CN111621467A - 一种诱导人脂肪间充质干细胞分化为肝脏样细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明所提供了一种诱导人脂肪间充质干细胞分化为肝脏样细胞的方法，是对人脂肪间充质干细胞首先用Activin A和Wnt3a进行第一阶段的诱导，再用FGF basic和BMP‑4进行第二阶段诱导，使用FGF‑4和HGF进行第三阶段诱导，最后再用FGF‑4、HGF、OSM、DEX进行第四阶段诱导分化为肝脏样细胞。本发明方法使用细胞因子组合诱导hADMSCs体外向肝脏细胞分化效率高，所得最终成熟肝脏细胞中表达特异性AFP、ALB蛋白的阳性细胞所占比率高于95％。

Description

一种诱导人脂肪间充质干细胞分化为肝脏样细胞的方法
技术领域
本发明属于干细胞与再生医学技术领域，涉及一种诱导人脂肪间充质干细胞分化为肝脏样细胞的方法。
背景技术
肝移植和肝细胞疗法是是治疗终末期肝脏疾病的常用方法，但是由于肝脏供体不足以及肝细胞来源的安全性和有效性问题而受到制约，因此寻找新的功能性肝细胞来源是目前亟需解决的重要问题。人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymalstem cells,hAD-MSCs)因其来源广泛易取材、低免疫原性等优点被应用于体外高效稳定地诱导表型和功能完善的肝细胞或肝组织，有望解决细胞治疗和肝移植面临的问题。
目前在体外培养中，hADMSCs通过表达病毒支持的转录因子或在分化过程中外源性添加化学小分子、生长因子，可以成功分化为肝细胞。然而，病毒转导的安全性问题成为其广泛应用的局限。化学小分子诱导同样存在效率低下，机制不明确等问题。在大多数情况下，这些诱导的细胞不完全具备可移植肝细胞所需的特征，因为它们通常是异质性的，并且大多数分化细胞缺乏功能活性。
而天然的细胞生长因子组合诱导可以模拟体内胚胎发育过程，启动相应的信号通路，从而按阶段产生肝脏发育过程中各类型细胞，最终形成有功能的肝脏细胞。也有一些关于细胞因子组合诱导间充质干细胞分化为肝脏细胞的研究(例如公开号为CN108823148A的中国发明专利申请)，但是其诱导过程并未突出胚胎发育的阶段性，即诱导过程是否经历了限定性内胚层(Definitive Endoderm,DE)、前肠期(Foregut)、肝脏祖细胞(Hepatoblasts)、成熟类肝细胞(Hepatocyte-like cells,HLCs)的分化过程。因此，开发生长因子组合分步诱导hADMSCs分化形成肝脏细胞具有重要的研究意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种诱导人脂肪间充质干细胞分化为肝脏样细胞的方法，即通过不同细胞因子的组合来分步序贯诱导人脂肪间充质干细胞分化为肝脏样细胞，从而弥补现有技术中原代肝细胞来源短缺，体外诱导功能性肝细胞过程不明确的问题。
本发明所提供的一种诱导人脂肪间充质干细胞分化为肝脏样细胞的方法，是对人脂肪间充质干细胞首先用Activin A和Wnt3a进行第一阶段的诱导，再用FGF basic和BMP-4进行第二阶段诱导，使用FGF-4和HGF进行第三阶段诱导，最后再用FGF-4、HGF、OSM、DEX进行第四阶段诱导分化为肝脏样细胞；
其中第一阶段的诱导，Activin A和Wnt3a的使用浓度能够促进限定性内胚层标记蛋白Foxa2、Sox17的表达；
其中第二阶段的诱导，FGF basic和BMP-4的使用浓度能够促进转录因子HNF4α的表达；
其中第三阶段的诱导，FGF-4和HGF的使用浓度使前肠期细胞分化为肝脏祖细胞；
其中第四阶段的诱导，FGF-4、HGF、OSM、DEX的使用浓度能够促进肝脏祖细胞分化为成熟的类肝细胞。
作为实施例的一种具体的记载，第1阶段中Activin A和Wnt3a在培养液中的浓度分别为5ng/ml、50ng/ml；
第2阶段中FGF basic和BMP-4在培养液中的浓度分别为10ng/ml、10ng/ml；
第3阶段中FGF-4和HGF在培养液中的浓度分别为10ng/ml、10ng/ml；
第4阶段中FGF-4、HGF、OSM、DEX在培养液中的浓度分别为10ng/ml、10ng/ml、10ng/ml、100nM。
所述的人脂肪间充质干细胞，优选为培养第4～6代人脂肪间充质干细胞。
本发明的有益效果如下：
