KR101083047B1 - 간엽줄기세포의 배양방법 및 간엽줄기세포를 포함하는 피부결함의 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 지방조직으로부터 분리된 간엽줄기세포를 혈청-함유 배지에서 배양하는 단계; 및 (b) 혈청-함유 배지에서 배양된 간엽줄기세포를 혈청-부재 배지에서 배양하는 단계를 포함하며, 상기 최종적으로 배양된 간엽줄기세포의 타입 I 프로-콜라겐 발현량은 섬유아세포보다 크고, 프로-MMP-1(pro-matrix metalloprotease-1)의 발현량은 섬유아세포보다 작은 것을 특징으로 하는 콜라겐-고발현 간엽줄기세포의 배양방법, 그리고 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 피부 결함의 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

간엽줄기세포의 배양방법 및 간엽줄기세포를 포함하는 피부 결함의 치료용 조성물{METHODS FOR CULTURING MESENCHYMAL STEM CELL AND COMPOSITIONS COMPRISING MESENCHYMAL STEM CELL FOR REPAIRING SKIN DEFECTS}

본 발명은 간엽줄기세포에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 지방조직-유래 간엽줄기세포의 배양방법 및 간엽줄기세포를 포함하는 피부 결함의 치료용 조성물에 관한 것이다.

미적인 효과를 얻기 위해 신체 특히 얼굴에 물질을 주입하는 시술은 처음에는 파라핀으로 시작하여 실리콘 주사액, 소-유래 콜라겐, 보툴리륨 독소 등 점점 다양하고, 빈번하게 확대 되어왔다. 그러나 비-생물학적 물질이나 독소의 주입으로 인한 부작용과 면역거부반응 때문에, 기대하는 효과를 얻을 수 없는 경우가 많았으며, 주입물이 흡수되거나 녹아버려서 지속적인 효과를 기대하기 어려웠다(Heise H., J. Craniomaxillofac Surg. 29(4):238-41(2001); Delustro, F. et al., Plastic and Reconstructive Surgery 79:581(1987)).

환자 본인의 지방 흡입술로 얻어진 지방 덩어리를 본인의 노화된 피부의 주름개선을 위해 진피에 이식하는 시술법은 1980년대부터 시작되었으며, 그 안전성을 충분히 입증 받아서 현재까지 널리 성행되고 있다. 그러나 지방 흡입술로 인한 지 방조직의 상처와, 혈액 등의 이물질이 섞인 지방 덩어리 조직을 단순히 이식하는 것만으로는 생착률이 떨어지고, 쉽게 흡수되어서 주름개선 효과는 단지 몇 개월 정도만 지속되는 것으로 나타났다. 그러므로 재시술을 받아야하는 문제점을 갖고 있다 (Chajchir A., Plast. Reconstr. Surg. 84(6):921-935(1989); O. Onur Erol OO, Plast. Reconstr. Surg. 106(6):1375-1387(2000)).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허가 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 임상 적용 시 피부 결함의 치료 효능이 실제로 발휘될 수 있을 정도로 콜라겐을 고발현하는 간엽줄기세포를 제공하고자 예의 연구 노력한 결과, 종래에 개발된 간엽줄기세포 배양방법을 변형시켜 혈청-부재 배지에서 최종적으로 배양하면 콜라겐-고발현 간엽줄기세포를 얻을 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 콜라겐-고발현 간엽줄기세포의 배양방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 피부 결함의 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 피부 결함의 치료방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 피부 결함의 치료용 약물 (medicament)을 제조하기 위한 지방조직-유래 간엽줄기세포의 용도(use)를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 지방조직으로부터 분리된 간엽줄기세포를 혈청-함유 배지에서 배양하는 단계: 및 (b) 혈청-함유 배지에서 배양된 간엽줄기세포를 혈청-부재 배지에서 배양하는 단계를 포함하며, 상기 최종적으로 배양된 간엽줄기세포의 타입 I 프로-콜라겐 발현량은 섬유아세포보다 크고, 프로-MMP-1 (pro-matrix metalloprotease-1)의 발현량은 섬유아세포보다 작은 것을 특징으로 하는 콜라겐-고발현 간엽줄기세포의 배양방법을 제공한다.

본 발명자들은 임상 적용 시 피부 결함의 치료 효능이 실제로 발휘될 수 있을 정도로 콜라겐을 고발현하는 간엽줄기세포를 얻을 수 있는 배양방법을 개발하고자 노력하였고, 그 결과 혈청-함유 배지에서의 배양에 이어 혈청-부재 배지에서 최종적으로 배양하면 간엽줄기세포에서 콜라겐이 고발현 된다는 것을 확인하였다.

