JPWO2018207918A1 - 移植効率を向上させる間葉系幹細胞の純化方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、簡便かつ高効率に間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を純化、濃縮する方法を提供する。より具体的には、生体から単離された新鮮な組織から、ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を分離することにより、簡便かつ高効率に間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を純化、濃縮することが可能となる。本発明により、培養前に間葉系幹細胞のみを単一抗体により選択的に分離し、移植部への生着効率を高める間葉系幹細胞の培養系を確立することができる。

Description

関連出願の相互参照
本願は、特願２０１７−０９５２１６号（出願日：２０１７年５月１２日）の優先権を主張する出願であり、これは引用することによりその全体が本明細書に取り込まれる。
本発明は、間葉系幹細胞を分離、純化または濃縮する方法に関する。より詳細には、生体から単離された新鮮な組織から、細胞表面のマーカータンパク質の発現を指標にして、間葉系幹細胞を分離、純化または濃縮する方法に関する。また、本発明は、細胞移植などに利用可能な間葉系幹細胞の製造方法、およびそのような方法に用いるキットにも関する。
間葉系幹細胞は、骨髄や滑膜、脂肪、臍帯の中に存在する体性幹細胞であり、軟骨や骨、脂肪、神経細胞への分化能を有することが報告されている（非特許文献１）。成人の組織からも分離できることから、半月板や軟骨の損傷部の再生治療に用いられている（非特許文献２）。しかしながら、それらの移植細胞は、組織から採取した雑多な細胞集団を培養により増やしたものであり、間葉系幹細胞以外にも組織を構成するその他の細胞が混在している。
近年、間葉系幹細胞は組織再生のみならず、血球系細胞の移植の際に同時に移植することで免疫寛容を促すという効果が報告されている（非特許文献３）。間葉系幹細胞以外の雑多な細胞が混在することでその効果が減弱することが懸念される。
間葉系幹細胞の評価法として、細胞増殖の程度や、培養後の細胞の表面抗原発現の解析が行われている（非特許文献４および５）。しかし、雑多な骨髄細胞の中に含まれる間葉系幹細胞以外の細胞までもが増殖すること、さらに、間葉系幹細胞以外の細胞が培養によって間葉系細胞様の抗原発現をすることが明らかにされた（非特許文献６）。
これまでに、複数の表面マーカーを用いて、ヒトやマウスの間葉系幹細胞を培養前に選択的に分離する系は既に確立されている（非特許文献７および８）。しかしながら、ヒト間葉系幹細胞の分離にはＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）およびＴＨＹ−１（ＣＤ９０）（特許文献１、非特許文献７）に特異的な抗体、マウス間葉系幹細胞の分離にはＰＤＧＦＲα（ＣＤ１４０ａ）およびＳｃａ−１（非特許文献８）に特異的な抗体が使用されており、動物種ごとに異なる抗体が用いられている。
特開２００９−６０８４０号公報
Colter, D. C., Sekiya, I. & Prockop, D. J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Proc Natl Acad Sci. 2001;98:7841-7845. Sekiya I., Muneta T., Horie M. & Koga H. Arthroscopic Transplantation of Synovial Stem Cells Improves Clinical Outcomes in Knees With Cartilage Defects. Clin Orthop Relat Res. 2015;473:2316-26. Salem, H. K. & Thiemermann, C. Mesenchymal stromal cells: current understanding and clinical status. 2010;28:585-596. De Bari, C., Dell'Accio, F., Tylzanowski, P. & Luyten, F. P. Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane. Arthritis Rheum.2001;44: 1928-1942. Harting, M., Jimenez, F., Pati, S., Baumgartner, J. & Cox, C., Jr. Immunophenotype characterization of rat mesenchymal stromal cells. Cytotherapy. 2008;10:243-253. Guanerio J., Coltella N., Ala U., Tonon G., Pandolfi PP. & Bernardi R. Bone Marrow Endosteal Mesenchymal Progenitors Depend on HIF Factors for Maintenance and Regulation of Hematopoiesis. Stem Cell Reports. 2014;2:794-809 Mabuchi, Y. et al. LNGFR(+)THY-1(+)VCAM-1(hi+) cells reveal functionally distinct subpopulations in mesenchymal stem cells. Stem Cell Reports.2013;1:152-165. Morikawa, S. et al. Prospective identification, isolation, and systemic transplantation of multipotent mesenchymal stem cells in murine bone marrow. J Exp Med. 2009;206:2483-2496.
本発明は、ヒトを含む哺乳動物の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を簡便に分離、純化または濃縮する方法を提供することを目的の一つとする。また、本発明は、細胞移植などに利用可能な間葉系幹細胞の製造方法、およびそのような方法に用いるキットを提供することも別の目的の一つとしている。
本発明者らは、生体から単離された新鮮な組織から、ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を分離することにより、簡便かつ高効率に間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を純化、濃縮できることを見出した。本発明により、培養前に間葉系幹細胞のみを単一抗体により選択的に分離し、移植部への生着効率を高める間葉系幹細胞の培養系を確立することができる。本発明により、異なる動物種間で同一の抗原が認識されることが見出されたことより、同一抗原を発現する細胞を用いた非臨床試験での安全性、有効性の評価が可能となり、雑多な細胞集団ではなく新鮮純化細胞を用いることで、安定した移植効果が期待される。
本発明はこのような知見に基づくものであり、以下の態様を包含する：
実施態様１
ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、およびｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程を含む、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の純化方法。
実施態様２
ＣＤ７３タンパク質を唯一の陽性選択マーカーとして用いることを特徴とする、実施態様１の方法。
実施態様３
ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ２７１、ＣＤ１４０ａ、またはレプチンレセプターのいずれをもＭＳＣを純化するための選択マーカーとして用いないことを特徴とする、実施態様１または２の方法。
実施態様４
血球／内皮細胞を除去する工程をさらに含むことを特徴とする実施態様１〜３の方法。
実施態様５
血球／内皮細胞を取り除くための陰性選択マーカーとしてＣＤ３１、ＣＤ４５、ＧＰＡ、および／またはＴｅｒ１１９を用いて血球／内皮細胞を除去することを特徴とする実施態様４の方法。
実施態様６
ＣＤ７３タンパク質をＭＳＣ純化のための唯一の選択マーカーとして用いることを特徴とする、実施態様１〜５の方法。
実施態様７
生体から単離された新鮮な細胞の集団が骨髄、脂肪組織、臍帯、胎盤、滑膜、または歯髄由来であることを特徴とする、実施態様１〜６の方法。
実施態様８
生体から単離された新鮮な細胞の集団をコラゲナーゼで処理する工程をさらに含むことを特徴とする、実施態様１〜７の方法。
実施態様９
生体から単離された新鮮な細胞の集団が末梢血由来であることを特徴とする、実施態様１〜６の方法。
