CN113133443A - 一种脂肪组织保护液及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种脂肪组织保护液，所述脂肪组织保护液由人血白蛋白注射液、丙酮酸钠、生理盐水、青霉素、链霉素组成。同时还提供了该保护液在保存脂肪组织以及分离制备脂肪源干细胞中的应用。采用本发明保护液制备得到的脂肪源干细胞数量大、活率高、纯度高，安全性的得到保证，能满足临床要求。

Description

一种脂肪组织保护液及其应用
技术领域
本发明涉及一种细胞的分离方法，尤其涉及一种脂肪源干细胞的分离制备方法。
背景技术
脂肪源干细胞(adipose derived stem cells,ADSC)具有自我更新与多种分化潜能,通过分离培养可以在体外稳定增殖,在特定的诱导条件下,可以被分化诱导为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞等。新鲜分离的ADSC在组织工程、再生医学及修复中有着广泛的应用，如应用于股骨头坏死组织工程技术修复、辅助脂肪移植、面部年轻化、促进毛发生长、皮肤烧伤、糖尿病足、骨缺损修复、神经损伤修复以及炎症性疾病等的治疗。
新鲜分离的ADSC是来源于脂肪组织的脂肪血管基质细胞(脂肪血管基质组分，Stromal vascular fraction，SVF)的主要组成部分之一(Adipose tissue-derivedstromal vascular fraction in regenerative medicine:a brief review on biologyand translation.Stem Cell Res Ther.2017 15；8(1):145.)。2018年复旦大学汤其群教授将从脂肪组织中分离的SVF作为ADSC的一种。ClinicalTrials.gov网站上登记的众多相关临床研究中，有很多研究者直接使用新鲜分离的ADSC进行临床研究。
CD34作为间充质干细胞的主要阴性标记，研究发现在新鲜分离的ADSC中可以检测到CD34，而且会随着不断的传代而逐渐消失，Adipose tissue-derived stromal vascularfraction in regenerative medicine:a brief review on biology and translation.(Stem Cell Res Ther.2017 15；8(1):145.)一文CD34可作为新鲜分离的ADSC纯度的评价指标之一，且有众多其他研究学者将CD34视为前脂肪细胞和祖细胞的标志物，以CD34的检测结果来判断新鲜分离的ADSC纯度。
从脂肪中分离ADSC的方法尚未达成共识，而且纯度不高，目前ADSC的制备方法主要有两种：一是使用蛋白酶水解消化脂肪组织的酶消化法；二是不使用蛋白水解酶的物理机械法，如常鹏于2014年8月12申请的授权号为CN203999585U的专利“一种富集脂肪源干细胞自动提取装置”公开了一种自动提取装置分离富集脂肪源干细胞的方法，使用物理机械法分离脂肪源干细胞耗时很长，有些方法需要三天左右，同时细胞得率、活性以及纯度较低，很难满足临床需求。。
酶消化法常采用Ⅰ型胶原酶或混合胶原酶与脂肪组织按一定比例混合，消化1～3小时，随后离心过滤得到脂肪源干细胞，细胞得率、活性和物理机械法相比虽然有一定程度的提高，但是仍有较大的改进和提升空间。
