KR102224319B1

KR102224319B1 - 골수 세포로부터 중간엽 줄기세포의 고순도 정제를 위한 조성물, 키트 및 방법

Info

Publication number: KR102224319B1
Application number: KR1020190132553A
Authority: KR
Inventors: 고정태; 송주한; 오신혜; 이미남; 김정우
Original assignee: 전남대학교 산학협력단
Priority date: 2019-10-23
Filing date: 2019-10-23
Publication date: 2021-03-08

Abstract

본 발명은 클로드로네이트 함유 리포좀을 이용한 생쥐 골수 유래 중간엽 줄기세포의 고순도 정제에 관한 것으로, 구체적으로는 클로드로네이트 함유 리포좀을 포함하는 골수 세포로부터 중간엽 줄기세포의 정제용 조성물 및 키트, 정제 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 생쥐 골수 유래 중간엽 줄기세포의 분리 배양 과정에서 발생하는 대식세포와 같은 이종의 세포들을 효과적으로 제거함으로써 성공적으로 고순도의 중간엽 줄기세포를 정제 배양할 수 있으며, 종래의 배양 기법과 비교하여 배양에 소요되는 시간과 인력, 장비 및 비용을 절감할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

골수 세포로부터 중간엽 줄기세포의 고순도 정제를 위한 조성물, 키트 및 방법{Composition, Kit and Method for Highly Purifying Mesenchymal Stem Cell from Bone Marrow Cell}

본 발명은 클로드로네이트 함유 리포좀을 이용한 생쥐 골수 유래 중간엽 줄기세포의 고순도 정제에 관한 것으로, 구체적으로는 클로드로네이트 함유 리포좀을 포함하는 골수 세포로부터 중간엽 줄기세포의 정제용 조성물 및 키트, 정제 방법에 관한 것이다.

중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, 이하 MSCs라 함)는 무한한 자가재생을 통해 미분화 상태를 유지하며 특정 조건하에서 조골세포(osteoblast), 연골세포(chondrocyte), 지방세포 및 신경세포 등 다양한 유형의 세포로 분화할 수 있는 다능성 줄기세포(pluripotent stem cell)를 말한다 (Arthritis Res Ther. 2007, 9:204). MSCs는 상기의 특성에 더해 접근성이 좋고 면역 억제능력이 탁월하기 때문에 손상된 조직재생을 위한 세포기반 치료기술 개발 분야에서 이의 가치와 기대가 증대되고 있다 (Biomol Ther (Seoul). 2019, 27:25-33). MSCs는 인간에서 생쥐(mouse), 쥐(rat), 돼지, 토끼, 개 등에 이르기까지 다양한 종들의 혈액, 골수, 제대혈, 지방조직 등에서 분리되어 그 특성이 파악되고 있다. MSCs는 세포치료에 있어 광범위한 활용 가능성을 보이고 있으나, 연구 목적의 인간 유래 MSCs 사용에는 접근성 측면이나 윤리적 측면에서 엄연한 한계가 존재한다. 이를 보완하기 위해 생쥐로부터 분리한 MSCs를 in vitro 및 전임상 연구에 활발하게 활용하고 있다. 생쥐는 저렴하고 관리 및 조작이 용이하며 특히 인간과 아주 높은 상동성을 갖고 있기 때문에 생명과학 및 의과학 분야에서 가장 보편적으로 사용되는 실험동물이다. MSCs를 확보함에 있어 생쥐의 골수(bone marrow)는 널리 사용되는 조직이지만 MSCs의 비율이 낮기 때문에 다른 종보다 배양하기 까다롭다고 알려져 있다 (J Cell Biochem. 1999, 72:570-85).

