CN111690597B - 人自体脂肪血管基质成分svf的提取试剂及提取、扩增培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供人自体脂肪血管基质成分SVF的提取试剂及提取、扩增培养方法，该提取试剂，包括0.3‑0.6w/w％混合酶溶液、2‑5w/w％海藻糖溶液、0.05‑0.15w/w％明胶溶液、0.1‑0.5w/w％聚谷氨酸溶液和0.03‑0.07w/w％壳聚糖溶液；利用本发明的提取试剂进行脂肪组织中SVF细胞的提取，可显著提高SVF细胞的提取量和提取效率，细胞活率高，操作简便，从而实现了更加简单快捷且高细胞数得率、高细胞活率的脂肪SVF细胞提取和扩增培养，在扩增培养至P3代的特定细胞群可表现出良好的增殖能力，细胞活力稳定，成活率高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及人自体脂肪血管基质成分SVF的提取试剂及提取、扩增培养方法。
背景技术
脂肪组织中的血管基质成分(Stromal Vascular Fraction,SVF)是由脂肪组织经过消化、离心去除成熟的脂肪组织、结缔组织，得到的异质细胞群体。脂肪SVF细胞中包括如造血干细胞、成纤维干细胞、间充质干细胞、内皮细胞、周细胞等多种细胞类型。
传统的脂肪SVF细胞的分离提取方法是采用单一的胶原酶溶液对脂肪组织进行离心、振荡消化和过滤来得到脂肪SVF细胞的混合物，但由于通常为了保证脂肪SVF细胞的纯度，往往需要多次反复的离心、抽吸和过滤等机械操作，而导致脂肪SVF细胞中的细胞数得率和细胞成活率低的不足，从而限制了SVF使用功效。因此，需要寻找一种新的SVF细胞提取试剂，以实现更加简单快捷且高细胞数得率、高细胞活率的脂肪SVF细胞提取和扩增培养，为更好地进行获取、扩增培养脂肪SVF细胞中的特定细胞提供重要基础。
发明内容
鉴于此，本发明提出一种人自体脂肪血管基质成分SVF的提取试剂及提取、扩增培养方法。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种人自体脂肪血管基质成分SVF的提取试剂，包括0.3-0.6w/w％混合酶溶液、2-5w/w％海藻糖溶液、0.05-0.15w/w％明胶溶液、0.1-0.5w/w％聚谷氨酸溶液和0.03-0.07w/w％壳聚糖溶液。本发明在加入一定量的海藻糖和明胶溶液作为细胞保护液的基础上，通过利用一定比例的混合酶增强对脂肪组织的消化能力，同时加入了聚谷氨酸和壳聚糖，增强细胞组织在离心过程的的分离作用，有利于保证在高速离心作用下，快速与油脂及红细胞的充分分离，消除油脂对细胞分离的阻力，并且充分提高细胞黏附值，进一步增强了细胞离心的保护作用，有效避免脂肪组织在高速离心过程的损伤，保持SVF细胞增殖分化潜能，并且无需再进行多次反复的离心、抽吸作用就可以高效获取的SVF细胞，且细胞数得率和细胞活率明显提高。
进一步说明，所述明胶溶液、聚谷氨酸溶液和壳聚糖溶液的质量比为2:5:1。
进一步说明，所述混合酶溶液由胶原酶溶液与中性蛋白酶溶液按体积比为(1～2):1混合而成。
进一步说明，包括0.5w/w％混合酶溶液、3w/w％海藻糖溶液、0.1w/w％明胶溶液、0.25w/w％聚谷氨酸溶液和0.05w/w％壳聚糖溶液。
一种人自体脂肪血管基质成分SVF的提取、扩增培养方法，包括如下步骤：
A.提取SVF细胞:
(1)采集脂肪组织，加入磷酸盐缓冲液清洗2-4遍，去除洗涤液；向清洗后的脂肪组织加入维生素C钠溶液，于30～35℃水浴中80～90rpm缓慢振荡2～3min后；加入1～1.5倍体积提取试剂，在36～38℃，以260-320rpm振荡消化35-45min，离心，弃除上层消化液、油脂及红细胞，取沉淀细胞；