본 발명의 방법을 각 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 지방조직으로부터 분리된 간엽줄기세포를 혈청-함유 배지에서 배양

우선, 지방조직으로부터 간엽줄기세포 (mesenchymal stem cell: MSC)를 얻기 위하여, 지방조직을 절단한 다음, 적합한 단백질 분해효소, 바람직하게는 콜라게나아제를 처리한다. 콜라게나아제 분해 현탁액으로부터 MSC를 분리한다. 분리된 MSC를 혈청-함유 배지에서 배양한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 " 혈청-함유 배지" 는 당업계에서 통상적으로 이용되는 동물세포용 배지에 혈청이 포함된 배지를 의미한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지도 가능하며, 예를 들어, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물 (Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C.J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G et al., In Vitro 14:11(1978)) 등이 이용될 수 있다. 바람직하게는, DMEM, F12, DMEM과 F12의 혼합물 및 RPMI 1640이며, 가장 바람직하게는 DMEM이다.

본 발명의 단계 (a)의 배지에 포함되는 혈청은 당업계에서 인식하는 목적으로 첨가되며, 지방조직-유래 간엽줄기세포의 증식에 있어서 성장인자(growth factors)의 공급원으로서 중요한 역할을 한다. 이용될 수 있는 혈청은, 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 가능하며, 예를 들어, 송아지 혈청, 우태아혈청, 말 혈청 및 인간 혈청을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 간엽줄기세포를 투여할 환자 자신의 혈청이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)에서 이용되는 배지의 질소 공급원으로서 글루타민이 이용된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)에서 이용되는 배지는 혈청을 포함하는 DMEM에 기초하며 질소원으로서 글루타민을 포함하는 배지이다. 단계 (a)에서의 배양은 약 16시간-3주일 동안 실시될 수 있다.

배지 및 배양에 대한 일반적인 설명은 R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc., New York (1984)에 기재되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

단계 (b): 혈청-함유 배지에서 배양된 간엽줄기세포를 혈청-부재 배지에서 배양

상기 단계를 거친 지방조직-유래 간엽줄기세포를 혈청-부재 배지에서 배양한다. 이러한 혈청-부재 배지에서의 배양 단계를 거친 지방조직-유래 간엽줄기세포는 증가된 타입 I 프로-콜라겐 발현량 및 감소된 프로-MMP-1(pro-matrix metalloprotease-1) 발현량 패턴을 나타내며, 이러한 발현량 패턴은 섬유아세포에서의 발현량과 상대적으로 비교하였을 때 더욱 명확하게 확인할 수 있다.

본 명세서에서 용어 " 혈청-부재 배지" 는 당업계에서 통상적으로 이용되는 동물세포용 배지에 혈청이 포함되지 않은 배지를 의미하며, 바람직하게는 "성장인자-부재 (growth factors-free) 배지" 를 의미한다.

단계 (b)에서 이용될 수 있는 배지는 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지도 가능하며, DMEM, F12, DMEM과 F12의 혼합물 및 RPMI 1640이며, 보다 바람직하게는 DMEM과 F12의 혼합물이며, 가장 바람직하게는 DMEM과 F12가 3:1로 혼합된 혼합 배지이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (b)에서의 배양은 단계 (a)에서의 배양보다 짧다. 단계 (b)에서 장시간의 배양 (long-term culture)을 하면, 세포성자 및 분열에 필요한 영양소 결핍의 문제점이 있기 때문에 단계 (b)에서의 배양은 10분-24시간, 바람직하게는 30분-12시간, 보다 바람직하게는 30분-6시간, 가장 바람직하게는 30분-3시간 동안 실시하는 것이다.

지방에서 유래된 간엽줄기세포의 경우 다른 간엽줄기세포 보다 지방으로 쉽게 분화될 수 있으며, 골화될 수 있는 비율이 낮은 것이 특징이다 (Gerard Ailhaud, Biochemi and Biophys Res Commun. 315(2):255-263(2004); Sakaguchi Y., Arthritis Rheum. 52(8)2521-9(2005)). 또한, 본 발명에 따라 배양된 간엽줄기세포의 경우 타입 I 프로-콜라겐 발현량은 섬유아세포보다 높고, 프로-MMP-1 (pro-matrix metalloprotease-1)의 발현량은 섬유아세포보다 낮기 때문에 콜라겐 생성능이 매우 우수하며, 따라서 섬유아세포를 이식하는 경우보다 향상된 피부 결함 치료 효과를 나타낼 수 있다. 피부에서 콜라겐 생성이 주로 섬유아세포에 의해 이루어진다는 것을 고려하였을 때, 본 발명에 의해 달성된 결과는 매우 놀라운 것이다.

