JP2016513962A - 療法および予防のための細胞を単離する方法 - Google Patents

療法および予防のための細胞を単離する方法 Download PDF

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Abstract

内皮前駆細胞(EPC)を単離するための方法が開示される。さらに詳細には、本発明は、自己複製および分化能を示す内皮前駆細胞を単離するための方法を開示する。本発明の単離された細胞集団は、特に、インビトロまたはインビボでの内皮細胞の作製およびこれらの細胞の投与による様々な状態の治療的処置または予防的処置を含む広範囲の臨床および研究の場において有用である。治療の影響および/またはこれらの細胞が曝露される可能性のある潜在的な処理方式もしくは培養方式の毒性を試験するためのインビトロベースのスクリーニングシステムなどの研究目的で内皮前駆細胞を単離することも容易になる。本発明はまた、間葉系幹細胞、特に、胎児起源および/または母体起源の間葉系幹細胞を単離するための方法も開示する。これらの細胞はまた、インビトロおよびインビボでの様々な治療的用途、予防的用途、および研究用途においても有用である。

Description

発明の分野
本発明は、内皮前駆細胞(EPC)を単離する方法に関する。さらに詳細には、本発明の方法は、自己複製および分化能を示す内皮前駆細胞を単離する方法に関する。本発明の単離された細胞集団は、特に、インビトロまたはインビボでの内皮細胞の作製およびこれらの細胞の投与による様々な状態の治療的処置または予防的処置を含む広範囲の臨床および研究の場において有用である。治療の影響および/またはこれらの細胞が曝露される可能性のある潜在的な処理方式もしくは培養方式の毒性を試験するための、インビトロベースのスクリーニングシステムなどの研究目的で内皮前駆細胞を単離することも容易になる。関連する局面において、本発明の方法はまた、間葉系幹細胞、特に、胎児起源および/または母体(maternal)起源の間葉系幹細胞の単離も可能にする。これらの細胞はまた、インビトロおよびインビボでの様々な治療的用途、予防的用途、および研究用途においても有用である。一回の操作で複数の別個の細胞集団を効率的に単離することができるプロトコールの設計はこれまでに例がない。
発明の背景
本明細書において著者が言及する刊行物の書誌学上の詳細を説明の最後にアルファベット順に集めた。
本明細書におけるあらゆる先行技術についての記載は、先行技術がオーストラリアではありふれた一般知識の一部をなすことを認めるものでも示唆をするものでもなく、先行技術がオーストラリアではありふれた一般知識の一部をなすことを認めるとも示唆をするとも解釈してはならない。
血管系は胚発生および成年期に必要不可欠である(Flamme, I., et al.; Patan, S.,を参照されたい)。内皮細胞は所定の位置に置かれたら死ぬまで血管を維持しなければならない。内皮細胞の自然代謝回転は脈管構造全体にわたって均一ではなく、剪断応力部分に集中している(Schwartz, S.M. & Benditt, E.P.; Xu, Q,を参照されたい)。動物データに基づいて、アテローム性動脈硬化症に対して耐性のある部分にある内皮細胞の寿命は12ヶ月であるのに対して、病変を起こしやすい部位にある細胞は数週間しか生存せず、動物が年をとるにつれてさらに短くなる。従って、内皮細胞は動脈壁のいくつかの部分において何回も複製する (Xu, Q.を参照されたい)。この代謝回転はアテローム性動脈硬化症およびその危険因子、例えば、応力および年齢によって増加し、その結果として内皮老化が起こる(Minamino, T. & Komuro, I.,を参照されたい)。
内皮層には欠損が起こる絶え間ないリスクがあるので、内皮前駆細胞を介した修復機構が恒久的に活動する。これらの細胞は、分裂して、さらなる細胞を生じる、血管内膜に既にある常在性の内皮前駆細胞でもよい。実際に、血管内に高増殖性の内皮細胞を特定することができる。血管由来の常在性内皮細胞、例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)およびヒト大動脈内皮細胞(HAEC)はインビトロでは40回を超える集団倍化にわたって継代することができる。これは、これらの細胞が高度に分化し、成熟した内皮細胞だという広く支持された考えとは対照的な立場を取る事実である。または、内皮前駆細胞は遠くにある供給源から来る場合がある。