JP6207299B2 - 間葉系幹細胞の分離方法 - Google Patents
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骨質を材料として間葉系幹細胞を分離することを特徴とする、間葉系幹細胞の分離方法。
CD271陰性であることを指標として間葉系幹細胞を分離する、項1に記載の分離方法。
SSEA-4陰性且つCD271陽性であることを指標として間葉系幹細胞を分離する、項1に記載の分離方法。
さらに、血球系細胞マーカー陰性、アポトーシスマーカー陰性、及び死細胞マーカー陰性よりなる群から選択される少なくとも1種を指標として間葉系幹細胞を分離する、項1〜3のいずれかに記載の方法。
項1〜4のいずれかに記載の分離方法によって分離された間葉系幹細胞。
(a)骨質由来であり、(b)血球系細胞マーカー陰性であり、(c)アポトーシスマーカー及び/又は死細胞マーカー陰性であり、且つ(d)CD271陰性である、間葉系幹細胞。
(a)骨質由来であり、(b)血球系細胞マーカー陰性であり、(c)アポトーシスマーカー及び/又は死細胞マーカー陰性であり、(e)SSEA-4陰性であり、且つ(f)CD271陽性である、間葉系幹細胞。
本発明は、骨質を材料として間葉系幹細胞を分離することを特徴とする、間葉系幹細胞の分離方法に関する。
本発明は、上記「1.間葉系幹細胞の分離方法」に記載の方法により分離された間葉系幹細胞に関する(以下、「本発明の間葉系幹細胞」と示す)。本発明の間葉系幹細胞は、骨質由来であるが故に、従来知られている骨髄や臍帯血由来の間葉系幹細胞とは性質が異なっている。したがって、本発明の間葉系幹細胞は、従来の間葉系幹細胞とは異なる新規の細胞であり、新たな研究材料として提供されるものである。
骨髄由来間葉系幹細胞を分離する指標として既に知られている、Lineage及びCD45が陰性であり且つSca-1及びPDGFRαが陽性であるという指標(非特許文献19及び20)に基づき、マウス骨質を材料として間葉系幹細胞を分離した。具体的には次のように行った。
3匹の8週齢雌C57BL/6マウスより、合計6本の脛骨(tibia)を採取した。脛骨の骨端を切除し、脛骨内腔に存在する骨髄を、PBS+2%FCSで洗い流した。骨髄が除去された骨質部分を乳鉢で粉砕し、得られた粉砕物をPBS+2%FCSで洗浄した。洗浄後に残った粉砕物をビーカーに入れ、該粉砕物が十分に浸る程度にcollagenase-dispase液を加えた。該ビーカーを37℃の恒温器中の振盪プレート上におき、ビーカー内の液を穏やかに撹拌しながら1時間処理した。得られた処理液を細胞液とした。なお、上記調製で用いるcollagenase-dispase液(計20 ml)は、PBSを用いてCollagenase type I(Invitrogen社)溶液(10 mg/ml)、及びDispase(Invitrogen社)溶液(10 mg/ml)をそれぞれ別々に調製した後、millipore filterで滅菌し、滅菌済みCollagenase溶液3 mlと滅菌済みDispase溶液4 mlとを混合し、さらに20%FCSを含むα培地13 mlを混合して調製した。
細胞液中の細胞等を、FITC標識されたLineageマーカー(B220、CD11b、Ly6G、TcRαβ、TcRγδ、Ter119)抗体、PE標識されたCD45抗体、Pacific Blue標識されたSca-1抗体、APC標識されたPDGFRα抗体、7ADD、及びFITC標識されたAnnexinVを用いて、定法に従って免疫染色した。
FACS(FACS Aria(BD Bioscience))により、細胞等が免疫染色された細胞液から、Lineage及びCD45が陰性であり、且つSca-1及びPDGFRαが陽性である細胞を間葉系幹細胞として分離した。なお、陽性であるか陰性であるかの境界の設定は、定法に従って行った。FACSによる分離結果を図1に示す。