본 발명은 체외배양된 지방조직-유래 간엽줄기세포가 실질적으로 피부 결함의 치료 효능을 발휘할 수 있다는 것을 최초로 제시하는 것이다. 따라서, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 지방조직-유래 간엽줄기세포의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 피부 결함의 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 지방조직-유래 간엽줄기세포의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 피부 결함의 치료방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 피부 결함의 치료용 약물(medicament)을 제조하기 위한 지방조직-유래 간엽줄기세포의 용도(use)를 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 " 피부 결함의 치료" 는 진피 또는 피하조직의 결손으로 인한 피부결함을 치료하는 것을 의미하며, 주름개선, 얼굴 윤곽선 교정, 창상이나 기형으로 인한 함몰된 부위의 재생, 여드름으로 인한 반흔의 치료, 입술의 감형성의 교정, 연장 마크 (stretch mark)의 교정 등 진피 또는 피하조직의 결손으로 인한 피부결함의 치료를 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 간엽줄기세포는 상술한 본 발명의 방법에 의해 제조된 것이다.

본 발명의 조성물은 유효성분으로서 간엽줄기세포 이외에 다른 세포 (예컨대, 섬유아세포 및 지방세포)를 포함할 수 있으나, 바람직하게는 간엽줄기세포 이외에 다른 인간-유래 세포가 결여되어 있는, 즉 간엽줄기세포를 단독 유효성분으로 이용한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 이용되는 간엽줄기세포는 섬유아세포보다 타입 I 프로-콜라겐 발현량이 크고, 프로-MMP-1 (pro-matrix metalloprotease-1) 발현량이 작다. 본 발명의 조성물에 이용되는 간엽줄기세포는 섬유아세포보다 타입 I 프로-콜라겐 발현량이 1.5-7배, 바람직하게는 2-6배 크며, 섬유아세포보다 프로-MMP-1 발현량이 3-130배, 바람직하게는 4-125배 작다.

본 발명의 조성물에 포함되는 간엽줄기세포는 투여되는 대상에 대하여 자가(autologous)이거나 또는 타가 (allogenic)일 수 있으나, 바람직하게는 자가 간엽줄기세포이다. 자가 간엽줄기세포는 환자 자신의 지방조직으로부터 간엽줄기세포를 분리 및 배양하여 제조된다.

본 발명의 약제학적 조성물은, 유효성분으로서 지방조직-유래 간엽줄기세포이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 현재 주름개선제로 사용되고 있는 보톡스 (botox) 레스틸렌 (Restylane), 피브리노젠(fibrinogen), 콜라겐 (collagen) 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 피부에 직접 투여할 목적으로 개발되었다. 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량" 은 상술한 피부 결함 치료 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 104-108 세포이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 주사제, 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 바람직하게는 진피 또는 피하 주입을 위한 주사제 형태로 제조된다.

본 발명의 약제학적 조성물은, 획기적으로 피부 결함을 경감시키나 혹은 치료할 수 있는 세포치료제로서, 더욱이 자가 간엽줄기세포를 이용하는 경우에는 면역학적으로도 매우 안전하다.

도 1a 및 도 1b는 본 발명에서 분리된 간엽줄기세포에 대한 FACS (fluorescence-activated cell sorting) 실험 데이터이다.

도 2는 본 발명에서 분리된 간엽줄기세포의 지방세포로의 분화능을 확인한 오일 레드 O 염색 결과 사진이다.

도 3은 본 발명에서 분리된 간엽줄기세포의 골세포로의 분화능을 확인한 본 코사스 (Von kossa's) 염색 및 알리자린 레드 (alizarin red) 염색 결과 사진이다.

도 4는 본 발명에서 분리된 간엽줄기세포의 연골세포로의 분화능을 확인한 사프라닌 (Safranin) O 염색 및 타입 II 콜라겐 염색 결과 사진이다.

도 5a는 본 발명의 간엽줄기세포의 타입 I 프로콜라겐 발현 양상을 보여주는 그래프이다.

도 5b는 본 발명의 간엽줄기세포의 pro-MMP-1 (matrix metalloprotease)-1 발현 양상을 보여주는 그래프이다.

도 6a는 누드마우스에 주입된 본 발명의 간엽줄기세포의 vimentin 발현 양상을 보여주는 결과 사진이다.

도 6b는 누드마우스에 주입된 본 발명의 간엽줄기세포의 PCNA(proliferating cell nuclear antigen) 발현양상을 보여주는 결과 사진이다.

도 7은 누드마우스에 주입된 본 발명의 간엽줄기세포의 타입 I 콜라겐 발현양상을 보여주는 결과사진이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 환자의 지방 조직으로부터 MSC (mesenchymal stem cell) 분리 및 배양