(2)采用生理盐水洗涤沉淀细胞，在2500～2800rpm下离心3～5min，去除上清，向沉淀加入生理盐水重悬细胞，80～120μm过滤SVF细胞，再次采用生理盐水重悬细胞，用20～60μm滤器过滤细胞，得到SVF细胞；
B.扩增培养：
将提取获得的SVF细胞采用流式细胞分选法分离出成纤维干细胞、软骨细胞、间充质干细胞和内皮细胞，将成纤维干细胞、软骨细胞、间充质干细胞和内皮细胞，分别接种至培养瓶中进行传代扩增培养至P3代，接种比例为3000-4000个/cm2，待细胞长至培养瓶的70％-90％后，收集混合，得到扩增培养的特定细胞群体。通过在提取SVF细胞的过程中，加入维生素C钠增强细胞组织的活力，有利于使组织消化更加彻底，有效保持SVF细胞的活力，提高SVF细胞的成活率。
进一步说明，步骤(1)中，所述维生素C钠溶液的加入量0.02～0.05倍体积。
进一步说明，所述维生素C钠溶液浓度为0.8～1.3mg/ml。
进一步说明，步骤(1)中，振荡消化后，在150～200rpm离心2～3min，弃除上层消化液、油脂及红细胞，取沉淀细胞。
进一步说明，步骤(2)中，洗涤沉淀细胞和重悬细胞时，生理盐水的加入量为8～10倍体积。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1)本发明利用海藻糖和明胶溶液作为细胞保护液和利用混合酶增强对脂肪组织的消化能力的同时，加入聚谷氨酸和壳聚糖，以增强细胞组织在离心过程的的分离作用，有利于在高速离心作用下，使SVF细胞与油脂及红细胞的分离更加充分，提高SVF细胞数得率，并与细胞保护液共同提高细胞黏附值，进一步增强了细胞离心的保护作用，有效避免脂肪组织在高速离心过程的损伤，保持SVF细胞增殖分化潜能，并且无需再进行多次反复的离心、抽吸作用就可以高效获取高得率的SVF细胞，且提高SVF细胞的活率。
2)利用本发明的提取试剂进行SVF细胞的提取，能够显著提高SVF细胞的提取量和提取效率，细胞活率高，操作简便，并在扩增培养的过程中，采用分离独立的接种、扩增培养方式，更加快速地获得SVF细胞中特定细胞群体，从而有效实现了更加简单快捷且高细胞数得率、高细胞活率的脂肪SVF细胞提取和扩增培养，在扩增培养至P3代的特定细胞群可表现出良好的增殖能力，细胞活力稳定，成活率高。
3)本发明在提取SVF细胞的过程中，加入维生素C钠增强细胞组织的活力，有利于使组织消化更加彻底，有效保持SVF细胞的活力，提高SVF细胞的成活率。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1-一种人自体脂肪血管基质成分SVF的提取试剂，包括0.3w/w％混合酶溶液、2w/w％海藻糖溶液、0.05w/w％明胶溶液、0.1w/w％聚谷氨酸溶液和0.03w/w％壳聚糖溶液；
所述混合酶溶液由胶原酶溶液与中性蛋白酶溶液按体积比为1:1混合而成。
实施例2-一种人自体脂肪血管基质成分SVF的提取试剂，包括0.6w/w％混合酶溶液、5w/w％海藻糖溶液、0.15w/w％明胶溶液、0.5w/w％聚谷氨酸溶液和0.07w/w％壳聚糖溶液。
所述混合酶溶液由胶原酶溶液与中性蛋白酶溶液按体积比为2:1混合而成。
实施例3-依据实施例2的提取试剂，进行人自体脂肪血管基质成分SVF的提取、扩增培养方法，包括如下步骤：
A.提取SVF细胞：
(1)采集脂肪组织，加入磷酸盐缓冲液清洗2遍，去除洗涤液；向清洗后的脂肪组织加入0.02倍体积的维生素C钠溶液，维生素C钠溶液浓度为1.3mg/ml，于30℃水浴中80rpm缓慢振荡2min后；加入1倍体积提取试剂，在36℃，以260rpm振荡消化35min，在150rpm离心2min，弃除上层消化液、油脂及红细胞，取沉淀细胞；