数学モデルから、遠くからの内皮前駆細胞ホーミングがなければ、内皮にある欠損の少なくとも4.6％(SD 1.0％)は65歳までに修復できないことが見積もられた(Op den Buijs, J., et al.)。しかしながら、このことから、常在性細胞は血管修復の大多数を引き受けていることが分かる。この常在性内皮の自己複製能は年齢に左右される。すなわち、マウスモデルでは、大動脈内皮細胞の15％は出生時に細胞分裂しているのに対して、6ヶ月では0.6％しか細胞分裂していない(Schwartz, S.M. & Benditt, E.P.を参照されたい)。従って、血管内皮への、遠くにある内皮前駆細胞の相対的な寄与は小さいが、年をとるにつれてますます明白になる(Op den Buijs, J., et al.)。これは、成体血管ホメオスタシスを維持するための内皮前駆細胞療法の必要性に光をあてる。
内皮前駆細胞が特定されたことで、様々な細胞タイプを用いて、血管修復、主として心筋梗塞時および重症下肢虚血時の血管修復を促進する非常に多くの臨床試験が促された。利用される、最も頻度の高い供給源は、末梢循環に由来する初期増殖内皮前駆細胞および骨髄単核細胞(MNC)であった。重症下肢虚血の処置後に、下肢喪失の減少、無痛歩行距離の増加、および虚血下肢潰瘍の治癒などの大きな改善が観察された(Kawamoto, A., et al.; Tateishi-Yuyama, E., et al.を参照されたい)。心筋梗塞影響における内皮前駆細胞療法の利益は中程度であり、梗塞サイズの縮小に関連して左室駆出率(LVEF)が2〜8％改善された(Assmus, B., et al.; Stamm、C., et al.を参照されたい)。しかしながら、死亡、再梗塞、または脳卒中などの主要な心血管アウトカムに及ぼす内皮前駆細胞療法の影響を報告した研究はない(Kumar, A.H. & Caplice、N.M.を参照されたい)。
これらの初期臨床研究における大きな制約は、どうやって内皮前駆細胞が定義されたのかと関係がある。循環している内皮前駆細胞の数を明らかにするために、血管内皮(VE)-カドヘリンまたはCD31などの古典的な内皮マーカーに加えてCD34、VEGFR2(KDR/FLK-1)、および/またはCD133を用いたフローサイトメトリーが従来より用いられる。しかしながら、どのマーカー組み合わせからも、信頼性の高い、または識別力のあるマーカーセットが得られていない。最近の比較試験では、心筋梗塞になったばかりの患者のソーティングされた骨髄細胞またはソーティングされていない骨髄細胞の効力が比較され、両群はほぼ同じ低めの割合(3％)で左室駆出率を改善したのでアウトカムの差違は見出されなかった(Tendera, M., et al.を参照されたい)。内皮前駆細胞を単離する代わりのアプローチは、フィブロネクチン上で短期間培養した後に、部分的に分化した内皮前駆細胞を使用するアプローチである。これによって、アセチル化低密度リポタンパク質を消化し、3日以内に現れるいくつかの特定のレクチンを染色することができる紡錘状細胞が生じる。しかしながら、両方法とも造血細胞によるかなりの混入が生じる。Asaharaらは、CD34濃縮集団がCD45を発現するので、ほとんど(97％)造血細胞であることを報告した。CD34、VEGFR2、およびCD133は造血幹細胞にかなり豊富にあり、内皮前駆細胞に特異的でない(Case, J., et al.を参照されたい)。興味深いことに、単球(CD34+CD14+)は臨床試験に用いられたときに、血管再建された冠状動脈の再狭窄に結び付けられており、血管内のアテローム性動脈硬化巣の一因となる(Kumar, A.H. & Caplice, N.M.を参照されたい)。従って、混入細胞は純粋な内皮前駆細胞療法の利益を打ち消す可能性がある。
以前の試験において明らかになった別の大きな問題は療法のために十分な細胞数を得ることが難しいことであった。ほとんどのレジメンにおいて単回注射が用いられたが、連続送達が有利であると予想されるだろう。FACSまたは磁気ソーティングによって単離された(造血細胞混入)循環内皮細胞は血液1mLあたり0〜10個の細胞だと見積もられている(Woywodt, A., et al.を参照されたい)。しかしながら、これらの末梢由来細胞の大半は増殖能が限られており(17倍)、高い増殖能(1000倍)をもつ唯一の細胞は骨髄由来である(Lin, Y.,et al.を参照されたい)。従って、これらの細胞は、現在、療法のための信頼性の高い供給源でない。