플라스틱 배양용기에 부착하는 물리적 특성을 이용한 MSCs 배양방법이 1970년에 처음 수립된 이래로 현재까지 이는 가장 보편적인 방법으로 이용되고 있다 (Cell Tissue Kinet. 1970, 3:393-403). 그러나 생쥐 MSCs의 경우, 상기 방법에 기초한 분리 및 배양방법은 필연적으로 조혈계통 세포(hematopoietic lineage cell)의 오염을 동반한다. 이러한 문제를 극복하기 위해 잦은 배지교환법과 저밀도/고밀도 배양법 등이 고안되었으나 다소의 단점을 갖고 있다 (Int J Dev Biol. 2007, 51:723-9; Nat Protoc. 2009, 4:102-6; Dev Growth Differ. 2006, 48:361-70). 잦은 배지교환법은 초기 배양과정에서 수 시간 단위로 배지를 교체해야 하기 때문에 불편하고, 저밀도/고밀도 배양법은 조혈계통 세포의 오염으로부터 자유롭지 못하다. 또한, 이 두 방법을 포함하여 플라스틱 부착성에 기초한 분리 및 배양방법은 기본적으로 최소 3번 이상의 계대배양을 통해 MSCs 순도를 올려야 하기 때문에 상당한 시간이 요구된다 (J Orthop Translat. 2014, 3:26-33). 이러한 근원적 문제를 해결하기 위해 세포 표면에 발현하는 특이 마커를 이용하거나 저산소 환경에서 배양하는 등 고유의 정제방법이 개발되었으나 (J Biomed Biotechnol. 2010, 2010:105940; Nat Protoc. 2012, 7:2103-11; Sci Rep. 2017, 7:13334), 이러한 방법들은 조혈계통 세포의 오염의 재발 또는 MSCs 수율의 한계에서 오는 여러 마리 생쥐의 희생이 요구되기 때문에 동물 윤리적으로 문제가 발생할 수 있다. 또한 이러한 선별방법에는 고가의 장비와 숙련된 연구자가 필요하기 때문에 개별 연구실 차원에서 널리 활용하기에는 한계가 따르며 접근성과 재현성을 보장하는 표준화된 프로토콜의 정립이 어렵다.

클로드로네이트가 함유된 리포좀 (liposomal clodronate)은 1984년에 van Rooijen과 van Nieuwmegen에 의해 개발되어 (Cell Tissue Res. 1984, 238:355-8) 현재는 Encapsula NanoSciences사와 FormuMax Scientific사 등에서 상업적으로 판매되고 있다. 클로드로네이트 함유 리포좀을 동물의 생체내로 주입할 경우, 이 리포좀을 외부항원으로 인식하는 대식세포(macrophage)에 의해 주로 포식되며 이 리포좀을 포식한 세포들은 클로드로네이트의 약물 작용으로 사멸한다. 이러한 작용기전을 바탕으로 클로드로네이트 함유 리포좀은 생체 내 면역 또는 비면역 반응에서 기능하는 대식세포의 역할을 규명하는 in vivo 동물 실험에 사용되고 있다. In vitro 골수 유래 MSCs의 분리과정에서 발생하는 조혈계통 세포 오염은 그 대부분이 대식세포이지만, 클로드로네이트 리포좀을 활용하여 골수 세포로부터 오염된 세포를 제거하여 고순도의 MSCs를 분리 또는 제조하는 방법은 아직까지 개발된 바 없다.

본 발명은 상기한 필요성을 충족하며 상기한 문제점을 해결하고자 고안된 것으로서 본 발명의 목적은 제조 과정의 간편성, 편리성, 경제성 등을 개선하면서 재현성 있게 고순도 생쥐 골수 유래 중간엽 줄기세포를 정제 배양할 수 있는, 클로드로네이트 함유 리포좀을 포함하는 골수 세포로부터 중간엽 줄기세포의 정제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 골수 세포로부터 중간엽 줄기세포의 정제용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 조성물을 포함하는 배지에서 골수 세포를 배양하는 단계를 포함하는 골수 세포로부터 중간엽 줄기세포의 정제 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명은 클로드로네이트(clodronate) 함유 리포좀을 포함하는 골수 세포로부터 중간엽 줄기세포의 정제용 조성물을 제공한다.

상기 클로드로네이트 함유 리포좀은 클로드로네이트가 리포좀에 의해 봉입된 형태일 수 있다. 이때, 클로드로네이트 함유 리포좀은 조성물 내 0.01 내지 1.00 μl/mL, 바람직하게는 0.05 내지 0.5 μl/mL의 농도로 포함될 수 있다.

