CN105531366A - 用于分离基质血管组分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于从样品回收基质血管组分的方法。所述方法包括提供能够将所述样品破碎成单细胞悬液、同时维持完整的基质血管组分细胞的细胞结构的机械力，其中所述机械力是切碎和/或均质化。还公开了使用所述基质血管组分的方法。

Description

用于分离基质血管组分的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年7月10日提交的新加坡专利申请号2013053095的优先权的权益，该新加坡专利申请的内容出于所有目的在此以引用方式整体并入。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域。具体地说，本发明涉及用于细胞分离中的设备。

背景技术

干细胞是用于开发再生疗法的理想资源。通常，存在于人体中的干细胞数目有限，并且完全优化其纯化和使用效率的方案仍在开发之中。脂肪组织已经日益被视为是对再生医学潜在有益的干细胞的有前景的来源。除了成熟的脂肪细胞外，脂肪组织在基质血管组分(SVF)中还含有相对丰富的祖细胞和间充质干细胞(MSC)群体(参见图1)。据估计，多达1％的基质血管组分细胞是间充质干细胞，其在本公开中也被称为脂肪来源的干细胞(ASC)。这与在骨髓中仅占0.001-00.2％的间充质干细胞不同，骨髓被认为是成体干细胞的标准中心(Fraser等人，2006)。

考虑到新加坡和全世界肥胖症的上升，脂肪组织充当了可充足获取且相对容易获得的独特的干细胞储库。脂肪抽吸术(一种去除过多脂肪组织的操作)是在发达国家进行的最常见的整形外科手术之一。例如，已知2012年在美国有超过313,000例脂肪抽吸手术。另外，与需要以高密度(超过50,000个细胞/cm²)进行初始平板接种的骨髓来源的间充质干细胞不同，脂肪来源的干细胞可以低到3,000个细胞/cm²的密度接种，用于后续的培养生长(Sotiropoulou,P.A.等人，2006)。脂肪来源的干细胞和骨髓来源的间充质干细胞是增殖性的和多能的，具有分化成有限的细胞类型如脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞和肌细胞的能力。另外，脂肪来源的干细胞被显示分化成将可用于组织和细胞替代疗法的胰内分泌细胞、神经元、上皮和内皮(Cawthorn等人，2012；Gimble等人，2007以及Ong,W.K.和S.Sugii，2013)。由于脂肪来源的干细胞固有地分泌免疫调节因子、血管生成因子、抗细胞凋亡因子和造血因子，因此它们还可潜在地用于组织和创面修复。当前全世界使用基质血管组分细胞或脂肪来源的干细胞在各种各样的疾病领域中正在进行超过80个临床试验(Lim等人，2014)。

还证实脂肪来源的干细胞也可被理想地“再程序化”为诱导型多能干(iPS)细胞(Sugii,S.等人，2011；Sugii,S.等人，2010)。脂肪来源的干细胞的再程序化效率大大高于对于人成纤维细胞所报道的那些(高达100倍)并且可进行所述过程而无需动物饲养细胞(WO2011/032025A2)。通过建立生成来源于脂肪来源的干细胞的iPS细胞的无饲养细胞的、无异源物的方案，这开辟了脂肪组织的应用的甚至更宽的可能性，尤其是在iPS细胞如胚胎干细胞在理论上能够成为人或动物体的任何细胞类型时。

尽管脂肪来源的干细胞有用于细胞替代和再生疗法的潜力，但加工和开发脂肪组织来源的产品的技术仍处于早期阶段。典型的脂肪来源的干细胞分离方案涉及通过胶原酶消化分离的脂肪组织，之后离心以分开上浮的脂肪细胞和沉淀物组分中的含有脂肪来源的干细胞的基质血管组分(Lim等人，2014)。几家公司也已开发加工脂肪组织和分离基质血管组分的半自动化装置，所述装置涉及具有一次性用品的封闭系统，其将通过脂肪抽吸收获的脂肪组织消化成细胞，分离它们并将它们浓缩成用于立即递送到患者中的悬液(Lim等人，2014)。当前，本领域内已知的多数方法主要使用用于消化的胶原酶或其它解离酶。然而，使用诸如胶原酶的酶可能引起安全担忧，因为胶原酶通常是从革兰氏阳性细菌溶组织梭状芽胞杆菌(Clostridiumhistolyticum)产生的。使用酶还使得难以进行质量控制，因为它具有保存期限且其活性存在批次间的变异性。另外，胶原酶消化要求长的加工时间(约1小时)并且常常导致以细胞数目表示的产量的不一致性。考虑到使用了源于细菌的胶原酶，所述方法还需要进行充分洗涤，这导致分离或回收过程所涉及的总的时间和成本增加。另外，本领域内已知的方法还需要技术人员的大量手工处置，这增加了污染风险。

考虑到本领域内所遇到的问题，存在着对提供用于从样品回收基质血管组分的替代方法的需要。

发明内容

在一个方面，提供用于从样品回收基质血管组分的方法。在一个示例中，所述方法包括提供能够将样品破碎成单细胞悬液、同时维持完整的基质血管组分细胞的细胞结构的机械力，其中所述机械力是切碎和/或均质化。

在另一方面，提供治疗需要细胞疗法的受试者的方法。在一个示例中，该方面的治疗受试者的方法包括向有此需要的受试者施用由本公开的方法获得的基质血管组分的细胞。

在再一方面，提供治疗需要细胞疗法的受试者的方法。在一个示例中，该方面的治疗受试者的方法包括向需要细胞疗法的受试者施用由本公开的方法获得的脂肪来源的干细胞。

附图说明

当结合非限制实施例和附图考虑时，参考具体实施方式将更好地理解本发明，其中：

图1显示可在基质血管组分中发现的细胞类型的图解说明。图1提供可通过本公开的方法回收的细胞类型的示意图。

图2显示使用本领域内已知的典型酶促方法分离并且培养以富集脂肪来源的干细胞后的细胞生长和形态的显微镜图像。

图3显示如在培养的第4天通过本领域内已知的方法(即通过酶方法)获得的分离的细胞样品的显微镜图像(在培养的第4天；以100x放大率)。

图4显示在37℃孵育1小时、之后均质化65秒后的细胞样品的显微镜图像(在培养的第4天；以100x放大率)。图4显示使用本公开的一种方法回收的细胞的细胞形态的显微镜图像。