実施態様１０
生体から単離された新鮮な細胞の集団がＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＡＭ３１００（プレリキサフォル）を生体に投与した後に生体から単離されることを特徴とする、実施態様１〜９の方法。
実施態様１１
抗ＣＤ７３抗体の結合した担体またはＦＡＣＳを用いて、ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離することを特徴とする、実施態様１〜１０の方法。
実施態様１２
抗ＣＤ７３抗体の結合した担体が磁気ビーズである、実施態様１１の方法。
実施態様１３
抗ＣＤ７３抗体の結合した担体がカラムに充填されている、実施態様１１の方法。
実施態様１４
ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、および
ｉｉ）抗ＣＤ７３抗体の結合した担体を用いてＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程を含む、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の純化方法であって、
ＣＤ７３タンパク質を唯一の陽性選択マーカーとして用い、
ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ２７１、ＣＤ１４０ａ、またはレプチンレセプターのいずれをも選択マーカーとして用いず、
ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞の単離に先立ち、細胞の接着培養は行わないことを特徴とする、純化方法。
実施態様１５
ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、ｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程、およびｉｉｉ）工程ｉｉで単離された細胞を増殖させる工程を含む、移植用の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の製造方法。
実施態様１６
ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、ｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程、およびｉｉｉ）工程ｉｉで単離された細胞に分化を誘導する工程を含む、移植用の細胞の製造方法。
実施態様１７
ＧＭＰグレードの抗体が用いられることを特徴とする、実施態様１〜１６の方法。
実施態様１８
抗ＣＤ７３抗体の接合した担体を含む、実施態様１〜１６の方法に用いるためのキット
。
実施態様１９
抗ＣＤ７３抗体の接合した担体が磁気ビーズである、実施態様１８のキット。
実施態様２０
抗ＣＤ７３抗体の接合した担体がカラムに充填されている、実施態様１８のキット。
実施態様２１
標識の接合した抗ＣＤ７３抗体を含む、実施態様１〜１６の方法に用いるためのキット
。
実施態様２２
ＧＭＰグレードの抗体が用いられることを特徴とする、実施態様１８〜２１のキット。
実施態様２３
実施態様１〜１６の方法により得られる細胞を含む細胞組成物。
実施態様２４
ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、ｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程を含む、ＣＤ７３陽性細胞組成物の製造方法。
実施態様２５
工程ｉｉで単離された細胞を増殖させる工程をさらに含む、ＣＤ７３陽性細胞組成物の製造方法。
実施態様２６
ＣＤ７３タンパク質を唯一の選択マーカーとして用いることを特徴とする、実施態様２４または２５の方法。
実施態様２７
ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞の単離に先立ち、細胞の接着培養は行わないことを特徴とする、実施態様２４〜２６の方法。
実施態様２８
ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞の単離に先立ち、血球／内皮細胞を除去する工程を含まないことを特徴とする実施態様２４〜２７の方法。
実施態様２９
生体から単離された新鮮な細胞の集団が骨髄、皮下脂肪、内臓脂肪、絨毛、絨毛膜、または羊膜由来であることを特徴とする、実施態様２４〜２８の方法。
実施態様３０
ＦＡＣＳを用いて、ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離することを特徴とする、実施態様２４〜２９の方法。
実施態様３１
ＧＭＰグレードの抗体が用いられることを特徴とする、実施態様２４〜３０の方法。
実施態様３２
ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、および
ｉｉ）ＦＡＣＳを用いてＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程を含む、ＣＤ７３陽性細胞組成物の製造方法であって、
生体から単離された新鮮な細胞の集団が皮下脂肪または内臓脂肪由来であり、
ＣＤ７３タンパク質を唯一の選択マーカーとして用い、
ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞の単離に先立ち、細胞の接着培養は行わないことを特徴とする、ＣＤ７３陽性細胞組成物の製造方法。
実施態様３３
実施態様２４〜３２の方法により得られるＣＤ７３陽性細胞組成物。
実施態様３４
ＣＤ７３陽性細胞の純度が少なくとも９０％である、実施態様３３のＣＤ７３陽性細胞組成物。
実施態様３５
少なくとも１０３個のＣＤ７３陽性細胞を含む、実施態様３３または３４のＣＤ７３陽性細胞組成物。
実施態様３６
実施態様３３〜３５のＣＤ７３陽性細胞組成物を含む、移植効率改善組成物。
実施態様３７
実施態様３３〜３５のＣＤ７３陽性細胞組成物を含む、抗炎症組成物。
実施態様３８
実施態様３３〜３５のＣＤ７３陽性細胞組成物を含む、免疫抑制組成物。
実施態様３９
実施態様３３〜３５のＣＤ７３陽性細胞組成物と筋サテライト細胞とを含む、筋損傷または筋疾患の治療に用いるための組成物。
実施態様４０
実施態様３３〜３５のＣＤ７３陽性細胞組成物を含む、炎症性腸疾患の治療に用いるための組成物。
実施態様４１
実施態様３３〜３５のＣＤ７３陽性細胞組成物を含む、ＧＶＨＤの治療または予防に用いるための組成物。
実施態様４２
他家細胞を用いた細胞治療において、実施態様３３〜３５のＣＤ７３陽性細胞組成物を他家の細胞と同時に投与することを含む、細胞治療の効率を上げる方法。
実施態様４３
他家細胞を用いた細胞治療において、細胞治療効率を上げるために他家細胞と同時投与するための、実施態様３３〜３５のＣＤ７３陽性細胞組成物。
ヒトおよびマウス骨髄においてＣＤ７３陽性細胞が間葉系幹細胞のマーカーを発現していることを示す図である。 ヒト脂肪組織中のＣＤ７３陽性細胞の表面抗原解析データを示す図である。 ラット骨髄においてＣＤ７３陽性細胞が間葉系幹細胞のマーカーを発現していることを示す図である。 ＣＤ７３抗体を用いて新鮮純化された細胞集団が、全骨髄細胞と比較し高いコロニー形成能力を有していることを示す図である。 ＣＤ７３抗体によって分離、培養された細胞集団が効率よく移植部に生着し、マクロファージの浸潤を抑制していることを示す画像である。 図６は、ヒト間葉系組織（骨髄、内臓脂肪、皮下脂肪、羊膜、絨毛膜、絨毛、および臍帯）に含まれるＣＤ７３陽性細胞の割合を分析した結果を示す図である。 図７は、骨髄、内臓脂肪、皮下脂肪、羊膜、絨毛膜、絨毛から得られるＣＤ７３陽性細胞のコロニー形成能力を調べた結果を示すグラフである。 図８は、骨髄、内臓脂肪、皮下脂肪、羊膜、絨毛膜、絨毛から得られるＣＤ７３陽性細胞のコロニー形成能力を調べた結果を示す培養皿の写真である。 図９は、皮下脂肪、内臓脂肪、絨毛膜、絨毛から分離したＣＤ７３陽性細胞の増殖能力を調べた結果を示すグラフである。培養開始時（Ｄａｙ０）を１とした場合の培養１４日目（Ｄａｙ１４）における相対的な細胞数が示されている。 図１０は、潰瘍性大腸炎マウスモデルを用いた実験のプロトコルを示す図である。 図１１は、潰瘍性大腸炎マウスモデルにおけるＣＤ７３陽性細胞の投与の影響を示す写真およびグラフである。左の写真は実験の８日目に摘出した大腸を示している。右のグラフは結腸の長さを分析した結果を示すグラフである。 図１２は、直腸炎症部位の組織学的検討の結果を示す写真およびグラフである。左の写真は、ＣＤ７３陽性細胞の投与により、移植した細胞が炎症部にホーミングし、大腸の構造を保持する効果があることを示している。右のグラフは、ＣＤ７３陽性細胞投与群では炎症度スコアが有意に低くなっていること示している。 図１３は、カルディオトキシン（ＣＴＸ）を前脛骨筋に投与することで筋損傷を引き起こしたマウスに、同種他家マウスの骨格筋幹細胞（サテライト細胞）を投与した結果を示す画像である。同種他家のＣＤ７３陽性細胞を共投与した。 図１４は、カルディオトキシン（ＣＴＸ）を前脛骨筋に投与することで筋損傷を引き起こしたマウスに、同種他家マウスの骨格筋幹細胞（サテライト細胞）を投与した結果を示す画像である。同種他家のＣＤ７３陽性細胞を共投与した。