細胞液として、実施例1の[細胞液の調製]において除去された骨髄を用いた以外は、実施例1と同様に行った。FACSによる分離結果を図2に示す。
ヒト骨質を材料として、間葉系幹細胞を分離した。具体的には次のように行った。
関西医科大学倫理委員会の承認(関医倫第1114号)の下に、大腿骨の人工骨頭置換術の際に切除された大腿骨骨端部の骨皮質ブロック(1〜2cm角)の提供を受けた。なお、該人工骨頭置換術の患者より文書による同意を得た。骨皮質ブロックを、生理食塩水で数回洗浄した後、collagenase-dispase-DNase液中に分散し、37℃で1時間震盪処理した。震盪処理後、骨皮質ブロックはスポンジ状となり、骨皮質細胞浮遊液が得られた。その後、70μmのセルストレーナーを通して骨片や細胞集塊を除去した。さらに溶血操作を行って赤血球を除去し、骨質由来細胞液を得た。
得られた細胞液中の細胞等を、FITC標識されたLineageマーカー(CD2、CD3、CD4、CD14、CD16、CD19、CD24、CD41、CD56、CD66c、CD235a)抗体、BV510標識されたCD45抗体、PE標識されたCD271抗体、APC標識されたSSEA-4抗体、7-AAD、及びFITC標識されたAnnexinVを用いて、定法に従って免疫染色した。
FACSを用いて、細胞等が免疫染色された細胞液から、FSC/SSCゲートでdoubletを除去した。さらに7-ADD(死細胞マーカー)、AnnexinV(アポトーシスマーカー)、Lineage(血球系細胞マーカー)、及びCD45(血球系細胞マーカー)陰性である細胞を分取した。これを、さらに4つ(SSEA-4陰性且つCD271陰性である分画(DN(Double Negative))、SSEA-4陽性且つCD271陰性である分画(SSEA-4 SP(Single Positive))、SSEA-4陰性且つCD271陽性である分画(CD271 SP(Single Positive))、及びSSEA-4陽性且つCD271陽性である分画(DP(Double Positive)))に亜分画した。FACSによる分画結果を図3に示す。
FACSにより得られた4つの分画の細胞を培地(10%FCS含有α-MEM)に懸濁し、該細胞懸濁液を10 cm2プラスチックディッシュに播種して、定法に従って培養した。培養開始から12日後に、間葉系幹細胞の有無の指標となるCFU-F形成の有無を、倒立位相差顕微鏡で観察した。CFU-Fアッセイの結果を図4に示す。
FACSにより得られた4つの分画の細胞それぞれについて、細胞の大きさを示す前方散乱光(FSC)を測定した。前方散乱光の測定結果を図5に示す。
図3より、各々の分画細胞の割合は、DP分画が6.9%、CD271 SP分画が14.8%、SSEA-4 SP分画が2.5%、DN分画が61.5%であった。図4より、4つの分画全て、CFU-Fを形成することが確認された。このことから、4つの分画全てに間葉系幹細胞が含まれていることが示された。図5より、細胞の大きさの分布のパターンを見ると、4つの分画は、FSC250〜600付近で同様のピークを示すものの、FSC800〜2000付近では分布のパターンが異なっていた。
ヒト骨髄を材料として、間葉系幹細胞を分離した。具体的には次のように行った。
血縁者間同種骨髄移植又は非血縁者間同種骨髄移植に際して、通常は廃棄されるフィルターバッグに残存する細胞を回収し、PBS-を用いて数回洗浄した。洗浄後の細胞から、Ficoll-Paque比重遠心法により単核球分画を回収した。回収した単核球分画から、免疫磁気ビーズでlineage陽性細胞を除去したものを細胞液とした。なお、血縁者間同種骨髄移植のフィルターバッグの使用については、関西医科大学倫理委員会の承認(関医倫第611号)を得た上で、該骨随移植の健常人ドナーより文書による同意を得た。また、非血縁者間同種骨髄移植のフィルターバッグの使用については、財団法人骨髄移植推進財団データ・試料管理委員会の承認(平成18年12月19日)を得て、該骨髄移植の健常人ドナーより文書による同意を得た。