图5显示均质化65秒后的分离的细胞样品的显微镜图像(在培养的第4天；以100x放大率)。图5显示使用本公开的一种方法回收的细胞的细胞形态的显微镜图像。

图6显示切碎5分钟后的分离的细胞样品的显微镜图像(在培养的第4天；以100x放大率)。图6显示使用本公开的一种方法回收的细胞的细胞形态的显微镜图像。

图7显示在37℃预处理1小时、之后切碎5分钟后的分离的细胞样品的显微镜图像(在培养的第4天；以100x放大率)。图7显示使用本公开的一种方法回收的细胞的细胞形态的显微镜图像。

图8显示描绘在进行本公开的方法之一(即切碎)后获得的活细胞计数的数目的条形图。具体地说，条形图显示每5ml分离的脂肪组织的活细胞计数(在培养的第7天)。切碎组的测量结果是三个样品的平均值。代表至少10次独立实验的数据。使用本领域内已知的方法获得阳性对照，所述方法使用酶促消化；将阴性对照切碎10秒。

图9显示描绘在与脂解剂(异丙肾上腺素和异丁基甲基黄嘌呤-IBMX)组合进行本公开的方法之一后获得的活细胞计数的数目的条形图。具体地说，条形图显示每5ml分离的脂肪组织的活细胞计数(在培养的第7天)。试剂组的测量结果是两个样品的平均值。代表至少5次独立实验的数据。使用本领域内已知的方法获得阳性对照，所述方法使用酶促消化；将阴性对照切碎30秒。

图10显示描绘在进行本公开的方法之一(即切碎10秒，之后均质化65秒)后获得的活细胞计数的数目的条形图。均质化组的测量结果是三个样品的平均值。代表至少7次独立实验的数据。使用本领域内已知的方法获得阳性对照，所述方法使用酶促消化；将阴性对照切碎10秒。

附表简述

当结合非限制实施例和附表考虑时，参考具体实施方式将更好地理解本发明，其中：

表1显示使用本公开的方法回收的脂肪来源的干细胞的百分比产率。

表2显示使用本公开的方法回收的脂肪来源的干细胞的百分比产率，其中所述方法进一步包括使用如本文所述的非酶促试剂。

表3显示使用本公开的方法回收的脂肪来源的干细胞的百分比产率，其中所述方法进一步包括其它分离方法的组合。

具体实施方式

考虑到源于基质血管组分的脂肪来源的干细胞可在医学中提供的巨大可能性，需要具有用于回收基质血管组分的方法。因此，在一个方面，提供用于从样品回收基质血管组分的替代方法。如本文所用的，短语“基质血管组分”、“基质血管组分的细胞”或“基质血管组分细胞”是指源于脂肪组织的血管(或涉及携带血液的脉管)成分的细胞组分，其包含不同的细胞类型，包括但不限于脂肪来源的干细胞(例如间充质干细胞)、间充质细胞、造血细胞、造血干细胞/祖细胞、软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、内皮前体细胞或祖细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、周细胞、CD34+细胞(通常在脐带中发现)、CD29+细胞、CD166+细胞、Thy-1+或CD90+干细胞、CD44+细胞、免疫细胞如单核细胞、白细胞、淋巴细胞、B细胞和T细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突细胞、嗜中性白细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、粒细胞、红细胞、巨核细胞、血小板等，包括表达一种或多种以下标志物的免疫细胞和其它细胞：CD3、CD14(巨噬细胞标志物)、CD19、CD20(B细胞标志物)、CD29(整联蛋白单元)、CD31(内皮细胞、血小板、巨噬细胞、树突细胞、粒细胞、T/NK细胞、淋巴细胞、巨核细胞、破骨细胞、中性粒细胞等)、CD44(透明质酸受体)、CD45(B细胞和T细胞标志物)、CD56、CD73(淋巴细胞分化标志物)和CD105。此外，基质血管组分还可包括表达本公开中所公开的任一标志物或其任意组合的细胞。如本文和本领域内所用的，短语"前体细胞"、"祖细胞"和"干细胞"可互换使用，并且是指多能或谱系未定(lineage-uncommitted)的祖细胞，所述细胞潜在能够进行无限次数的有丝分裂以自我更新或以产生将分化成期望的细胞类型的后代细胞。与多能干细胞不同，谱系未定的祖细胞通常被认为不能产生大量表型上彼此不同的细胞类型。

如本文所用的，术语“回收”、“分离”或“收获”是指从组织的通常与组织的期望组分或成分缔合的周围基质提取所述组织的所述组分或成分的过程。在一个示例中，术语“回收”、“分离”或“收获”是指从脂肪组织提取基质血管组分的动作。在另一示例中，术语“回收”、“分离”或“收获”是指从如由本公开的方法获得的基质血管组分提取脂肪来源的干细胞的动作。

由于用于回收基质血管组分的已知方法通常涉及解离酶如胶原酶，因此本公开提供用于从样品回收基质血管组分的非酶促方法。也就是说，如本文所述的方法可不包括酶消化，这与本领域内已知的方法不同，本领域内已知的方法包括在进行回收基质血管组分的方法之前或当时将酶添加到样品中的步骤。换句话说，如本文所述的方法可不包括外源酶消化。如本文所用的，术语“酶”是指能够消化将细胞结合在一起以形成组织的细胞外基质的生物分子。在本公开中，所述酶可以是促进对细胞与细胞的接触的消化或解离的解离酶，如可促进组织消化成单细胞悬液的胶原酶、胰蛋白酶等。在本公开的方法中排除酶是为了确保回收基质血管组分和具有临床等级的最终脂肪来源的干细胞并且具有最低污染风险。如本文所用的，术语“消化(digestion)”、“消化(digesting)”或可在本领域内互换使用的任何其它语法排列是指分解将细胞结合在一起以形成组织的细胞外基质的过程。