上述のとおり、本発明者らは、生体から単離された新鮮な組織から、ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を分離することにより、簡便かつ高効率に間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を純化、濃縮できることを見出した。以下に、本発明を詳細に説明する。
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、臍帯、骨髄、脂肪組織などの複数の組織に存在する多能性の成体幹細胞である。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は稀な細胞であるが、骨髄には１万から１０万個の有核骨髄細胞につき１個の割合で存在すると推定されている。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は自己増殖能を有し、骨芽細胞（骨細胞）、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞などの様々な細胞種に分化することができることから、再生医療への応用が期待されている。
Dominici et al., Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement., Cytotherapy. 2006;8(4):315-7による定義では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、（１）プラスチック培養容器に接着し、（２）ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＣＤ７３（エクト５’−ヌクレオチダーゼ）、ＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）を陽性マーカー、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９α、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＣｌａｓｓＩＩ（ＤＲ）を陰性マーカーとし、（３）骨、脂肪、軟骨への分化能を有する細胞であるとされている。従来的な間葉系幹細胞の単離方法では、プラスチック培養容器に接着して増殖するというＭＳＣの性質が利用される。
ＭＳＣとして同定されるためには、培養された細胞集団の９５％よりも多くがＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を発現しなければならず、そして、ＣＤ１１ｂまたはＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１９またはＣＤ７９α、およびＨＬＡ−ＤＲに関して陰性（≦２％の陽性細胞）でなければならない、とされているが、これらの抗原プロファイルは、人工的な環境下において細胞を培養した後に明らかにされるものであることに留意すべきである。
上述のように、間葉系幹細胞は多くの場合、骨髄等の組織から得た細胞を長期間培養した後に、培養皿に付着した細胞を増殖させることによって単離されているが、開始材料に含まれる細胞の不均一性などにより、最終的に得られる幹細胞の品質にばらつきが生じている。そのため、表面抗原マーカーを用いて間葉系幹細胞を単離する技術が開発されており、例えば、Ogataらは細胞表面マーカーとしてＬＮＧＦＲとＴＨＹ−１の２つを用いてヒトＭＳＣを純化できることを示している（Ogata et al., PLoS One. 2015 Jun 8;10(6):e0129096.）。
ＣＤ７３（ecto-5'-nucleotidase）
ＣＤ７３はエクト−５’−ヌクレオチダーゼとも呼ばれる酵素であり、一般にＡＭＰをアデノシンに変換する働きを有する。従来から、ＣＤ７３は、ＭＳＣを定義する陽性マーカーの一つに含められている。しかしながら、これまでＣＤ７３のみの発現を指標にしてＭＳＣを単離できることは知られていなかった。本発明者らは、予想外かつ驚くべきことに、ＣＤ７３のみの発現を指標にして、ヒト、マウスおよびラットのＭＳＣを実質的に純化できることを見出した。
純化方法
本発明の一つの態様は、ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、およびｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程を含む、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の純化方法に関する。ここで、新鮮な細胞とは、生体から分離した直後の、培養工程に付していない細胞を意味するが、新鮮な細胞は、生体から分離した直後に凍結保存されたものであってもよい。なお、本明細書における発明の詳細な説明の文脈において、ＭＳＣの純化方法は、ＭＳＣの単離方法あるいは濃縮方法とみなすこともできる。本開示の方法により処理した細胞の集団は、処理前の細胞の集団に比べて、細胞集団中におけるＭＳＣの比率が少なくとも１０％高まっている。ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行われ、フローサイトメトリーを用いた選別（ＦＡＣＳ）、アフィニティー・クロマトグラフィー、イムノパニング、磁気ビーズなどの担体を用いた分離を利用することができるが、選別の方法はこれらに限定はされない。
本明細書に記述されるＭＳＣの純化方法は、別の言い方をすれば、ＣＤ７３陽性細胞の純化方法、単離方法、あるいは濃縮方法であるとも言える。また、本明細書の開示に従う細胞の純化方法は以下、「新鮮純化法」と呼ぶ場合がある。
本明細書における発明の詳細な説明の文脈において、生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程は、人体から組織を単離する外科的な工程は含まないと解される。本発明の一つの態様は、生体から新鮮な細胞の集団（組織）を単離する工程をさらに含むことができる。
本発明の一つの態様は、ＣＤ７３タンパク質を唯一の陽性選択マーカーとして用いることを特徴とする方法に関する。すなわち、培養された細胞をＭＳＣとして同定する際にマーカーとして用いられるＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ２７１、ＣＤ１４０ａまたはレプチンレセプターのいずれをもＭＳＣを純化するための陽性選択マーカーとしては使用しない。本発明の一つの態様では、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ２７１、ＣＤ１４０ａまたはレプチンレセプターは、選択マーカーとしては使用せず、陰性選択マーカーとしても使用しない。本発明の一つの態様では、ＣＤ７３タンパク質がＭＳＣ純化のための唯一の選択マーカーとして用いられる。
本発明の一部の態様では、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ１０、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ７９α、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３１、およびＧＰＡから選択される１または複数の細胞表面マーカーも選択マーカーとして使用しない。
単一のマーカーを指標にして選択することから、このような態様に係る方法は、複数の抗体を用いる方法に比べてコスト面で大きな優位性があるとみなされうる。このような視点は、ＧＭＰグレードの抗体の使用が要求される状況では特に重要となる。また、高価なマルチカラーＦＡＣＳシステムの使用が要求されず、磁気ビーズ等の担体を用いた簡便な単離も可能となる。
本発明の一つの態様は、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＧＰＡ、および／またはＴｅｒ１１９を血球／内皮細胞を取り除くための陰性選択マーカーとして用いる方法に関する。後述するように、ＦＡＣＳを用いて細胞の純化を行う場合は、これらの陰性選択マーカーを用いることで容易に細胞の純度を高めることができる。
生体から単離された新鮮な細胞を用意する際における細胞の供給源としては、例えば、哺乳動物の骨髄、臍帯、臍帯血、末梢血、滑膜、脂肪組織などが挙げられる。好ましい細胞の供給源の一つは骨髄であるが、骨髄は、脊椎、胸骨、肋骨、大腿骨、脛骨、腸骨等の骨髄を用いることができる。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラットを挙げることができるが、これらに限定はされない。本開示に係るＣＤ７３を指標とするＭＳＣの純化方法は、ヒト、マウス、ラットに共通して適用可能であるという優れた利点を有している。好ましくは、本開示に係る純化方法は、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の純化に利用される。
