CN109876189A - 一种利用超声波高效制备脂肪源生物材料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用超声波高效制备脂肪源生物材料的方法，包括离心、超声波破碎(包括接触式和非接触式超声波)、离心收集等步骤。本发明所述方法利用超声波破碎脂肪组织中大部分成熟脂肪细胞，同时应用絮状离心沉淀技术，将破碎成熟脂肪细胞产生的油滴汇聚出去，从而达到富集SVFs的目的；再利用高速离心去除细胞成分，得到ECM。经过超声波处理后，细胞活性大幅度提高、细胞凋亡率大幅度下降，从而使得移植的有效性得到很大提高；同时可得到ECM生物大分子材料，避免了操作繁琐导致的ECM含量过低和细胞因子损失。由本发明方法制备得到的生物材料可用于自体移植生物疗法，降低了脂肪移植的并发症，提高了移植脂肪的存活率。

Description

一种利用超声波高效制备脂肪源生物材料的方法

技术领域

本发明涉及再生医学技术领域，具体地，涉及一种利用超声波高效制备脂肪源生物材料的方法。更具体地，涉及一种利用接触式和非接触式超声波高效制备基质血管片段细胞材料和细胞外基质材料的方法。

背景技术

干细胞能够长期存活，具有不断自我繁殖能力和多向化潜能，为临床多种疾病的治疗提供了新的思路(Zuk，2010)。研究发现，干细胞主要来源有两种，即胚胎干细胞(mesenchymal stem cell，ESC)和成体干细胞(Adult stem cell，ASC)，目前国内的ESC尚无产品达到临床研究要求。在临床治疗中，常用的细胞类型是成体源性细胞，如骨髓、脐带血、脐带等来源的间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)等。与ESC相比，ASC广泛存在于身体的各个组织和器官，如骨髓、皮肤、脂肪和肌肉等，与此同时，同样具有高度可塑性、自我更新和定向分化的潜力(De Ugarte,et al，2003)，并且来源自身，避免了伦理道德问题，因此已经成为了目前组织工程及再生医学中最为理想的种子细胞，为一些传统药物治疗困难的疾病带来新的希望(Sterodimas,et al，2010)。

脂肪组织来自中胚层，含有大量细胞基质成分。大量研究从脂肪组织中分离得到富含细胞的成分，并将其命名为基质血管成分(Chung,et al，2013)，通过系列研究证实SVF中的细胞成分具有多细胞系分化能力。研究表明，通过吸脂得到的脂肪组织经过一系列处理，分离纯化得到的细胞成分经过体外培养可以贴壁生长，在合适的条件下，这些细胞可以向成骨、成脂、成肌方向分化。从而证明基质血管成分除了含有特定成脂的前脂肪细胞外，还存在着具有多向分化能力的干细胞。脂肪组织是ASC的重要来源。脂肪组织可以从吸脂或切脂减肥的瘦身者中获取，而且过程易于被患者所接受。同时脂肪组织取材量充足，展现出广阔的临床应用前景，脂肪组织中的多功能干细胞被称之为脂肪源性干细胞(Adipose-derived stromal/stem cell，ADSC)(Zuk,et al，2001)，简称脂肪干细胞，又称吸脂术细胞(processed lipoaspirate cell，PLA)。ADSC来源充足、具有较强的自我更新能力、分离培养较为容易、增殖较快、全能性较高，已经成为干细胞治疗领域的热点(Baglioni,et al，2009)，在组织重建与修复中展现出良好的应用前景(Bourin,et al，2013)。

脂肪组织中的血管基质部分(SVF)含有大量的、具有超强生命活性的ADSC，ADSC作为脂肪组织的储备可直接分化为脂肪细胞，同时SVF还包含血管内皮细胞、基质细胞、周细胞、血管平滑肌细胞、免疫细胞以及大量血液循环来源的细胞，是细胞辅助脂肪移植中最重要的组分。以上理论已经在多项临床试验中得到验证，其在促进游离移植脂肪的存活率方面起到重大作用，另外SVF自来源丰富、取材方便的脂肪组织分离，于自身组织无免疫排斥反应，具有非常好的研究和应用价值(Zuk,et al，2001)。

