CN106381283A - 一种成脂诱导培养基及成脂分化方法 - Google Patents

一种成脂诱导培养基及成脂分化方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106381283A
CN106381283A CN201610906762.7A CN201610906762A CN106381283A CN 106381283 A CN106381283 A CN 106381283A CN 201610906762 A CN201610906762 A CN 201610906762A CN 106381283 A CN106381283 A CN 106381283A
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture medium
cell
stem cell
adipogenic induction
induction culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610906762.7A
Other languages
English (en)
Inventor
陈海佳
葛啸虎
王飞
王一飞
戚康艺
张维敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Original Assignee
Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd filed Critical Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Priority to CN201610906762.7A priority Critical patent/CN106381283A/zh
Publication of CN106381283A publication Critical patent/CN106381283A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0653—Adipocytes; Adipose tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides, bases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1361—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from dental pulp or dental follicle stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种成脂诱导培养基及成脂分化方法。该成脂诱导培养基包括3‑异丁基‑1‑甲基黄嘌呤、胰岛素、吲哚美辛、地塞米松、罗格列酮、PRP和基础培养基。本发明提供一种由多种诱导因子联合应用作用于GMSCs等间充质干细胞，具有协同作用，能有效的诱导间充质干细胞成脂分化，其成脂分化效果显著优于现有常规的诱导方法。GMSCs自体取材方便、易于体外扩增，可以用于自体移植，从而避免了免疫排斥反应。

Description

一种成脂诱导培养基及成脂分化方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种成脂诱导培养基及成脂分化方法。
背景技术
牙周疾病不仅是引起成年人失牙的主要原因，还是危害人类口腔乃至全身健康的主要口腔疾病。牙周病是牙周组织的慢性炎症刺激下的感染性疾病，是牙菌斑中的微生物在相应的微环境下引起的炎症，它损坏牙周组织，尤其是牙槽骨的破坏和牙周组织的丧失，最终导致牙齿松动脱落以及牙槽骨的吸收。而牙周治疗的目标就是要治疗牙周炎症，改善微环境重新再生出新的结缔组织附着和支持组织，完成牙槽骨、牙骨质和牙周膜的构建。常用的牙周再生方法，如引导组织再生术、根面平整术等，此类方法简单易行，但并不能完全实现功能性和结构性牙周组织再生，具有一定的局限性。牙周组织工程技术的出现和发展为牙周再生提供了崭新的思路和方法。
牙龈属于牙周组织，是附于牙齿周围的分隔下方牙周组织和外部空间的粘膜屏障。牙龈包括上皮和固有层两部分，从发育来源上，上皮来自原始口腔上皮，与口腔粘膜上皮相延续；固有层则发育自早期神经嵴细胞迁移形成的间充质，上皮与间充质不断相互作用，最终形成牙龈组织。牙龈组织的一个典型特点是具有较强的创伤愈合能力，表现为切除、损伤后能够无疤愈合，恢复牙龈外形。
牙龈间充质干细胞(gingival mesenchymal stem cells,GMSCs)是组成牙龈结缔组织的主要间充质细胞，来源于中胚层的纤维母细胞，不仅具有活跃的自我更新的能力，并且还具有合成和降解胶原等细胞外基质的功能：I型和Ⅲ型胶原、纤维粘连蛋白等。牙龈间充质干细胞取材方便、牙龈组织中细胞含量大、增值速度快，作为成体间充质干细胞中的一员，在体外使用合适的诱导剂同样具有分化为牙骨质的能力。牙龈间充质干细胞这种功能特性极大地吸引了来自基础医学和临床医学的研究者，给基础科学的研究者们提供了一种研究发展生物学的模式，牙龈间充质干细胞所具有的修复、替代和再生能力也为临床医学提供了一个发展新疗法的机会。虽然有研究采用包括脂肪、骨髓在内的多种组织来源的成体干细胞进行牙周再生，但取材的有创性和伦理性等问题仍然制约了其发展。因此，GMSCs有望成为牙周组织再生的种子细胞。
