CN108823148A - 一种脂肪间充质干细胞诱导分化为肝脏样细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种脂肪间充质干细胞诱导分化为肝脏样细胞的方法，包括：将脂肪组织清洗干净，加入等体积组织消化酶进行消化；消化结束后再加入胰蛋白酶液进行消化；消化结束后离心去除上层油脂和消化液，沉淀为脂肪组织血管基质部分细胞；将血管基质部分细胞用生理盐水再次重悬并筛去大块组织，清洗，离心去除上清液，清洗后的血管基质细胞接种培养，得到脂肪间充质干细胞；选取P3代脂肪间充质干细胞消化得到单细胞悬液，培养基接种培养过夜；去除无血清增殖培养基，添加第一诱导培养液诱导培养；更换为第二诱导培养液进行诱导，得到分化后的肝脏样细胞。本方法可以诱导得到具有功能性的肝脏细胞。

Description

一种脂肪间充质干细胞诱导分化为肝脏样细胞的方法
技术领域
本发明属于干细胞与再生医学领域，具体涉及一种脂肪间充质干细胞诱导分化为肝脏样细胞的方法。
背景技术
肝脏是人体内脏中最大的一个器官，以代谢功能为主，并在身体里面起着去氧化、储存肝糖、合成分泌性蛋白质以及分泌胆汁辅助脂肪消化等等的作用。对人体健康起到重要作用，肝功能衰竭甚至会威胁生命。
随着社会发展，肝脏损伤，包括急性肝功能衰竭，各种慢性肝病，甚至肝癌威胁越来越多的人的健康。肝脏原位移植是治疗终末期肝病最好的方法，但是肝脏移植面临诸多问题，例如供体有限，存在严重的免疫排斥反应等。干细胞技术的发展直接推动组织工程和再生医学等相关领域的进步；各种成体干细胞分离培养成功，干细胞横向分化能力的发现，让人们意识到，使用自体干细胞来修复肝脏损伤可能成为最佳的治疗途径。
现有间充质干细胞诱导方法有采用肝脏组织匀浆液诱导(专利号：201610324114.0)、通过转染特异性转录因子诱导(专利号：201711284606.2)和通过添加肝脏特异性细胞因子诱导等方法。但是采用组织匀浆液诱导存在自体肝脏组织取材困难，异体肝脏组织匀浆液甚至带来交叉污染的可能，后期临床应用受到限制；而转染的转录因子可能会造成细胞基因组改变，使细胞癌变，存在安全性隐患，同样在临床应用中受到限制；通过添加特异性细胞因子也可以使间充质干细胞诱导为肝脏样细胞，但是细胞因子比例组合不同，各种细胞因子使用量不同会直接影响诱导效率，而且现阶段使用特异性细胞因子诱导的肝脏样细胞功能有限，目标细胞得率低下，尚存在严重不足。
发明内容
本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够有效使脂肪间充质干细胞诱导分化为肝脏样细胞的方法。
为此，本发明提供了以下技术方案。
一种脂肪间充质干细胞诱导分化为肝脏样细胞的方法，其包括以下步骤：
(1)将脂肪组织清洗干净，加入与脂肪组织等体积的组织消化酶进行消化；
(2)消化结束后再加入与组织消化酶等体积的胰蛋白酶液进行消化；
(3)消化结束后离心去除上层油脂和消化液，沉淀为脂肪组织血管基质部分细胞；
(4)将血管基质部分细胞用生理盐水再次重悬并筛去大块组织，再用生理盐水清洗，离心去除上清液，清洗后的血管基质细胞用无血清增殖培养基接种培养，得到脂肪间充质干细胞；
(5)选取P3代脂肪间充质干细胞消化得到单细胞悬液，用无血清增殖培养基接种培养过夜；
(6)培养24小时后去除无血清增殖培养基，添加第一诱导培养液I诱导培养；
(7)诱导第10天更换为第二诱导培养液进行诱导，得到分化后的肝脏样细胞。
优选地，所述组织消化酶包括DMEM、基于所述DMEM体积1mg/ml的I型胶原酶、0.5mg/ml的中性蛋白酶、0.05mg/ml的DNA酶。
优选地，所述胰蛋白酶液的浓度为0.05％(质量体积比)。
优选地，所述第一诱导培养液包括H-DMEM、基于H-DMEM体积10％的正常人血清、10ng/ml的肝脏细胞生长因子、15ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、20ng/ml的表皮细胞生长因子、以及终浓度为1μM的地塞米松。