이러한 클로드로네이트 함유 리포좀은 대식세포와 같이 외부 항원을 인식하는 세포에 의해 포식되며, 그 포식한 세포들은 클로드로네이트의 작용에 의해 사멸한다. 따라서, 본 발명에서는 포식 작용하는 대식세포의 특성을 이용하여 대식세포-유사 세포를 제거하는데 클로드로네이트 함유 리포좀을 사용한 것을 특징으로 한다.

상기 골수 세포는 인간을 포함한 포유동물에서 유래된 것일 수 있으며, 일례로, 인간 및 생쥐, 쥐, 햄스터, 기니피그, 토끼 등의 당업계에 공지된 실험용 동물일 수 있다. 이러한 골수 세포는 혈구를 생성하는 세포 (hematopoietic stem cell)와 지방, 뼈 등을 생성하는 세포 (stromal stem cell)로 분화 가능한 줄기세포를 포함한다. 예를 들면, 한 마리의 생쥐로부터 약 8 Х 10⁷ 의 골수 세포를 얻을 수 있다. 이때, 골수 세포는 효소 처리 또는 적혈구 제거와 같은 전처리 과정 없이 골수에서 유래된 모든 세포 및 구성물을 포함할 수 있다.

상기 중간엽 줄기세포는 세포 표면에 Sca-1 및 CD44를 발현하고, CD34, CD45 및 CD11b를 발현하지 않는 것일 수 있다. 또한, 중간엽 줄기세포는 조혈계통 세포의 마커인 Ptprc, Itgam, Macrosialin, Adgre1 유전자를 거의 발현하지 않는 것일 수 있다. 이와 같이 중간엽 줄기세포는 대식세포 등의 조혈계통 세포들과 다른 단백질 발현을 나타내므로, 이러한 마커를 통해 세포의 유형을 구분할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 클로드로네이트 함유 리포좀을 이용하여 골수 유래 대식세포 또는 대식세포-유사 세포를 제거함으로써 골수 유래 중간엽 줄기세포만을 고순도로 정제 및 배양할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 골수 유래 중간엽 줄기세포의 고순도 정제용 배지 조성물일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 골수 세포로부터 중간엽 줄기세포의 정제용 키트를 제공한다.

이러한 키트는 전술한 클로드로네이트 함유 리포좀을 포함하는 조성물을 통해 골수 세포로부터 대식세포와 같은 조혈계통 세포를 제외한 중간엽 줄기세포만을 선택적으로 배양하는데 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 배지에서 골수 세포를 배양하는 단계를 포함하는 골수 세포로부터 중간엽 줄기세포의 정제 방법을 제공한다.

상기 단계는 조성물 내 클로드로네이트 함유 리포좀에 의해 골수 세포 내 조혈계통 세포가 제거되는 과정이다. 이때, 골수 세포는 효소 처리 또는 적혈구 제거와 같은 전처리 과정 없이 골수에서 유래된 모든 세포 및 구성물을 포함할 수 있다. 또한, 골수 세포는 배양 용기에서 1계대한 중간엽 줄기세포일 수 있다. 예를 들면, 생쥐에서 골수 세포를 적출하여 배양 용기에서 8일 동안 배양한 후 배양 용기의 바닥면에 부착된 세포를 회수하여 배양한 1계대 중간엽 줄기세포의 배지에 클로드로네이트 함유 리포좀을 첨가하여 1일 동안 배양함으로써 골수 세포로부터 대식세포 유사 세포(macrophage-like cell)가 제거되는 것일 수 있다.