지방 흡입수술로 얻어진 지방 조직이나, 외과적 수술 후에 얻어진 지방 조직을 10％ 페니실린-스트렙토마이신을 포함한 PBS로 10회 이상 세척하여 혈액과 이물질을 제거한 후, 조직을 0.2-0.3 g이 되도록 잘게 절단하였다. 0.2％ 콜라게나아제 (Roche, Sandhofer Strasse, Mannheim, Germany) 용액에 넣어서 37℃의 수욕, 100 rpm에서 1시간 동안 반응시켰다. 100 ㎛ 메쉬를 이용하여 콜라게나아제에 의해서 분해된 용액층과 분해 되지 않은 조각을 분리한 후, 분리된 콜라게나아제 용액에 동량의 PBS를 첨가하였다. 이어, 4℃, 1200 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액인 지질과 지방층을 제거하고, 콜라게나아제 상층액을 제거하였다. 가라앉은 MSC로부터 남은 콜라게나아제 용액을 제거하기 위해서 MSCGM [mesenchymal stem cell growth media: MSC 기본 배지 (Cambrex, Walkersville, MD, 미국), 간엽세포 성장 보조물 (Cambrex, Walkersville, MD, 미국), 4 mM L-글루타민 및 페니실린(0.025 unit/500 ㎖)/스트렙토마이신(0.025 mg/500 ㎖)]를 넣어 다시 4℃, 1200 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. MSCGM은 우태아혈청을 포함하는 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)에 기초한 배지이다. 이어, 상층액을 제거하고, 얻어진 MSC는 배양 접시에 접종하여 MSCGM로 37℃, 5％ CO2 항온기에서 배양하였다. 이틀에 한번씩 배양액을 교체하면서 배양하였다.

실시예 2: MSC 확인 시험 (FACS: fluorescence-activated cell sorting)

각각 다른 사람의 지방 조직으로부터 분리되어진 MSC를 3계대까지 배양한 후, 각각의 MSC 5 x 105 개에 일차항체인 항-CD34 항체, 항-CD29 항체, 항-CD44 항체 및 항-CD105 항체 (Dako, Carpinteria, CA, USA)를 FACS 용액 (Bacton Dickinson, San Jose, CA, USA)에 1:50으로 희석하여 얼음에서 30분간 반응시켰다. FACS 용액으로 2번 세척하여 원심분리한 후, FITC-접합된 이차항체 (Vector, Burlingame, CA, USA)를 FACS 용액에 1:100으로 희석하여 얼음에서 30분간 반응 시켰다. FACS 용액으로 1번 세척하여 원심분리한 후, FACS 용액 0.5 ㎖을 첨가하여 현탁시키고, FACS 장비 (FACSort, Bacton Dickinson, San Jose, CA, USA)로 측정하였다. 음성 대조군으로 FITC-접합된 이차항체만을 반응시킨 MSC를 이용하였다.

도 1a에서 볼 수 있듯이, 지방조직에서 분리된 MSC 한 세트 (A1-MSC)는 조혈줄기세포 마커인 CD34에 대하여는 네가티브, 엔도그린(endoglin) 수용체인 CD105 및 CD44, 그리고 β-1-인테그린 29에 대해서는 포지티브한 결과를 나타내었다. 따라서, 이러한 마커 분석을 통하여 본 발명에서 분리한 세포는 MSC 특성을 보이는 것을 알 수 있다. 또한, 도 1b에서 볼 수 있듯이, 지방조직에서 분리한 또 다른 MSC 세트 (A4-MSC)는 조혈줄기세포 마커인 CD34에 대하여는 네가티브, 엔도그린 (endoglin) 수용체인 CD105 및 CD44, 그리고 β-1-인테그린 29에 대해서는 포지티브한 결과를 나타내었다. 따라서, 이러한 마커 분석을 통하여 본 발명에서 분리한 세포는 MSC 특성을 보이는 것을 알 수 있다.

실시예 3: MSC의 지방세포로의 분화

6-웰 플레이트에 지방조직에서 분리된 MSC를 2 X 105개씩 접종하여 완전하게 컨플루언시될 때까지 MSCGM 배양액에서 이틀에 한번씩 배지를 교환하면서 5-13일 동안 37℃, 5％ CO2에서 배양한다. 100％ 컨플루언시 되면 지방세포 분화를 위해서 유도 배지 [지방세포 유도 배지, 인간 인슐린, L-글루타민, MCGS (mesenchymal stem cell supplement), 덱사메타손, 인도메타신, IBMX(3-isobutyl-1-methyl-xanthine), 페니실린/스트렙토마이신: Cambrex, Walkersville, MD, 미국)에서 3일간 배양액의 교환 없이 배양하고, 유지 배지 (지방세포 유지 배지, 인간 인슐린, L-글루타민, MCGS, 페니실린/스트렙토마이신: Cambrex, Walkersville, MD, 미국)에서 1-3일간 배양액의 교환 없이 배양하였다. 지방세포 분화를 유도/유지 배양과정을 3번 반복한 후, 마지막 유지 배지에서 7일 동안 배양하였다.