本公开的方法包括提供能够将样品破碎成单细胞悬液、同时维持完整的基质血管组分细胞的细胞结构的机械力，其中所述机械力是切碎和/或均质化。因此，在一个示例中，所述方法提供不与酶消化组合的机械力。这减少了对重复洗涤样品或分离的基质血管组分的需要并且降低了污染风险。如本文所用的，“污染”是指存在不想要的材料，如可能对分离的细胞的健康和/或接受所述分离的细胞或组分的受试者的健康有害的外源酶、微生物如细菌或细菌片段。如本领域内已知的，本领域内优选最小操作的基于细胞和组织的产品，所述产品与涉及酶消化的方法不同，已知涉及酶消化的方法被美国食品和药物管理局(USFoodandDrugAdministration)强调认为是多于最小操作的并且可能造成公共安全担忧。本公开的机械力以足够的机械力或剪切力提供，其能够引起细胞与细胞的接触的解离，由此产生期望的单细胞悬液，同时维持完整的基质血管组分细胞的细胞结构。因此，虽然本发明中提供的机械力可使脂肪细胞破裂，但所述机械力不会引起基质血管组分的细胞爆裂或被破坏。本发明中提供的机械力将不会使基质血管组分的细胞变得不健康，由此使它们能够在本领域内已知的合适条件下培养时增殖。相比之下，已知本领域内已知的方法、特别是利用酶消化的那些改变了基质血管组分细胞的细胞行为和基因表达。因此，在一个示例中，机械力排除了可引起细胞损伤或细胞破裂的过大力，例如，标准均质器和/或大功率均质化。如本文所用的，短语“单细胞悬液”或等同表述是指在本公开中可通过任何可利用的机械手段、生物学手段或化学手段制备的、与彼此基本上或完全分离(即不聚集或形成团块)的流体和细胞或更通常多个细胞的混合物。

因此，本公开的方法不包括能够将样品破碎成单细胞悬液的内部机械力。如本文所用的，术语“内部”是指在样品内部或里面且与样品直接连接或接触。内部机械力的示例可包括将在样品内提供的珠粒或与样品混合的珠粒。如表3所说明的，相比于已知的回收基质血管组分的酶促方法，与本公开的方法组合使用玻璃珠粒在培养生长的第7天得到小于60％的脂肪来源的干细胞的产率。内部机械力的另一示例可包括探头式超声仪(probesonicator)，其中所述探头与样品直接(流体)接触。如表1中所说明的，相比于已知的回收基质血管组分的酶促方法，在本公开的方法中使用探头式超声仪负面地影响细胞健康和生长，并且在培养生长的第7天得到小于40％脂肪来源的干细胞的产率。因此，在一个示例中，本公开的方法可以不利用探头式超声仪进行。

不希望受限于理论，相信本公开的方法可用于从已知具有脂肪来源的干细胞的样品(例如但不限于脂肪组织)回收基质血管组分。如本文所用的，短语"脂肪组织"泛指任何脂肪组织。脂肪组织可包含成熟的脂肪细胞和其它异源的细胞群体，其在分离后被称为基质血管组分。在本公开中，脂肪组织可以是间充质或基质的棕色脂肪组织、白色脂肪组织。如本文所用的，“棕色脂肪组织”和“白色脂肪组织”是指可在哺乳动物中发现的脂肪组织类型。棕色脂肪组织通常在新生儿或冬眠型哺乳动物中会被丰富地发现并且含有多于白色脂肪组织的线粒体。在一个示例中，脂肪组织可以是皮下白色脂肪组织。脂肪组织可来自具有脂肪组织的任何生物体。在一个示例中，待用于本公开中的样品可从动物、哺乳动物、人获得，包括但不限于动物，如牛、猪、马、狗、猫、啮齿类动物(如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、绵羊、山羊、海豚等。在一个示例中，样品可从哺乳动物获得，其中哺乳动物可以是人。在一个示例中，样品可以源于脂肪抽吸外科手术或其它外科手术的脂肪吸出物或切除的脂肪的形式获得。

为了确保基质血管组分的最大产率和细胞活力，可进行对样品立即使用本公开的用于回收基质血管组分的方法。然而，如果可以不立即进行从样品立即回收基质血管组分，则可在约1小时到72小时内对样品进行本公开的方法。也就是说，本公开的方法可以在从受试者获得样品的约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时、49小时、50小时、51小时、52小时、53小时、54小时、55小时、56小时、57小时、58小时、59小时、60小时、61小时、62小时、63小时、64小时、65小时、66小时、67小时、68小时、69小时、70小时、71小时或72小时进行。当不立即加工样品时，可将样品储存在约4℃以减少内源酶消化或细胞死亡。

如本文所用的，术语“内源酶”是指固有地存在于样品中的酶，它与术语“外源酶”相反，如本文所用的，“外源酶”是指由进行本领域内已知的回收基质血管组分的方法的人添加到样品中的酶。因此，在一个示例中，本公开的回收基质血管组分的方法不包括外源酶，即添加的酶。

在一个示例中，在对样品进行本公开的方法之前，可将样品储存在生物学可接受的液体中，所述液体例如但不限于磷酸盐缓冲盐水、汉克斯氏平衡盐溶液(Hank’sbalancedsaltsolution)、生理盐水、肿胀液等。

在一个示例中，本公开的方法可在约0℃到约42℃的范围进行。因此，本公开的方法可在约0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃或42℃进行。在一个示例中，本公开的方法可在约25℃到约42℃下进行。在一个示例中，为了增加效率，本公开的方法可在37℃进行，37℃可使胶原结构松散并增强成熟脂肪细胞的脂解活性。

为了增加细胞分离效率，本公开的方法可利用能够增强脂肪细胞的脂解的试剂进行。在一个示例中，所述方法可进一步包括孵育样品与能够增强脂肪细胞的脂解的试剂的步骤。在一个示例中，孵育样品的步骤可在约25℃到约42℃的温度范围进行。也就是说，孵育样品的步骤可在约25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃或42℃进行。在一个示例中，孵育样品与试剂的步骤可进行约5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、21分钟、22分钟、23分钟、24分钟、25分钟、26分钟、27分钟、28分钟、29分钟、30分钟、31分钟、32分钟、33分钟、34分钟、35分钟、36分钟、37分钟、38分钟、39分钟、40分钟、41分钟、42分钟、43分钟、44分钟、45分钟、46分钟、47分钟、48分钟、49分钟、50分钟、51分钟、52分钟、53分钟、54分钟、55分钟、56分钟、57分钟、58分钟、59分钟或60分钟。在一个示例中，孵育样品与试剂的步骤可进行约5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、1.5小时或2小时。