関連する局面において、本発明の単離方法は、内皮前駆細胞の単離を可能にすることに加えて、母体間葉系幹細胞が混入していない間葉系幹細胞、特に、胎児間葉系幹細胞の単離を可能にすることも確かめられている。実際に、2種類の間葉系幹細胞集団である胎児間葉系幹細胞しか含まない集団と、培養によって母体間葉系幹細胞を生じるもう1つの集団を得ることができる。具体的には、シングルアイソレーションプロトコールの状況では、複数の別個の、かつ稀な前駆体細胞集団を、単離プロトコール中に別個の画分に分離することによって効果的に単離することができる。従って、このプロトコールの開発によって、複数の別個の前駆体細胞集団を単離する、信頼性が高くかつ日常的な手段が初めて得られた。
従って、前駆細胞に基づく血管療法が現実のものとなるのであれば、利用しやすく、信頼性が高く、かつ豊富な内皮前駆細胞供給源を特定することが必要とされる。本発明につながった研究において、今日まで利用可能であったものより純度の高い内皮前駆細胞集団を効率的かつ確実に単離することができる単離方法が開発された。この内皮前駆細胞集団は、先行技術の単離方法を特徴付けていた程度の細胞混入を含まない。これによって、この発見から、インビトロまたはインビボで使用するための純粋な内皮細胞集団を日常的かつ確実に単離する手段が初めて得られた。さらなる局面では、胎盤は実は豊富な内皮細胞供給源であり、この方法を特に胎盤に適用することによって、以前では実現不可能であったレベルの純度および存在量の内皮前駆細胞の単離が可能になることも確かめられている。従って、本発明の単離方法を特に胎盤組織に適用することによって、自己複製および分化能を両方とも示す豊富な内皮前駆細胞供給源が得られる。従って、この発見によって、今や、内皮前駆細胞に基づく療法の現実的な開発が可能になった。
本明細書および以下の特許請求の範囲の全体にわたって、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む(comprise)」という単語ならびに「含む(comprises)」および「含む(comprising)」などの語尾変化は、述べられた整数もしくは工程または整数もしくは工程の集まりを含むことを意味するが、他の任意の整数もしくは工程または整数もしくは工程の集まりを排除することを意味しないことが理解されるだろう。
本明細書で使用する、「に由来する」という用語は、特定の整数または整数の集まりが、明記された種から生じたが、必ずしも、明記された供給源から直接得られたとは限らないことを示すと解釈するものとする。さらに、本明細書で使用する、単数形「1つ(a)」、「および(and)」、および「その(the)」は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き複数の指示対象を含む。
特に定義のない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および化学用語は、本発明が属する当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
本発明の一局面は、哺乳動物内皮前駆細胞を単離する方法であって、以下の工程:
(i)哺乳動物細胞集団を単離する工程;
(ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;
(iii)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程;および
(iv)CD31lo/-表現型プロファイルを発現する、工程(iii)に由来するCD34+細胞の亜集団を単離し、それによって内皮前駆細胞を単離する工程
を含む方法に関する。
別の局面において、哺乳動物内皮前駆細胞を単離する方法であって、以下の連続工程:
(i)哺乳動物細胞集団を単離する工程;
(ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;
(iii)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程;および
(iv)CD31lo/-表現型プロファイルを発現する、工程(iii)に由来するCD34+細胞の亜集団を単離し、それによって内皮前駆細胞を単離する工程
を含む方法が提供される。
関連する局面において、本発明は、哺乳動物間葉系幹細胞を単離する方法であって、以下の工程:
(i)哺乳動物細胞集団を単離する工程;
(ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;ならびに