申请公布号为CN104560868A的发明专利“一种脂肪干细胞的原代分离培养方法”，公开了一种使用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶的混合液体分离脂肪干细胞的方法，每毫升脂肪分离的细胞量为3.79×106，该方法使用了来源于动物的胰蛋白酶，用于临床时增加感染的风险。申请号为CN110241078A的发明专利“一种脂肪干细胞的提取和注射方法”，公布了一种将脂肪组织破碎后使用Ⅰ和Ⅱ胶原酶混合液消化分离脂肪干细胞的方法，该方法细胞得率低，50mL脂肪分离的细胞总量为2.13～2.21×106，且活率低于80％。申请公布号为CN109652367的发明专利“一种制备临床级脂肪干细胞的方法”，公布了将脂肪组织机械破碎后使用Ⅰ型胶原酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶Ⅰ和胰蛋白酶混合液消化分离脂肪干细胞的方法，该方法分离过程中引入大量外源物质，1mL脂肪分离的细胞量仅有0.6～0.8×106，且活率低于90％。申请公布号为N107475190A的发明专利“一种脂肪SVF细胞临床级高效制备和冻存的方法及其用途”，公开了一种脂肪SVF细胞临床级高效制备方法，所得细胞中单核细胞含量较低仅有17％～30％，采用CD34进行纯度分析的结果可知纯度达不到60％。申请公布号为CN110129260A的发明专利“一种脂肪组织中的血管基质成分的提取方法及应用”，公开了一种采用0.2％的胶原酶进行低温酶解的方法处理脂肪组织，从而提高细胞的得率，该方法虽然得率高，但消化时间长达3小时，而且CD34+细胞的比例低，仅为32.82％，限制了其在临床上的应用。
综上所述，新鲜分离的ADSC应用范围广，且分离方法不完善，主要问题有：(1)安全性未得到保证，使用的消化酶为非临床级或有动物源性物质引入，增加感染风险；(2)ADSC得率低；(3)制备的ADSC中单核细胞含量少、纯度低。这些问题限制了ADSC临床应用，影响临床使用效果。因此需要开发出一种安全的、高效的、可制备高得率、高活率和高纯度ADSC的方法。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种脂肪组织保护液，用于保存脂肪组织，然后可通过使用该保护液保存脂肪组织，分离获得大量高纯度的优质临床级ADSC，提高分离效率和ADSC的活率和数量。
本发明提供一种脂肪组织保护液，所述脂肪组织保护液由人血白蛋白注射液、丙酮酸钠、生理盐水、青霉素、链霉素组成。
上述人血白蛋白注射液和生理盐水的体积比为5～10:90～95。
上述丙酮酸钠浓度为1～3mg/mL，青霉素和链霉素的浓度为100Units/mL。
上述丙酮酸钠浓度为2mg/mL.
本发明第二方面还提供上述脂肪组织保护液的应用，所述脂肪组织保护液用于保存脂肪组织。
本发明第三方面，还提供上述脂肪组织保护液用于分离制备脂肪源干细胞。
本发明的突出优点：
1.在保护液中加入人血白蛋白为组织代谢提供氮源、维持细胞渗透压；
2.保护液中加入丙酮酸钠，为组织代谢提供碳源、同时具有抗氧化作用，维持细胞活性，减少细胞的凋亡；
3.ADSC活性高、数量大，1mL脂肪组织可分离1.27～5.16*106的ADSC，是现有方法的20倍左右，ADSC活率＞90％；
4.本发明提供的保护液大幅度提高了ADSC的活率和纯度，分离ADSC中单核细胞量为32.8％～65.49％，是现有技术的2倍左右，以检测细胞表面的CD34含量判断ADSC的纯度，ADSC纯度为51.01％～90.73％，是现有技术的1～3倍。
本发明因分离的SVF中大部分为ADSC，因此将分离的细胞统称为ADSC。
本发明共采集20批数据，在具体实施例中包括以下步骤：
步骤一：对供者身体健康状况进行检查，供者身体状态良好，无遗传病家族病史、无恶性肿瘤、自身免疫性疾病、急慢性传染病、先天性疾病、无血液系统疾病和无其他影响手术抽脂疾病史。人源性特定病毒(HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV等)为阴性、梅毒螺旋体阴性，如果供者的相关检查结果为阳性，需在独立的操作空间和空调系统下完成，避免交叉污染的发生；