这些能够增强脂肪细胞的脂解的非酶促试剂可包括但不限于肾上腺素、异丁基甲基黄嘌呤、异丙肾上腺素等。在一个示例中，这些试剂可与彼此组合使用。表2显示将这些试剂添加到本公开的方法中改善了脂肪来源的干细胞的最终产率。在一个示例中，肾上腺素可以约1mg/L到20mg/L肾上腺素的浓度提供。也就是说，肾上腺素可以约1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、11mg/L、12mg/L、13mg/L、14mg/L、15mg/L、16mg/L、17mg/L、18mg/L、19mg/L或20mg/L肾上腺素提供。在另一示例中，异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)可以约0.01mM到0.2mMIBMX的浓度提供。也就是说，IBMX可以约0.01mM、0.02mM、0.03mM、0.04mM、0.05mM、0.06mM、0.07mM、0.08mM、0.09mM、0.1mM、0.11mM、0.12mM、0.13mM、0.14mM、0.15mM、0.16mM、0.17mM、0.18mM、0.19mM或0.20mMIBMX提供。在另一示例中，异丙肾上腺素可以约0.01mM到0.20mM异丙肾上腺素的浓度提供。也就是说，异丙肾上腺素可以约0.01mM、0.02mM、0.03mM、0.04mM、0.05mM、0.06mM、0.07mM、0.08mM、0.09mM、0.1mM、0.11mM、0.12mM、0.13mM、0.14mM、0.15mM、0.16mM、0.17mM、0.18mM、0.19mM或0.20mM异丙肾上腺素提供。

在另一示例中，本公开的方法还可在包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)、汉克斯氏平衡盐溶液(HBSS)或红细胞溶解缓冲液的培养基中进行。

为了获得基质血管组分，本公开的方法可进一步包括从单细胞悬液分离基质血管组分的步骤。本公开的分离基质血管组分的步骤可通过密度梯度、流式细胞术、膜过滤、膜吸附或离心进行。当使用离心作为从单细胞悬液分离基质血管组分的步骤时，必须在最佳的离心力下进行，因为过度离心也可导致细胞损伤。在一个示例中，离心力可在约100g、约150g、约200g、约250g、约300g、约350g、约400g、约450g、约500g、约550g、约600g、约650g、约700g、约750g、约800g、约850g、约900g、约950g、约1000g、约1050g、约1100g、约1150g、约1200g、约1250g、约1300g、约1350g、约1400g、约1450g或约1500g下进行。离心力可在约100g、约150g、约200g、约250g、约300g、约350g、约400g、约450g、约500g、约550g、约600g、约650g、约700g、约750g、约800g、约850g、约900g、约950g、约1000g、约1050g、约1100g、约1150g、约1200g、约1250g、约1300g、约1350g、约1400g、约1450g到100g、约150g、约200g、约250g、约300g、约350g、约400g、约450g、约500g、约550g、约600g、约650g、约700g、约750g、约800g、约850g、约900g、约950g、约1000g、约1050g、约1100g、约1150g、约1200g、约1250g、约1300g、约1350g、约1400g、约1450g或约1500g的范围或其间的任何整数下进行。

在从样品回收基质血管组分时，本公开的方法可进一步包括从基质血管组分分离脂肪来源的干细胞的步骤。如本文所用的，术语"脂肪来源的干细胞(ADSC或ASC)"是指来自在脂肪组织中发现的血管成分的部分(即基质血管组分)的基质或间充质干细胞。在一个示例中，脂肪来源的干细胞可构成回收或分离的基质血管组分的约0.5％到约25％。因此，在一个示例中，脂肪来源的干细胞可构成回收或分离的基质血管组分的约0.5％、约1％、约1.5％、约2％、约2.5％、约3％、约3.5％、约4％、约4.5％、约5％、约5.5％、约6％、约7％、约7.5％、约8％、约8.5％、约9％、约9.5％、约10％、约10.5％、约11％、约11.5％、约12％、约12.5％、约13％、约13.5％、约14％、约14.5％、约15％、约15.5％、约16％、约17％、约17.5％、约18％、约18.5％、约19％、约19.5％、约20％、约20.5％、约21％、约21.5％、约22％、约22.5％、约23％、约23.5％、约24％、约24.5％、约25％或其间的任何量。在一个示例中，脂肪来源的干细胞可在本领域内已知的条件下分化成各种细胞类型。例如，如由本公开的方法获得的脂肪来源的干细胞可转分化成非中胚层细胞类型，例如但不限于神经元细胞、肝细胞和内皮细胞；如由本公开的方法获得的脂肪来源的干细胞可分化成中胚层谱系细胞类型，例如但不限于脂肪细胞、成纤维细胞、肌细胞、心肌细胞、成骨细胞和软骨细胞。本领域内将会理解，脂肪来源的干细胞的分化过程可根据本领域内已知的标准培养程序或其它方法进行。可使用本领域内已知的技术从基质血管组分分离脂肪来源的干细胞，例如，可使用已知将由脂肪来源的干细胞表达的细胞表面标志物从细胞混合物分离所述细胞。在一个示例中，术语“脂肪来源的干细胞”包括以下细胞：其在标准培养条件下展现如塑料附着的特性，表达CD105、CD73和CD90，但对于CD45、CD34、CD14、CD79和HLA-DR的表面表达为阴性，并且能够在体外分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞。

如本文所用的，术语"约"在关于回收的总基质血管组分的细胞的百分比的背景下，可意指所述值的+/-0.5％、所述值的+/-0.4％、所述值的+/-0.3％、所述值的+/-0.2％、所述值的+/-0.1％或所述值的+/-0.05％。

在一个示例中，脂肪来源的干细胞可在向有此需要的受试者施用之前被培养。在一个示例中，可在组织培养基中培养由本公开的方法分离或回收的细胞，所述组织培养基例如但不限于最低必需培养基(MEM)、达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’sModifiedEagleMedium)(DMEM)、罗斯韦尔公园纪念研究所(RoswellParkMemorialInstitute)(RPMI)-1640和DMEM:F12。应理解，培养基的选择将有利地导致被培养的脂肪来源的干细胞中的基因的差异表达。

在另一示例中，可在培养基中培养基质血管组分细胞和/或从基质血管组分分离的脂肪来源的干细胞，所述培养基具有人血清如同种异体AB血清(从AB血型供体获得的血清/不含有抗A型抗体或抗B型抗体的血清)、凝血酶激活的富含血小板的血浆和人血小板溶解产物。在另一示例中，可在无血清培养基中培养基质血管组分细胞和/或脂肪来源的干细胞。将血清添加到含有如通过本公开的方法分离的细胞的组织培养基中将有利地使总细胞产率得以改善。

如本文关于脂肪来源的干细胞或基质血管组分所用的术语"分离的"或"回收的"是指从其中细胞通常被实际上缔合的组分分离的细胞。因此，在一个示例中，本公开还提供分离的脂肪来源的干细胞和/或分离的基质血管组分。