(a)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程、およびCD31-表現型プロファイルを発現する、前記CD34+細胞の亜集団を単離する工程、ならびに/または
(b)CD34-表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を単離し、それによって間葉系幹細胞を単離する工程
を含む方法に関する。
さらに別の局面において、哺乳動物間葉系幹細胞を単離する方法であって、以下の連続工程:
(i)哺乳動物細胞集団を単離する工程;
(ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;ならびに
(a)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程、およびCD31-表現型プロファイルを発現する、前記CD34+細胞の亜集団を単離する工程;ならびに/または
(b)CD34-表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を単離し、それによって間葉系幹細胞を単離する工程
を含む方法が提供される。
さらに別の局面において、哺乳動物内皮前駆細胞を単離する方法であって、以下の工程:
(i)哺乳動物細胞集団を単離する工程;
(ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;
(iii)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程;および
(iv)CD31lo/-表現型プロファイルを発現する、工程(iii)に由来するCD34+細胞の亜集団を単離し、それによって内皮前駆細胞を単離する工程を含み、
前記内皮前駆細胞が血管内皮細胞に分化することができる方法が提供される。
さらに別の局面において、単能性(monopotent)哺乳動物内皮前駆細胞または複能性(multipotent)哺乳動物内皮前駆細胞を単離する方法であって、以下の工程:
(i)哺乳動物細胞集団を単離する工程;
(ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;
(iii)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程;および
(iv)CD31lo/-表現型プロファイルを発現する、工程(iii)に由来するCD34+細胞の亜集団を単離し、それによって単能性内皮前駆細胞または複能性内皮前駆細胞を単離する工程
を含む方法が提供される。
なおさらに別の局面において、哺乳動物内皮前駆細胞を単離する方法であって、以下の工程:
(i)哺乳動物胎盤由来細胞集団を単離する工程;
(ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;
(iii)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程;および
(iv)CD31lo/-表現型プロファイルを発現する、工程(iii)に由来するCD34+細胞の亜集団を単離し、それによって内皮前駆細胞を単離する工程
を含む方法が提供される。
なおさらに別の局面において、本発明は、哺乳動物間葉系幹細胞を単離する方法であって、以下の工程:
(i)哺乳動物胎盤由来細胞集団を単離する工程;
(ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;ならびに
(a)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程、およびCD31-表現型プロファイルを発現する、前記CD34+細胞の亜集団を単離する工程;ならびに/または
(b)CD34-表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を単離し、それによって間葉系幹細胞を単離する工程
を含む方法に関する。
別の局面において、哺乳動物内皮前駆細胞を単離する方法であって、以下の工程:
(i)哺乳動物胎盤分葉細胞物質を単離する工程;
(ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;
(iii)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程;および
(iv)CD31lo/-表現型プロファイルを発現する、工程(iii)に由来するCD34+細胞の亜集団を単離し、それによって内皮前駆細胞を単離する工程