본 발명에 따르면, 생쥐 골수 유래 중간엽 줄기세포의 분리 배양 과정에서 발생하는 대식세포와 같은 이종의 세포들을 효과적으로 제거함으로써 성공적으로 고순도의 중간엽 줄기세포를 정제 배양할 수 있으며, 종래의 배양 기법과 비교하여 배양에 소요되는 시간과 인력, 장비 및 비용을 절감할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 통상적으로 사용되는 생쥐 BMSCs 배양의 형태와 구성을 보여주는 결과이다. (a) 최초 세포접종한 후 5일째 이종 형태의 세포들이 콜로니(colony)를 형성하며 증식하고 있는 모습이다. (b) 첫 계대배양(P1) 다음 날 섬유아세포-유사(fibroblast-like) 형태와 대식세포-유사(macrophage-like) 형태의 세포들이 혼재되어 있다. (a) 및 (b)의 배율: Х5. (c) P1 BMSCs 배양에서 이종세포 오염을 확인하기 위해 조혈계통 세포의 마커들 (CD45, CD11b, F4/80)로 면역염색 후 유세포 분석(flow cytometric analysis) 한 결과이다.
도 2는 본 발명의 개략도이다. P1 BMSCs를 클로드로네이트 함유 리포좀이 첨가된 배양 배지에서 배양하여 최종적으로 고순도 L-BMSCs를 제조하는 개략적인 흐름을 나타낸다.
도 3은 BMSCs 배양에서 세포-특이적 리포좀 포식을 나타내는 결과이다. (a) P1 BMSCs를 세 그룹으로 나누고 일반 배지 (untreated), 컨트롤 리포좀 함유 배지 (encapsome) 및 붉은색 형광으로 표지된 리포좀 함유 배지 (Fluo-DiI)에서 16시간 배양 후 조혈계통 마커 (CD45, CD11b)로 면역염색하고 유세포 분석을 통해 각각의 세포들에 의한 리포좀 포식을 분석한 결과이다. (b) (a)의 실험을 세 번 반복한 결과로서, CD45 또는 CD11b 양성(positive) 또는 음성(negative) 반응 세포집단이 띄는 붉은색 형광 강도(MFI)를 평균 ± 표준편차(mean ± S.D.)로 표현한 그래프이다. (c) (a) 실험에 의해 생성된 세포를 CD11b 항체와 DAPI로 염색하고 형광현미경으로 관찰하였다. 배율: Х10.
도 4는 BMSCs를 클로드로네이트 함유 리포좀이 첨가된 배지에서 배양하는 과정 중 대식세포가 클로드로네이트 함유 리포좀 (clodrosome)의 농도 의존적으로 제거되는 것을 나타내는 결과이다. (a) 도면에 표기된 농도 (0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 μl/ml)의 클로드로네이트 함유 리포좀이 첨가된 배지에서 배양하고 면역염색한 후 유세포 분석한 결과로서 붉은색 점은 대식세포를, 파란색 점은 BMSCs를 나타낸다. (b) (a)의 실험을 세 번 반복한 결과로서, 각 마커에 양성(positive) 반응을 나타내는 세포 비율을 평균 ± 표준편차(mean ± S.D.)로 표현한 그래프이다.
도 5는 L-BMSCs의 형태 및 면역표현형 특성을 나타내는 결과이다. (a) C-BMSCs와 L-BMSCs의 형태를 비교한 사진이다. 배율: Х10. (b) 그 두 세포들을 면역염색 (CD44, CD11b) 및 핵염색 (DAPI) 후 형광현미경으로 관찰한 사진이다. 배율: Х20. (c) 두 세포들의 유세포 분석 결과로서 가로축의 FSC(forward scatter)는 세포의 크기(size), 세로축의 SSC(side scatter)는 세포의 입상도(granularity)를 나타낸다. (d) 면역표현형에 대한 유세포 분석으로 가로축은 일반적인 BMSCs 마커들 (Sca-1, CD44, CD105, CD90.2)이고 세로축은 조혈계통 세포 마커들 (CD34, CD45, CD11b)이다.
도 6은 C-BMSCs와 L-BMSCs에서 조혈계통-특이 유전자 (Ptprc, Itgam, Macrosialin, Adgre1)의 발현을 비교한 real time-PCR 결과이다. 골수 유래 대식세포(BMMs)은 양성대조군이다.
도 7은 C-BMSCs와 L-BMSCs의 분화능력을 나타낸다. (a) 각 세포를 배양 배지(GM) 또는 조골세포 분화유도 배지(OM)에서 배양하고 ARS 염색을 시행한 결과이다. 오른쪽은 용출된 ARS 염색시약의 흡광도로서 평균 ± 표준편차(mean ± S.D.)로 표현한 그래프이다. (b) 각 세포를 지방세포 분화유도 배지(AM)에서 배양하고 oil red O 염색 또는 Bodipy 493/503 형광염색을 시행한 결과이다. 배율: Х10; 막대(bar): 100 μm. 오른쪽은 용출된 oil red O 염색시약의 흡광도로서 평균 ± 표준편차(mean ± S.D.)로 표현한 그래프이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하며 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: 생쥐 골수로부터 초기 BMSCs의 제조