生体から単離された新鮮な細胞を用意する際における細胞の供給源としては、上記のものに加えて、内臓脂肪、皮下脂肪、羊膜、絨毛膜、絨毛を挙げることができる。皮下脂肪、内臓脂肪などの脂肪組織には、比較的、容易に入手されうるという利点がある。また、絨毛もかなりの量（１人の妊婦から５００ｇ弱）を得ることができることから、細胞を入手するための良いソースとなりうる。
生体から単離した組織から目的の細胞を調製する際、組織中に含まれる間葉系幹細胞と他の細胞とを解離させるために、組織材料に対してピペッティング等による物理的処理や、酵素等による化学的処理を行うことができる。酵素としては、トリプシン、コラゲナーゼ等、常法で用いられる酵素が使用できるが、好ましくはコラゲナーゼで処理される。より具体的には、例えば、０．２％コラゲナーゼ溶液により３７℃で１時間処理する。また、末梢血から細胞を得る場合、例えば、材料を低張溶液で処理するなどして、材料に混入している赤血球を予め溶血しておくことが好ましい。細胞を得る際、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＡＭ３１００（プレリキサフォル）を生体に投与した後に生体から単離した細胞の集団を用いてもよい。
生体から単離した組織に血球細胞が含まれている場合には、細胞表面のＣＤ４５タンパク質とＣＤ２３５ａタンパク質の発現を指標に細胞を選別して取り除いてもよいが、表面マーカーはこれらに限定されず、例えば、ＣＤ３１タンパク質等も利用できる。選別方法としては、蛍光標識抗体を用いたフローサイトメトリーや、磁気ビーズ、イムノパニング、アフィニティー・クロマトグラフィーを用いる方法などが挙げられるが、これらに限定はされない。なお、ＣＤ４５−ＣＤ２３５ａ−細胞等の選別は、ＭＳＣの単離（純化、濃縮）前であっても、同時であっても、単離（純化、濃縮）後であってもよい。また、生体から単離した組織から目的の細胞を調製する際、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）などの死細胞を染色する蛍光色素と細胞集団とを反応させ、蛍光で染色された細胞を除去することにより、予め死細胞を除去してもよい。
本発明の一つの態様は、血球／内皮細胞を除去する工程を含む、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の純化方法に関する。この態様の純化方法は、例えば、ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、ｉｉ）血球／内皮細胞を除去する工程、およびｉｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程を含む。より具体的には、血球／内皮細胞を取り除くための陰性選択マーカーとしてＣＤ３１、ＣＤ４５、ＧＰＡ、および／またはＴｅｒ１１９を用いて血球／内皮細胞を除去することができる。本開示の方法においては、血球／内皮細胞を除去した後、ＣＤ７３タンパク質をＭＳＣ純化のための唯一の選択マーカーとして用いて、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を純化することができる。
ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する際には、例えば、ＣＤ７３タンパク質を特異的に認識する抗体を使用することができる。抗体は、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＡＰＣ等の蛍光色素で標識されていてもよい。使用可能な抗体は、例えば、ヒトＣＤ７３抗体の場合、クローンＡＤ２（ＢＤバイオサイエンス）などである。使用する抗体の特徴（モノクローナル／ポリクローナル抗体、アイソタイプ、全長／断片、等）や抗体の濃度は、当業者であれば、細胞の由来する組織、抗体の活性、抗体の使用方法等を考慮して適宜決定することができる。ヒト、マウス、ラットを含む哺乳動物のＣＤ７３タンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列は公知であり、それらの情報をもとに抗ＣＤ７３抗体を作製して使用してもよい。ヒト、マウス、ラットのＣＤ７３タンパク質を認識する抗体としては、同一の抗体を用いても、各動物種ごとに異なる抗体を用いてもよい。単離したＭＳＣをヒトの再生医療に利用する場合は、ＧＭＰグレードの抗体が利用される。
ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞の単離は、例えば、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）やイムノパニング、アフィニティー・クロマトグラフィーを用いて、あるいは磁気ビーズなどの担体を用いて行うことができる。本開示に係るＭＳＣ純化方法においては、上述のように、ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞の単離に先立ち、従来的なＭＳＣの単離に用いられる接着培養工程は行われない。
ＦＡＣＳ（fluorescence activated cell sorting）では、蛍光抗体で細胞を染色し、個々の細胞が発する蛍光を測定して分析することによって、特定の細胞を分取（ソーティング）する。ＦＡＣＳシステムとしては、例えば、ＢＤバイオサイエンス社のＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）セルソーターを使用することができる。蛍光標識した抗ＣＤ７３抗体を用いてＣＤ７３＋細胞を選別するが、当業者であれば、セルソーターの設定は適宜行うことができる。また、ＣＤ７３＋細胞を選別する際、血球／内皮細胞を取り除くためにＣＤ３１−ＣＤ４５−ＣＤ２３５ａ−を条件に加えてもよいが、このような陰性選択マーカーは、これらに限定はされない。
細胞の単離は、抗ＣＤ７３抗体の結合したビーズ（マイクロスフェア）などの担体を用いて行うこともできる。担体はビーズ、例えば磁気ビーズであることができるが、これに限定はされない。ビーズの代わりにアガロースなどの別の単体を用いることもでき、ビーズは磁気アガロースビーズであってもよい。様々なビーズ（マイクロスフェア）が市販されており、本発明において利用することができる。
抗体と担体との結合は、共有結合、水素結合等でありうるが、特に限定はされない。抗ＣＤ７３抗体は担体に直接結合している必要はなく、間接的に結合するものであってもよい。抗体と担体との間にリンカー（例えば、ビオチン−アビジン系）を介在させることにより、抗体と担体との分離を容易にすることができる。また、例えば、抗ＣＤ７３抗体を細胞に結合させ、抗ＣＤ７３抗体を認識する別の抗体に結合した担体を用いて、細胞の単離を行うこともできる。
骨髄細胞を用いる場合、抗ＣＤ７３抗体の結合した担体による細胞の単離に先立ち、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（商標）磁気ビーズ選択などを用いて、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋細胞を取り除いてもよい。
抗ＣＤ７３抗体の結合した担体をカラムに充填し、そこに細胞試料を通過させることによって、アフィニティー・クロマトグラフィーにより純化を行うこともできる。
移植用間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の製造方法
本発明の一つの態様は、移植用の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の製造方法に関する。このような製造方法に係る態様の一つは、例えば、ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、ｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程、およびｉｉｉ）工程ｉｉで単離された細胞を増殖させる工程を含む。工程ｉおよびｉｉに関する詳細は、本明細書中の他の部分に述べられているとおりである。
工程ｉｉで単離された細胞を増殖させる工程には、ＭＳＣの培養について知られている任意の方法を用いることができる。間葉系幹細胞増殖培地は、当業者に公知であり、様々な培地が市販されている。培養条件、期間は当業者が適宜決定することができる。
本発明の一つの態様は、上記の方法により製造されるＭＳＣを含む細胞集団あるいは細胞組成物に関する。本発明者らは、ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を分離することによって純化した細胞集団は、移植部への生着効率が高いことを見出した。本発明に係るＭＳＣを含む細胞集団は細胞集団中に少なくともＭＳＣを２％以上含み、好ましくは１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、または８０％以上、さらに好ましくは９０％以上含む。全体に占めるＭＳＣの割合は、細胞表面のマーカーを指標にして測定することができる。