を含む方法が提供される。
さらに別の局面において、哺乳動物間葉系幹細胞を単離する方法であって、以下の工程:
(i)哺乳動物胎盤分葉細胞物質を単離する工程;
(ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;ならびに
(a)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程、およびCD31-表現型プロファイルを発現する、前記CD34+細胞の亜集団を単離する工程;ならびに/または
(b)CD34-表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を単離し、それによって間葉系幹細胞を単離する工程
を含む方法が提供される。
従って、さらなる局面では、哺乳動物内皮前駆細胞を単離する方法であって、以下の連続工程:
(i)哺乳動物細胞集団を単離する工程;
(ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を負の選択によって濃縮する工程;
(iii)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を正の選択によって濃縮する工程;および
(iv)CD31lo/-表現型プロファイルを発現する、工程(iii)に由来するCD34+細胞の亜集団を正の選択によって単離し、それによって内皮前駆細胞を単離する工程
を含む方法が提供される。
さらなる局面において、本発明は、哺乳動物間葉系幹細胞を単離する方法であって、以下の工程:
(i)哺乳動物細胞集団を単離する工程;
(ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を負の選択によって濃縮する工程;ならびに
(a)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を正の選択によって濃縮する工程、およびCD31-表現型プロファイルを発現する、前記CD34+の亜集団を正の選択によって単離する工程;ならびに/または
(b)CD34-表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を単離し、それによって間葉系幹細胞を単離する工程
を含む方法に関する。
一態様において、前記CD31-集団は胎児CD31-集団であり、前記間葉系幹細胞は胎児間葉系幹細胞である。
別の態様において、前記CD45-/CD34-間葉系幹細胞は母体幹細胞である。
本発明の別のさらなる局面は、哺乳動物における状態を治療的および/または予防的に処置する方法であって、有効な数の内皮前駆細胞または部分的もしくは完全に分化したEPC由来細胞を前記哺乳動物に投与する工程であって、前記内皮前駆細胞が本発明の方法に従って単離されている工程を含む、方法に関する。
本発明の関連する局面において、哺乳動物MSC由来細胞の作製を容易にする方法であって、本発明の方法に従って単離された間葉系幹細胞を刺激物質と接触させて、前記間葉系幹細胞の分化を間葉系表現型に向ける工程を含む、方法が提供される。
本発明のさらに別のさらなる局面は、哺乳動物における状態を処置するための医用薬剤の製造における内皮前駆細胞またはEPC由来細胞の集団の使用であって、前記細胞が本発明の方法に従って単離されている、使用に関する。
別の局面において、本発明は、哺乳動物における状態を治療的および/または予防的に処置する方法であって、有効な数の間葉系幹細胞または部分的もしくは完全に分化したMSC由来細胞を前記哺乳動物に投与する工程であって、前記間葉系幹細胞が本発明の方法に従って単離されている工程を含む、方法に関する。
さらに本発明の別の局面は、内皮前駆細胞またはEPC由来細胞の単離された集団であって、前記内皮前駆細胞が本発明の方法に従って単離されている、単離された集団に関する。
本発明の別の局面は、哺乳動物における状態を処置するための医用薬剤の製造における間葉系幹細胞またはMSC由来細胞の集団の使用であって、前記細胞が本発明の方法に従って単離されている、使用に関する。
本発明のさらに別の局面は、間葉系幹細胞またはMSC由来細胞の単離された集団であって、前記間葉系幹細胞が本発明の方法に従って単離されている、単離された集団に関する。
本発明のさらに別の局面において、間葉系幹細胞またはMSC由来細胞の表現型状態または機能状態に及ぼす処理方式もしくは培養方式の影響を評価する方法であって、前記間葉系幹細胞またはMSC由来細胞を前記処理方式に供する工程であって、前記間葉系幹細胞が上で定義された方法に従って単離されている工程、および機能状態または表現型状態の変化についてスクリーニングする工程を含む、方法が提供される。