생후 6~10주령의 C57BL/6N 생쥐 (다물사이언스, 대전)의 대퇴골과 경골을 수술적으로 분리하고 그 뼈의 양 말단을 절단한 후 주사기로 배지를 주입하여 골수를 적출하였다. 그 골수 유래 세포를 10% FBS(fetal bovine serum; Grand Island, NY), 100 U/ml 페니실린(penicillin) 및 100 μg/ml 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가된 MEMα(alpha-modified Minimum Essential Medium) 배지 (Gibco)에 부유하고 그 부유액을 5Х10⁵/cm²의 세포 농도로 10-cm 배양 용기(culture dish)에 나누어 5% CO₂, 95% 습도 및 37℃가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 그 배지는 매 3일마다 새 배양 배지로 교체하였으며 그 과정에서 배양용기 바닥면에 부착하지 않은 세포 및 세포 찌꺼기를 제거하였다. 배양시작 후 2일째에 배양용기 바닥면에 부착된 MSCs-유사 세포를 관찰하였으며 3일째에 MSCs-유사 세포의 콜로니가 형성됨을 관찰하였다. 그 세포들에 더해, 배양하는 과정에서 대식세포-유사 세포도 함께 혼재되어 증식하는 것을 관찰하였다. 그 불균질한 세포들이 배양용기 바닥면을 ~80% 정도 채우는 8일째에 0.25% 트립신(trypsin-EDTA; T/E)를 처리하고 2분 동안 37℃에서 배양하였다. 그 후에 부유한 세포들을 1,200 rpm에서 3분간 원심분리를 통해 획득하였다. 그 세포들을 2Х10⁴/cm²의 세포 밀도로 계대배양 하였다 (passage 1; P1). 그 첫 계대한 세포들이 배양 용기 바닥면을 80% 정도 채우는 5일째에 첫 계대 시 사용한 방법을 이용해 두 번째 계대배양(passage 2; P2) 하였고, 동일한 세포배양과 계대과정을 거쳐 추가적으로 P3, P4 및 P5 단계의 C-BMSCs를 획득하였다. 첫 계대배양 과정에서 획득한 세포는 이후 BMSCs의 정제배양을 위한 근원세포(source cell)로 사용되었다. 또한, 상기의 과정에서 획득했던 세포 일부는 세포 종류와 비율을 확인하는 유세포 분석(flow cytometric analysis) 용도로 사용되었다. 이를 통해 MSCs는 Sca-1에 양성 반응 및 CD34, CD45, CD11b에 음성반응으로 확인하였고, 대식세포는 CD45, CD11b 및 F4/80 모두에 양성반응으로 확인하였다.

실시예 2: BMSCs 배양에서 대식세포-유사 세포-특이적 리포좀 포식

골수 세포의 초기 배양으로 생성된 BMSCs를 passage 1(P1)으로 계대배양한 다음 날, 불균질 세포들 가운데 대식세포-유사 세포에 의한 선택적 리포좀 포식(ingestion) 유무를 확인하기 위해 배지를 붉은색 형광 리포좀 (Fluo-DiI; Encapsular NanoSciences, Brentwood, TN)이 첨가된 배양 배지로 교체하고 16시간 배양하였다. 배양이 끝나면 세포를 배양용기에 부착한 채로 포르말린으로 고정한 다음 Alexa488 형광이 표지된 CD11b 항체로 염색한 후 형광현미경을 이용하여 붉은색 형광 양성반응 세포에서 CD11b 양성 발현을 동정하였다. 또 한편으로는 0.25% T/E 처리로 세포를 획득한 후 그 세포들을 FITC(fluorescein isothiocyanate)가 표지된 CD45 또는 CD11b 항체로 염색한 후 유세포 분석을 통해 대식세포-유사 세포들에 의한 리포좀의 선택적 포식을 동정하였다.