上記の方法により製造されたＭＳＣを含む細胞集団は、生体への移植に用いることができる。移植は、欠損あるいは傷害した組織の直接的な再生を目的としたものでも、あるいはＭＳＣが分泌する因子による間接的な効果を目的としたものであってもよい。例えば、ＭＳＣは、急性心筋梗塞、脳卒中、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、移植片対宿主病、および脊髄損傷の患者において、治療効果が得られる可能性が示されている。
特定の組織の再生を目的とする場合は、下記においても述べるように、ＭＳＣに何らかの分化誘導を行った後、移植を行ってもよい。また、遺伝子編集技術等を用いて、移植前にＭＳＣに遺伝子改変を加えておくこともできる。
本発明の一つの態様は、ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、ｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程、ｉｉｉ）工程ｉｉで単離された細胞を増殖させる工程、およびｉｖ）増殖させた細胞を患者に移植する工程を含む、疾患または傷害の治療方法に関する。傷害は例えば、半月板の損傷でありうる。本発明の一つの態様は、例えば、半月板損傷の治療に用いるための細胞組成物でありうる。
移植用細胞の製造方法
本発明の一つの態様は、移植用の細胞の製造方法に関する。このような細胞の製造方法は、例えば、ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、ｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程、およびｉｉｉ）工程ｉｉで単離された細胞に分化を誘導する工程を含む。工程ｉおよびｉｉに関する詳細は、本明細書中の他の部分に述べられているとおりである。
工程ｉｉで単離された細胞に分化を誘導する工程には、ＭＳＣの分化誘導について知られている任意の方法を用いることができる。間葉系幹細胞は、骨芽細胞、骨細胞、脂肪細胞への多分化能を有する。間葉系幹細胞は、分化誘導の条件に応じて、軟骨細胞、筋肉細胞、ストローマ細胞、腱細胞等へも分化させることができる。間葉系幹細胞の分化誘導方法は、当業者に公知であり、様々な分化誘導用培地が市販されている。培養条件、期間は当業者が適宜決定することができる。例えば、軟骨細胞誘導培地は、ＬＯＮＺＡ社等から購入して使用することができる。
本発明の一つの態様は、ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、ｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程、ｉｉｉ）工程ｉｉで単離された細胞に分化を誘導する工程、およびｉｖ）分化を誘導した細胞を患者に移植する工程を含む、疾患または傷害の治療方法に関する。傷害は例えば、半月板の損傷でありうる。本発明の一つの態様は、例えば、半月板損傷の治療に用いるための、分化を誘導した細胞を含む細胞組成物でありうる。
キット
本発明の一つの態様は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の単離、純化または濃縮に用いるためのキットに関する。一つの態様に係るキットは、抗ＣＤ７３抗体を含む。抗体は好ましくはＧＭＰグレードである。
フローサイトメトリーによってＭＳＣを単離するためのキットは、例えば、蛍光標識した抗ＣＤ７３抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ４５抗体を含む。フローサイトメトリー用のキットは、血球／内皮細胞を取り除くための他のマーカーを認識する別の抗体をさらに含んでいてもよく、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ４５抗体は他のマーカーを認識する別の抗体と置き換えてもよい。
ビーズ（マイクロスフェア）などの担体を用いてＭＳＣを単離するためのキットは、抗ＣＤ７３抗体の結合した担体を含む。抗体と担体との結合は、共有結合、水素結合等でありうるが、特に限定はされない。抗ＣＤ７３抗体は担体に直接結合している必要はなく、間接的に結合するものであってもよい。一つの態様に係るキットは、例えば、抗ＣＤ７３抗体と、抗ＣＤ７３抗体に結合する別の抗体に結合した担体を含むことができる。
担体はビーズ、例えば磁気ビーズであることができるが、これに限定はされない。ビーズの代わりにアガロースなどの別の単体を用いることもでき、ビーズは磁気アガロースビーズであることができる。様々なビーズ（マイクロスフェア）が市販されており、本発明において利用することができる。
アフィニティー・クロマトグラフィーを用いてＭＳＣを単離するためのキットは、抗ＣＤ７３抗体の結合した担体を充填したカラムを含む。一つの態様に係るキットは、例えば、カラムに結合した細胞の溶出に用いるためのバッファーを含むことができる。
ＣＤ７３陽性細胞組成物
本発明の細胞純化方法を用いることにより、高純度なＣＤ７３陽性細胞集団または細胞組成物を得ることができる。よって、本発明の一つの態様は、ＣＤ７３陽性細胞組成物の製造方法に関する。このような製造方法に係る態様の一つは、例えば、ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、ｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程、および場合によりｉｉｉ）工程ｉｉで単離された細胞を増殖させる工程を含む。工程ｉおよびｉｉに関する詳細は、本明細書中の他の部分に述べられているとおりである。細胞を増殖させる工程は例えば、３〜３０日間、あるいは１０〜２０日間、例えば１４日間の細胞培養を含む。このような方法により得られる細胞組成物は、少なくとも１０３個、例えば、少なくとも１０４個、好ましくは１０５個以上、より好ましくは１０６個以上、さらに好ましくは１０７個以上のＣＤ７３陽性細胞を含む。なお、本細胞組成物にはＣＤ７３陽性細胞以外の細胞が混入していても良いが、ＣＤ７３陽性細胞の純度が高いことが好ましい。本細胞組成物におけるＣＤ７３陽性細胞の純度は、少なくとも５０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上である。純度を高めるという観点からは、ＦＡＣＳによる細胞の分離が好ましい。本細胞組成物に含まれる細胞は、好ましくはヒトの細胞であるが、特に限定はされない。本発明の一つの態様では、ＣＤ７３陽性細胞を含む細胞組成物は１つの容器に納められている。
本細胞組成物は、例えば、治療を目的とした移植に用いることができる。細胞の移植は、例えば、損傷した部位の再生を目的として、機能の低下した組織の再生を目的として、あるいは炎症や免疫反応の抑制を目的として、行うことができる。移植の対象は、好ましくはヒトであるが、特に限定はされない。本発明の一つの態様は、疾患または傷害の治療に用いるための、少なくとも１０３個、例えば、１０４個以上、好ましくは１０５個以上、より好ましくは１０６個以上、さらに好ましくは１０７個以上のＣＤ７３陽性を含む細胞組成物に関する。治療の対象となる疾患または傷害は例えば、炎症性疾患、免疫異常、自己免疫疾患、膠原病、アレルギー疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、筋損傷、筋断裂、先天性または後天性の筋疾患、筋ジストロフィー、先天性ミオパチー、遠位型ミオパチー、筋強直性疾患、炎症性筋疾患、周期性四肢麻痺、代謝性筋疾患、重症筋無力症、先天性筋無力症候群、ミトコンドリア病、 およびサルコペニアを含むが、これらに限定はされない。本細胞組成物は、他の細胞または組織と一緒に移植されてもよい。
移植効率改善組成物
本発明の一つの態様は、本発明に係るＣＤ７３陽性細胞組成物を含む、移植片（細胞または組織）の移植効率または生着率を改善するための組成物に関する。細胞または組織を生体に移植する場合、通常は、免疫抑制剤を投与しない限り、他家の細胞は移植後に生着できない。本発明者らは、同種他家（骨格筋サテライト細胞と同じ種のマウス由来）のＣＤ７３陽性細胞を共投与することで、驚くべきことに、他家由来の骨格筋サテライト細胞が再生筋として生着可能となることを見出した。ＣＤ７３陽性細胞を共投与した場合、移植部位への炎症細胞の浸潤が抑制される。よって、当業者には、ＣＤ７３陽性細胞を目的とする移植片（細胞または組織）と共に移植することで、移植片の生着率を高めることができることが理解される。また、本発明の一つの態様は、目的とする細胞または組織とＣＤ７３陽性細胞とを一緒に移植することを含む、疾患または傷害の治療方法に関する。より具体的には、本発明の一つの態様は、処置を必要とする対象にＣＤ７３陽性細胞組成物を筋サテライト細胞と共に投与することを含む、筋組織の再生方法に関する。さらに、本発明の一つの態様は、目的とする細胞または組織の移植効率または生着率を改善するための、ＣＤ７３陽性細胞の使用に関する。なお、好ましい移植片（細胞または組織）は同種他家のものであるが、これに限定はされず、異種他家または、自家の細胞もしくは組織が使用されてもよい。また、ＣＤ７３陽性細胞も、同種他家または自家のいずれであってもよい。具体的な病態としては、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ：graft versus host disease）が挙げられる。