现有的SVF细胞的富集方法主要包括酶解法、推注破碎法等。酶解法在富集过程中加入了外源性消化酶，不仅花费较高，且需要在特定实验条件下进行，存在一定的安全性问题，所以在临床方面并无很大的利用价值。因此，研究人员已经开发了各种非酶方法来分离基质血管部分，涉及强烈的涡旋和离心(Patricia，2001)。推注法运用机械破碎原理破碎脂肪组织中成熟脂肪细胞，不加入外源性化学物质而富集SVF并且保留有SVF粘附在细胞外基质(extracellular matrix，ECM)上的生理关系。但现有的常规推注法操作繁琐，且造成移植材料SVF胶的活细胞比例低、细胞凋亡率高、细胞碎片高从而导致炎症反应比较明显，同时手术剪剪碎原始脂肪增加了污染概率。因此，现急需开发一种能有效提高基质血管片段细胞活性、降低细胞凋亡率的制备方法。

此外，脂肪源的生物材料除了细胞组分如基质血管片段(SVF)外，还有非细胞组分—细胞外基质(ECM)。ECM是细胞外分子的集合，为周围细胞提供结构和生化支持。ECM也控制着周围细胞的迁移，扩散和分化(Bunnell,et al，2008)，以提高自体脂肪移植的有效性。Young等人研究了使用市售的软组织填充剂，分别采用合成的和天然的聚合物，使用和不使用细胞外基质的材料进行脂肪组织工程试验，发现ECM的产品最有可能促进新生脂肪形成，从而促进长期保留。

目前分离ECM的方法，主要是Flynn提出的反复冻融+多次酶解+极性溶剂萃取的方法，该方法不仅耗时长，费用高，操作繁琐，其中细胞因子因多次反复处理丢失殆尽，且需要在特定实验条件下进行，所以在临床方面并无很大的利用价值。因此，现急需开发一种能高效富集ECM且减少细胞因子损失的方法。

综上，开发一种能同时高效富集SVF和ECM的方法在脂肪源生物移植、疾病治疗及创伤修复的临床治疗方面具有重要意义。

发明内容

本发明是针对推注法和反复冻融+多次酶解+极性溶剂萃取等物理方法获得SVF和ECM存在上述问题，提供了一种利用超声波高效制备脂肪源生物材料的方法。本发明通过利用接触式和非接触式超声波高效制备基质血管片段细胞材料和细胞外基质材料，不需要加入外源性化学物质，避免了操作的繁琐，通过超声波法得到的SVF活细胞比例显著增加，细胞碎片及凋亡显著降低，同时可以制备富含细胞因子的ECM。

本发明的目的在于提供一种利用超声波高效制备脂肪源生物材料的方法。

本发明的另一目的在于提供由上述方法制得的基质血管片段细胞材料和细胞外基质材料在制备皮肤移植材料、软组织填充材料、修复药物或皮肤抗皱产品中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种利用超声波高效制备脂肪源生物材料的方法，包括如下步骤：

S1.将脂肪组织于1000～12000rpm条件下离心1～8min，离心后若分为三层，分别为顶层油脂、中间层混合物和底层肿胀液，则弃去底层肿胀液，过滤去除顶层油脂并取滤液；若不分层或分层不明显，则重复此步骤；

S2.将S1所得滤液进行非接触式超声破碎，所述超声破碎条件为600～1190W、5～55min、20～38℃；

S3.将经S2非接触式超声破碎后的脂肪混合物于1000～10000rpm条件下离心3～10min；

S4.经S3离心后，若脂肪混合物分为三层，分别为顶层油脂、中间层混合物和底层肿胀液，且油脂层体积占脂肪混合物总体积60％以上，则弃去顶层油脂，取中间层混合物；若脂肪混合物不分层或分层不明显，则重复S2～S3；再用接触式超声波处理中间层混合物，所述超声破碎条件为15～325W、1～250s、15～38℃；

S5.经S4接触式超声处理后，加等体积生理盐水混匀，于3000～12000rpm条件下离心3～8min；

S6.取S5离心沉淀，加入与中间混合物等体积的生理盐水重悬细胞，即得含有高度浓缩的基质血管片段细胞材料；

S7.弃去S5离心沉淀，收集上层浅黄色絮状物，即得富含细胞因子的细胞外基质材料。

一方面，本发明采用超声波破碎细胞利用的是空化效应引起的剪切力和冲击力，是一种纯物理破碎方式，不需要加入外源性化学物质从而富集SVFs并且保留有SVFs粘附在ECM上的生理关系，且制得的两种生物活性材料(一种为细胞材料，一种为生物大分子材料)，不含有外源性物质，能提高自体脂肪移植的有效性；另一方面，本发明所述方法步骤简易、花费成本较低，能制备得到大量细胞活性高的富含脂肪来源干细胞的基质血管片段细胞材料和富含细胞因子的细胞外基质材料，可用于制备皮肤移植及软组织填充、修复相关材料，降低了脂肪移植的并发症，提高了移植脂肪的存活率，具有广阔的应用前景。