(1)使用细胞因子组合诱导hADMSCs体外向肝脏细胞分化效率高，所得最终成熟肝脏细胞中表达特异性AFP、ALB蛋白的阳性细胞所占比率高于95％。
(2)本发明的方法分阶段进行连续诱导培养，最终可获得具有肝细胞形态、功能及基因表达的类肝脏细胞，其诱导过程稳定，每一步所得诱导细胞均有可能单独移植治疗，为临床治疗方案提供了多种移植细胞选项。其中尤以最终诱导的成熟肝脏细胞为佳，可成为临床治疗方案中肝细胞移植的稳定来源。
附图说明
图1是本发明诱导过程中细胞形态图；
图2是本发明诱导第5天限定性内胚层标记Foxa2、Sox17表达免疫荧光图；
图3是本发明诱导第9天前肠阶段标记HNF4α、ALB表达免疫荧光图；
图4是本发明诱导第19天成熟类肝细胞标记ALB、AFP表达免疫荧光图；
图5是本发明诱导过程中细胞ALB蛋白表达变化结果图；
图6是本发明诱导的成熟类肝细胞功能检测结果图。
具体实施方式
本发明通过细胞因子组合四步法序贯诱导，可以在体外诱导hADMSCs分化为功能性的类肝细胞。第1阶段加入诱导液成分Activin A和Wnt3a可以有效促进限定性内胚层标记蛋白Foxa2、Sox17的表达。第2阶段诱导液成分FGF basic和BMP-4可以促进其由限定性内胚层向前肠期细胞分化，表达关键转录因子HNF4α。第3阶段诱导液成分FGF-4和HGF可以促进前肠期细胞分化为肝脏祖细胞。第4阶段导液成分FGF-4、HGF、OSM、DEX则能够促进肝脏祖细胞分化为成熟的类肝细胞。
对于本发明中所涉及的名词解释如下：
Activin A：激活素A,属于转化生长因子(TGF-β)超家族成员。
Wnt3a：Wnt信号通路配体蛋白3a，通过调控膜受体激活Wnt经典信号通路，实现其在细胞中的功能。
FGF basic：碱性成纤维细胞因子，属于成纤维细胞生长因子(FGF)家族成员之一，可与细胞表面的FGF受体结合，将信号传递到胞内刺激成纤维细胞和内皮细胞增殖。
BMP-4：骨形成蛋白-4，TGF-β超家族成员，也是一种重要的生长因子和信号分子。
HNF4α：肝细胞核因子4α，属于细胞核受体超家族成员,在肝脏的发育、肝细胞分化成熟过程中起重要调控作用。
FGF-4：成纤维细胞生长因子4，也属于成纤维细胞生长因子(FGF)家族成员之一。
HGF：肝细胞生长因子，一种能刺激肝细胞增殖的生长因子。
OSM：人抑瘤素M，属IL-6家族细胞因子家族，可抑制肿瘤细胞生长，诱导某些肿瘤细胞分化。
DEX:地塞米松，糖皮质激素药物，是一种人工合成的皮质类固醇。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1
1、hAD-MSCs的原代分离培养
脂肪组织来自抽脂手术的健康成年人捐献者，并签署知情同意书。使用50ml离心管分装脂肪组织，约30ml每管，加入含青霉素-链霉素双抗的D-Hank’s至45ml，800rpm离心3min，吸取脂肪下层液体弃掉，洗去血细胞和麻药，再洗1次；转移上层脂肪至新的50ml离心管中，加入1/3体积0.2％的胶原酶P(脂肪组织体积:胶原酶用量为3:1)，滴加3滴双抗，混匀后封口放入37℃摇床，120rpm消化30min，消化至整体呈粘着液体状；将消化好的脂肪组织用100μm筛网过滤，加入D-Hank’s稀释至45ml，1500rpm离心10min；加入D-Hank’s洗去胶原酶和血细胞，1200rpm离心10min，可重复洗1～2次；用新鲜的含双抗的hAD-MSCs培养基吹打成单细胞悬液，接种于T75cm2培养瓶中，记录细胞名称和日期。24小时后，更换培养基，以去除未贴壁细胞和杂质。
2、hAD-MSCs向类肝细胞诱导分化及检测
1)第一阶段，诱导限定性内胚层细胞
选择第4～6代hAD-MSCs，消化待用；细胞均以4×105细胞/孔的密度铺于6孔板中，培养24h；加入含有5ng/ml Activin A和50ng/ml Wnt3a的低血清(含0.5％FBS)H-DMEM培养基，2ml/孔，诱导24h；然后加入只含有5ng/ml Activin A的低血清(含0.5％FBS)H-DMEM培养基，2ml/孔；每2天换液一次，诱导4天。第5天，收样，免疫荧光检测Foxa2、Sox17等蛋白表达。
细胞免疫荧光检测方法如下：