また、本発明の一つの態様は、他家細胞を用いた細胞治療において、ＣＤ７３陽性細胞組成物を他家の細胞と同時に投与することを含む、細胞治療の効率を上げる方法に関する。さらに、本発明の一つの態様は、他家細胞を用いた細胞治療において、細胞治療効率を上げるために他家細胞と同時投与するための、ＣＤ７３陽性細胞組成物に関する。
抗炎症組成物
本発明の一つの態様は、本発明に係るＣＤ７３陽性細胞組成物を含む、抗炎症組成物に関する。本発明者らは、潰瘍性大腸炎マウスモデルにおいて、ＣＤ７３陽性細胞の投与により、病態の改善が得られることを明らかにした。また、筋サテライト細胞の筋損傷部位への移植の際にＣＤ７３陽性細胞を同時に移植することにより、炎症細胞の浸潤を抑制できることを示している。よって、当業者には、ＣＤ７３陽性細胞を用いて、生体の炎症反応を抑制できることが理解される。また、本発明の一つの態様は、処置を必要とする対象にＣＤ７３陽性細胞を投与することを含む、炎症性疾患の治療方法に関する。より具体的には、本発明の一つの態様は、処置を必要とする対象にＣＤ７３陽性細胞組成物を投与することを含む、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）の治療方法に関する。さらに、本発明の一つの態様は、炎症反応の抑制あるいは炎症性疾患の治療に用いるためのＣＤ７３陽性細胞の使用に関する。
免疫抑制組成物
本発明の一つの態様は、本発明に係るＣＤ７３陽性細胞組成物を含む、免疫抑制組成物または免疫寛容誘導組成物に関する。本発明者らは、同種他家（骨格筋サテライト細胞と同じ種のマウス由来）のＣＤ７３陽性細胞を共投与することで、驚くべきことに、他家由来の骨格筋サテライト細胞が再生筋として生着可能となることを見出した。細胞または組織を生体に移植する場合、通常は、免疫抑制剤を投与しない限り、他家の細胞は移植後に生着できないことから、当業者には、ＣＤ７３陽性細胞を用いて、生体の免疫反応を抑制しうること、あるいは免疫寛容を誘導しうることが理解される。また、本発明の一つの態様は、処置を必要とする対象にＣＤ７３陽性細胞を投与することを含む、免疫抑制（免疫寛容誘導）方法に関する。さらに、本発明の一つの態様は、免疫反応の抑制（免疫寛容の誘導）あるいは免疫疾患の治療に用いるためのＣＤ７３陽性細胞の使用に関する。
以下に、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これらにより本発明は何ら制限を受けるものではない。本発明者らは、ヒト、マウス、ラットの骨髄組織に含まれるＣＤ７３陽性細胞の機能について調べた。骨髄組織からＣＤ７３の表面抗原を指標とした細胞選別を行い、ＣＤ７３陽性細胞に間葉系幹細胞の表現型を示す細胞が含まれているかどうかを検証した。また、皮下組織への移植を行った際に、効率よく生着することを検証した。以下、具体的な実験例を示す。
＜例１：骨髄組織に存在するＣＤ７３＋細胞の表面抗原解析＞
（骨髄細胞の採取・調製）
材料は、ＬＯＮＺＡ社により購入したヒト骨髄単核球細胞（カタログ番号：２Ｍ−１２５Ｃ）（２０歳以下、男性）、ラット（Ｌｅｗｉｓ、８〜１０週齢、オス）、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｊ、６〜９週齢）を使用した。液体窒素により保存されていた凍結ヒト骨髄単核球細胞（２Ｍ−１２５Ｃ）を取り出し、３７℃の恒温槽で１分温めた。その後、あらかじめ３７℃に温めておいた９ｍｌのＨＢＳＳ（−）溶液（Hanks’ Balanced Salt Solution）に素早く解凍した。遠心機（８００ｇ）にて室温で５分間遠心分離し、上清を除去した後に細胞ペレットを新しいＨＢＳＳ（−）溶液にて再懸濁し、ヒト骨髄細胞懸濁液を得た。
ラットおよびマウスの骨髄細胞ついては、成体の大腿骨、脛骨、腸骨から採取した。取り出した大腿骨、脛骨、腸骨を不織布により外側の筋肉や結合組織を除去した後にＰＢＳ（−）にて洗浄した。骨切りハサミ（松吉医療総合）および外科用ハサミ（室町機器）にて合計１５０〜２００回刻んだ後、ＨＢＳＳ（−）溶液を用いて骨片を洗浄し、血球系細胞を洗い流した。残った骨片を更に細かく刻み、２５Ｕ／ｍｌ ＤＮａｓｅ１（シグマ）を添加した０．２％コラゲナーゼ溶液（ｗａｋｏ）（ＤＭＥＭ）に入れ、３７℃で１時間１００ｒ／分の速度で振盪した。コラゲナーゼ処理した骨片をさらにハサミで刻み、乳棒にて徐々に砕きながらＨＢＳＳ（−）溶液で洗浄し、７０μｍメッシュのセルストレーナー（ファルコン）にて濾過した。遠心機８００ｇにて４℃で５分間遠心分離し、上清を除去した後に細胞ペレットを新しいＨＢＳＳ（−）溶液にて再懸濁し、ラットおよびマウス骨髄細胞懸濁液を得た。赤血球細胞を除去するため、遠心分離後の細胞ペレットに対し、ＡＣＫ溶液（ＬＯＮＺＡ）もしくは水による溶血操作を行った。セルストレーナーで赤血球の破片等を除去し、骨髄懸濁液を得た。
（細胞表面の抗体染色）
上記方法によって得られた骨髄細胞２．０×１０８〜４．０×１０８個をＨＢＳＳ（−）溶液１ｍｌに懸濁し、１５ｍｌ遠沈管に添加した。１倍希釈のＡＰＣまたはＰＥ標識抗ヒトＣＤ７３抗体、ＰＥ−ｃｙ７標識抗ＣＤ３１抗体、ＰＥ−ｃｙ７標識抗ＣＤ４５抗体、ＰＥ−ｃｙ７標識抗ＣＤ２３５ａ抗体を２〜３μＬ（抗体量０．４５〜０．７μｇ）細胞浮遊液に懸濁し、チューブに２００μＬ分注した。ヒト間葉系幹細胞マーカーとして、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ２９抗体、ＡＰＣ標識抗ＣＤ４４抗体、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ９０抗体、ＰＥ標識抗ＣＤ２７１抗体およびＡＰＣ標識抗レプチンレセプター抗体を各チューブに添加し、氷上で３０分間遮光し免疫抗体染色をした（ＢＤ社製抗体、およびＲ＆Ｄ社製抗体を使用）。１倍希釈のＡＰＣまたはＰＥ標識抗マウスＣＤ７３抗体、ＰＥ−ｃｙ７標識抗ＣＤ３１抗体、ＰＥ−ｃｙ７標識抗ＣＤ４５抗体、ＰＥ−ｃｙ７標識抗Ｔｅｒ１１９抗体を細胞浮遊液に懸濁し、チューブに２００μＬ分注した。マウス間葉系幹細胞マーカーとして、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ２９抗体、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４４抗体、ＰＥ標識抗ＣＤ９０抗体、ＡＰＣ標識抗ＣＤ１４０ａ抗体およびビオチン標識抗レプチンレセプター抗体、ＰＥ標識ストレプトアビジンを各チューブに添加し、氷上で３０分間遮光し免疫抗体染色をした（ＢＤ社製抗体を使用）。１倍希釈のＡＰＣ標識抗ラットＣＤ７３抗体、ビオチン標識抗ＣＤ３１抗体、ビオチン標識抗ＣＤ４５抗体、ＰＥｃｙ７標識ストレプトアビジンを細胞浮遊液に懸濁し、チューブに２００μＬ分注した。ラット間葉系幹細胞マーカーとして、ＦＩＴＣ標識抗ラットＣＤ２９抗体、ＰＥ標識抗ＣＤ４４抗体、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ５４抗体、ＢＶ４２１標識抗ＣＤ９０抗体を各チューブに添加し、氷上で３０分間遮光し免疫抗体染色をした（ＢＤ社製抗体を使用）。その後、ＨＢＳＳ（−）溶液５００μＬを加え、４℃下８００ｇで５分間遠心した。沈殿した細胞集団を、２μｇ／ｍＬの濃度でヨウ化プロピジウム（以下ＰＩ）を加えたＨＢＳＳ（−）溶液３ｍＬで懸濁し、１×１０７細胞程度になるように調製した。この細胞懸濁液に対し、メッシュ付き５ｍｌラウンドチューブ（ＢＤ）を用いて得られた細胞浮遊液を以下のフローサイトメーターによる解析に用いた。
（ＣＤ７３細胞の細胞表面抗原解析）
表面抗原抗体と反応させたヒト、マウスおよびラットの骨髄細胞をフローサイトメーターを用いて解析した。フローサイトメーターには、ＦＡＣＳＡｒｉａを使用した。生細胞分画であるＰＩ陰性細胞集団をゲートし、ダブレット細胞をゲートアウトした後、その中で縦軸を血球／内皮マーカー（ヒト：ＣＤ３１／ＣＤ４５／ＧＰＡ；マウス：ＣＤ３１／ＣＤ４５／Ｔｅｒ１１９；ラット：ＣＤ３１／ＣＤ４５）に、また横軸をＣＤ７３マーカーにて展開した。血球／内皮マーカー陰性、およびＣＤ７３マーカー陽性細胞集団にゲートを設定し、その細胞集団における間葉系幹細胞マーカーの発現解析を行った。その結果、ヒトとマウスの骨髄に存在するＣＤ７３陽性細胞は、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ２７１（ヒト）、ＣＤ１４０ａ（マウス）、レプチンレセプターすべて陽性であった（図１、表１および２参照）。さらに、ヒト脂肪組織中に存在するＣＤ７３陽性細胞も前述の抗体（クローンＡＤ２）にて分離可能であり、間葉系幹細胞マーカーであるＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０を発現していた（図２参照）。ラット骨髄に存在するＣＤ７３陽性細胞は、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９０がおおむね陽性であった（図３および表３参照）。