本发明前期采用非接触式超声波(探头不直接接触脂肪组织)对脂肪组织进行破碎，避免了接触式超声波由于探头放置于脂肪组织内，易污染导致SVF细胞和ECM感染而无法在临床上使用的缺点，具有安全高效无污染的优点。后续为了避免脂肪组织破碎不够彻底，因此采用接触式超声波(探头直接接触脂肪组织)进行短时间处理，进一步破碎脂肪组织，达到最佳破碎效果，又避免了探头长时间放置于脂肪组织内易引起污染的问题。

其中，S1所述脂肪组织的获取均采用吸脂手术，从患者腹部或者大腿吸取，即最终获得的SVF和ECM来源于自体脂肪。S1中在推出底层肿胀液时应在不损失脂肪的情况下尽可能将肿胀液去除干净，否则最后所得产物会带有血细胞，目的是浓缩脂肪组织。S1中在转移中间层混合物时，尽可能不要将顶层油脂转入离心管中。S2非接触式超声破碎完成之后，离心管中的脂肪混合物应当为浅黄色蛋花汤样，目的是破碎成熟的脂肪细胞，使SVF和ECM游离出来。

此外，发明人在研究各实验参数对制备得到的SVF材料的活细胞数量、细胞碎片率、细胞活性等方面的影响，以及对制备得到的ECM中蛋白含量和细胞因子含量的影响时，发现超声波破碎条件对SVFs和ECM的影响最大。经过发明人大量的创造性摸索和试验，最终得到了最适合的一整套制备工艺。

优选地，步骤S2中所述超声破碎条件为700～1190W、3～50min、22～37℃。

更优选地，步骤S2中所述超声破碎条件为800～1180W、4～45min、25～37℃。

更优选地，步骤S2中所述超声破碎条件为1000～1150W、5～20min、32～37℃。

优选地，步骤S4中所述超声破碎条件为15～200W、5～100s、20～36℃。

更优选地，步骤S4中所述超声破碎条件为15～180W、5～70s、20～36℃。

更优选地，步骤S4中所述超声破碎条件为20～120W、10～30s、25～36℃。

优选地，步骤S1中所述过滤为20～120目数筛网过滤。

优选地，所述筛网的目数为60～80目。

更优选地，所述筛网的目数为60目。

优选地，所述筛网过滤时采用负压吸取残留在过滤器中的脂肪组织。

优选地，步骤S1中所述离心条件为4000～6000rpm离心2～5min。

更优选地，步骤S1中所述离心条件为5000rpm离心3min。

优选地，步骤S3中所述离心条件为3000～5000rpm离心4～6min。

更优选地，步骤S3中所述离心条件为5000rpm离心5min。

优选地，步骤S5中所述离心条件为3000～5000rpm离心3～5min。

更优选地，步骤S5中所述离心条件为5000rpm离心4min。

本发明还请求保护由上述方法制得的基质血管片段细胞材料和细胞外基质材料在制备皮肤移植材料、软组织填充材料、修复药物或皮肤抗皱产品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明所述方法利用复合超声波(非接触和接触式超声波)破碎脂肪组织中大部分成熟脂肪细胞，同时应用絮状离心沉淀技术，将破碎成熟脂肪细胞产生的油滴汇聚出去，从而达到富集SVFs的目的；再利用高速离心去除细胞成分，得到ECM。整个制备过程中没有加入任何外源性化学生物试剂，并且为自体移植，故不存在安全性及伦理性争议。

(2)本发明方法简单易行，在制备成本低的情况下，经过复合超声波处理后，细胞活性大幅度提高、细胞凋亡率大幅度下降，有效避免SVFs细胞数量及活力的损失，从而使得移植的有效性得到很大提高；同时可得到ECM生物大分子材料，避免了操作繁琐导致的ECM含量过低和细胞因子损失问题。

(3)由本发明方法所制备的脂肪自体移植细胞材料和ECM材料中含有丰富的脂肪来源干细胞及基质血管部分和细胞因子，可用于自体移植生物疗法和创面修复，可以降低脂肪移植的并发症，提高移植脂肪的存活率，并提高生物修复能力，具有广阔的应用前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