考虑到脂肪来源的干细胞的有用性，脂肪来源的干细胞可用于治疗需要细胞疗法的受试者的各种方法中。因此，在另一方面，提供治疗需要细胞疗法的受试者的方法，其中所述方法包括向有此需要的所述受试者施用由本公开的方法获得的基质组分的细胞。在一个示例中，受试者或患者(所述术语可互换使用)可以是动物、哺乳动物、人，包括但不限于动物如牛、猪、马、狗、猫、啮齿类动物(如兔、小鼠、大鼠或豚鼠)、海豚、绵羊、山羊等。在一个示例中，患者可以是人。在一个示例中，提供由本公开的方法获得的基质组分的细胞在用于治疗需要细胞疗法的受试者的药剂的制造中的用途。

在另一方面，提供治疗需要细胞疗法的受试者的方法，其中所述方法包括向需要细胞疗法的受试者施用由本公开的方法获得的脂肪来源的干细胞。在一个示例中，受试者或患者(所述术语可互换使用)可以是动物、哺乳动物、人，包括但不限于动物如牛、猪、马、狗、猫、啮齿类动物(如兔、小鼠、大鼠或豚鼠)、海豚、绵羊、山羊等。在一个示例中，患者可以是人。在一个示例中，提供由本公开的方法获得的脂肪来源的干细胞在用于治疗需要细胞疗法的受试者的药剂的制造中的用途。

在一个示例中，细胞疗法可用在受试者中用于如Lim,M.H.等人，2014中所述的许多临床应用，该参考文献的内容以引用方式并入本文中。例如，使用由本公开的方法获得的基质血管组分的细胞和/或脂肪来源的干细胞的细胞疗法可用于可能需要以下中的任何一种的受试者：组织移植物、骨和软骨修复、从缺血性疾病修复、从周围性血管疾病修复、软组织填充和重建外科手术、伤口愈合、从免疫性疾病修复或免疫性疾病的治疗、从糖尿病修复或糖尿病的治疗等。例如，造血干细胞或祖细胞可用于治疗血液疾病，并且内皮细胞可在组织移植中用于功能组织的血管化和形成。如本文所用的，术语“移植物”是指通常为了置换、矫正或以其它方式克服缺陷而被植入到个体中的细胞、组织或器官。移植物可进一步包括支架。组织或器官可由来源于同一个体的细胞组成；该移植物在本文中由以下可互换的术语指代："自体移植物(autograft)"、"自体移植体(autologoustransplant)"、"自体植入物"和"自体移植物(autologousgraft)"。包含来自同一物种的遗传上不同的个体的细胞的移植物在本文中由以下可互换的术语指代："同种移植物(allograft)"、"同种异体移植体(allogeneictransplant)"、"同种异体植入物"和"同种异体移植物(allogeneicgraft)"。“同种异体”泛指源于同一物种的不同哺乳动物(例如并非所述移植物的受体的另一人)的任何材料。来自其同卵双胎的个体的移植物在本文中被称为"同系移植物(isograft)"、"同基因移植体(syngeneictransplant)"、"同基因植入物"或"同基因移植物(syngeneicgraft)"。"异种移植物(xenograft)"、"异种移植体(xenogeneictransplant)"或"异种植入物"是指从一个个体到不同物种的另一个体的移植物。

在另一方面，提供从样品回收基质血管组分的方法，其包括使所述样品经受切碎。如本文所用的，术语“切碎”、“切割”或指代同一动作的任何其它同义词是指将样品切成非常小的块的动作。过程“切碎”或“切割”可由进行所述方法的技术人员手动进行或通过用于切碎和/或切割的装置或设备操作。在一个示例中，切碎或切割过程可被施加约10秒到20分钟。也就是说，切碎过程可被施加约10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、55秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟或其间的任何整数。

在另一方面，提供从样品回收基质血管组分的方法，其包括使所述样品经受均质化。在一个示例中，均质器可以是低功率均质器，如Labquip(IKAT18BasicUltra-Turrax)等。在一个示例中，均质器可提供约1,000rpm到约10,000rpm的圆周速度。因此，在一个示例中，均质器可以约1000rpm、约1050rpm、约2000rpm、约2500rpm、约3000rpm、约3500rpm、约4000rpm、约4500rpm、约5000rpm、约5500rpm、约6000rpm、约6500rpm、约7000rpm、约7500rpm、约8000rpm、约8500rpm、约9000rpm、约9500rpm、约10,000rpm或其间的任何整数实施。在一个示例中，均质化容器中的均质化过程或停留时间可在约5秒到20分钟的范围。也就是说，均质化过程可被施加约5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、55秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟或其间的任何整数。在一个示例中，本方面的用于回收基质血管组分的方法可进一步包括分离基质血管组分的步骤，所述步骤可通过密度梯度、流式细胞术、膜过滤/吸附或离心进行。在另一示例中，本方面的方法可进一步包括将基质血管组分再悬浮于如本文所述的合适的培养基或缓冲液中。

在一个示例中，本方面的方法可进一步包括在使所述样品经受均质化之前将所述样品切碎的步骤。在一个示例中，切碎或切割过程可进行约1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟或其间的任何整数。

在另一方面，提供冷冻保存基质血管组分和/或脂肪来源的干细胞的方法。所述方法可包括从样品回收基质血管组分和/或脂肪来源的干细胞，用缓冲液和/或培养基洗涤分离的基质血管组分的细胞和/或脂肪来源的干细胞，冷冻处于合适的培养基中的所述分离的基质血管组分的细胞和/或脂肪来源的干细胞。在一个示例中，用于冷冻保存基质血管组分和/或脂肪来源的干细胞的合适培养基可包括含有10％血清(如胎牛血清或人AB血清)和10％DMSO(二甲亚砜)的生长培养基。

本文所说明性地描述的本发明可在不存在本文未具体公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制的情况下被合适地实施。因此，例如，术语"包含"、"包括"、"含有"等应当被宽泛地解读并且没有限制。另外，本文所采用的术语和表述作为描述而非限制的术语被使用，并且使用这些术语和表述并不意在排除所显示和描述的特征或其部分的任何等同物，而应认识到可在所要求保护的本发明范围内作出各种修改。因此，应当理解，虽然已经通过优选实施方案和任选特征具体地公开了本发明，但可由本领域技术人员实现本文所公开的优选实施方案和任选特征中所体现的本发明的修改和变更，并且认为此类修改和变更在本发明范围内。

