CN106801035A - 一种人脂肪来源间充质干细胞的预处理方法 - Google Patents

一种人脂肪来源间充质干细胞的预处理方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种人脂肪来源间充质干细胞的预处理方法：其包括：a)提供人脂肪来源间充质干细胞；b)对人脂肪来源间充质干细胞进行原代培养；c)对人脂肪来源间充质干细胞进行传代培养；d)在传代培养过程中，采用波长660nm±20nm低能量激光照射人脂肪来源间充质干细胞，照射剂量为11‑16J/cm2；e)获得处理后的人脂肪来源间充质干细胞。本发明通过照射处理，能保持hAD‑MSC细胞学特征，并有效提高其增殖和迁移能力，可用于干细胞移植前预处理方案。

Description

一种人脂肪来源间充质干细胞的预处理方法
技术领域
本发明涉及间充质干细胞的预处理方法，具体涉及一种提高人脂肪来源间充质干细胞增殖与迁移能力的预处理方法。
背景技术
人脂肪来源间充质干细胞(hAD-MSC)是干细胞家族中重要的一类具有再生医学应用的细胞，其表面表达间充质特异性标记CD73、CD90、CD105，不表达CD34、CD43、CD45，可以分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞[1]。有研究表明将干细胞在体外暴露于低氧环境，模拟干细胞在受损组织经历的微环境，可以增强干细胞移植后在体内的抵抗力，其它的方案如热休克处理诱导热休克蛋白(HSP)表达，或者过氧化氢暴露增加抗氧化应激能力。将干细胞种植在3D条件下例如3D聚集体和水凝胶，也提供了有利的微环境，通过细胞-细胞或细胞-基质的相互作用以及干细胞分泌的营养因子的调节作用，促进了干细胞在缺血条件下的滞留率和存活率。阻碍上述方法被广泛接受的原因之一是在预处理所需的参数较难控制，可能因处理不当造成干细胞的死亡。对增加干细胞移植后在受损组织中的存活率进而不损害组织完整性的非遗传学操作将被优先考虑在干细胞移植前预处理方案中。
周围环境中的信号对间充质干细胞的功能起关键调节作用，协调诸如增殖、迁移和分化等活动。许多工作都集中在调节干细胞功能的生化信号，生物物理刺激的影响正待揭示[2,3]。光生物调节作用(photobiomodulation,PBM)使用光来影响内源性酶活性，以引发细胞信号通路和细胞或组织的代谢改变。PBM通过各种类型的光源，如发光二极管(LED)和低能量激光(LLL)，发出的频谱可以穿透组织但不至于像紫外线的致突变效应[4]。低能量激光近年来作为一种非侵入性的物理疗法被临床用于骨质疏松症的治疗，低能量激光可以直接或间接影响骨髓间充质干细胞的状态[5]。
因此，亟需开发一种有助于提高干细胞存活率、简便、安全、有效的脂肪来源间充质干细胞的移植前预处理方法。
发明内容
有鉴于此，本发明目的是提供一种人脂肪来源间充质干细胞的预处理方法，其包括：
a)提供人脂肪来源间充质干细胞；
b)对人脂肪来源间充质干细胞进行原代培养；
c)对人脂肪来源间充质干细胞进行传代培养；
d)在传代培养过程中，采用波长660nm±20nm低能量激光照射人脂肪来源间充质干细胞，照射剂量为11-16J/cm2；
e)获得处理后的人脂肪来源间充质干细胞。
本领域技术人员理解，可以采用本领域任何适合方式来提供人脂肪来源间充质干细胞。例如，在一些实施方案中，由成人吸脂术后，收取无菌脂肪组织，消化分离获得人脂肪来源间充质干细胞。
本领域技术人员理解，可以采用本领域任何适合方式和任何适合的培养基对人脂肪来源间充质干细胞进行原代培养。在一些实施方案中，采用贴壁的培养方式对人脂肪来源间充质干细胞进行原代培养。在一些实施方案中，在hAD-MSC工作液(DMEM/F12，添加有10ng/ml表皮生长因子、10ng/ml血小板衍生生长因子、1×胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸、1×亚油酸-牛血清白蛋白、50μM巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、4％胎牛血清、100μg/ml青霉素和100U/ml硫酸链霉素双抗生素)中对人脂肪来源间充质干细胞进行原代培养。在本发明的上下文中，原代培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行的首次培养。原代培养的人脂肪来源间充质干细胞称为P0代。原代培养后进行首次传代后培养的人脂肪来源间充质干细胞称为P1代或第1代，将P1代进行传代后培养的人脂肪来源间充质干细胞为P2代或第2代。
在一些实施方案中，可以采用本领域任何适合方式和任何适合的培养基对人脂肪来源间充质干细胞进行传代培养。在一些实施方案中，采用贴壁的培养方式对人脂肪来源间充质干细胞进行传代培养。在一些实施方案中，在hAD-MSC工作液中对人脂肪来源间充质干细胞进行传代培养。