실시예 4: 오일 레드 O 염색

지방세포로 분화 유도된 MSC를 10％ 포르말린 용액으로 상온에서 20분간 고정한 후, PBS로 3번 세척하여 포르말린을 제거하였다. 30％ 이소프로필 알코올로 한번 세척한 후, 이소프로필 알코올에 녹인 0.3％ 오일 레드 O 스톡 용액 (Sigma, Saint Louis, MO, 미국)에서 15분간 상온에서 반응시켰다. 30％ 이소프로필 알코올로 한번 세척한 후, DW로 세척하였다. 해리스 헤마토자일린으로 상온에서 1분간 카운터 염색한 후, DW로 세척하고 마운팅 하였다.

도 2에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 MSC로부터 지방세포로 분화유도된 세포를 오일 레드 O 염색한 결과, 염색된 지방세포를 관찰할 수 있었고, 분화유도 시기가 길어질수록 더 많은 지방세포를 관찰할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 MSC는 지방세포 분화능을 가지고 있음을 알 수 있다.

실시예 5: MSC의 골세포로의 분화

6-웰 플레이트에 지방조직에서 분리된 MSC를 3 X 104개씩 접종하여 4-24시간동안 MSCCM 배양액, 37℃, 5％ CO2에서 배양한 후, 골생성 유도 배지 [골세포 분화 기본 배지 (Cambrex, Walkersville, MD, 미국), 덱사메타손, L-글루타민, 아스코베이트, MCGS, β-글리세로포스페이트, 페니실린/스트렙토마이신]로 이틀에 한번 씩 교환하면서 28일간 배양하였다.

실시예 6: 본 코사스 (Von kossa's) 염색

골아세포로 분화 유도된 MSC를 10％ 포르말린 용액으로 상온에서 20분간 고정한 후, DPBS (without Calcium PBS)로 3번 세척하여 포르말린을 제거하였다. DW로 한번 세척한 후, DW에 녹인 5％ 실버 니트레이트 용액에서 1시간 상온에서 반응시켰다. 반응 중에는 호일을 밑에 깔아서 최대한 밝은 빛을 받을 수 있도록 하였다. 60 W 이상의 빛을 이용하였다. DW로 3회 세척하고, 5％ Hypo(sodium thiosulphate)로 5분간 중화반응시키고, DW로 1회 세척한 후, Nuclear-fast Red (Sigma, Saint Louis, MO, 미국)로 5분간 카운터 염색을 하였다. DW로 세척하여 마운팅 하였다.

도 3에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 MSC로부터 골아세포로 분화유도된 세포를 본 코사스 염색한 결과, 염색된 골아세포와 침천된 Ca2+를 관찰할 수 있었고, 분화 유도 시기가 길어질수록 더 많은 골아세포와 침천된 Ca2+를 관찰할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 MSC는 골아세포 분화능을 가지고 있음을 알수 있다.

실시예 7: 알리자린 레드 (alizarin red) 염색

골아세포로 분화 유도된 MSC를 10％ 포르말린 용액으로 상온에서 20분간 고정한 후, DPBS로 3번 세척하여 포르말린을 제거하였다. DW로 한번 세척한 후, DW에 녹인 2％ 알리자린 레드 S 용액 (Sigma, Saint Louis, MO, 미국)으로 5분간 상온에서 반응시켰다. 90％ 아세톤으로 30초 동안 반응 시킨 후, 그대로 건조시켰다.

도 3에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 MSC로부터 골아세포로 분화유도된 세포를 알리자린 레드 염색한 결과, 염색된 골아세포와 침천된 Ca2+를 관찰할 수 있었고, 분화유도 시기가 길어질수록 더 많은 골아세포와 침천된 Ca2+를 관찰할수 있었다. 따라서, 본 발명의 MSC는 골아세포 분화능을 가지고 있음을 알 수 있다.

실시예 8: MSC의 연골세포로의 분화

지방조직에서 분리한 MSC 2.5 x 105개를 폴리프로필렌 튜브에서 불완전 연골생성 배지 [연골세포 분화 기본 배지 (Cambrex, Walkersville, MD, 미국), 덱사메타손, 아스코베이트, ITS+supplement, 소듐 피루베이트, 프롤린, L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신]로 150 x g에서 5분간 원심분리하여 세척하였다. 상층액을 제거하고, 0.5 ㎖의 완전 연골생성 배지 (사용직전에 불완전 배지 2 ㎖에 20 ng TGF-β3를 첨가해서 사용)을 채워준 후, 재현탁하였다. 150 x g에서 5분간 원심분리하고, 형성된 펠릿을 37℃, 5％ CO2에서 배양하였다. 이틀에 한번씩 펠릿이 손상되지 않도록 조심스럽게 0.5 ㎖ 완전 연골생성 배지로 교환해 주면서, 14-28일간 배양하 였다.