目前，对于GMSCs成脂分化诱导的研究主要集中于不同细胞因子对其生物学行为产生的不同影响，但是往往局限于单一细胞因子对其作用的研究。由于生物体是一个复杂的存在多诱导因素的有机体，因此在牙周组织复杂的微环境中，多种诱导因子在牙周再生的过程中可能会起到相互协同或拮抗的作用。因此，提供一种具有协同作用的诱导因子组合物具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种成脂诱导培养基及成脂分化方法。该成脂诱导培养基包括3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、吲哚美辛、地塞米松、罗格列酮、PRP等诱导因子，多种诱导因子联合应用作用于GMSCs等间充质干细胞，能有效的诱导间充质干细胞成脂分化，其成脂分化效果显著优于现有常规的诱导方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种成脂诱导培养基，包括3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、吲哚美辛、地塞米松、罗格列酮、PRP和基础培养基。
本发明提供的成脂诱导培养基中多种诱导因子联合应用作用于GMSCs等间充质干细胞，更加高效的诱导GMSCs等间充质干细胞的成脂分化。
作为优选，成脂诱导培养基中各组分的用量为：
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤：0.05～0.15mmol/L；
胰岛素：1～10mg/L；
吲哚美辛：0.05～0.15mmoL/L；
地塞米松：0.5～1.5μmoL/L；
罗格列酮：0.1～1.0mmoL/L；
PRP：1％～10％体积分数；
基础培养基：补足。
优选地，成脂诱导培养基中各组分的用量为：
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤：0.1mmol/L；
胰岛素：5mg/L；
吲哚美辛：0.1mmoL/L；
地塞米松：1μmoL/L；
罗格列酮：0.1～1.0mmoL/L；
PRP：1％～5％体积分数；
基础培养基：补足。
更优选地，成脂诱导培养基中各组分的用量为：
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤：0.1mmol/L；
胰岛素：5mg/L；
吲哚美辛：0.1mmoL/L；
地塞米松：1μmoL/L；
罗格列酮：0.5mmoL/L；
PRP：2.5％体积分数；
基础培养基：补足。
在本发明提供的实施例中，基础培养基为含有10％体积分数FBS的低糖DMEM培养基。
本发明还提供了一种诱导间充质干细胞成脂分化的方法，包括采用本发明提供的成脂诱导培养基培养间充质干细胞。
在本发明提供的实施例中，间充质干细胞为牙龈间充质干细胞。
作为优选，间充质干细胞为第2～5代间充质干细胞。
优选地，间充质干细胞为第3代间充质干细胞。
作为优选，间充质干细胞的接种密度为(1～10)×104cell/mL。
优选地，间充质干细胞的接种密度为2×104cell/mL。
作为优选，间充质干细胞的培养温度为37℃，培养时间不低于14天。
优选地，间充质干细胞的培养时间不低于21天。
本发明提供了一种成脂诱导培养基及成脂分化方法。该成脂诱导培养基包括3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、吲哚美辛、地塞米松、罗格列酮、PRP和基础培养基。本发明至少具有如下优势之一：
1)本发明提供一种由多种诱导因子联合应用作用于GMSCs等间充质干细胞，具有协同作用，能有效的诱导间充质干细胞成脂分化，其成脂分化效果显著优于现有常规的诱导方法。
2)GMSCs自体取材方便、易于体外扩增，可以用于自体移植，从而避免了免疫排斥反应。
附图说明
图1示GMSCs形态图；其中，1-1示GMSCs放大40倍图片，1-2示GMSCs放大100倍图片；
图2示GMSCs细胞表面标志物流式检测结果图；其中，2-1～2-6分别示CD146、HLA-DR、CD105、CD34、CD90、CD45的阳性表达率；
图3示对照组和实验组细胞油红O染色效果图；其中，3-1～3-2分别示对照组1中细胞诱导21天后放大200倍、400倍的图片；
3-3～3-4分别示对照组2中细胞诱导21天后放大200倍、400倍的图片；
3-5～3-6分别示对照组3中细胞诱导21天后放大200倍、400倍的图片；
3-7～3-8分别示对照组4中细胞诱导21天后放大200倍、400倍的图片；
3-9～3-10分别示实验组1中细胞诱导21天放大200倍、400倍的图片；
3-11～3-12分别示实验组2中细胞诱导21天放大200倍、400倍的图片；
3-13～3-14分别示实验组3中细胞诱导21天放大200倍、400倍的图片；
图4示对照组和实验组细胞诱导分化率比较(p<0.01)；
图5示不同时间点对照组和实验组的PPARγ-2和LPL的表达水平比较；图5-1示不同时间点对照组和实验组的PPARγ-2的表达水平比较；图5-2示不同时间点对照组和实验组的LPL表达水平比较。
具体实施方式
本发明公开了一种成脂诱导培养基及成脂分化方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的成脂诱导培养基及成脂分化方法中所用生物材料、试剂和仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1GMSCs原代分离培养、传代及鉴定
1、GMSCs原代分离培养
1)原材料来源：取临床上正畸导萌术切下的牙龈或阻生拔牙需要而切除包绕在恒牙周围的牙龈组织。要求患者没有牙龈增生、炎症及使用过导致牙龈增生的药物。切取的牙龈组织快速浸入含3倍双抗的4℃预冷的PBS中。
其中，3倍双抗浓度为300u/mL青霉素、300u/mL链霉素。