在传代培养过程中，采用波长660nm±20nm低能量激光照射人脂肪来源间充质干细胞，照射剂量为11-16J/cm2，，优选15J/cm2。在一个优选的实施方案中，对第1-3代的人脂肪来源间充质干细胞进行低能量激光照射。在一个优选的实施方案中，对培养至第3代的细胞进行照射，进行细胞增殖、计数后，可用于干细胞移植。
在具体的实施方案中，可以使用医疗器械量子血管外照射仪(LXW660-II，沈阳吉星医疗器械有限公司)对人脂肪来源间充质干细胞照射1h±10min，优选1h。具体地，该量子血管外照射仪具有以下技术参数：电源：220V±22V，50Hz±1Hz；光输出波长：660nm±20nm；单点输出光功率：3mw-4.5mw。
本发明在另一方面还提供了一种细胞制品，其包含经上述的方法预处理的人脂肪来源间充质干细胞。
本发明在另一方面还提供了一种细胞制品，其包含经上述的方法预处理的人脂肪来源间充质干细胞；和药学上可接受的载体。
本发明在另一方面还提供了上述的细胞制品在制备用于治疗移植物抗宿主病、再生障碍性贫血、系统性红斑狼疮及多发性硬化的药物中的用途。
可见，通过本发明提供的提高人脂肪来源间充质干细胞增殖和迁移能力的预处理方法对人脂肪来源间充质干细胞进行预处理，可以增加移植前人脂肪来源间充质干细胞的存活率和迁移能力。提供了简便、安全、有效的脂肪来源间充质干细胞的移植前预处理方法，用于干细胞移植前预处理方案。
附图说明
图1A和图1B：LLL处理组(图1A)及对照组(图1B)的hAD-MSC在显微镜下的形态良好(20X)。
图2A和图2B：其中图2A显示MTS检测LLL处理组较对照组hAD-MSC增殖加快；图2B显示LLL处理组的细胞数目倍增时间减少。
图3：LLL处理组细胞的S期比例上升。
图4A至图4E：细胞划痕实验检测LLL处理组划痕愈合加快。其中，图4A为使用枪头进行划线的LLL处理组的细胞；图4B为使用枪头进行划线后培养12小时的LLL处理组的细胞；图4C为使用枪头进行划线的对照组的细胞；图4D为使用枪头进行划线后培养12小时的对照组的细胞；图4E显示LLL处理组和对照组细胞使用枪头进行划线后培养12小时后细胞迁移距离的比较。
图5A至图5F：Transwell检测LLL促进hAD-MSC迁移，对侵袭能力无影响。其中，图5A为LLL处理组培养24小时后基底膜基质胶侵袭情况；图5B为对照组培养24小时后基底膜基质胶侵袭情况；图5C为LLL处理组培养24小时后细胞迁移情况；图5D为对照组培养24小时后细胞迁移情况；图5E显示LLL处理组和对照组细胞基底膜基质胶侵袭的比较；图5F为LLL处理组和对照组细胞迁徙的比较。
具体实施方式
以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：hAD-MSC的分离及原代培养
hAD-MSC由成人吸脂术后收取无菌脂肪组织消化分离获得，成人脂肪样品取自整形医院，所有样品均与供者签订知情同意书。
具体地，吸脂术采集的脂肪放入含双抗生素(青霉素、链霉素(购自华北制药厂))的D-Hanks’液(购自北京索莱宝科技有限公司)保存运输。吸脂术采集的脂肪组织，用上述含有双抗生素的D-Hanks’液洗涤2次，去除血细胞及麻药，800rpm离心3min。将洗涤后的下层液体用移液管吸出，去尽，将脂肪组织转至新的50ml离心管内，加入0.2％胶原酶P(购自Sigma)(脂肪:胶原酶P体积比3:1)消化，于37℃恒温培养震荡器震荡30min。加入适量D-Hanks’液将消化后的脂肪组织，100μm细胞滤网过滤，去除未消化的组织，1500rpm离心10min。将上层油脂用移液管吸出后，弃上清，D-Hanks’重悬细胞沉淀，洗涤1次，1500rpm离心10min。弃上清，用12ml含适量100μg/ml青霉素和100U/ml硫酸链霉素双抗生素hAD-MSC工作液(DMEM/F12(Gibco)添加表皮生长因子(10ng/ml)(Gibco)、血小板衍生生长因子(10ng/ml)(Sigma)、1×胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸(Gibco)、1×亚油酸-牛血清白蛋白(Gibco)、50μM巯基乙醇(Merck)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)，4％胎牛血清(Gibco)重悬细胞，将2×106个细胞接种于T75培养瓶(购自Corning)内，于37℃恒温、5％CO2饱和湿度细胞培养箱中，进行原代细胞培养。原代细胞接种24h后，除去上层未贴壁的细胞，继续培养，每隔2-3天全量换液一次；细胞达80％汇合时，可进行传代培养或冻存保种。