步骤二：配制脂肪组织保护液，脂肪组织保护液含人血白蛋白注射液、丙酮酸钠(原料药)、生理盐水、青霉素(注射用)、链霉素(注射用)，人血白蛋白和生理盐水的比例为5～10:95～90，丙酮酸钠浓度为1～3mg/mL，青霉素和链霉素的浓度为100Units/mL；
步骤三：通过吸脂术获取的脂肪组织，且脂肪采集在层流手术室进行，将脂肪组织保存在脂肪组织保护液中，运送至GMP车间；
步骤四：用生理盐水配制一定活力的注射用胶原酶溶液，并预热至37℃；
步骤五：将通过吸脂术获得的脂肪组织离心，分为四层，即油脂层、脂肪组织层、液体层和底部沉淀；
步骤六：弃去油脂层、液体层和底部沉淀，保留脂肪组织；
步骤七：加入脂肪组织3～4倍体积的生理盐水，用力震荡混匀后离心，离心后分四层，即少量油脂层、脂肪组织层、液体层和底部沉淀，弃去油脂层、液体层和底部沉淀，保留脂肪组织；
步骤八：重复第七步的操作，用生理盐水清洗脂肪组织2～3次，离心后无油脂层和底部沉淀，即可进行后续操作
步骤九：在清洗后的脂肪组织加入一定体积步骤四配制的注射用胶原酶溶液，在恒温气浴培养振荡器消化一定时间；
步骤十：将第九步消化后的脂肪组织离心，分别收集底部的细胞沉淀和上层脂肪组织；
步骤十一：将细胞沉淀重悬在含人血白蛋白的生理盐水中，备用；
步骤十二：在第十步所得的脂肪组织中继续加入一定体积的注射用胶原酶溶液，在恒温气浴培养振荡器消化一定时间；
步骤十三：将第十二步消化后的脂肪组织离心，弃去上层脂肪组织和中间液体层，收集底部的细胞沉淀；
步骤十四：将细胞沉淀重悬在含一定浓度人血白蛋白的生理盐水中，与第十步所得的细胞悬液混合，用70μm的滤网过滤上述细胞悬液，离心；
步骤十五：弃上清，并用含人血白蛋白的生理盐水重悬细胞，离心，重复操作两次，尽可能的去除红细胞；
步骤十六：用适量含人血白蛋白的生理盐水重悬细胞并取样，台盼蓝法计数并检测细胞活率，利用流式细胞仪检测CD34的含量；
步骤十七：根据临床要求制备相应浓度的ADSC制剂直接使用，临床级ADSC制剂仅含有ADSC、人血白蛋白和生理盐水；或冻存于-196℃备用，冻存液为临床级冻存液和人血白蛋白注射液，体积比为5:95。
附图说明
图1：本发明工艺流程图；
图2：A为对比例1分离的ADSC中有核细胞含量检测结果，B为实施例2和实施例4分离的ADSC中有核细胞最高含量，C为实施例3、实施例5和实施6分离的ADSC中有核细胞最低含量，D实施例3、实施例5和实施6分离的ADSC中有核细胞最高含量；
图3：A为对比例1CD34检测结果，B为实施例2CD34检测结果，C为实施例3CD34检测结果，D为实施例4CD34检测结果，E为实施例5CD34检测结果，F为实施例6CD34检测结果。
具体实施方式
以下，参照实施例对本发明进行更详细和具体地描述，但下述实施例并不意在限制本发明。
通过以下实施例进一步说明本发明，而非限制本发明，本发明中百分比浓度为体积百分比浓度，本发明中ADSC为新鲜分离制备的ADSC。
实施例1 对比例临床级ADSC细胞的制备
采用目前公开的制备临床级ADSC的方法制备ADSC，对比例和实施例每毫升脂肪分离细胞量和活率对比见表1
1.对供者身体健康状况进行检查，供者身体状态良好，无遗传病家族病史、无恶性肿瘤、自身免疫性疾病、急慢性传染病、先天性疾病、无血液系统疾病和无其他影响手术抽脂疾病史。人源性特定病毒(HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV等)为阴性、梅毒螺旋体阴性；
2.配制常规脂肪组织保护液，0.9％生理盐水+100ug/mL青霉素+100ug/mL链霉素；
3.配制消化液：20％的人血白蛋白25mL、0.9％生理盐水75mL、5mg的混合胶原酶、145μL的200mg/mL的氯化镁溶液；