本文已对本发明进行了宽泛的和一般性的描述。落入该一般公开范围内的每个较窄的种类和亚属分组也构成本发明的一部分。这包括带有将任何主题从大类中去除的附带条件或负面限制的对本发明的一般性描述，而不管被除去的内容是否在本文中具体述及。

其它实施方案在以下权利要求书和非限制性实施例的范围内。另外，在用马库什组(Markushgroup)描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员将认识到，由此也是以马库什组的任何单个成员或成员亚组来描述本发明。

实验部分

实施例1-收获后样品的准备

方法

在进行如本文所述的任何方法之前获得作为脂肪吸出物获得的脂肪组织或通过外科手术切除的脂肪组织。为了确保最佳的细胞活力，建议在获得样品当天立即分离基质血管组分。然而，最佳地可在获得样品的24小时内进行如本文所述的方法。如果本公开的方法不能在收获样品时或在获得样品的72小时内立即进行，则将样品在4℃储存。在酶促消化的情况下，在进行到分离程序之前，使样品达到室温。

在获得作为脂肪吸出物的样品时，为了去除碎片，用等量的缓冲液(如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或汉克斯氏平衡盐溶液(HBSS))洗涤脂肪组织。例如，对于50cc或50克容量的脂肪吸出物来说，使用50ml缓冲液。使洗涤过的样品沉降几分钟并且吸出底部的流体而留下顶部的脂肪层。将洗涤步骤重复两次。将收集的脂肪层分到如下文所述的不同方法中。

材料

为了增加细胞分离的效率，将如本文所述的任一方法与其它变量组合，所述其它变量如室温(25℃)到42℃范围内的改变的操作温度、添加化学品以增强成熟脂肪细胞的脂解(例如5mg/L肾上腺素、0.05mM异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)或0.05mM异丙肾上腺素)和在机械处理期间使用不同的缓冲液(例如红细胞溶解缓冲液，代替HBSS)。

实施例2–传统的酶促方法

已知的用于回收基质血管组分的酶促方法先前已被描述(WO2011/032025；Sugii等人，2010和Sugii等人，2011)。简单地说，已知/传统的酶促方法包括以下步骤：

i)将等体积的胶原酶溶液(ml/克或cc脂肪垫)添加到一个无菌小瓶中并且升温到37℃。通常，胶原酶溶液由缓冲液中的2.5μg/mlI型胶原酶、1％(wt/vol)牛血清白蛋白(BSA)、50μg/mlD-葡萄糖和200nM腺苷构成；

ii)将洗涤过的脂肪组织置于胶原酶溶液中；

iii)用经灭菌的剪刀将所述组织细细切碎；

iv)将小瓶在37℃水浴振荡器中振荡(约100rpm)30–60min。每10min检查消化物，并且当反应完成时，终止反应；

v)通过250μm尼龙过滤器转移和过滤消化的溶液。然后通过100μm细胞筛网过滤并且取决于体积将滤液转移到15ml和50ml离心管中。在室温下以400g离心5min；

vi)小心地吸出含有成熟脂肪细胞和水性上清液的上浮层，留下沉淀物。该沉淀物是基质血管组分；

vii)用10ml用于洗涤的缓冲液将所述沉淀物再悬浮。再次以400g离心5min；

viii)将步骤vii)重复三次；

ix)如果所述沉淀物呈现红色，则通过添加10ml红细胞溶解缓冲液(154mMNH₄Cl和20mMTris,pH7.4)将红细胞破裂。上下吸移以将所述沉淀物再悬浮。溶液应当变为红色。在室温下静置5min并且以400g离心5min。吸出上清液；

x)对于培养来说，将所述沉淀物再悬浮于10ml培养基(例如达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM；Lifetechnology,USA)、15％热灭活的胎牛血清(FBS；Lifetechnology,USA)、1xGlutaMAX^TM(Lifetechnology,USA)、1x非必需氨基酸(NEAA；Lifetechnology,USA)、5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(FGF；Lifetechnology,USA)、青霉素/链霉素[100U/ml/100μg/ml；Lifetechnology,USA]或市售的无血清的、无异源物的培养基)中。

xi)平板接种到适当的器皿中并且将培养皿在37℃、5％CO₂孵育箱中孵育。第二天用缓冲液洗涤三次，并且用新鲜培养基更换。在显微镜下观察以检查生长和形态(典型的显微照片图2和3)；

xii)对于立即储存来说，用血细胞计数器或自动化的细胞计数器对细胞数目计数。以每毫升1x10⁶个活细胞将所述沉淀物再悬浮于冷冻培养基(具有15％FBS和10％二甲亚砜(DMSO)的DMEM或市售的无血清的、无异源物的储存溶液)中。每个小瓶储存1x10⁶个细胞。

实施例3–超声处理方法(水浴超声波仪)

当使用超声处理方法、特别是水浴超声波仪时，本公开的方法的步骤的详细实施例如下：

i)将洗涤过的脂肪组织置于适当大小的管中；

ii)将冷却的水填充到所示水平以避免水浴超声波仪的过热；

iii)以最低水平的设置(例如，40kHz，使用Branson’s3510型)将脂肪组织样品超声处理5-10min。对于本领域技术人员将显而易见的是，不同的超声波仪将得到非常不同的结果。因此，将需要进行超声处理时间和强度的优化；

iv)将样品以400g离心5min以使解离的基质血管组分细胞沉淀。将上清液转移到新管中，并且如果需要的话，将其用于下面的步骤vi)；

v)将沉淀物再悬浮于缓冲液(PBS或HBSS；1ml/100cc原始组织)中。用血细胞计数器或自动化的细胞计数器对细胞数目计数；

vi)如果细胞数目远小于每100cc原始组织1x10⁶个细胞，则重复步骤iii)到v)。如果细胞数目回收率仍然较低，则将强度增加到下一水平(如果可用的话)，或重复步骤iii)到v)。利用该方法，实现了相比于实施例1中基于酶的方法高达30％的细胞产率；

vii)对于培养来说，将10ml培养基(例如DMEM、15％热灭活的FBS、1xGlutaMAX^TM、1xNEAA、5ng/ml碱性FGF、青霉素/链霉素[100U/ml/100μg/ml]或市售的无血清的、无异源物的培养基)添加到所述细胞中；

viii)平板接种到适当的器皿中并且将培养皿在37℃、5％CO₂孵育箱中孵育。第二天用缓冲液洗涤三次，并且用新鲜培养基更换。在显微镜下观察以检查生长；

ix)对于立即储存来说，以每毫升1x10⁶个活细胞将所述沉淀物再悬浮于冷冻培养基(具有15％FBS和10％DMSO的DMEM或市售的无血清的、无异源物的储存溶液)中。每个小瓶储存1x10⁶个细胞。