2)漂洗：用含3倍双抗的PBS冲洗3次，再将牙龈置于间充质干细胞无血清培养基中浸泡5min；
其中，3倍双抗浓度为300u/mL青霉素、300u/mL链霉素。
其中，间充质干细胞无血清培养基中含有100u/mL青霉素、100u/mL链霉素。
3)第一次消化：将牙龈组织剪成1cm3大小，加入适量Ⅰ型胶原酶-Dispase酶混合消化液，置37℃，200R恒温摇床中消化45min。消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量PBS重悬，100um细胞滤网过滤悬液，过滤后的细胞悬液1000r/min离心5min，弃上清。
其中，Ⅰ型胶原酶-Dispase酶的比例为1:1，胶原酶浓度为胶原酶3g/L，Dispase酶浓度为Dispase酶4g/L。
其中，消化环境为为37℃，200R恒温摇床中，消化时间为45min；
其中，所用细胞滤网孔径为100um；
其中，离心速度为1000r/min，离心时间为5min。
4)第二次消化：把步骤3)中过滤下下来未消化的组织加入等体积的0.125％的胰蛋白酶，置37℃，200R恒温摇床中继续消化15min。消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量PBS重悬，70um细胞滤网过滤悬液，过滤后的细胞悬液1000r/min离心5min，弃上清。
其中，胰蛋白酶与牙龈组织的比例为体积比1:1，胰蛋白酶的浓度为0.125％；
其中，所用细胞滤网孔径为70um；
其中，离心速度为1000r/min，离心时间为5min。
5)接种：步骤3)与步骤4)中收集的细胞用含10ng/mL EGF(表皮生长因子)的间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，接种于六孔板，5％CO2培养箱37℃培养。
其中，基础培养基为间充质干细胞无血清培养基，可市场购买或自制。
其中，完全培养基中EGF(表皮生长因子)的浓度为10ng/mL；
6)纯化：待细胞长满80-90％，收集细胞，用磁珠分选法纯化细胞。将收集的细胞与STRO-1单抗4℃孵育1h，与磁珠30min4℃孵育，在磁力设备作用下筛选出STRO-1+GMSCs，接种于新的六孔板中，5％CO2培养箱37℃培养。
2、GMSCs传代
待细胞长满80-90％，用吸管吸弃旧培养液，加入2-3mL0.25％胰蛋白酶，消化1-3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入5-10mL间充质干细胞无血清培养基终止消化，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清。加入5-10mL含10ng/mL EGF的间充质干细胞无血清培养基，进行细胞计数，按5×104cell/mL密度接种于培养皿中进行传代培养，5％CO2培养箱37℃培养，每隔2-3天换液一次。培养过程中观察细胞形态，结果如图1所示。细胞接种约4h后开始贴壁，3-4d进入对数生长期，6-8d进入平台期。细胞生长速度平稳，呈单层贴壁生长。大部分细胞呈长梭形，形态不规则。
3、GMSCs表面标志物鉴定
待细胞长满80-90％，收集细胞(约1×106个)，加入3g/L Triton浸泡20min，PBS洗3遍，10％山羊血清室温封闭2h，分别滴加1:200稀释的CD146、CD105、CD90、CD34、CD45、HLA-DR抗体各50ul，同时对照组滴加单纯PBS 50ul，4℃处理16h。次日室温放置30min，PBS漂洗3遍，各组分别滴加1:500稀释的FITC标记二抗IgG，常温避光孵育1h，PBS漂洗2遍，10％福尔马林固定细胞，流式细胞仪测定抗原的阳性率。试验结果见表1、图2。
检测结果显示，克隆细胞表面抗原CD146、CD105、CD90阳性表达，而CD34、CD45、HLA-DR阴性表达，说明本发明中得到的GMSCs属来源于中胚层的间充质干细胞。
表1GMSCs细胞表面标志物表达率结果
细胞表型 CD146 CD105 CD90 HLA-DR CD34 CD45
阳性表达率(％) 100.00 99.90 96.70 0.30 0.00 0.10
实施例2GMSCs成脂分化
1、富血小板血浆(PRP)的制备
采集与牙齿同一供者的外周血，于超净台内把血样转入15mL离心管，10mL每管，2500rpm/min，离心10min。离心结束后血样分为淡黄色上清层，中间白细胞层和红色细胞底层。吸取全部上清、白色细胞层及红色细胞层上部1-2mm，移入新15mL离心管，2500rpm/min，离心5min。离心结束后吸取上清层和白细胞层，移入新15mL离心管，1200g/min，离心5min。离心结束后弃上清，保留最下面的2.5mL，即富血小板血浆。
2、PRP活化
移入含氯化钙的促凝管，4℃过夜，4000rpm/min，离心12min，吸取出促凝管内的全部上清，0.22μm过滤，滤液-20℃保存待用。
试验例
为了验证本发明成脂分化诱导的效果，同时设置4组对照组和3组实验组，对实验组和对照组进行油红O染色及成脂基因PPARγ-2和LPL表达检测。
对照组1为阴性对照组，为常规培养组，使用的培养液为：含体积分数10％FBS的高糖DMEM培养液。
对照组2为阳性对照组，为常规间充质干细胞成脂诱导配方，使用的成脂诱导液为0.1mmoL/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、5mg/L胰岛素、0.1mmoL/L吲哚美辛、1μmoL/L地塞米松、体积分数10％FBS，余量为高糖DMEM培养液。