실시예 9: 사프라닌 (Safranin) O 염색

연골세포로 분화 유도된 MSC 펠릿을 10％ 포르말린 용액으로 상온에서 1시간 고정한 후, 파라핀 블록을 만들어서 6 ㎛ 두께로 박절하여 건조시켜 파라핀 절편을 제작하였다. 탈파라핀 과정을 위해서 자일렌에서 5분간 3번, 100％ 에탄올에서 2분간 3번, 90％ 에탄올에서 1분간 1번, 80％ 에탄올에서 1분간 1번, 70％ 에탄올에서 1분간 1번 반응시킨 후, PBS에서 10분간 세척하였다. 해리스 헤마토자일린으로 4분간 염색하고, DW로 남은 염색액이 제거될 때 까지 세척하였다. 0.02％ 패스트 그린 FCF (Sigma, Saint Louis, MO, USA)로 3분간 염색하고, 30초 동안 1％ 아세트산에서 반응시켰다. 0.1％ 사프라닌-O (Sigma, Saint Louis, MO, USA)로 5분간 염색하고, 70％ 에탄올에 1초간 10번, 80％ 에탄올에 1초간 10번, 90％ 에탄올에 1초간 10번, 100％ 에탄올에 1분간 2번, 자일렌에 3분간 3번 반응시킨 후, 마운팅 용액으로 마운팅 하였다.

도 4에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 MSC로부터 연골세포로 분화유도된 세포를 사프라닌-O 염색한 결과, 염색된 연골세포를 관찰할 수 있었고, 분화유도 시기가 길어질수록 더 많은 연골세포를 관찰할 수 있었다. 도 4에서, 3주와 4주는 분화기간을 표시한 것이다.

실시예 10: 타입 II 콜라겐 면역조직화학 염색

연골세포로 분화 유도된 MSC의 파라핀 블록을 4 ㎛ 두께로 박절하여 건조시켜 파라핀 절편을 제작하였다. 탈파라핀 과정을 위해서 자일렌에서 5분간 3번, 100 ％ 에탄올에서 2분간 3번, 90％ 에탄올에서 1분간 1번, 80％ 에탄올에서 1분간 1번, 70％ 에탄올에서 1분간 1번 반응시킨 후, PBS에서 10분간 세척하였다. 전처리 과정을 위해서 메탄올에 0.5％ H2O2 용액에서 10분간, 0.3％ PBST에서 5분간, 100℃로 끓인 0.01 M 소듐 시트레이트 용액에서 10분간 반응시켰다. 비특이적인 단백질의 반응을 억제하기 위해서 PBS에 1％ 노말 블록킹 혈청을 혼합한 용액에서 30분간 반응시켰다. 일차항체 항-타입 II 콜라겐 항체 (Dako, Carpinteria, CA, 미국)를 1％ 노말 블록킹 혈청에 혼합하여 40분간 반응시켰다. 바이오틴이 결합되어 있는 만능 이차항체 (Universal Secondary Antibody, Vector, Burlingame, CA, 미국)를 35분간 반응시켰다. 스트렙타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다아제 (Vector, Burlingame, CA, 미국)를 30분간 반응 시켰다. 이어, 발색제로 DAB 용액에 3.5％ H2O2와 니켈을 혼합하여 발색시켰다. 카운터염색으로는 패스트 레드를 사용하였다. 70％ 에탄올에 1초간 10번, 80％ 에탄올에 1초간 10번, 90％ 에탄올에 1초간 10번, 100％ 에탄올에 1분간 2번, 자일렌에 3분간 3번 반응 시킨 후, 마운팅 용액으로 마운팅 하였다.

도 4에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 MSC로부터 연골세포로 분화유도된 세포를 타입 II 콜라겐 면역조직화학 염색한 결과, 염색된 연골세포를 관찰할 수 있었고, 분화유도 시기가 길어질수록 더 많은 연골세포를 관찰할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 MSC는 연골세포 분화능을 가지고 있음을 알 수 있다.

실시예 11: 혈청 부재 (serum free) 배양 조건에서의 MSC 배양

상기 실시예 1에서 분리된 MSC를 혈청 부재 (즉, 성장인자 부재) 조건 하에 서 배양하였다. 실시예 1에서 분리된 MSC를 MSCGM [mesenchymal stem cell growth medla: MSC 기본 배지 (Cambrex, Walkersville, MD, 미국), 간염세포 성장 보조물 (Cambrex, Walkersville, MD, 미국), 4 mM L-글루타민 및 페니실린(0.025 unit/500 ㎖)/스트렙토마이신(0.025 mg/500 ㎖)]이 들어 있는 6-웰 플레이트에 1.6 x 105 cells/well의 밀도로 씨딩하고 18시간 동안 37℃, 5％ CO2 항온기에서 배양하였다. 섬유아세포를 배양하는 경우에는 FGM-2 (Cambrex, Walkersville, MD, 미국)를 이용하였다. 이어, 혈청 부재 (즉, 성장인자 부재)의 p-배지 (DMEM과 F12 배지가 3:1로 혼합된 배지)로 교체하여 6시간 동안 37℃, 5％ CO2 항온기에서 배양하였다.