弃去培养液，PBS缓冲盐溶液漂洗2～3次；1ml4％组织细胞固定液固定，室温静置15分钟，PBS漂洗3次；吸干PBS，加入0.1％Triton X-100进行透化，冰上放置10分钟，PBS漂洗3次；含1％BSA的PBS室温封闭30分钟；加入足够量含1％BSA PBS稀释的rabbit antiFoxa2、mouse antiSox17、rabbit anti HNF4α、rabbit anti ALB和rabbit anti AFP一抗，4℃冰箱过夜，PBS漂洗3次，每次5min；吸干PBS，滴加足够量含1％BSA PBS稀释的FITC荧光二抗(1:50稀释)，放湿盒中，37℃避光孵育1h，注意防止水分蒸发，PBS漂洗3次，每次5min；避光加入DAPI染料，室温避光孵育3～5min，PBS漂洗3次，每次5min；每孔加入1mlPBS，Nikon荧光显微镜下观察，采用Image-J软件对图像行分析合成。
2)第二阶段，从DE细胞诱导获得前肠期细胞
加入含有10ng/ml FGF-basic和10ng/ml BMP-4的低血清(含1％FBS)H-DMEM培养基，2ml/孔；每2天换液一次，诱导4天；第9天，收样，免疫荧光检测ALB、HNF4α等蛋白的表达。细胞免疫荧光实验操作方法如上。
3)第三阶段，诱导获得肝脏祖细胞的方法
加入含有10ng/ml FGF-4和10ng/ml HGF的低血清(含0.5％FBS)H-DMEM培养基，2ml/孔；每2天换液一次，诱导4天，第13天，收样细胞免疫荧光检测AFP、ALB等蛋白的表情情况；细胞免疫荧光实验操作方法如上。
4)第四阶段，诱导类肝细胞的方法
加入含有10ng/ml FGF-4、10ng/ml HGF、10ng/ml OSM和100nMDEX的低血清(含0.5％FBS)H-DMEM培养基；2ml/孔；每2天换液一次，诱导6天，获得肝脏成熟细胞。
western blot检测诱导过程0、5、9、13、19d ALB蛋白表达变化。试剂盒检测白蛋白分泌、CYP1A2酶活性及糖原储存功能。
蛋白质印记(Western blot,WB)实验操作如下：
①总蛋白的提取
全程冰上进行，加入4℃预冷的PBS冲洗2遍；冰上配制蛋白裂解液:每孔加入100ulRIPA、1ul PMSF、1ul cocktail，混匀备用；使用滤纸吸干PBS，六孔板每孔加入配制好的蛋白裂解液100μl，冰上裂解15～20min；用细胞刮刮下细胞裂解物，移入1.5ml EP管中，4℃12000rpm离心30min，弃沉淀，吸取上清转移至新EP管中，冰上待用或-80℃保存。
②蛋白浓度的测定
按照BCA蛋白浓度测定试剂盒测定各个样品的蛋白浓度。
③蛋白样品的预处理
在已知浓度的蛋白样品中加入适量5×SDS-PAGE Buffer，混匀并封口；将蛋白样品在95℃金属浴中孵育10min，然后置于冰上冷却，分装后-80℃储存备用。
④SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
准备制胶用玻璃板：安装制胶板，捡漏；参照快速制胶试剂盒，制备10％分离胶，各成分及含量如下；
Figure BDA0002536115310000071
将分离胶沿玻璃板一侧缓慢匀速灌注至所需高度，用无水乙醇或去离子水压封，室温水平放置15～20分钟至分离胶凝固，注意此过程不要晃动制胶玻璃板；
待分离胶凝固后，按照雅酶TMPAGE凝胶快速制备试剂盒说明书配制浓缩胶，配制方法如下:
Figure BDA0002536115310000072
Figure BDA0002536115310000081
弃去上层无水乙醇或去离子水，用滤纸吸干，沿制胶板一侧缓慢灌入浓缩胶至满溢，小心水平插入厚度为1.0mm厚的样品梳，待浓缩胶凝固；加入配置好的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，轻轻拔出样品梳，让每个泳道都浸满电泳液。根据实验需要加入等质量等体积的20～30μg蛋白样品，将样品和Marker按预定顺序加入到梳孔中，并记录上样顺序；电泳时，先80v恒压电泳，待条带蓝全部进入分离胶后，将电压调至120V继续恒压电泳(可根据分离需要调节电压)，直至溴酚蓝到达分离胶底部左右终止电泳。
⑤湿转法转膜
配制电转缓冲液(2000ml):2.9gTris碱、14.4g甘氨酸、400ml甲醇，加蒸馏水至2000ml，混合均匀后置于4℃预冷；裁剪1片稍大于凝胶面积的PVDF膜和4片预裁切滤纸，PVDF膜置于甲醇中活化3～5min；按三明治结构将上述物品装入电转槽的夹子中，夹子的黑面(负极在下)，依次放上海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-夹子的红面(正极)；将转膜夹放入电泳槽中(黑面对黑面)；加入电转液，加冰盒，加盖，接通电源，110mA恒流转膜1.5h。