对照组3为阳性对照组，使用的成脂诱导液为：0.1mmoL/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、5mg/L胰岛素、0.1mmoL/L吲哚美辛、1μmoL/L地塞米松、0.5mmoL/L罗格列酮、体积分数10％FBS，余量为高糖DMEM培养液。
对照组4为阳性对照组，使用的成脂诱导液为：0.1mmoL/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、5mg/L胰岛素、0.1mmoL/L吲哚美辛、1μmoL/L地塞米松、体积分数2.5％PRP、体积分数10％FBS，余量为高糖DMEM培养液。
实验组1中使用的成脂诱导液为：0.1mmoL/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、5mg/L胰岛素、0.1mmoL/L吲哚美辛、1μmoL/L地塞米松、0.1mmoL/L罗格列酮、体积分数1％PRP、体积分数10％FBS，余量为高糖DMEM培养液。
实验组2中使用的成脂诱导液为：0.1mmoL/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、5mg/L胰岛素、0.1mmoL/L吲哚美辛、1μmoL/L地塞米松、0.5mmoL/L罗格列酮、体积分数2.5％PRP、体积分数10％FBS，余量为高糖DMEM培养液。
实验组3中使用的成脂诱导液为：0.1mmoL/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、5mg/L胰岛素、0.1mmoL/L吲哚美辛、1μmoL/L地塞米松、1.0mmoL/L罗格列酮、体积分数5％PRP、体积分数10％FBS，余量为高糖DMEM培养液。
各组培养液的配方如表2：
表2各组培养液的配方
效果实施例1油红O染色
取第3代GMSCs，按2×104cell/mL密度接种于6孔培养板内，培养至细胞达到80％融合以上时，各组分别更换表2所示成脂诱导液。诱导分化培养21d对细胞进行油红O染色。染色的具体方法为：
弃培养液，用PBS清洗细胞2到3次；加入4％多聚甲醛固定15-20min；吸弃多聚甲醛，PBS清洗3次；加入油红O染色液，室温染色15-20min。结束后吸弃残液，用37℃预热的去离子水清洗2到3次，每次20s；晾干后在倒置显微镜下观察并采集图像。各组细胞染色效果如图3。
对油红0染色的细胞进行计数，计算出两组的分化率进行比较。倒置显微镜100倍放大视野下，每孔随机记数3个视野，计算分化细胞占细胞总数的比例，每次平行计数3个孔，计算平均数)。
诱导分化率＝染色阳性细胞数/细胞总数×100％。
各组诱导分化率结果如表3、图4所示。
表3各组诱导分化率
注：*，※表示P﹤0.01。
结果显示培养21d后，对照组1为阴性对照组，不含诱导因子，不对细胞进行成脂分化诱导，因此没有着色，成脂分化率为零。实验组1、3与各对照组均有显著性差异(P﹤0.01，*)；实验组2与其他各组均有显著性差异(P﹤0.01，**)；实验组2中的成脂分化率均值为86.27±1.04％，是常规诱导分化组(对照组2)的2.72倍。说明本发明所示的成脂分化诱导液对GMSCs成脂分化诱导的效果最好。
效果实施例2PPARγ-2和LPL的表达检测
按照实验组或对照组方法对GMSCs进行培养或成脂分化诱导，连续诱导培养14d和21d后对细胞进行PPARγ-2和LPL的表达检测。
按TRIzol试剂盒说明书进行细胞总RNA提取；M-MLV反转录试剂盒获得cDNA。按SYBR Green定量PCR试剂盒说明书对PPARγ-2、LPL表达水平进行检测。以GAPDH作为内参基因。以2-△△Ct法进行定量分析。使用的引物如表4所示。结果如图5所示。
表4引物序列表
实验结果表明，细胞诱导培养14d、21d后，在同一时间点，各诱导组与未诱导组(阴性对照组)比较，成脂细胞标志性基因PPARγ-2、LPL表达水平均有极显著性差异(*，P﹤0.01)，实验组1、3与各对照组比较，均有极显著性差异(※，p﹤0.01)，实验组2与其他各诱导组均有极显著性差异(**，p﹤0.01)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种成脂诱导培养基，其特征在于，包括3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、吲哚美辛、地塞米松、罗格列酮、PRP和基础培养基。
2.根据权利要求1所述的成脂诱导培养基，其特征在于，所述成脂诱导培养基中各组分的用量为：
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤：0.05～0.15mmol/L；
胰岛素：1～10mg/L；
吲哚美辛：0.05～0.15mmoL/L；
地塞米松：0.5～1.5μmoL/L；
罗格列酮：0.1～1.0mmoL/L；
PRP：1％～10％体积分数；
基础培养基：补足。
3.根据权利要求1或2所述的成脂诱导培养基，其特征在于，所述成脂诱导培养基中各组分的用量为：
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤：0.1mmol/L；
胰岛素：5mg/L；
吲哚美辛：0.1mmoL/L；
地塞米松：1μmoL/L；
罗格列酮：0.1～1.0mmoL/L；
PRP：1％～5％体积分数；
基础培养基：补足。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的成脂诱导培养基，其特征在于，所述成脂诱导培养基中各组分的用量为：
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤：0.1mmol/L；