실시예 3: 클로드로네이트 함유 리포좀 (클로드로좀 또는 clodrosome)이 함유된 배지에서 BMSCs의 정제 배양

정제된 고순도 BMSCs를 제조하기 위하여, 첫 계대배양 시 BMSCs를 0~0.5 μl/ml 클로드로좀이 첨가된 정제 배지에 부유하고 2Х10⁴/cm² 농도로 접종한 후 24시간 동안 배양하였고, 배양이 끝나면 일반 배양 배지로 교체하였다. 일반 배지로 교체하는 과정에서 정제 배지 하에서 발생했던 죽은 세포 또는 세포 찌꺼기는 제거되었다. 일반 배지로 3일 간 더 배양하면 대부분의 대식세포-유사 세포가 제거된 고순도의 BMSCs (L-BMSCs) 제조가 완료된다. 비교 대상으로 클로드로좀이 첨가되지 않은 일반 배양배지에서 배양된 P1 BMSCs (C-BMSCs)를 사용하였다.

정제배양에 따른 세포의 균질성 정도는 광학현미경으로 확인하였다. 대식세포-유사 세포의 제거는 CD11b 양성반응을 나타내는 세포의 형광현미경 분석으로 확인하였다. 또한, 그 정제된 L-BMSCs의 순도는 유세포 분석을 통해 CD34, CD45 및 CD11b 음성반응 및 Sca-1, CD44, CD105 및 CD90.2 발현 양상에 따른 세포 비율에 의해 동정되었다.

또한, 정제 과정에서 대식세포 제거에 대한 검증은 조혈계통 세포(hematopoietic lineage cells)의 마커 유전자 (Ptprc, Itgam, Macrosialin, Adgre1)에 대한 실시간(real-time) PCR 분석으로 재확인하였다. 정제 배양된 L-BMSCs와 P1, P3 및 P5 단계의 C-BMSCs의 total RNA는 TRIzol 용액 (Ambion, Carlsbad, CA)을 이용하여 추출하였고, 그 추출된 total RNA 1.5 μg은 랜덤 프라이머 및 oligo-dT 프라이머와 함께 M-MLV 역전사효소 (Promega, Madison, WI)에 의해 cDNA로 역전사되었다. 그로부터 합성된 cDNA를 마커 유전자 프라이머 및 Power SYBR Green PCR Master Mix 키트 (Applied Biosystem, Valencia, CA)와 함께 섞고 QuantStudio cycler (Applied Biosystem) real-time PCR 장비에서 반응하고 그 산물들을 동정하였다. 그 반응으로부터 생성된 데이터는 QuantStudio Design 분석프로그램 (Applied Biosystem)을 이용하여 ΔΔCt 방법에 의해 분석되었다. 그 반응을 위해 고안된 생쥐 프라이머는 다음 표 1에 정리된 바와 같다.

실시예 4: 중간엽줄기세포의 기능적 특성화

상기 실시예를 통해 정제 배양된 L-BMSCs의 분화능력은 조골세포(osteoblast)와 지방세포(adipocyte) 계통으로 분화를 유도함으로써 동정되었다. L-BMSCs의 분화능력을 비교하기 위해 P1 C-BMSCs가 대조군으로 사용되었다. 각각의 세포는 T/E 처리에 의해 회수되었고 하기 실시예에 따라 분화를 유도하였다.

조골세포 분화의 경우, 세포를 1Х10⁴/cm² 세포 밀도로 48-웰 플레이트(well plate) 또는 6-웰 플레이트에 접종하여 하루 동안 부착시킨 후 10 mM β-글리세롤 포스페이트(β-glycerol phosphate) (Sigma, St. Louis, MO), 50 μg/ml 아스코르브산(ascorbic acid) (Sigma) 및 50 ng/ml hBMP-2(human bone morphogenetic protein-2) (Cowellmedi, Pusan, Korea)가 추가된 배양 배지로 교체한 후 배양하였고, 그 분화유도 배지는 3일마다 교체하였다. 조골세포 분화에 의한 석회화(calcification)를 측정하기 위해 분화를 유도한 8일째와 16일째에 세포를 10% 포르말린으로 15분간 고정하고 ARS(alizarin red S) 염색을 실시하였다. 염색 반응이 끝나면 침착된 ARS 시약을 10% CPC(cetylpiridinium chloride) 용액으로 녹인 후 562 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

