitory 105, 106, Daqian industrial factory, area 67, Xingdong community, Xin'an street, Bao'an District, Shenzhen City, Guangdong Province

Patentee before: WoXin Biotechnology (Shenzhen) Co.,Ltd.

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