优选地，所述第二诱导培养液包括H-DMEM、基于H-DMEM体积10％的正常人血清、10ng/ml的肝脏细胞生长因子、1μg/ml抑瘤素M(OSM)。
优选地，所述步骤(5)中，所述脂肪间充质干细胞接种于24孔板中，每孔10000个细胞。
优选地，所述步骤(6)中，每孔添加1ml第一诱导培养液诱导培养9天，每3天全量换液。
优选地，所述步骤(6)中，使用第二诱导培养液连续诱导15天，每3天全量换液。
针对现有技术的缺点，本发明提供了一种脂肪间充质干细胞体外诱导为肝脏样细胞的方法，通过调整优化诱导剂的配方和诱导方案，诱导得到具有功能性的肝脏样细胞，诱导之后的肝脏样细胞除具有正常肝脏细胞的形态外，还可以表达肝脏细胞特异性蛋白(ALB和AFP)，并且具有合成尿素和肝糖原的功能，诱导之后的肝脏样细胞可以为干细胞治疗终末期肝病提供理想的种子细胞。通过抽取患者少量脂肪组织可以分离培养出大量脂肪间充质干细胞，培养后的脂肪间充质干细胞经过诱导可以得到具有功能性的肝脏细胞，诱导后的肝脏细胞可以通过肝脏动脉或者肝脏门静脉途径回输到患者肝脏，可以有效补偿受损肝脏细胞，恢复肝脏功能，从而达到治疗的目的。
和现有技术相比，本发明选用脂肪间充质干细胞，取材容易，细胞增殖活性高，而且可以来自患者自身脂肪组织，后期临床应用无伦理障碍，无免疫源性；此外，本发明选用正常人血清，可以避免动物血清诱导带来的各种隐患，后期临床应用可以使用患者自体血清，无免疫源性；再者，本发明的诱导效率高，糖原染色和肝脏特异性蛋白阳性率都高于90％。
附图说明
图1是诱导后肝脏细胞ALB免疫荧光染色结果。
图2是诱导后肝脏细胞AFP免疫荧光染色结果。
图3是诱导后肝脏细胞糖原染色结果。
图4是尿素检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的详述，但本发明并不限于以下实施例。
诱导脂肪间充质干细胞分化为肝脏样细胞，步骤如下：
1、30ml脂肪组织来自抽脂减肥的健康成年人捐献者腹部，并签署知情同意书；
2、整形医院外科手术室采集后密封于运输瓶中冷藏运输(4-8℃)，运输瓶中需要添加50ml组织保护液，组织保护液由生理盐水添加25μg/ml的硫酸庆大霉素和5μg/ml的两性霉素B配制，确保运输过程中无细菌和真菌污染；
3、脂肪组织运抵实验室后组织清洗液清洗干净(组织清洗液由生理盐水添加25μg/ml的硫酸庆大霉素和5μg/ml的两性霉素B配制)，直至组织清洗液无血液残留；
4、清洗干净的脂肪组织于水平离心机中低速离心(800r/min×1min)，去除多余组织清洗液；
5、脂肪组织加入与该脂肪组织等体积的组织消化酶于37℃环境中震荡消化45分钟，震荡转速为150r/min。组织消化酶的配方如下：DMEM(Dulbecco's Modified EagleMedium，杜氏改良Eagle培养基)(10ml)+I型胶原酶(10mg)+中性蛋白酶(5mg)+DNA酶(0.5mg)；
6、消化结束后再加入与组织消化酶等体积的胰蛋白酶液(质量浓度0.05％)震荡消化10分钟，脂肪组织、组织消化液、胰蛋白酶液的体积比为1：1：1；
7、消化结束后低速离心(1500r/min×5min)，去除上层油脂和消化液，沉淀为脂肪组织血管基质细胞(SVF)；
8、SVF沉淀用生理盐水再次重悬并过100μm筛网去除大块组织，生理盐水清洗沉淀2次，每次离心去除上清液(1500r/min×5min)；
9、清洗后的SVF用无血清增殖培养基(友康恒业生物科技(北京)有限公司，间充质干细胞无血清培养基，产品货号：NC0103)接种于T75培养瓶中正常传代培养，得到脂肪间充质干细胞；
10、选取P3代(第三代)脂肪间充质干细胞使用0.05％(质量体积浓度)的胰蛋白酶液消化得到单细胞悬液，用无血清增殖培养基(友康恒业生物科技(北京)有限公司，间充质干细胞无血清培养基，产品货号：NC0103)接种于24孔板中(每孔10000个细胞)培养过夜；