仪器：宁波新芝SB-1200DTY非接触式扫频超声波清洗机和JY92-IIN接触式超声波细胞粉碎仪。

实施例1

一种利用超声波高效制备脂肪源生物材料的方法，具体步骤如下：

(1)将脂肪组织于5000rpm条件下离心3min，离心后若分为三层，分别为顶层油脂、中间层混合物和底层肿胀液，则弃去底层肿胀液，过滤去除顶层油脂并取滤液；若不分层或分层不明显，则重复此步骤；

(2)将步骤(1)所得滤液进行非接触式超声破碎，所述超声破碎条件为1000W、10min、36℃；

(3)将经步骤(2)非接触式超声破碎后的脂肪混合物于5000rpm条件下离心5min；

(4)经步骤(3)离心后，若脂肪混合物分为三层，分别为顶层油脂、中间层混合物和底层肿胀液，且油脂层体积占脂肪混合物总体积60％以上，则弃去顶层油脂，取中间层混合物；若脂肪混合物不分层或分层不明显，则重复步骤(2)～(3)；再用接触式超声波处理中间层混合物，所述超声破碎条件为90W、30s、36℃；

(5)经步骤(4)接触式超声处理后，加等体积生理盐水混匀，于5000rpm条件下离心4min；

(6)取步骤(5)离心沉淀，加入与中间混合物等体积的生理盐水重悬细胞，即得含有高度浓缩的基质血管片段细胞材料；

(7)弃去步骤(5)离心沉淀，收集上层浅黄色絮状物，即得富含细胞因子的细胞外基质材料。

实施例2

一种利用超声波高效制备脂肪源生物材料的方法，具体步骤如下：

(1)将脂肪组织于5500rpm条件下离心3min，离心后若分为三层，分别为顶层油脂、中间层混合物和底层肿胀液，则弃去底层肿胀液，过滤去除顶层油脂并取滤液；若不分层或分层不明显，则重复此步骤；

(2)将步骤(1)所得滤液进行非接触式超声破碎，所述超声破碎条件为1100W、9min、36℃；

(3)将经步骤(2)非接触式超声破碎后的脂肪混合物于5000rpm条件下离心6min；

(4)经步骤(3)离心后，若脂肪混合物分为三层，分别为顶层油脂、中间层混合物和底层肿胀液，且油脂层体积占脂肪混合物总体积60％以上，则弃去顶层油脂，取中间层混合物；若脂肪混合物不分层或分层不明显，则重复步骤(2)～(3)；再用接触式超声波处理中间层混合物，所述超声破碎条件为90W、50s、36℃；

(5)经步骤(4)接触式超声处理后，加等体积生理盐水混匀，于4000rpm条件下离心3.5min；

(6)取步骤(5)离心沉淀，加入与中间混合物等体积的生理盐水重悬细胞，即得含有高度浓缩的基质血管片段细胞材料；

(7)弃去步骤(5)离心沉淀，收集上层浅黄色絮状物，即得富含细胞因子的细胞外基质材料。

实施例3

一种利用超声波高效制备脂肪源生物材料的方法，具体步骤如下：

(1)将脂肪组织于6000rpm条件下离心3min，离心后若分为三层，分别为顶层油脂、中间层混合物和底层肿胀液，则弃去底层肿胀液，过滤去除顶层油脂并取滤液；若不分层或分层不明显，则重复此步骤；

(2)将步骤(1)所得滤液进行非接触式超声破碎，所述超声破碎条件为1150W、5min、36.5℃；

(3)将经步骤(2)非接触式超声破碎后的脂肪混合物于5000rpm条件下离心4min；

(4)经步骤(3)离心后，若脂肪混合物分为三层，分别为顶层油脂、中间层混合物和底层肿胀液，且油脂层体积占脂肪混合物总体积60％以上，则弃去顶层油脂，取中间层混合物；若脂肪混合物不分层或分层不明显，则重复步骤(2)～(3)；再用接触式超声波处理中间层混合物，所述超声破碎条件为95W、40s、36.5℃；

(5)经步骤(4)接触式超声处理后，加等体积生理盐水混匀，于5000rpm条件下离心3min；

(6)取步骤(5)离心沉淀，加入与中间混合物等体积的生理盐水重悬细胞，即得含有高度浓缩的基质血管片段细胞材料；

(7)弃去步骤(5)离心沉淀，收集上层浅黄色絮状物，即得富含细胞因子的细胞外基质材料。

实施例4

一种利用超声波高效制备脂肪源生物材料的方法，具体步骤如下：

(1)将脂肪组织于4500rpm条件下离心5min，离心后若分为三层，分别为顶层油脂、中间层混合物和底层肿胀液，则弃去底层肿胀液，过滤去除顶层油脂并取滤液；若不分层或分层不明显，则重复此步骤；