지방세포 분화의 경우, 세포를 2Х10⁴/cm² 세포 밀도로 48-웰 플레이트 또는 6-웰 플레이트에 접종하여 하루 동안 부착시킨 후 10 μg/ml 인슐린(insulin) (Sigma), 1 μM 덱사메타손(dexamethasone) (Sigma) 및 2 μM 로시글리타존(rosiglitazone) (Sigma)이 추가된 배양 배지로 교체한 후 배양하였고, 그 분화유도 배지는 3일마다 교체하였다. 분화에 따른 세포내 지방소립(lipid droplet) 생성을 측정하기 위해 분화를 유도한 8일째에 세포를 10% 포르말린으로 15분간 고정하고 ORO(oil red O) (Sigma) 염색 또는 Bodipy 493/503 (ThermoFisher Scientific) 형광염색한 후 각각의 방법에 의한 염색 정도를 광학현미경 또는 형광현미경을 통해 관찰하였다. 그 현미경관찰이 끝나는 대로 지방소립에 침착된 oil red O 염색 시약을 100% 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol)에 용출시킨 후 510 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 5: 통계분석

본 발명의 결과는 3회 이상의 실험에 의해 산출되었고 그 결과 값은 평균 ± 표준편차(mean ± S.D.)로 표현되었다. 통계적 유의성은 Student t-test에 의해 분석하였고 P < 0.05 이면 유의하다고 판단하였다.

상기 실시예의 결과는 다음과 같다.

생쥐 BMSCs 배양 과정에서 대식세포에 의한 리포좀의 선택적 포식

생쥐 골수 유래 세포를 접종한 후 3일째에 MSCs-유사 세포가 처음 관찰되었고 그 이후 콜로니를 형성하였다. 그 주변으로 대식세포-유사 세포가 함께 관찰되었으며 P1 BMSCs로 계대한 이후에도 오염된 세포는 지속적으로 관찰되었다 (도 1a 및 b). P1 BMSCs를 면역염색하여 유세포 분석한 결과, 오염된 세포는 CD45, CD11b 및 F4/80 모두에 양성반응을 보인 대식세포임이 확인되었다.

대식세포가 오염되어 BMSCs와 혼재된 배양에 리포좀이 함유된 배양 배지로 교체하고 16시간 배양한 결과 50% 이상의 대식세포가 리포좀을 포식하였으나 BMSCs에 의한 리포좀 포식은 관찰되지 않았다 (도 3a 및 b). 배양시간이 길어질수록 대식세포에 의한 리포좀 포식은 증가할 것으로 충분히 예상된다. 형광현미경 분석에서도 CD11b 양성세포와 리포좀 형광의 신호는 거의 일치하는 것으로 확인되었다 (도 3c). 이상의 결과는 리포좀이 BMSCs 배양에서 발생하는 대식세포 오염을 제거하는데 충분히 활용될 수 있음을 의미한다고 할 수 있겠다.

정제배양 배지에 의해 제조된 L-BMSCs의 형태학적 및 면역표현형적 특성

본 발명자들은 대식세포의 리포좀 포식능력을 활용하여 클로드로좀이 함유된 배지에서 P1 BMSCs를 배양하여 대식세포만을 제거하려는 시도를 실시하였고 그 결과는 다음과 같다. 클로드로좀 농도와 무관하게 CD34에는 모두 음성반응을 보였다. CD45에 대해서, 0 부터 0.5 μl/ml 농도까지 각각 27.5 ± 0.5%, 15.0 ± 3.2%, 5.6 ± 1.2%, 3.9 ± 1.7% 및 2.7 ± 0.7%의 세포가 양성반응을 보였다. CD11b에 대해서, 각각 29.3 ± 2.0%, 15.2 ± 2.8%, 5.9 ± 1.3%, 3.6 ± 1.2% 및 2.3 ± 0.7%의 세포가 양성반응을 보였다 (도 4). 이상의 결과로 대식세포-유사 세포가 클로드로좀 농도에 의존적으로 감소됨이 확인되었다.