(2)采用8倍体积生理盐水洗涤沉淀细胞，在2500rpm下离心3min，去除上清，向沉淀加入8倍体积生理盐水重悬细胞，80μm过滤SVF细胞，再次采用8倍体积生理盐水重悬细胞，用20μm滤器过滤细胞，得到SVF细胞；
B.扩增培养：
将提取获得的SVF细胞采用流式细胞分选法分离出成纤维干细胞、软骨细胞、间充质干细胞和内皮细胞，将成纤维干细胞、软骨细胞、间充质干细胞和内皮细胞，分别接种至培养瓶中进行传代扩增培养至P3代，每3天更换培养液，接种比例为4000个/cm2，待细胞长至培养瓶的90％后，收集混合，得到扩增培养的特定细胞群体。
实施例4-依据实施例3人自体脂肪血管基质成分SVF的提取、扩增培养方法，区别在于：所述提取试剂，包括0.5w/w％混合酶溶液、3w/w％海藻糖溶液、0.1w/w％明胶溶液、0.25w/w％聚谷氨酸溶液和0.05w/w％壳聚糖溶液，其余均与实施例3相同。
实施例5-依据实施例4的提取试剂，人自体脂肪血管基质成分SVF的提取、扩增培养方法，包括如下步骤：
A.提取SVF细胞:
(1)采集脂肪组织，加入磷酸盐缓冲液清洗4遍，去除洗涤液；向清洗后的脂肪组织加入0.05倍体积的维生素C钠溶液，维生素C钠溶液浓度为0.8mg/ml，于35℃水浴中80～90rpm缓慢振荡3min后；加入1.5倍体积提取试剂，在38℃，以320rpm振荡消化45min，在200rpm离心3min，弃除上层消化液、油脂及红细胞，取沉淀细胞；
(2)采用10倍体积生理盐水洗涤沉淀细胞，在2800rpm下离心5min，去除上清，向沉淀加入10倍体积生理盐水重悬细胞，120μm过滤SVF细胞，再次采用10倍体积生理盐水重悬细胞，用60μm滤器过滤细胞，得到SVF细胞；
B.扩增培养：
将提取获得的SVF细胞采用流式细胞分选法分离出成纤维干细胞、软骨细胞、间充质干细胞和内皮细胞，将成纤维干细胞、软骨细胞、间充质干细胞和内皮细胞，分别接种至培养瓶中进行传代扩增培养至P3代，每3天更换培养液，接种比例为4000个/cm2，待细胞长至培养瓶的90％后，收集混合，得到扩增培养的特定细胞群体。
对比例1-根据实施例5的人自体脂肪血管基质成分SVF的提取、扩增培养方法，区别在于：所述提取试剂包括包括0.5w/w％混合酶溶液、3w/w％海藻糖溶液、0.1w/w％明胶溶液、1w/w％聚谷氨酸溶液和0.05w/w％壳聚糖溶液，其余均与实施例5相同。
对比例2-根据实施例5的人自体脂肪血管基质成分SVF的提取、扩增培养方法，区别在于：所述提取试剂，包括0.5w/w％混合酶溶液、3w/w％海藻糖溶液、0.1w/w％明胶溶液和0.3w/w％壳聚糖溶液，其余均与实施例5相同。
对比例3-根据实施例5的人自体脂肪血管基质成分SVF的提取、扩增培养方法，区别在于：步骤(1)中，未加入维生素C钠溶液，采集脂肪组织，加入磷酸盐缓冲液清洗4遍去除洗涤液后，直接加入1.5倍提取试剂，其余均与实施例5相同。
对比例4-根据实施例5的人自体脂肪血管基质成分SVF的提取、扩增培养方法，区别在于：步骤(1)中，所述维生素C钠溶液的加入量0.05倍体积，浓度为1.5mg/ml，其余均与实施例5相同。
根据上述实施例3～5和对比例1～4的人自体脂肪血管基质成分SVF的提取方法，每组重复提取获得3个SVF细胞样本，每个样本重复取样5份，分别计算平均的SVF细胞数量以及采用台盼蓝计算细胞成活率，并且根据实施例3～5和对比例1～4的人自体脂肪血管基质成分SVF的扩增培养方法，每组对重复提取获得3个SVF细胞样本进行扩增培养，统计培养至P3代的细胞成活率，对照实验为采用0.5w/w％胶原酶溶液作为提取试剂，进行如实施例5相同的提取方法和扩增培养方法，其结果如下表：