胰岛素：5mg/L；
吲哚美辛：0.1mmoL/L；
地塞米松：1μmoL/L；
罗格列酮：0.5mmoL/L；
PRP：2.5％体积分数；
基础培养基：补足。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的成脂诱导培养基，其特征在于，所述基础培养基为含有10％体积分数FBS的低糖DMEM培养基。
6.一种诱导间充质干细胞成脂分化的方法，其特征在于，采用权利要求1至5中任一项成脂诱导培养基培养间充质干细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞为牙龈间充质干细胞。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞为第2～5代间充质干细胞。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞的接种密度为(1～10)×104cell/mL。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞的培养温度为37℃，培养时间不低于14天。
CN201610906762.7A 2016-10-18 2016-10-18 一种成脂诱导培养基及成脂分化方法 Pending CN106381283A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610906762.7A CN106381283A (zh) 2016-10-18 2016-10-18 一种成脂诱导培养基及成脂分化方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610906762.7A CN106381283A (zh) 2016-10-18 2016-10-18 一种成脂诱导培养基及成脂分化方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106381283A true CN106381283A (zh) 2017-02-08

Family

ID=57958745

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610906762.7A Pending CN106381283A (zh) 2016-10-18 2016-10-18 一种成脂诱导培养基及成脂分化方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106381283A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108888633A (zh) * 2018-09-21 2018-11-27 北京泰盛生物科技有限公司 一种牙龈间充质干细胞制剂及其应用和制备方法
CN109679901A (zh) * 2019-02-21 2019-04-26 山东华思生物科技有限公司 一种成脂诱导分化培养液及成脂诱导分化方法
CN109694849A (zh) * 2018-12-28 2019-04-30 山西医科大学第一医院 快速诱导人骨髓间充质干细胞向脂肪分化的培养基及方法
CN114181899A (zh) * 2021-12-22 2022-03-15 中山大学孙逸仙纪念医院 一种从小鼠牙龈组织中获得间充质干细胞的方法
CN115232786A (zh) * 2022-08-02 2022-10-25 莫伊森(厦门)生发有限公司 一种脂肪干细胞外泌体及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011124741A1 (es) * 2010-04-08 2011-10-13 Fundación Progreso Y Salud Uso de un medio de cultivo condicionado por células madre mesenquimales para la diferenciación de células madre pluripotentes humanas
CN104837988A (zh) * 2012-11-30 2015-08-12 瑞士干细胞基金会 用于人的间充质干细胞的无血清培养基
CN104830757A (zh) * 2015-04-15 2015-08-12 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种间充质干细胞成脂诱导分化培养基及其制备方法
CN105462917A (zh) * 2015-11-30 2016-04-06 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种牙周膜干细胞成脂分化诱导液及方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011124741A1 (es) * 2010-04-08 2011-10-13 Fundación Progreso Y Salud Uso de un medio de cultivo condicionado por células madre mesenquimales para la diferenciación de células madre pluripotentes humanas
CN104837988A (zh) * 2012-11-30 2015-08-12 瑞士干细胞基金会 用于人的间充质干细胞的无血清培养基