4.配制洗涤液：5ml 20％的人血白蛋白注射用加入500ml生理盐水中；
5.通过吸脂术获取的脂肪组织，且脂肪采集在层流手术室进行，将脂肪组织保存在常规脂肪组织保护液中，运送至GMP车间；
6.脂肪组织清洗后，加入与脂肪组织等体积的消化酶，混匀后置于37℃水浴锅内，每间隔1min摇匀一次，消化20～30min，观察无大块脂肪组织时终止消化；
7. 18℃、400g离心7min，弃去上层液体和脂肪组织，保留底部沉淀，用洗涤液重悬后，使用100μm细胞滤网过滤，补加洗涤液后，18℃、400g离心7min，弃上清，保留ADSC沉淀；
8.用适量洗涤液重悬细胞，取样计数、检测细胞活率、单核细胞含量以及细胞纯度。
实施例2 本发明分离方法制备优质临床级脂肪源干细胞制剂1
采用目前公开的制备临床级ADSC的方法制备ADSC，其主要步骤具体同实施例1，但是保护液采用本发明保护液，具体配方为，人血白蛋白和生理盐水的体积比为5:95，丙酮酸钠浓度为2mg/mL，青霉素和链霉素的浓度为100Units/mL。脂肪组织保护液与脂肪组织比例为1:1。
实施例3 本发明分离方法制备优质临床级脂肪源干细胞制剂2
一种从脂肪组织中高效分离制备优质临床级脂肪源干细胞的方法，其主要步骤包括：
1.对供者身体健康状况进行检查，供者身体状态良好，无遗传病家族病史、无恶性肿瘤、自身免疫性疾病、急慢性传染病、先天性疾病、无血液系统疾病和无其他影响手术抽脂疾病史。人源性特定病毒(HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV等)为阴性、梅毒螺旋体阴性，如果供者的相关检查结果为阳性，需在独立的操作空间和空调系统下完成，避免交叉污染的发生；
2.配制脂肪组织保护液，含人血白蛋白注射液、丙酮酸钠(原料药)、生理盐水、青霉素(注射用)、链霉素(注射用)，具体配方为：人血白蛋白和生理盐水的体积比为10:90，丙酮酸钠浓度为2mg/mL，青霉素和链霉素的浓度为100Units/mL；
3.在层流手术室中通过吸脂术采集脂肪组织，并将脂肪组织保存在脂肪组织保护液中，脂肪组织保护液与脂肪组织比例为1:1，运送至GMP车间；
4.用生理盐水配制注射用胶原溶液，酶活力为62.5～250.0U/mL，并预热至37℃；
5.脂肪组织在400g条件下离心10min，分为四层，即油脂层、脂肪组织层、液体层和底部沉淀；
6.弃去油脂层、液体层和底部沉淀，保留脂肪组织，在脂肪组织中，加入脂肪组织3～4倍体积的生理盐水，用力震荡充分摇匀，400g离心10min；
7.重复第6步的操作，用生理盐水清洗脂肪组织2～3次，离心后无油脂层和底部沉淀，即可进行后续操作；
8.在清洗后的脂肪组织中加入酶活力为62.5～250.0U/mL的注射用胶原酶溶液，脂肪组织与胶原酶溶液的体积比为1:0.25～1:1；
9.混匀后，置于恒温气浴培养振荡器中，恒温气浴培养振荡器转速80～100rpm，消化10～30min，观察无大块状脂肪组织，停止消化；
10. 400g×10min离心，分别收集底部的细胞沉淀和上层脂肪组织；
11.用含终浓度为2％～4％人血白蛋白的生理盐水(生理盐水和20％人血白蛋白的体积比为9:1～4:1)重悬细胞沉淀，备用；
12.在第10步所得的脂肪组织中继续加入酶活力为62.5～250.0U/mL的胶原酶溶液，脂肪组织与胶原酶溶液的体积比为1:0.25～1:1；
13.混匀后，置于恒温气浴培养振荡器中，恒温气浴培养振荡器转速80～100rpm，消化10～20min，观察脂肪组织为乳状时，停止消化；
14. 400g离心10min，弃去上层脂肪组织和中间液体层，收集底部细胞沉淀；
15.用含终浓度2％～4％人血白蛋白的生理盐水(生理盐水和20％人血白蛋白的体积比为9:1～4:1)重悬细胞沉淀，并与第10步所得的细胞悬液混合；