由上表可以看出，利用本发明的提取试剂进行SVF细胞的提取，能够显著提高SVF细胞提取的细胞数得率，且成活率显著提高，操作简便，实现了更加简单快捷且高细胞数得率、高细胞活率的脂肪SVF细胞提取和扩增培养，在扩增培养至P3代的特定细胞群可表现出良好的增殖能力，细胞活力稳定，成活率高。并且，优选该提取试剂的配方为0.5w/w％混合酶溶液、3w/w％海藻糖溶液、0.1w/w％明胶溶液、0.25w/w％聚谷氨酸溶液和0.05w/w％壳聚糖溶液。其中，将实施例5与对比例1～2比较，在对比例1～2中的SVF细胞提取的细胞数得率和成活率明显降低，表明聚谷氨酸和壳聚糖有利于增强细胞组织在离心过程的的分离作用，有利于保证在高速离心作用下，快速与油脂及红细胞的充分分离，消除油脂对细胞分离的阻力，并且充分提高细胞黏附值，进一步增强了细胞离心的保护作用，从而实现在高速离心作用下，有效获取高细胞数得率、高细胞活率的SVF细胞。将实施例5与对比例3～4比较，可看出，本发明在提取SVF细胞提取的过程中，加入维生素C钠可进一步增强细胞活力，有利于使组织消化更加彻底，有效保持SVF细胞的活力，提高SVF细胞的成活率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种人自体脂肪血管基质成分SVF的提取试剂，其特征在于：包括0.3-0.6w/w%混合酶溶液、2-5w/w%海藻糖溶液、0.05-0.15w/w%明胶溶液、0.1-0.5w/w%聚谷氨酸溶液和0.03-0.07w/w%壳聚糖溶液；所述混合酶溶液由胶原酶溶液与中性蛋白酶溶液按体积比为（1~2）:1混合而成。
2.根据权利要求1所述的一种人自体脂肪血管基质成分SVF的提取试剂，其特征在于：所述明胶溶液、聚谷氨酸溶液和壳聚糖溶液的质量比为2:5:1。
3.根据权利要求1所述的一种人自体脂肪血管基质成分SVF的提取试剂，其特征在于：包括0.5w/w%混合酶溶液、3w/w%海藻糖溶液、0.1w/w%明胶溶液、0.25w/w%聚谷氨酸溶液和0.05w/w%壳聚糖溶液。
4.一种如权利要求1-3中任意一项所述的提取试剂对人自体脂肪血管基质成分SVF的提取、扩增培养方法，其特征在于：包括如下步骤：
A.提取SVF细胞:
（1）采集脂肪组织，加入磷酸盐缓冲液清洗2-4遍，去除洗涤液；向清洗后的脂肪组织加入0.02~0.05倍体积的维生素C钠溶液，于30~35℃水浴中80~90rpm缓慢振荡2~3min后；加入1~1.5倍体积提取试剂，在36~38℃，以260-320 rpm振荡消化35-45min，离心，弃除上层消化液、油脂及红细胞，取沉淀细胞；所述维生素C钠溶液浓度为0.8~1.3mg/ml；
（2）采用生理盐水洗涤沉淀细胞，在2500~2800rpm下离心3~5min，去除上清，向沉淀加入生理盐水重悬细胞，80~120μm过滤SVF细胞，再次采用生理盐水重悬细胞，用20~60μm滤器过滤细胞，得到SVF细胞；
B.扩增培养：
将提取获得的SVF细胞采用流式细胞分选法分离出成纤维干细胞、软骨细胞、间充质干细胞和内皮细胞，将成纤维干细胞、软骨细胞、间充质干细胞和内皮细胞，分别接种至培养瓶中进行传代扩增培养至P3代，接种比例为3000-4000个/cm2，待细胞长至培养瓶的70%-90%后，收集混合，得到扩增培养的特定细胞群体。
5.根据权利要求4所述的提取、扩增培养方法，其特征在于：步骤（1）中，振荡消化后，在150~200rpm离心2~3min，弃除上层消化液、油脂及红细胞，取沉淀细胞。
6.根据权利要求4所述的提取、扩增培养方法，其特征在于：步骤（2）中，洗涤沉淀细胞和重悬细胞时，生理盐水的加入量为8~10倍体积。
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