細胞液を、実施例2と同様に、4つ(SSEA-4陰性且つCD271陰性である分画(DN(Double Negative))、SSEA-4陽性且つCD271陰性である分画(SSEA-4 SP(Single Positive))、SSEA-4陰性且つCD271陽性である分画(CD271 SP(Single Positive))、及びSSEA-4陽性且つCD271陽性である分画(DP(Double Positive)))に亜分画した。分画は、細胞液を変えて複数回行った。FACSによる分画結果の1つを図6に示す。
FACSにより得られた4つの分画の細胞を培地(10%FCS含有α-MEM)に懸濁し、該細胞懸濁液を10 cm2プラスチックディッシュに播種して、定法に従って培養を開始した。培養開始後、ディッシュ上の細胞がコンフルエントになったらその一部を新たなディッシュに継代するという工程を繰り返した。4継代目(培養開始から約1ヶ月)に、細胞の増殖の有無、及び細胞形態を観察し、間葉系幹細胞が樹立できたか否かを評価した。細胞形態の観察結果を図7に示す。
FACS解析の結果、細胞液の細胞数に対する各分画の細胞数の割合は、DP分画が0.1〜3.1%、CD271 SP分画が0.1〜6.8%、SSEA-4 SP分画が3.3〜42.5%、DN分画が50.7〜93.4%であった。また、図7に示されるように、SSEA-4 SP分画以外の3分画(DN、CD271 SP、DP)で間葉系幹細胞の樹立に成功した。
実施例1の[FACS解析]において、Lineage(血球系細胞マーカー)、CD45(血球系細胞マーカー)、及びPDGFRα(幹細胞マーカー)が陰性であり、且つSca-1が陽性である細胞を微小幹細胞として分離した。
骨質から間葉系幹細胞を分離する場合(実施例1)と、骨髄から間葉系幹細胞を分離する場合(比較例1)とで、分離効率(細胞液中の細胞1×106当たりの、間葉系幹細胞の数)を比較した。比較結果を図8に示す。図8より、骨髄よりも骨質を材料とする方が約1000倍も効率的に間葉系幹細胞を分離できることが示された。
骨質由来間葉系幹細胞(実施例1)と、骨質由来微小幹細胞(比較例3)とで、細胞の大きさを比較した。具体的には、細胞の大きさを示す前方散乱光(FSC)を測定して、該測定値を比較した。比較結果を図9に示す。図9中、aが骨質由来間葉系幹細胞の大きさの分布を示し、bが骨質由来微小幹細胞の大きさの分布を示す。図9より、両細胞のピークは大きく異なり(間葉系幹細胞:FSC 550付近、微小幹細胞:FSC 50付近)、また分布パターンも異なることから、両者は明確に区別される異なる細胞であることが示唆された。
骨質由来間葉系幹細胞(実施例1)と、骨質由来微小幹細胞(比較例3)とで、増殖特性を比較した。具体的には、それぞれの細胞を培地(20%FCS含有α‐MEM)中で2週間、定法に従って培養した。培養中の細胞を倒立位相差顕微鏡で観察した。観察結果を図10に示す。間葉系幹細胞(MSCs)は分裂増殖してクラスターを形成した。さらに、脂肪滴の蓄積も観察された。一方、骨質由来微小幹細胞は分裂・増殖が観察されなかった。このように、両細胞は増殖特性が異なることから、明確に区別される異なる細胞であることが示唆された。
骨質由来間葉系幹細胞(実施例2)及び骨髄由来間葉系幹細胞(比較例2)について、骨、脂肪、及び軟骨細胞への分化能を解析した。具体的には次の様に行った。