(2)将步骤(1)所得滤液进行非接触式超声破碎，所述超声破碎条件为1120W、10min、37℃；

(3)将经步骤(2)非接触式超声破碎后的脂肪混合物于4000rpm条件下离心5min；

(4)经步骤(3)离心后，若脂肪混合物分为三层，分别为顶层油脂、中间层混合物和底层肿胀液，且油脂层体积占脂肪混合物总体积60％以上，则弃去顶层油脂，取中间层混合物；若脂肪混合物不分层或分层不明显，则重复步骤(2)～(3)；再用接触式超声波处理中间层混合物，所述超声破碎条件为75W、35s、37℃；

(5)经步骤(4)接触式超声处理后，加等体积生理盐水混匀，于3000rpm条件下离心3.5min；

(6)取步骤(5)离心沉淀，加入与中间混合物等体积的生理盐水重悬细胞，即得含有高度浓缩的基质血管片段细胞材料；

(7)弃去步骤(5)离心沉淀，收集上层浅黄色絮状物，即得富含细胞因子的细胞外基质材料。

实施例5

1、分别采用本发明实施例1～4所述方法和酶解法制备SVFs细胞材料，分别采用台盼蓝染色、流式细胞分析技术、LDH细胞活性检测方法测定活细胞含量，细胞碎片率和细胞活性，测定结果见表1(结果是3次实验的平均值)。

表1 SVFs细胞测定结果

由表1可知，经本发明方法制得的SVFs从存活细胞含量、细胞碎片率、细胞活力等方面检测与酶解法测定结果基本相同，但本发明方法中并没有引入外源性消化酶及外源性物质，不存在任何风险，且酶解法在国际上是不允许的，因此本发明方法具有更好的安全性和可靠性。

2、分别采用本发明实施例1～4所述方法、Flynn法制备ECM材料，其中层粘连蛋白、胶原蛋白IV、SDF-1、VEGF等细胞因子均采用ELISA检测。检测结果见表2(结果是3次实验的平均值)。

表2 ECM的成分测定

由表2可知，经本发明方法复合超声波处理得到的ECM富含多种细胞因子，这些细胞因子对创面修复和移植物存活有极大的辅助功能。而Flynn法则因多次反复酶解和萃取导致细胞因子基本丢失。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用超声波高效制备脂肪源生物材料的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.将脂肪组织于1000～12000rpm条件下离心1～8min，离心后若分为三层，分别为顶层油脂、中间层混合物和底层肿胀液，则弃去底层肿胀液，过滤去除顶层油脂并取滤液；若不分层或分层不明显，则重复此步骤；

S2.将S1所得滤液进行非接触式超声破碎，所述超声破碎条件为600～1190W、5～55min、20～38℃；

S3.将经S2非接触式超声破碎后的脂肪混合物于1000～10000rpm条件下离心3～10min；

S4.经S3离心后，若脂肪混合物分为三层，分别为顶层油脂、中间层混合物和底层肿胀液，且油脂层体积占脂肪混合物总体积60％以上，则弃去顶层油脂，取中间层混合物；若脂肪混合物不分层或分层不明显，则重复S2～S3；再用接触式超声波处理中间层混合物，所述超声破碎条件为15～325W、1～250s、15～38℃；

S5.经S4接触式超声处理后，加等体积生理盐水混匀，于3000～12000rpm条件下离心3～8min；

S6.取S5离心沉淀，加入与中间混合物等体积的生理盐水重悬细胞，即得含有高度浓缩的基质血管片段细胞材料；

S7.弃去S5离心沉淀，收集上层浅黄色絮状物，即得富含细胞因子的细胞外基质材料。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2中所述超声破碎条件为700～1190W、3～50min、22～37℃。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤S2中所述超声破碎条件为800～1180W、4～45min、25～37℃。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S4中所述超声破碎条件为15～200W、5～100s、20～36℃。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S4中所述超声破碎条件为15～180W、5～70s、20～35℃。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1中所述过滤为20～120目数筛网过滤。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1中所述离心条件为4000～6000rpm离心2～5min。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S3中所述离心条件为3000～5000rpm离心4～6min。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S5中所述离心条件为3000～5000rpm离心3～5min。

10.由权利要求1～9任一项所述方法制得的基质血管片段细胞材料和细胞外基质材料在制备皮肤移植材料、软组织填充材料、修复药物或皮肤抗皱产品中的应用。