상기 결과를 토대로 클로드로좀의 적정 농도를 0.2 μl/ml로 정하였으며 그 농도의 클로드로좀이 첨가된 정제 배지로 배양한 세포 (L-BMSCs)의 형태학적 및 면역표현형적 특성을 심층분석 하였다. 형태학적으로는 일반 배양 배지에서 배양한 C-BMSCs에 비해 L-BMSCs는 균질화된 섬유아세포의 형태를 보였다 (도 5a 및 b). 이와 같은 형태적 특성은 유세포 분석시에도 확인할 수 있었는데, 즉 작은 크기(FSC)와 낮은 입상도(SSC)로 대표되는 대식세포가 위치하는 플롯 좌측하단의 세포들이 현저하게 줄어들어 있었다 (도 5c). 면역염색 후 면역표현형적 특성을 동정한 결과 (도 5d), 두 가지 다른 조건에서 배양한 세포 모두 CD34에 대해 음성반응을 보였다. CD45와 CD11b에 대해, C-BMSCs의 경우 약 30~40%의 세포에서 양성반응을 나타낸 반면, L-BMSCs의 경우 약 5% 미만 정도의 비율로 확연하게 감소된 걸 확인할 수 있었다. 조혈계통 특이 마커들 (CD34, CD45, CD11b)에 양성인 세포를 제외하고 음성인 세포, 즉 BMSCs 분획만을 분석할 경우 Sca-1, CD44, CD105 및 CD90.2의 발현 양상이나 비율은 두 배양그룹 간에 거의 차이가 없었다.

본 발명자들은 정제배양에 따른 BMSCs의 순도 향상을 real-time PCR 기법으로 한 번 더 검증하였다. 대식세포 오염에 대한 양성대조군으로는 골수 유래 대식세포(BMMs)를 사용하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이 대식세포 마커 유전자들에 대한 real-time PCR 분석 결과, 이들 마커에 대해 P1, P3 및 P5 C-BMSCs는 모두 양성을 보인 반면 L-BMSCs는 거의 검출이 되지 않음을 나타냈다.

상기의 여러 기법들에 의해 검증된 바와 같이, 본 발명가들이 발명한 정제배양 방식은 기존 배양방식의 주된 문제점으로 지적된 대식세포의 오염을 억제할 뿐만 아니라 P1 BMSCs 단계에서 한 번의 정제배지 배양만으로도 충분히 고순도의 BMSCs 배양을 가능하게 해줌으로서 배양시 들어가는 번거로움과 비용 및 소요시간을 절약해 줌을 알 수 있다.

L-BMSCs의 기능적 특성

L-BMSCs의 기능적 특성은 조골세포와 지방세포로 분화하는 능력을 통해 검증하였다. C-BMSCs와 비교실험을 통해 조골세포 분화능력을 살펴본 바, L-BMSCs는 분화유도 후 8일째와 16일째에 분화지표인 ARS 염색에서 강한 양성반응을 보임을 알 수 있으며 C-BMSCs에서 보이는 양성반응 정도에 비해 뚜렷하게 증가함을 확인할 수 있었다 (도 7a). 이와 유사하게, oil red O 또는 Bodipy 493/503 염색에 의해 확인한 지방세포 분화능력에서도 L-BMSCs가 C-BMSCs에 비해 향상된 특성을 나타내었다.

Claims

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시험관 내(in vitro)에서, 클로드로네이트(clodronate) 함유 리포좀을 포함하는 배지에서 골수 세포를 배양하는 단계를 포함하는 골수 세포로부터 중간엽 줄기세포의 정제 방법.
청구항 8에 있어서,
상기 골수 세포는 효소 처리 또는 적혈구 제거 처리 없이 인간을 포함한 포유동물의 골수에서 유래한 모든 세포 및 구성물을 포함하는 것인 방법.
청구항 8에 있어서,
상기 단계는 골수 세포로부터 CD45, CD11b 및 F4/80를 발현하는 대식세포 유사 세포(macrophage-like cell)가 제거되는 것인 방법.
청구항 8에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 세포 표면에서 Sca-1 및 CD44를 발현하면서 CD34, CD45 및 CD11b를 발현하지 않는 것인 방법.