16.用70μm的滤网过滤上述细胞悬液，400g离心10min；
17.弃上清，用含终浓度2％～4％人血白蛋白的生理盐水清洗ADSC，重悬细胞沉淀后，400g离心10min；
18.重复第17步的操作，清洗细胞2到3次。
19.弃上清，细胞沉淀用适量含2％～4％人血白蛋白的生理盐水重悬取样，利用台盼蓝法检测细胞数量、活率，用流式细胞仪检测单核细胞含量和CD34含量。
20.根据临床要求制备相应浓度的ADSC制剂直接使用，临床级ADSC制剂仅含有ADSC、人血白蛋白和生理盐水；或冻存于-196℃液氮中备用，冻存液的配方是临床级DMSO和人血白蛋白的体积比为5:95，使用程序降温仪进行降温。
21.ADSC复苏率和复苏后细胞活率检测：从-196℃液氮中取出冻存的ADSC，在37～40℃水浴锅中快速震荡进行复苏，时间少于1min，然后转移至含终浓度2％～4％人血白蛋白的生理盐水中，400g离心10min，弃上清，细胞沉淀用适量含终浓度2％～4％人血白蛋白的生理盐水重悬，取样用台盼蓝法计数并检测复苏后细胞活率，计算复苏率，由检测结果可知，复苏率都高于90％，且细胞活率大于90％，可满足临床应用需求
实施例4 本发明分离方法制备优质临床级脂肪源干细胞制剂3
一种从脂肪组织中高效分离制备优质临床级脂肪源干细胞的方法，其主要步骤具体同实施例3，但是保护液采用常规脂肪组织保护液，具体配方为，0.9％生理盐水+100ug/mL青霉素+100ug/mL链霉素。
实施例5 本发明分离方法制备优质临床级脂肪源干细胞制剂4
保存时，脂肪组织保护液与脂肪组织比例为1:1，脂肪组织保护液的具体配方为：人血白蛋白和生理盐水的体积比为5:95，丙酮酸钠浓度为3mg/mL，青霉素和链霉素的浓度为100Units/mL；其余步骤同实施例3。
实施例6本发明分离方法制备优质临床级脂肪源干细胞制剂5
保存时，脂肪组织保护液与脂肪组织比例为1:1，脂肪组织保护液具体配方为：人血白蛋白和生理盐水的体积比为10:90，丙酮酸钠浓度为3mg/mL，青霉素和链霉素的浓度为100Units/mL；其余步骤同实施例3。
各实施例每毫升脂肪分离细胞量和活率数据的实验结果如表1所示。
表1各实施例每毫升脂肪分离细胞量和活率对比
Figure BDA0002374520170000071
从以上结果可以看出，采用同样的分离方法，不同脂肪组织保护液，本发明脂肪组织保护液的效果均优于普通脂肪组织保护液，且如采用本发明分离方法和本发明脂肪组织保护液，则分离的细胞量和纯度均大大优于普通方法和普通脂肪组织保护液。
此外，应理解，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不脱离本发明的范围和实质的情况下，可以对本发明的技术方案进行各种修改或者等同替换。

Claims (7)

1.一种脂肪组织保护液，其特征在于，所述脂肪组织保护液由人血白蛋白注射液、丙酮酸钠、生理盐水、青霉素、链霉素组成。
2.如权利要求1所述脂肪组织保护液，其特征在于，所述人血白蛋白注射液和生理盐水的体积比为5～10:90～95。
3.如权利要求2所述脂肪组织保护液，其特征在于，所述丙酮酸钠浓度为1～3mg/mL，青霉素和链霉素的浓度为100Units/mL。
4.如权利要求3所述脂肪组织保护液，其特征在于，所述丙酮酸钠浓度为2mg/mL。
5.如权利要求1-4任一权利要求所述脂肪组织保护液的应用，其特征在于，所述脂肪组织保护液用于保存脂肪组织。
6.如权利要求5所述脂肪组织保护液的应用，其特征在于，所述脂肪组织与脂肪保护液的体积比为1:1-1:5。
7.如权利要求1-4任一权利要求所述脂肪组织保护液的应用，其特征在于，所述脂肪组织保护液用于分离制备脂肪源干细胞。
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