혈청 부재-배지 조건 하에서 6시간 동안 배양된 세포의 세포 배양액을 수집하여 타입 I 프로콜라겐 ELISA (R＆D, Minneapolis, MN, USA) 제품을 이용해서 시험하였으며, 배양액은 1/25로 희석하여서 시험하였다. 실험 결과는 도 5a 및 표 1에 나타나 있다.

[표 1]

표 1에서 OD 값은 평균± SD로 나타낸 것이고, NF46은 섬유아세포를 나타내며, MSC는 3명의 각각 다른 환자로부터 분리한 것을 이용하였다.

또한, 혈청 부재-배지 조건 하에서 6시간 동안 배양된 세포의 배양액을 1/10으로 희석하여 pro-MMP (matrix metalloprotease)-1 ELISA (R＆D, Minneapolis, MN, USA)) 제품을 이용해서 pro-MMP-1의 발현을 조사하였다. 실험 결과는 도 5b 및 표 2에 나타나 있다.

[표 2]

표 2에서 OD 값은 평균± SD로 나타낸 것이고, NF46은 섬유아세포를 나타내며, MSC는 3명의 각각 다른 환자로부터 분리한 것을 이용하였다.

도 5a 및 표 1에서 볼 수 있듯이, 성장인자가 포함된 배지조건에서 배양한 후, 추가적으로 혈청 부재 조건에서 배양한 경우, 섬유아세포와 비교하여 본 발명의 MSC의 타입 I 프로콜라겐 발현정도가 현저하게 증가된다. 이와 같은 MSC의 높은 타입 I 프로콜라겐 발현정도는 매우 놀라운 결과이며, 이 결과는 본 발명의 MSC가 주름개선용 세포치료제로서 단독으로 혹은 섬유아세포와 혼합된 형태로 실용화 될 수 있음을 보여주는 것이다.

또한, 도 5b 및 표 2에서 볼 수 있듯이, 성장인자가 포함된 배지조건에서 배양한 후, 추가적으로 혈청 부재 조건에서 배양한 경우, 섬유아세포와 비교하여 본 발명의 MSC의 pro-MMP-1 발현이 매우 감소된 패턴을 보인다. 따라서, 본 발명의 MSC의 콜라겐 분해 활성이 크게 감소되어 주름 개선제로서의 효능을 상승적으로 증가시킨다.

결과적으로서, MSC의 배양 과정에서 최종적으로 혈청 부재 (즉, 성장인자 부재) 조건에서 배양하는 경우에는, MSC의 타입 I 프로콜라겐 발현정도를 증가시키고 콜라겐 분해 활성을 감소시켜 피부 결함의 치료제로서의 효능을 크게 증가시킬 수 있다는 것을 알 수 있다.

실시예 12: MSC의 누드 마우스 진피내 주입시험

누드 마우스(Balb/c nude mouse)의 허벅지 부분에 10 mm biopsy punch에 문신용 염색약을 묻혀서 주입부분을 표시한 후, 실시예 1에서 사람의 지방조직으로부터 분리, 배양된 MSC 0.5-1 x 106 cells을 5％ 포도당 생리 식염액 150 ㎕에 현탁하여 마취 하에서 1 ml syringe로 표시된 부분에 주입하였다. 음성대조약물은 5％ 포도당 생리 식염액만을 주입하였다. 주입 7-28일 후에 마우스의 주입 부위에서 진피와 피하 피부조직을 10 mm biopsy punch로 잘라낸 후 조직을 10％ 포르말린에 고정하여 paraffin section 하고, anti-vimentin 항체(Dako, Carpinteria, CA, 미국)와 anti-PCNA 항체(Dako, Carpinteria, CA, 미국)를 이용하여 면역 염색을 실시하였다.

도 6a에서 볼 수 있듯이, 정상적인 사람의 지방조직에서 분리, 배양된 MSC를 누드마우스의 진피나 피하에 주입했을 때 간염세포에서 특이적으로 발현하는 vimentin을 정상적으로 발현하는 것을 볼 수 있었다. 이러한 결과에서 분리, 배양된 MSC가 마우스의 진피나 피하에 주입되었을 때 대사과정이 정상적으로 진행되고 있음을 알 수 있으며, 주입된 MSC와 마우스의 세포를 구분할 수 있는 표시물질로 vimentin을 이용할 수 있음을 확인하였다.