CN104830757A (zh) * 2015-04-15 2015-08-12 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种间充质干细胞成脂诱导分化培养基及其制备方法
CN105462917A (zh) * 2015-11-30 2016-04-06 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种牙周膜干细胞成脂分化诱导液及方法

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108888633A (zh) * 2018-09-21 2018-11-27 北京泰盛生物科技有限公司 一种牙龈间充质干细胞制剂及其应用和制备方法
CN109694849A (zh) * 2018-12-28 2019-04-30 山西医科大学第一医院 快速诱导人骨髓间充质干细胞向脂肪分化的培养基及方法
CN109679901A (zh) * 2019-02-21 2019-04-26 山东华思生物科技有限公司 一种成脂诱导分化培养液及成脂诱导分化方法
CN109679901B (zh) * 2019-02-21 2022-06-24 山东华思生物科技有限公司 一种成脂诱导分化培养液及成脂诱导分化方法
CN114181899A (zh) * 2021-12-22 2022-03-15 中山大学孙逸仙纪念医院 一种从小鼠牙龈组织中获得间充质干细胞的方法
CN115232786A (zh) * 2022-08-02 2022-10-25 莫伊森(厦门)生发有限公司 一种脂肪干细胞外泌体及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yu et al. LPS‑induced upregulation of the TLR4 signaling pathway inhibits osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells under inflammatory conditions
KR101328604B1 (ko) 누공 치료를 위한 자가 및 동종의 지방 유래 스트로마 줄기세포 조성물
CN106434539A (zh) 一种成骨诱导培养基及骨向分化方法
CN106906182A (zh) 一种间充质干细胞无血清培养基
CN106381283A (zh) 一种成脂诱导培养基及成脂分化方法
CN106318904A (zh) 间充质干细胞条件培养基用于美容品领域的用途
CN105132369B (zh) 一种将间充质干细胞转化为睾酮分泌细胞的诱导剂及诱导培养基
CN104762257B (zh) 一种从脐带制备间充质干细胞的方法
US20130029292A1 (en) Method of implanting mesenchymal stem cells for natural tooth regeneration in surgically prepared extraction socket and compositions thereof
CN103301154B (zh) 脐带间充质干细胞在制备治疗红斑狼疮的制剂中的用途
CN109234229A (zh) 从胎盘血管分离间充质干细胞的方法和所用消化酶组合物
CN102191217A (zh) 一种诱导脐带间充质干细胞分化为类神经细胞的方法
CN106244533A (zh) 牙龈间充质干细胞的原代分离方法
Zhang et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cell differentiation into odontoblast-like cells and endothelial cells: a potential cell source for dental pulp tissue engineering
CN110475855A (zh) 用于从牙髓组织衍生的细胞制备牙髓干细胞的方法
CN105238746A (zh) 骨髓间充质干细胞的诱导方法及其诱导液
CN105255824A (zh) 一种牙周膜干细胞成骨分化诱导液及方法
JP5388297B2 (ja) アディポクラスター
CN107287156A (zh) 一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法及其应用
CN104031881B (zh) 一种人类嗅黏膜间充质干细胞的分离培养方法
CN108865985A (zh) 一种干细胞源外泌体干预上皮-间质转化的方法
CN109628388A (zh) 用消化酶组合物从胎盘血管分离间充质干细胞
Salvadè et al. GMP-grade preparation of biomimetic scaffolds with osteo-differentiated autologous mesenchymal stromal cells for the treatment of alveolar bone resorption in periodontal disease
CN106834217A (zh) 一种促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法及应用
CN106566810A (zh) 一种组合物、含有该组合物的诱导制剂及诱导方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170208