⑥封闭
5％的脱脂奶粉:2.5g脱脂奶粉+50ml TBST，提前半小时配制好，保证奶粉溶解完全，放于4℃保存；将PVDF膜，放入5％的脱脂奶粉封闭液中，摇床上室温缓慢摇晃1h；用TBST稍作冲洗。
⑦一抗孵育
孵育盒中每格加入抗体稀释液稀释后的抗体5ml，稀释比例为anti-Foxa2 1:1000、anti-Sox17 1:5000、anti-HNF4α1:1000、anti-AFP 1:4000、anti-ALB 1:20000、anti-GAPDH 1:20000；将孵育盒置于水平摇床上，4℃摇床过夜；TBST中快洗5次，每次10min。
⑧二抗孵育
加入稀释后的二抗(1:5000 2.5％脱脂奶粉配制)，室温摇床振荡45分钟，TBST中快洗5次，每次10min。
⑨ECL显色反应
将发光液均匀滴在PVDF膜上并覆盖整张膜，室温反应30s，然后在Tanon全自动化学发光成像仪上曝光并拍照。使用image J对条带的灰度值进行统计分析。
⑩膜的再生
TBST中快洗3次，每次10min；加入适当体积NCM Western BlotStripping Buffer，充分覆盖膜表面，置于摇床使其缓慢的水平晃动，室温孵育15min；TBST中快洗3次，每次10min，洗掉膜再生液，加入封闭液重新进行封闭，重复上述步骤。
白蛋白分泌试验操作如下：
在待测时间点取1ml细胞培养液上清放入1.5ml EP管中，10000g离心1min，立即使用或-20℃短期保存；每孔加入100μl按1:100稀释的包被抗体，封板后,室温孵育1h；加入ELISA Wash Solution洗板，重复5次；接着加入200μl ELISA Blocking Buffer，封板，室温孵育30min；加入ELISAWash Solution洗板，重复5次；每孔加入100μl标准品或样品，封板，37℃孵育1小时。标准品按下面表格准备:
Figure BDA0002536115310000091
Figure BDA0002536115310000101
加入洗涤液洗板，重复5次；每孔加入100μl稀释后的HRP检测抗体；封板后，室温孵育1h；加入洗涤液洗板，重复5次；每孔加入100μl TMBSubstrate Solution，轻轻振荡混匀，避光37℃显色30min；每孔加ELISAStop Solution100μl，终止反应；上机检测，以空白孔调零，450nm波长依次测量各孔的吸收光度值。hAD-MSCs作为阴性对照，L-02细胞作为阳性对照。
糖原储备实验操作如下：
取待检测细胞，PBS洗3次，适量胰酶消化细胞，加入完全培养基终止消化，2100g离心6min；加入200μl单蒸水重悬；吸取60μl细胞悬液移至新的1.5mlEP管中，其余悬液测定总蛋白浓度；继续加入33％KOH240μl，EP管封口100℃煮20min，置于冰上冷却；吸取125μl液体移至15ml离心管中，每份样品做2个平行实验；加入单蒸水，补足至1ml；绘制标准曲线，在15ml离心管中分别加入0、1、2、3、5和10μl的1mg/ml糖原，继续加入单蒸水补至1ml；沿管壁缓慢滴加2ml蒽铜硫酸溶液(注意安全，浓硫酸遇水产热引起沸腾)，轻微晃动室温静置10min，再次晃动；上机检测，酶标仪读取620nm波长处的数值；所得出的浓度值是稀释(稀释40倍)后的数值，需先计算出原浓度，然后用每个样品的浓度/每份样品的总蛋白量，即为每份样品的最终糖原浓度。hAD-MSCs作为阴性对照，L-02细胞作为阳性对照。
细胞色素酶系统P450/CYP1A2活性(药物代谢)检测操作如下：
在诱导分化结束的前24h，将干细胞培养基更换为含有10μM奥美拉唑的培养基，12h再更换一次；12h后PBS冲洗细胞1～2次，加入400μl新培养基，包括一个空白对照孔；继续加入8μl反应底物，注意防止液体挥发，37℃孵育4h；孵育完收集上清，吸出50μl上加入96孔板底尽量每个做2-3个平行实验；每孔加50μl Luciferin Detection Reagent，上机检测连续读取11次荧光值，每次间隔2min；同时将每个样品的细胞用胰酶消化下来，并计数；hAD-MSCs作为阴性对照，L-02细胞作为阳性对照。
计算公式:Lumin sample＝1000000*(sample-medium)/cell number