Figure 2018207918
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＜例２：ＣＤ７３＋細胞のコロニー形成能力解析＞
（ＣＤ７３による細胞純化の効果）
実施例１に示したＣＤ７３陽性細胞をフローサイトメーターにて分離した。９６ｗｅｌｌプレートに２００μＬの間葉系幹細胞増殖培地（ＤＭＥＭ＋２０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン）を添加し、１ｗｅｌｌに対し１細胞をソーティングした。プレートは３７℃のインキュベーターにて培養し、１４日後にコロニーが形成されてているｗｅｌｌのカウントを行った。
その結果、間葉系幹細胞の特徴でもあるコロニー形成能力は、全骨髄細胞（Ｗｈｏｌｅ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ：ＷＢＭ）と比較し、１３倍以上の形成能力を有していることが分かった（図４参照）。
＜例３：ＣＤ７３＋細胞の生着機能解析＞
（間葉系幹細胞の皮下移植による生着率の評価）
ＣＤ７３陽性細胞を分離し、間葉系幹細胞増殖培地で２継代した後、細胞数が１．０×１０６〜３．０×１０６個になったところで、１５ｍｌ遠沈管に添加し遠心分離した。ペレット細胞に対し、軟骨細胞誘導培地（ＬＯＮＺＡ）＋ＴＧＦｂ３＋ＢＭＰ６に懸濁し、４分２００ｇにて遠心後３７℃のインキュベーターにて培養した。４日ごとに新しい軟骨細胞誘導培地を交換し、２週間分化誘導を行った。
得られた軟骨細胞ペレットをラットの頭部皮下組織に移植し、２週間後に組織を採取し、凍結切片の作成およびパラフィン包埋切片を作成した。凍結切片においては、マクロファージのマーカーであるＩｂａ１抗体（Ｗａｋｏ）、軟骨基質を染めるＡｇｇｒｅｃａｎ抗体（Developmental Studies Hybridoma Bankより入手）、細胞の核を染めるＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ）を用いて染色を行った。パラフィン切片においては、軟骨基質を染めるサフラニンＯ（武藤化学）による染色を行った。
移植細胞を検証した結果、ＣＤ７３陽性細胞を純化した細胞集団では、移植後の軟骨形成能力が高く、またマクロファージの浸潤が少ないことが確認された。一方、細胞を純化せずに培養した全骨髄細胞では、軟骨形成能力が低下しており、マクロファージの浸潤が確認された（図５参照）。
＜例４：ヒト間葉系組織からのＣＤ７３陽性細胞の分離＞
骨髄、内臓脂肪、皮下脂肪、羊膜、絨毛膜、絨毛、臍帯を破砕したのちに、０．２％コラゲナーゼ溶液により３７℃で１時間処理した。ＣＤ７３タンパク質を特異的に認識する抗体を用いて細胞を標識し、フローサイトメトリーで解析した。結果として、ＣＤ７３陽性細胞細胞は、骨髄に９．５％、内臓脂肪に３．０７％、皮下脂肪に２０．７８％、羊膜に１７．４１％、絨毛膜に２．３５％、絨毛に４．０３％、臍帯に２．１１％存在することが明らかとなった（図６参照）。
＜例５：ＣＤ７３＋細胞のコロニー形成能力解析＞
骨髄、内臓脂肪、皮下脂肪、羊膜、絨毛膜、絨毛から得られるＣＤ７３陽性細胞のコロニー形成能力を調べた。臍帯からは、ＣＤ７３陽性細胞は得られなかった。結果として、本発明に係る新鮮純化法を用いることにより、各組織のＣＤ７３陽性細胞のうち、骨髄、内臓脂肪、皮下脂肪、絨毛膜、絨毛からコロニー形成能を有する細胞を高効率で分離することが可能であることが明らかとなった（図７および８参照）。
＜例６：ＣＤ７３＋細胞の増殖能力解析＞
皮下脂肪、内臓脂肪、絨毛膜、絨毛から分離したＣＤ７３陽性細胞の増殖能力を調べた。結果として、皮下脂肪、内臓脂肪、絨毛膜、絨毛から分離したＣＤ７３陽性細胞は、１４日間の培養で増殖し、培養前に比べて１００倍程度の細胞数を得ることが可能であることが示された（図９参照）。よって、本発明に係る新鮮純化によって、生体への移植に用いる投与細胞数を従来法より減らせる可能性がある。
＜例７：潰瘍性大腸炎マウスモデル＞
３％のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を飲水投与することによって潰瘍性大腸炎を引き起こしたマウスに対し、ＣＤ７３陽性細胞と既存分離法によるＭＳＣを移植した（図１０参照）。より具体的には、８週齢のオスＣ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＣＡＧ−ＥＧＦＰ）マウスの皮下脂肪からＣＤ７３陽性細胞を取得し、３％ＤＳＳ投与の１日目と５日目にＶｅｈｉｃｌｅ、新鮮純化ＣＤ７３陽性細胞、または既存分離法によるＭＳＣ（それぞれ１４日または１８日間培養した細胞）を１０週齢のオスＣ５７ＢＬ／６−Ｎマウスに静脈投与（Ｉ．Ｖ．）した。その後、ＤＳＳ投与を中止し、８日目に大腸を調べた。
潰瘍性大腸炎の指標の一つとして、大腸の長さに短縮が見られることが知られている。結果として、細胞投与をしなかったＶｅｈｉｃｌｅ群、既存分離法のＭＳＣを投与した群に比べて、ＣＤ７３陽性細胞を投与した群では、大腸長の短縮の抑制が認められた（図１１参照）。投与したＣＤ７３陽性細胞がレシピエント側のマウス自身の上皮細胞を刺激し、再生を促したと考えられる。
直腸炎症部位の組織学的検討によって、ＣＤ７３陽性細胞の投与により、移植した細胞が炎症部にホーミングし、大腸の構造を保持する効果があることが認められた。これは、既存分離法のＭＳＣを投与した群ではほとんど認められなかった現象である（図１２参照）。また、炎症度スコアも、ＣＤ７３陽性細胞投与群では、Ｖｅｈｉｃｌｅ群に比べて有意に低くなっていた（図１２参照）。
＜例８：骨格筋サテライト細胞とＣＤ７３陽性細胞の共移植＞
カルディオトキシン（ＣＴＸ）を前脛骨筋に投与することで筋損傷を引き起こしたマウスに、同種他家マウスの骨格筋幹細胞（サテライト細胞）を投与した。通常の場合は、免疫抑制剤を投与しない限り、他家の細胞は生着できない。しかしながら、同種他家（骨格筋サテライト細胞と同じ種のマウス由来）のＣＤ７３陽性細胞を共投与することで、他家由来の骨格筋サテライト細胞が再生筋として生着可能になることが見出された（図１３および１４参照）。
ドナー側には、Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ （ＣＡＧ−ＥＧＦＰ）マウス由来のＳＭ／Ｃ−２．６陽性筋サテライト細胞と、８週齢のオスＣ５７ＢＬ／６−Ｎマウス由来のＣＤ７３陽性細胞を用いた。筋サテライト細胞はラミニンを含む培地中で５日間培養したものを用いた。ＣＤ７３陽性細胞は２週間培養したものを用いた。レシピエント側には、８週齢のオスＢＡＬＢｃＡマウスを用いた。筋サテライト細胞は６．０×１０５個の細胞を移植した。ＣＤ７３陽性細胞は６．０×１０３個の細胞（ＳＣ＋ＣＤ７３−Ｌ）または６．０×１０４個の細胞（ＳＣ＋ＣＤ７３−Ｍ）のいずれかを移植に用いた。移植は蛇毒（ＣＴＸ）の投与により筋損傷を生じさせた１日後に行い、解析は移植から１４日後に行った。図１３および１４に示されるとおり、６．０×１０４個のＣＤ７３陽性細胞を筋サテライト細胞と一緒に移植した場合（ＳＣ＋ＣＤ７３−Ｍ）には特に、他家マウス由来の細胞が再生筋を構成し、筋再生の促進が認められた。
本明細書には、本発明の好ましい実施態様を示してあるが、そのような実施態様が単に例示の目的で提供されていることは、当業者には明らかであり、当業者であれば、本発明から逸脱することなく、様々な変形、変更、置換を加えることが可能であろう。本明細書に記載されている発明の様々な代替的実施形態が、本発明を実施する際に使用されうることが理解されるべきである。また、本明細書中において参照している特許および特許出願書類を含む、全ての刊行物に記載の内容は、その引用によって、本明細書中に明記された内容と同様に取り込まれていると解釈すべきである。
本発明者らは、生体から単離された新鮮な組織から、ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を分離することにより、簡便かつ高効率に間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を純化、濃縮できることを見出した。本発明により、培養前に間葉系幹細胞のみを単一抗体により選択的に分離し、移植部への生着効率を高める間葉系幹細胞の培養系を確立することができる。単一抗体により選択することから、複数の抗体を用いる方法に比べてコスト面で大きな優位性がある。また、単一抗体による選択であるため、高価なマルチカラーＦＡＣＳシステムの使用が要求されず、磁気ビーズ等を用いた単離が可能となる。さらに、本発明により、異なる動物種間で同一の抗原が認識されることが見出されたことより、同一抗原を発現する細胞を用いた非臨床試験での安全性、有効性の評価が可能となり、雑多な細胞集団ではなく新鮮純化細胞を用いることで、安定した移植効果が期待される。

Claims (43)

  1. ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、およびｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程を含む、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の純化方法。