骨質由来間葉系幹細胞の4つの分画(DP、CD271 SP、SSEA-4 SP分画、及びDN分画)それぞれを、骨分化誘導キット、脂肪分化誘導キット、又は軟骨分化誘導キット(いずれもR & D社、Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit)で分化誘導させ、誘導から21日目の細胞を4%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定した。骨分化誘導させたサンプルについては、4%PFAで固定したサンプルを、定法に従ってアルカリ性ホスファターゼ染色し、染色像を観察した(CKX41, オリンパス社)(図11)。脂肪分化誘導させたサンプルについては、4%PFAで固定したサンプルを、定法に従ってズダンII染色(Oil Red O染色)し、染色像を観察した(CKX41, オリンパス社)(図12)。軟骨分化誘導させたサンプルについては、4%PFAで固定した細胞塊から凍結切片を作成し、該切片を定法に従ってAlcian Blueにより染色し、染色像を観察した(CKX41, オリンパス社)(図13)。
図11〜13に示すように、全骨質細胞(whole bone)由来有核細胞より樹立した間葉系幹細胞は、骨、脂肪、及び軟骨の3系統の細胞に分化誘導可能であった。DP分画の間葉系幹細胞は、対照と同様に、骨、脂肪、及び軟骨の3系統の細胞に分化誘導可能であった。一方、DN分画の間葉系幹細胞は、脂肪、及び軟骨の2系統の細胞に分化誘導可能であったが、骨への分化誘導はできなかった。同様に、SSEA-4 SP分画の間葉系幹細胞も、脂肪、及び軟骨の2系統の細胞に分化誘導可能であったが、骨への分化誘導はできなかった。CD271 SP分画の間葉系幹細胞は、骨、及び脂肪の2系統の細胞に分化誘導可能であったが、軟骨への分化誘導はできなかった。各分画の間葉系幹細胞が分化する組織を表1にまとめる。
骨髄由来間葉系幹細胞の4つの分画(DP、CD271 SP、SSEA-4 SP分画、及びDN分画)それぞれを、骨分化誘導キット、脂肪分化誘導キット、又は軟骨分化誘導キット(いずれもR & D社、Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit)で分化誘導させ、誘導から21日目に細胞を4%PFAで固定した。骨分化誘導させたサンプルについては、4%PFAで固定したサンプルを、一次抗体として抗osteocalcin抗体(骨分化誘導キットに添付)を用いて免疫染色し、染色像を蛍光顕微鏡(BX50、オリンパス社)で観察した。脂肪分化誘導させたサンプルについては、4%PFAで固定したサンプルを、一次抗体として抗FABP-4抗体(脂肪分化誘導キットに添付)を用いて免疫染色し、染色像を蛍光顕微鏡(BX50、オリンパス社)で観察した。軟骨分化誘導させたサンプルについては、4%PFAで固定した細胞塊から凍結切片を作成し、該切片を、一次抗体として抗Aggrecan抗体(軟骨分化誘導キットに添付)を用いて免疫染色し、染色像を蛍光顕微鏡(BX50、オリンパス社)で観察した。観察像を図14に示す。
図14に示すように、DP分画以外の間葉系幹細胞は、骨、脂肪、及び軟骨の3系統の細胞に分化誘導可能であった。一方、DP分画の間葉系幹細胞は、骨、及び軟骨の3系統の細胞に分化誘導可能であったが、脂肪への分化誘導はできなかった。
Claims (5)
- 骨質を材料として、
(i)CD271陰性であること、又は
(ii)SSEA-4陰性且つCD271陽性であること
を指標として間葉系幹細胞を分離することを特徴とする、間葉系幹細胞の分離方法。 - さらに、血球系細胞マーカー陰性、アポトーシスマーカー陰性、及び死細胞マーカー陰性よりなる群から選択される少なくとも1種を指標として間葉系幹細胞を分離する、請求項1に記載の方法。
- 請求項1又は2に記載の分離方法によって分離された間葉系幹細胞。
- (a)骨質由来であり、(b)血球系細胞マーカー陰性であり、(c)アポトーシスマーカー及び/又は死細胞マーカー陰性であり、且つ(d)CD271陰性である、間葉系幹細胞。
- (a)骨質由来であり、(b)血球系細胞マーカー陰性であり、(c)アポトーシスマーカー及び/又は死細胞マーカー陰性であり、(e)SSEA-4陰性であり、且つ(f)CD271陽性である、間葉系幹細胞。
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