实施例2：hAD-MSC的传代培养
将实施例1中获得的原代培养的hAD-MSC进行传代培养，具体地，1)当细胞达70％-80％汇合时，弃培养基，D-Hanks’液洗细胞2遍，加入0.25％的胰酶(含0.01％EDTA)消化液(Gibco)，室温消化，显微镜下观察，待细胞变为圆形时，FBS终止胰蛋白酶的作用；
2)用移液管轻轻吹打培养瓶的细胞，使细胞从培养瓶壁上脱离下来，并收集细胞悬液于15ml离心管内，取出少量培养液稀释至适当倍数细胞计数仪计数，剩余细胞1200rpm离心5min，弃上清；
3)传代：将细胞重悬于新培养基中，按1:3传代，接种于新的培养瓶，置于37℃，5％CO2饱和湿度的培养箱中继续培养。
实施例3：低能量激光(LLL)照射处理
采用低能量激光照射实施例2中传代培养的hAD-MSC，照射第1代细胞至第3代之间的细胞，直接对贴壁细胞进行照射，照射时间约为1h±10min(照射剂量11-16J/cm2)。具体地，在本实施例中，使用沈阳吉星医疗器械有限公司LXW660-II型量子血管外照射仪对hAD-MSC进行照射。该量子血管外照射仪的工作条件为：电源220V±22V，50hz±1HZ；光输出波长660nm±20nm，红色至近红外范围(630-1000nm)，单点光源的输出功率3mw-4.5mw。所有照射在室温下超净台内进行，对照组在相同条件下处理，无激光照射。
实施例4：采用MTS检测细胞生长曲线及倍增时间实验
将实施例3中经照射后的细胞(第3代，照射后直接实验)进行接种：用含10％胎小牛血清(购自：Gibco)的DMEM/F12培养液(购自：Gibco)配成单个细胞悬液，以每孔1000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μl，设置照射处理组和对照组。呈色：到达设计时间点后取样，每孔加MTS溶液20μl(购自：promega)。37℃培养箱孵育3h。设空白对照：与试验孔平行设置不加细胞只加培养液的空白对照孔。最后比色时，以空白孔调零。
比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。计算细胞对数生长期倍增时间(Td＝T×lg2/lg(N/N0)；Td：倍增时间，T：时间间隔，N：终点细胞OD，N0：初始细胞OD)[Td1＝T(72h)×lg2/lg(N96h/N0)，Td2＝T(48h)×lg2/lg(N72h/N0)，Td3＝T(24h)×lg2/lg(N48h/N0)→Td(平均值)+SD]。
实施例5：碘化丙锭(PI)染色流式细胞术测定细胞周期
接种细胞：采用实施例3中的方法，将第3代hAD-MSC的T75置于量子血管外照射仪下分别处理1h，处理完毕后样本以2.0×105个/孔接种于6孔板，每孔体积2ml DMEM/F12，每个样本设置3个复孔，放回培养箱培养。细胞常规胰酶(购自Gibco)消化后1000rpm离心5min，PBS(0.01mol/L)重悬细胞置于EP管中，1000rpm离心5min，向EP管中逐滴加入-20℃预冷无水乙醇700μl，混匀后于4℃固定过夜。次日上午，1000rpm离心5min，PBS洗2遍，500μlPBS重悬细胞，加RNaseA(购自：北京索莱宝科技有限公司)250μl(终浓度10μg/ml)，置37℃恒温水浴箱，孵育30min。加12.5μl(终浓度50μg/ml)碘化丙锭(PI)染色，避光孵育1min。BDFACScan(Becton Dickinson)流式细胞仪，汞灯488nm波长激发光激发。每个样品分析10,000个细胞的DNA含量。实验重复3次。分析细胞周期各时相的细胞百分数(％)，所得结果进行t检验。
实施例6：细胞划痕实验
准备实施例3中经照射后的细胞(第3代，照射后直接实验)：实验组和对照组按2×105/孔接种于六孔板中。过夜贴壁后观察细胞生长到70％-80％汇合，用10μl的枪头进行划线，显微镜下拍照记录。D-Hanks’液贴壁缓慢加入孔板洗2遍，去除悬浮细胞。加入低血清(1％胎牛血清(FBS)购自：Gibco)的培养基DMEM(购自：Hyclone)进行培养。培养12h后，于显微镜下观察并拍照，检测划痕愈合情况。
实施例7：体外侵袭和迁移实验