도 6b에서 볼 수 있듯이, 정상적인 사람의 지방조직에서 분리, 배양된 MSC를 누드마우스의 진피나 피하에 주입했을 때 vimentin을 발현하는 동일 세포에서 PCNA가 발현됨을 확인할 수 있다. 증식세포에 대한 표지인 PCNA(proliferating cell nuclear antigen)의 발현은 투여기간 14일에서 확인 되었으며, 28일에서는 확인되지 않았다. 그러므로 주입시킨 MSC가 누드 마우스의 진피나 피하에서 14일까지는 정상적으로 PCNA을 발현하여 분열하지만, 그 이후에는 계속적인 분열은 진행되지 않는 것을 알 수 있다. 계속적으로 분열되는 세포의 경우는 암화될 수 있으며, 정상적인 진피 세포의 경우는 wound 환경에서만 분열하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 주입된 본 발명의 간엽줄기세포는 정상적인 진피세포와 유사한 경향을 나타냄을 알 수 있으며, 피부 결함에 대한 부작용(특히, 암화) 없는 세포 치료제로 이용될 수 있음을 알 수 있다.

실시예 13: 누드 마우스의 진피내 주입된 MSC의 타입 I 콜라겐 발현시험

누드 마우스(Balb/c nude mouse)의 허벅지 부분에 10 mm biopsy punch에 문신용 염색약을 묻혀서 주입부분을 표시한 후, 4 μM BrdU(Sigma, Saint Louis, MO, USA)로 labeling된 실시예 1의 MSC 0.5-1 × 106cells를 5％ 포도당 생리 식염액 150 ㎕에 현탁하여 마취 하에서 1㎖ syringe로 표시된 부분에 주입하였다. 음성대조약물은 5％ 포도당 생리 식염액만을 주입하였다. 주입 7일과 14일후에 마우스의 주입 부위에서 진피와 피하 피부조직을 10 mm biopsy punch로 잘라낸 후 조직을 frozen section 하고, anti-collagen type I 항체(Chemichon, Temecula, CA, 미국)와 anti-BrdU 항체(Dako, Carpinteria, CA, 미국)를 이용하여 형광면역염색을 실시하였다.

도 7에서 볼 수 있듯이, MSC에 BrdU를 labeling하여 누드마우스의 진피나 피하에 주입하고, 투여기간 7일과 14일 후 anti-BrdU 형광면역염색 반응을 이용해서 주입된 세포의 위치를 추적할 수 있었으며, BrdU가 염색된 동일한 세포에서 타입 I 롤라겐이 발현됨을 anti-collagen type I 형광면역염색 반응을 이용해서 확인 할 수 있었다. 따라서, 주입된 MSC가 누드마우스의 진피 내에서도 타입 I 콜라겐을 정상적으로 발현하는 것을 알 수 있으며, 진피층의 콜라겐 손상으로 인한 노화나 주름, 함몰부위 등의 진피결손 피부조직 치료에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 콜라겐-고발현 간엽줄기세포의 배양방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 지방조직-유래 간엽줄기세포를 포함하는 피부 결함의 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따르면, 타입 I 프로-콜라겐 발현량이 크고, pro-MMP-1 발현량이 작은 지방조직-유래 간엽줄기세포를 효율적으로 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물은, 획기적으로 피부 결함을 경감시키거나 혹은 치료할 수 있는 세포치료제로서, 더욱이 자가 간엽줄기세포를 이용하는 경우에는 면역학적으로도 매우 안전하다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (24)

1. (a) 지방조직으로부터 분리된 간엽줄기세포를 혈청-함유 배지에서 배양하는 단계; 및 (b) 혈청-함유 배지에서 배양된 간엽줄기세포를 혈청-부재 배지에서 배양하는 단계를 포함하며, 상기 최종적으로 배양된 간엽줄기세포의 타입 I 프로-콜라겐 발현량은 섬유아세포보다 크고, 프로-MMP-1 (pro-matrix metalloprotease-1)의 발현량은 섬유아세포보다 작은 것을 특징으로 하는 콜라겐-고발현 간엽줄기세포의 배양방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 배양시간은 단계 (b)의 배양시간 보다 긴 것을 특징으로 하는 콜라겐-고발현 간엽줄기세포의 배양방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 혈청-부재 배지는 성장인자(growth factors)를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 콜라겐-고발현 간엽줄기세포의 배양방법.
4. (a) 타입 I 프로-콜라겐 발현량이 섬유아세포보다 1.5-7배 크고, 프로-MMP-1(pro-matrix metalloprotease-1)의 발현량은 섬유아세포보다 3-130 배 작은 지방조직-유래 간엽줄기세포의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 피부 결함의 치료용 약제학적 조성물.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 지방조직-유래 간엽줄기세포는 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 피부 결함의 치료용 약제학적 조성물.
6. 제 4 항에 있어서, 상기 조성물은 지방조직-유래 간엽줄기세포 이외에 다른 인간-유래 세포가 결여된 것을 특징으로 하는 피부 결함의 치료용 약제학적 조성물.
7. 삭제
8. 삭제
9. 제 4 항에 있어서, 상기 지방조직-유래 간엽줄기세포는 자가 (autologous) 간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는 피부 결함의 치료용 약제학적 조성물.
10. 제 4 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 진피 또는 피하 주입용 조성물인 것을 특징으로 하는 피부 결함의 치료용 약제학적 조성물.
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
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