实施例4–超声处理方法(探头式超声波仪)

当使用超声处理方法、特别是探头式超声波仪时，本公开的方法的步骤的详细实施例如下：

i)将洗涤过的脂肪组织置于适当大小的管中；

ii)对超声波仪或均质器的探头灭菌；

iii)对于初始实验来说，将脂肪组织样品以最低水平设置超声处理1min，每次处理包括0.5秒冲击(stroke)以及之后的0.5秒间隔。应当测试各种参数的组合；1.5到3MHz的能量范围，5到30次冲击，0.5到1.5秒脉冲。对于本领域技术人员将显而易见的是，不同的超声波仪将得到非常不同的结果。因此，将需要进行超声处理时间和强度的优化；

iv)将样品以400g离心5min以使解离的基质血管组分细胞沉淀。将上清液转移到新管中，并且如果需要的话，将其用于下面的步骤vi)。

v)将沉淀物再悬浮于缓冲液(PBS或HBSS；1ml/100cc原始组织)中。用血细胞计数器或自动化的细胞计数器对细胞数目计数；

vi)如果细胞数目小于每100cc原始组织1x10⁶个细胞，则重复步骤iii)到v)。如果回收的细胞仍然较少，则调节如步骤iii)中所述的水平和时长。利用该方法，实现了相比于实施例1中的基于酶的方法高达40％的细胞产率；

vii)对于培养来说，将10ml培养基(例如DMEM、15％FBS、1xGlutaMAX^TM、1xNEAA、5ng/ml碱性FGF、青霉素/链霉素[100U/ml/100μg/ml]或市售的无血清的、无异源物的培养基)添加到所述细胞中；

viii)平板接种到适当的器皿中并且将培养皿在37℃、5％CO₂孵育箱中孵育。第二天用缓冲液洗涤三次，并且用新鲜培养基更换。在显微镜下观察以检查生长；

ix)对于立即储存来说，以每毫升1x10⁶个活细胞将所述沉淀物再悬浮于冷冻培养基(具有15％FBS和10％DMSO的DMEM或市售的无血清的、无异源物的储存溶液)中。每个小瓶储存1x10⁶个细胞。

实施例5–其它机械方法

当使用其它机械方法如剪刀和均质器时，本公开的方法的步骤的详细实施例如下：

i)将洗涤过的脂肪组织置于适当的管中；添加等体积的HBSS溶液。通常对于重复处理/平板接种的每个变量使用10ml脂肪。切除的脂肪有利于细胞产率的一致性，但手工收获的脂肪吸出物是可接受的，虽然建议下述额外的优化工作；

ii)对机械部件(例如剪刀、均质器探头)灭菌；

iii)将一对灭菌的均质器或剪刀安装到容纳脂肪组织的容器上。将每个50ml管的脂肪小心地置于平台上的支架中并且调节管的高度，使得均质器或剪刀接近接触管的底部。接通并调节旋转速度并且启动计时器以开始均质化或切割；

iv)切碎所述组织直到细碎；通常处理5-12分钟，取决于收获的脂肪组织的柔软度。当使用均质器时，以最低水平设置将脂肪组织样品温和地均质化1min。对于本领域技术人员将显而易见的是，不同的均质器将得到非常不同的结果。市面上许多标准的均质器利用了过强且常常不适于本方法的功率水平。必须进行针对不同类型的脂肪组织的优化以获得优化的参数和均质化时间的时长；

v)当均质化或切碎完成时，断开旋转电动机并且小心地移出离心管；

vi)将样品以450g(约1800RPM)离心5min以使解离的基质血管组分细胞沉淀。如果存在大的脂肪块，则将离心增加到1200g(约2950RPM)。丢弃顶层的漂浮的成熟脂肪细胞；

vii)通过100μm细胞筛网转移残留溶液。用4mlHBSS将红色沉淀物再悬浮并且将它倾倒通过所述筛网。用HBSS冲洗细胞筛网；

viii)在室温下以400g离心5分钟；

ix)吸出含有成熟脂肪细胞和水性上清液的上浮层，留下沉淀物。该沉淀物是基质血管组分；

x)将沉淀物再悬浮于2mlACK溶解缓冲液中。在室温下孵育5分钟；

xi)在室温下以450g离心5分钟；

xii)将沉淀物再悬浮于缓冲液(PBS或HBSS；1ml/100cc原始组织)中。取样10μl并且通过血细胞计数器或自动化的细胞计数器对锥虫蓝的1:1混合物中的细胞数目计数。利用这些方法，我们已经实现了相比于A)中基于酶的方法超过70％的细胞回收率。

xiii)如果细胞数目小于每100cc原始组织1x10⁷个细胞，则重复步骤iv)到xii)。如果回收的细胞数目仍然较少，则调节如步骤iv)中所述的水平和时长。

xiv)对于培养来说，将每1x10⁶个细胞10ml培养基(例如DMEM、15％热灭活的FBS、1xGlutaMAX^TM、1xNEAA、5ng/ml碱性FGF、青霉素/链霉素[100U/ml/100μg/ml]或市售的无血清的、无异源物的培养基)添加到所述细胞中；

xv)平板接种到适当的器皿中并且将培养皿在37℃、5％CO₂孵育箱中孵育。第二天用缓冲液洗涤三次，并且用新鲜培养基更换。在显微镜下观察以检查生长；

xvi)对于立即储存来说，以每毫升1x10⁶个活细胞将所述沉淀物再悬浮于冷冻培养基(具有15％FBS和10％DMSO的DMEM或市售的无血清的、异源物的储存溶液)中。每个小瓶储存1x10⁶个细胞。