铺胶(侵袭)：用无血清培养基将基底膜基质胶(Matrigel，购自：BD)稀释10倍，每个小室加30μl，均匀晾干。细胞准备(第3代，照射后直接实验)：实验组与对照组细胞按2×105每孔接种于六孔板中，每组3孔。过夜贴壁后观察细胞生长到70％-80％汇合。水化小室：在上室中加入500μl含1％BSA(购自：碧云天)的无血清高糖DMEM(购自：Hyclone)，放培养箱中孵育2h。从培养箱中取出小室，小心吸去培养液，在下室中加入含10％FBS(作为趋化剂)的培养液。在上室中立即加入以含1％BSA的无血清DMEM培养液(购自Hyclone)重悬的细胞悬液。检查上室底部与下室接触液面间没有气泡后，将24孔板放入培养箱中常规培养。观察各组细胞的迁移情况，待迁移(侵袭)最快的小室上表面还有少量未穿过上室膜(或Matrigel)的细胞存在时(约24～48h)终止实验。以无菌棉棒轻轻揩去上室残留细胞后，用4％的多聚甲醛固定上室底面的细胞，室温放置15min。蒸馏水洗去固定液后，结晶紫染色30min。蒸馏水冲洗后观察拍照，在40倍或20倍视野下，对膜的上下左右及中间计数，取平均数。
实验结果
1)光学显微镜下观察LLL处理组和对照组的MSC贴壁生长，呈现成纤维样细胞的梭形，细胞核清晰，折光率均匀(图1A和图1B)。
2)使用LLL分别照射细胞1h后MTS实验显示LLL处理能增加细胞增殖能力(图2A)，同时细胞倍增时间从对照组的19.64±3.63h缩减到12.44±4.48h(图2B)。
3)通过PI染色测细胞周期，与对照组相比照射后MSC处于S期的细胞(32.47±2.08％对比12.78±1.37，p<0.05)显著增多，意味着细胞增殖活动加强(图3)。
4)照射1h后的MSC用于划痕实验，采用10μl白色枪尖划痕细胞，划好后显微拍照，继续培养12h后观察划痕愈合情况。结果显示，LLL处理组较对照组划痕较窄，细胞迁移较快，即照射后细胞愈合能力增强(图4A至图4E)。
5)细胞以2x105cell/孔接种于Matrigel处理的8μm transwell(24孔板)上室，或者1x105cell/孔直接接种于8μm transwell(24孔板)上室。实验组照射1h后，观察各组细胞，待迁移最快的小室膜上表面还有少量未穿膜的细胞存在时(约24h)终止实验，固定，染色。结果显示：LLL对MSC的侵袭能力没有影响，但显著上调MSC的迁移能力(图5A至图5F)。
受伤组织的部位通常与缺血、细胞外基质(ECM)降解、氧化应激、炎症和急性免疫反应有关，结果是干细胞通常显示出有限的存活率和损伤组织低保留率，降低它们的治疗效果。在移植前对干细胞进行激光照射处理可以提高其在细胞疗法中的长期效率。这个干细胞的长期存活并整合入受损组织将依靠预处理来增加它在缺氧缺血、营养剥夺与氧化应激区域的长效抵抗。
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Claims (9)

1.一种人脂肪来源间充质干细胞的预处理方法，其包括：
a)提供人脂肪来源间充质干细胞；
b)对人脂肪来源间充质干细胞进行原代培养；
c)对人脂肪来源间充质干细胞进行传代培养；
d)在传代培养过程中，采用波长660nm±20nm低能量激光照射人脂肪来源间充质干细胞，照射剂量为11-16J/cm2；
e)获得处理后的人脂肪来源间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在a)中通过吸脂术后，收取无菌脂肪组织，消化分离获得所述人脂肪来源间充质干细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述原代培养和所述传代培养中所使用的培养基是DMEM/F12，其中添加了10ng/ml表皮生长因子、10ng/ml血小板衍生生长因子、1×胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸、1×亚油酸-牛血清白蛋白、50μM巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺，4％胎牛血清、100μg/ml青霉素和100U/ml硫酸链霉素。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在d)中，采用低能量激光照射第1代至第3代的人脂肪来源间充质干细胞。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述低能量激光的波长为660nm，照射剂量为15J/cm2。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中产生所述低能量激光的装置为量子血管外照射仪。
7.一种细胞制品，其包含根据权利要求1至6中的任一项所述的方法预处理的人脂肪来源间充质干细胞。
8.一种细胞制品，其包含根据权利要求1至6中的任一项所述的方法预处理的人脂肪来源间充质干细胞；和
药学上可接受的载体。
9.根据权利要求7或8所述的细胞制品在制备用于治疗移植物抗宿主病、再生障碍性贫血、系统性红斑狼疮及多发性硬化的药物中的用途。
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