11、24小时后去除无血清增殖培养基，每孔添加1ml诱导培养液I诱导培养9天，每3天全量换液，诱导培养液I配方如下：H-DMEM+体积浓度为10％正常人血清(基于H-DMEM体积)+10ng/ml(基于H-DMEM体积)肝脏细胞生长因子(HGF)+15ng/ml(基于H-DMEM体积)碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)+20ng/ml(基于H-DMEM体积)表皮细胞生长因子(EGF)+终浓度1μM地塞米松(DEX)；
12、诱导第9天更换为诱导培养液II连续诱导15天，每3天全量换液，诱导培养液II配方如下：H-DMEM+体积浓度为10％(基于H-DMEM体积)正常人血清+10ng/ml(基于H-DMEM体积)肝脏细胞生长因子(HGF)+1μg/ml(基于H-DMEM体积)抑瘤素M(OSM)；
13、收集每次换液的条件培养液，使用尿素检测试剂盒(BioVision，货号：K375-100)检测其中尿素浓度；
14、诱导结束后多聚甲醛固定细胞，做肝糖原染色(碘酸-雪夫反应)、肝脏细胞特异性蛋白(ALB和AFP)免疫荧光染色鉴定诱导结果。
结果如图1至图4所示。鉴定结果表明，本发明的诱导效率高，糖原染色和肝脏特异性蛋白阳性率都高于90％，诱导之后的肝脏样细胞除具有正常肝脏细胞的形态外，还可以表达肝脏细胞特异性蛋白(ALB和AFP)，并且具有合成尿素和肝糖原的功能，诱导之后的肝脏样细胞可以为干细胞治疗终末期肝病提供理想的种子细胞。

Claims (8)

1.一种脂肪间充质干细胞诱导分化为肝脏样细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将脂肪组织清洗干净，加入与所述脂肪组织等体积的组织消化酶进行消化；
(2)消化结束后再加入与所述组织消化酶等体积的胰蛋白酶液进行消化；
(3)消化结束后离心去除上层油脂和消化液，沉淀为脂肪组织血管基质部分细胞；
(4)将所述血管基质部分细胞用生理盐水再次重悬并筛去大块组织，再用生理盐水清洗，离心去除上清液，清洗后的血管基质细胞用无血清增殖培养基接种培养，得到脂肪间充质干细胞；
(5)选取P3代脂肪间充质干细胞消化得到单细胞悬液，用无血清增殖培养基接种培养过夜；
(6)培养24小时后去除无血清增殖培养基，添加第一诱导培养液诱导培养；
(7)诱导第10天更换为第二诱导培养液进行诱导，得到分化后的肝脏样细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组织消化酶包括DMEM、基于所述DMEM体积1mg/ml的I型胶原酶、0.5mg/ml的中性蛋白酶、0.05mg/ml的DNA酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胰蛋白酶液的浓度为0.05％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一诱导培养液包括H-DMEM、基于所述H-DMEM体积10％的正常人血清、10ng/ml的肝脏细胞生长因子、15ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、20ng/ml的表皮细胞生长因子、以及终浓度为1μM的地塞米松。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二诱导培养液包括H-DMEM、基于所述H-DMEM体积10％的正常人血清、10ng/ml的肝脏细胞生长因子、1μg/ml抑瘤素M。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，所述脂肪间充质干细胞接种于24孔板中，每孔10000个细胞。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，每孔添加1ml所述第一诱导培养液诱导培养9天，每3天全量换液。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(7)中，使用所述第二诱导培养液连续诱导15天，每3天全量换液。
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