实施例6–对分离的细胞的分析

分析上述方法中的分离的基质血管组分细胞中脂肪来源的干细胞的质量和产率。所述分析包括利用血细胞计数器进行的细胞计数和活力分析、培养以富集脂肪来源的干细胞、有限稀释和集落形成测定、细胞表面标志物和多能分化测定。根据公布的方案进行这些程序(Sugii,S.等人，2011；Katz,A.J.等人，2005；Ong,W.K.等人，2014；Yang,Z等人，2011；和Zuk,P.A.等人，2001)。在上述培养基中的生长培养基中培养新分离的基质血管组分细胞。分化测定包括脂肪生成、软骨发生和骨生成。例如，通过在生成脂肪的诱导培养基(生长培养基+1.5μg/ml胰岛素+1.0μM地塞米松(dexamethasone)+0.5mM异丁基甲基黄嘌呤+0.2mM吲哚美辛(indomethacin))中培养，之后在生成脂肪的维持培养基(生长培养基+1.5μg/ml胰岛素)中培养，诱导细胞。利用购自GIBCO/LifeTech的StemPro试剂盒进行骨生成和软骨发生。通过用油红O染色来评估脂肪生成程度。成功的基质血管组分分离将生成每1cc或1克组织至少1x10⁵个健康的脂肪来源的干细胞群体，所述干细胞群体具有集落形成能力，>95％表达细胞表面标志物CD73、CD90和CD105并且能够分化成脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞。

实施例7-根据本公开的方法分离的结果

表1显示使用本公开的方法回收的脂肪来源的干细胞的百分比产率。

*所示的产率是与基于胶原酶的方法相比在7天生长后观察到的ASC的百分比。经胶原酶处理的脂肪将通常显示接近100％的产率。

表2显示使用本公开的方法回收的脂肪来源的干细胞的百分比产率，其中所述方法进一步包括使用如本文所述的非酶促试剂。

表3显示使用本公开的方法回收的脂肪来源的干细胞的百分比产率，其中所述方法进一步包括其它分离方法的组合。

参考文献

Sugii,S.等人，Feeder-dependentandfeeder-independentiPScellderivationfromhumanandmouseadiposestemcells.NatProtoc,2011.6(3):第346-58页.

Sugii,S.等人，Humanandmouseadipose-derivedcellssupportfeeder-independentinductionofpluripotentstemcells.ProcNatlAcadSciUSA,2010.107(8):第3558-63页.

Katz,A.J.等人，Cellsurfaceandtranscriptionalcharacterizationofhumanadipose-derivedadherentstromal(hADAS)cells.Stemcells,2005.23(3):第412-23页.

Ong,W.K.等人，Identificationofspecificcell-surfacemarkersofadipose-derivedstemcellsfromsubcutaneousandvisceralfatdepots.StemCellReports,2014.2(2):第171-9页.

Yang,Z.,J.F.Schmitt和E.H.Lee,Immunohistochemicalanalysisofhumanmesenchymalstemcellsdifferentiatingintochondrogenic,osteogenic,andadipogeniclineages.Methodsinmolecularbiology,2011.698:第353-66页.

Zuk,P.A.等人，Multilineagecellsfromhumanadiposetissue:implicationsforcell-basedtherapies.TissueEng,2001.7(2):第211-28页.

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Cawthorn,W.P.,E.L.Scheller和O.A.MacDougald,Adiposetissuestemcells:thegreatWAThope.TrendsEndocrinolMetab,2012.23(6):第270-7页.

Gimble,J.M.,A.J.Katz和B.A.Bunnell,Adipose-derivedstemcellsforregenerativemedicine.CircRes,2007.100(9):第1249-60页.

Ong,W.K.和S.Sugii,Adipose-derivedstemcells:Fattypotentialsfortherapy.Theinternationaljournalofbiochemistry&cellbiology,2013.45(6):第1083-1086页.

Lim,M.H.,W.K.Ong和S.Sugii,Thecurrentlandscapeofadipose-derivedstemcellsinclinicalapplications.Expertreviewsinmolecularmedicine,2014.16:第e8页.

Claims (19)

1.一种用于从样品回收基质血管组分的方法，所述方法包括提供能够将所述样品破碎成单细胞悬液、同时维持完整的基质血管组分细胞的细胞结构的机械力，其中所述机械力是切碎和/或均质化。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法是非酶促消化。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是脂肪组织。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括从所述单细胞悬液分离所述基质血管组分的步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其中通过密度梯度、流式细胞术、膜过滤、膜吸附或离心进行分离所述基质血管组分的所述步骤。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述基质血管组分包括以下细胞中的任何一种：脂肪来源的干细胞、间充质细胞、造血细胞、造血干细胞/祖细胞、软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、内皮前体细胞或祖细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、周细胞、CD34+细胞、CD29+细胞、CD166+细胞、Thy-1+或CD90+干细胞、CD44+细胞和选自由以下组成的组的免疫细胞：单核细胞、白细胞、淋巴细胞、B细胞和T细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突细胞、嗜中性白细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、粒细胞、红细胞、巨核细胞、血小板。

7.根据权利要求1所述的方法，其中从哺乳动物获得所述样品。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

9.根据权利要求1所述的方法，其中在收获所述样品的72小时内进行所述方法。

10.根据权利要求1所述的方法，其中在约0℃到约42℃进行所述方法。

11.根据权利要求1所述的方法，其中利用能够增强脂肪细胞的脂解的试剂进行所述方法。

12.根据权利要求11所述的方法，其中能够增强脂肪细胞的脂解的所述试剂是以下试剂中的任何一种：肾上腺素、异丁基甲基黄嘌呤和异丙肾上腺素。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中以约1000rpm到约10,000rpm实施所述均质化。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述机械力被施加约5秒到20分钟。

15.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括由根据权利要求1所述的方法获得的所述基质血管组分分离脂肪来源的干细胞的步骤。

16.一种治疗需要细胞疗法的受试者的方法，所述方法包括向有此需要的所述受试者施用由根据权利要求1所述的方法获得的所述基质血管组分或其部分。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞疗法将被用于需要以下中的任何一种的受试者：组织移植物、骨和软骨修复、从缺血性疾病修复、从周围性血管疾病修复、软组织填充和重建外科手术、伤口愈合、从免疫和炎性疾病修复或免疫和炎性疾病的治疗、从糖尿病修复或糖尿病的治疗。

18.一种治疗需要细胞疗法的受试者的方法，所述方法包括向有此需要的所述受试者施用由根据权利要求15所述的方法获得的脂肪来源的干细胞。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述细胞疗法将被用于需要以下中的任何一种的受试者：组织移植物、骨和软骨修复、从缺血性疾病修复、从周围性血管疾病修复、软组织填充和重建外科手术、伤口愈合、从免疫和炎性疾病修复或免疫和炎性疾病的治疗、从糖尿病修复或糖尿病的治疗。