  2. ＣＤ７３タンパク質を唯一の陽性選択マーカーとして用いることを特徴とする、請求項１記載の方法。
  3. ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ２７１、ＣＤ１４０ａ、またはレプチンレセプターのいずれをも選択マーカーとして用いないことを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
  4. 血球／内皮細胞を除去する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
  5. 血球／内皮細胞を取り除くための陰性選択マーカーとしてＣＤ３１、ＣＤ４５、ＧＰＡ、および／またはＴｅｒ１１９を用いて血球／内皮細胞を除去することを特徴とする請求項４記載の方法。
  6. ＣＤ７３タンパク質をＭＳＣ純化のための唯一の選択マーカーとして用いることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
  7. 生体から単離された新鮮な細胞の集団が骨髄、脂肪組織、臍帯、胎盤、滑膜、または歯髄由来であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
  8. 生体から単離された新鮮な細胞の集団をコラゲナーゼで処理する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
  9. 生体から単離された新鮮な細胞の集団が末梢血由来であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
  10. 生体から単離された新鮮な細胞の集団がＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＡＭ３１００（プレリキサフォル）を生体に投与した後に生体から単離されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
  11. 抗ＣＤ７３抗体の結合した担体またはＦＡＣＳを用いて、ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
  12. 抗ＣＤ７３抗体の結合した担体が磁気ビーズである、請求項１１記載の方法。
  13. 抗ＣＤ７３抗体の結合した担体がカラムに充填されている、請求項１１記載の方法。
  14. ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、および
    ｉｉ）抗ＣＤ７３抗体の結合した担体を用いてＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程を含む、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の純化方法であって、
    ＣＤ７３タンパク質を唯一の陽性選択マーカーとして用い、
    ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ２７１、ＣＤ１４０ａ、またはレプチンレセプターのいずれをも選択マーカーとして用いず、
    ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞の単離に先立ち、細胞の接着培養は行わないことを特徴とする、純化方法。
  15. ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、ｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程、およびｉｉｉ）工程ｉｉで単離された細胞を増殖させる工程を含む、移植用の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の製造方法。
  16. ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、ｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程、およびｉｉｉ）工程ｉｉで単離された細胞に分化を誘導する工程を含む、移植用の細胞の製造方法。
  17. ＧＭＰグレードの抗体が用いられることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか一項記載の方法。
  18. 抗ＣＤ７３抗体の接合した担体を含む、請求項１〜１６のいずれか一項記載の方法に用いるためのキット。
  19. 抗ＣＤ７３抗体の接合した担体が磁気ビーズである、請求項１８記載のキット。
  20. 抗ＣＤ７３抗体の接合した担体がカラムに充填されている、請求項１８記載のキット。
  21. 標識の接合した抗ＣＤ７３抗体を含む、請求項１〜１６のいずれか一項記載の方法に用いるためのキット。
  22. ＧＭＰグレードの抗体が用いられることを特徴とする、請求項１８〜２１のいずれか一項記載のキット。
  23. 請求項１〜１６のいずれか一項記載の方法により得られる細胞を含む細胞組成物。
  24. ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、ｉｉ）ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程を含む、ＣＤ７３陽性細胞組成物の製造方法。
  25. 工程ｉｉで単離された細胞を増殖させる工程をさらに含む、請求項２４に記載のＣＤ７３陽性細胞組成物の製造方法。
  26. ＣＤ７３タンパク質を唯一の選択マーカーとして用いることを特徴とする、請求項２４または２５に記載の方法。
  27. ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞の単離に先立ち、細胞の接着培養は行わないことを特徴とする、請求項２４〜２６のいずれか一項記載の方法。
  28. ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞の単離に先立ち、血球／内皮細胞を除去する工程を含まないことを特徴とする請求項２４〜２７のいずれか一項記載の方法。
  29. 生体から単離された新鮮な細胞の集団が骨髄、皮下脂肪、内臓脂肪、絨毛、絨毛膜、または羊膜由来であることを特徴とする、請求項２４〜２８のいずれか一項記載の方法。
  30. ＦＡＣＳを用いて、ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離することを特徴とする、請求項２４〜２９のいずれか一項記載の方法。
  31. ＧＭＰグレードの抗体が用いられることを特徴とする、請求項２４〜３０のいずれか一項記載の方法。
  32. ｉ）生体から単離された新鮮な細胞の集団を用意する工程、および
    ｉｉ）ＦＡＣＳを用いてＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞を単離する工程を含む、ＣＤ７３陽性細胞組成物の製造方法であって、
    生体から単離された新鮮な細胞の集団が皮下脂肪または内臓脂肪由来であり、
    ＣＤ７３タンパク質を唯一の選択マーカーとして用い、
    ＣＤ７３タンパク質を表面に発現する細胞の単離に先立ち、細胞の接着培養は行わないことを特徴とする、ＣＤ７３陽性細胞組成物の製造方法。
  33. 請求項２４〜３２のいずれか一項記載の方法により得られるＣＤ７３陽性細胞組成物。
  34. ＣＤ７３陽性細胞の純度が少なくとも９０％である、請求項３３記載のＣＤ７３陽性細胞組成物。
  35. 少なくとも１０３個のＣＤ７３陽性細胞を含む、請求項３３または３４記載のＣＤ７３陽性細胞組成物。
  36. 請求項３３〜３５のいずれか一項記載のＣＤ７３陽性細胞組成物を含む、移植効率改善組成物。
  37. 請求項３３〜３５のいずれか一項記載のＣＤ７３陽性細胞組成物を含む、抗炎症組成物。
  38. 請求項３３〜３５のいずれか一項記載のＣＤ７３陽性細胞組成物を含む、免疫抑制組成物。
  39. 請求項３３〜３５のいずれか一項記載のＣＤ７３陽性細胞組成物と筋サテライト細胞とを含む、筋損傷または筋疾患の治療に用いるための組成物。
  40. 請求項３３〜３５のいずれか一項記載のＣＤ７３陽性細胞組成物を含む、炎症性腸疾患の治療に用いるための組成物。
  41. 請求項３３〜３５のいずれか一項記載のＣＤ７３陽性細胞組成物を含む、ＧＶＨＤの治療または予防に用いるための組成物。
  42. 他家細胞を用いた細胞治療において、請求項３３〜３５のいずれか一項記載のＣＤ７３陽性細胞組成物を他家の細胞と同時に投与することを含む、細胞治療の効率を上げる方法。
  43. 他家細胞を用いた細胞治療において、細胞治療効率を上げるために他家細胞と同時投与するための、請求項３３〜３５のいずれか一項記載のＣＤ７３陽性細胞組成物。
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