Increase＝activityday19/activityday13
本发明方法诱导的结果如图1到图6所示。
如图1所示，在细胞因子组合的阶段性刺激下，诱导分化第5天，镜下观察细胞体积变大，细胞由长梭形变为花瓣簇状。诱导分化第9天，细胞间隙增大，细胞数量变少。诱导分化第13天，细胞呈不规则形或方形，细胞数量增加。最后阶段第19天分化结束后，镜下可见细胞体积变小，呈类圆形和多边形，与肝细胞的形态相似。
如图2所示，利用免疫荧光技术对肝脏诱导过程中的重要蛋白进行了检测，并分析其在细胞内的表达情况。免疫荧光结果显示，在第5天限定性内胚层结束后细胞表达Foxa2和Sox17。
如图3所示，免疫荧光结果显示，在第9天前肠期阶段分化结束时表达AFP和HNF4的细胞。
如图4所示，免疫荧光结果显示，最后在第19天肝脏细胞成熟阶段分化结束时获得ALB阳性和AFP阳性细胞。
如图5所示，使用western blot技术测定标志基因ALB在蛋白水平的总表达量变化，结果显示诱导后白蛋白的表达与肝脏细胞成熟度呈正相关。
为了检测诱导所获得的细胞是否具备成熟肝细胞的功能特征，对其进行白蛋白分泌实验，结果显示其具有分泌白蛋白的能力(图6A)。糖原储存是功能性肝细胞的另一个重要特征。通过添加含糖浓度为450mg/dl的培养基测定其储存糖原的能力，实验数据显示诱导的类肝细胞具有储存糖原的能力(图6C)，与功能性肝细胞相似。为了测试产生的肝细胞是否具有代谢药物和异生物质转化能力，评估其细胞色素酶活性。CYP1A2是人体内药物代谢的主要酶之一，在给予10μM奥美拉唑处理后，数据显示诱导获得的肝脏细胞具有代谢药物的能力(图6B)。
上述这些肝脏特异性功能的检测与成熟肝细胞标记物的表达一致的数据表明，通过在体外添加细胞因子组合分步序贯诱导，可以有效促进间充质干细胞向肝脏细胞命运的转变。

Claims (10)

1.一种诱导人脂肪间充质干细胞分化为肝脏样细胞的方法，其特征在于，所述的方法是对人脂肪间充质干细胞首先用Activin A和Wnt3a进行第一阶段的诱导，再用FGF basic和BMP-4进行第二阶段诱导，使用FGF-4和HGF进行第三阶段诱导，最后再用FGF-4、HGF、OSM、DEX进行第四阶段诱导分化为肝脏样细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一阶段的诱导，Activin A和Wnt3a的使用浓度能够促进限定性内胚层标记蛋白Foxa2、Sox17的表达。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第二阶段的诱导，FGF basic和BMP-4的使用浓度能够促进转录因子HNF4α的表达。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第三阶段的诱导，FGF-4和HGF的使用浓度使前肠期细胞分化为肝脏祖细胞。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第四阶段的诱导，FGF-4、HGF、OSM、DEX的使用浓度能够促进肝脏祖细胞分化为成熟的类肝细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第1阶段中Activin A和Wnt3a在培养液中的浓度分别为5ng/ml、50ng/ml。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第2阶段中FGF basic和BMP-4在培养液中的浓度分别为10ng/ml、10ng/ml。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第3阶段中FGF-4和HGF在培养液中的浓度分别为10ng/ml、10ng/ml。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第4阶段中FGF-4、HGF、OSM、DEX在培养液中的浓度分别为10ng/ml、10ng/ml、10ng/ml、100nM。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的人脂肪间充质干细胞为培养第4～6代人脂肪间充质干细胞。
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