本発明者らはまた、前記および本明細書の他の場所において大まかに説明された方法に従って単離されたEPCが、発現する遺伝子に関して、臍帯血(UCB)に由来するEPCとは定性的に異なることも確かめている。具体的には、本EPCは、1種類または複数種のマーカー遺伝子を、UCBに由来するEPC中の対応するマーカー遺伝子の発現レベルと少なくとも10％異なる(例えば、高いまたは低い)レベルで発現することを確かめた。
従って、本発明の別の局面は、MFGE8、MATN2、ELN、IGFBP2、SERPINH1、P4HA3、FN1、PKNOX2、FOXC1、NFIX、SMAD6、PRRX2、LRRC17、CTSK、PLA2G4A、DIRAS3、PDLIM3、ABCA8、CFB、PTK7、PTGFRN、SETBP1、LOC652900、SLC22A17、TANC2、SEZ6L2、ARRDC4、PODXL、MEOX2、MMP4、FAM107A、LOC647543、およびSCAMP5からなる群より選択される少なくとも1種類のマーカー遺伝子(例えば、少なくとも1種類、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、10種類、11種類、12種類、13種類、14種類、15種類、16種類、17種類、18種類、19種類、20種類、21種類、22種類、23種類、24種類、25種類、26種類、27種類、28種類、29種類、30種類、31種類、32種類、または33種類のマーカー遺伝子)を、臍帯血(UCB)に由来する内皮前駆細胞中の対応するマーカー遺伝子の発現レベルと少なくとも10％異なる(例えば、高いまたは低い)レベルで発現する、単離された内皮前駆細胞を提供する。
関連する局面において、本発明は、MFGE8、MATN2、ELN、IGFBP2、SERPINH1、P4HA3、FN1、PKNOX2、FOXC1、NFIX、SMAD6、PRRX2、LRRC17、CTSK、PLA2G4A、DIRAS3、PDLIM3、ABCA8、CFB、PTK7、PTGFRN、SETBP1、LOC652900、SLC22A17、TANC2、SEZ6L2、およびARRDC4からなる群より選択される少なくとも1種類のマーカー遺伝子(例えば、少なくとも1種類、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、10種類、11種類、12種類、13種類、14種類、15種類、16種類、17種類、18種類、19種類、20種類、21種類、22種類、23種類、24種類、25種類、26種類、または27種類のマーカー遺伝子)を、臍帯血(UCB)に由来する内皮前駆細胞中の対応するマーカー遺伝子の発現レベルと少なくとも10％(ならびに少なくとも11％〜少なくとも1000％およびこの間にある全ての整数パーセント)高いレベルで発現する、単離された内皮前駆細胞を提供する。
別の関連する局面において、本発明は、PODXL、MEOX2、MMP4、FAM107A、LOC647543、およびSCAMP5からなる群より選択される少なくとも1種類のマーカー遺伝子(例えば、少なくとも1種類、2種類、3種類、4種類、5種類、または6種類のマーカー遺伝子)を、臍帯血(UCB)に由来する内皮前駆細胞中の対応するマーカー遺伝子の発現レベルの90％未満(ならびに89％未満〜0.001％未満およびこの間にある全ての整数および小数パーセント)のレベルで発現する、単離された内皮前駆細胞を提供する。
適宜、単離された内皮前駆細胞は胎盤に由来する。
一部の態様において、単離された内皮前駆細胞はCD31lo表現型プロファイルを発現する。適宜、これらの態様では、単離された内皮前駆細胞は、CD45-表現型プロファイルおよびCD34+表現型プロファイルからなる群より選択される少なくとも1種類の表現型プロファイル(少なくとも1種類、2種類、または3種類の表現型プロファイル)をさらに発現する。
一部の態様において、単離された内皮前駆細胞は、CD105+表現型プロファイル、CD144+表現型プロファイル、CD146+表現型プロファイル、VEGFR2+表現型プロファイル、HLA-ABC+表現型プロファイル、CD73-表現型プロファイル、およびHLA-DR-表現型プロファイルからなる群より選択される少なくとも1種類の表現型プロファイル(少なくとも1種類、2種類、3種類、5種類、6種類、または7種類の表現型プロファイル)をさらに発現する。
本発明のさらに別の局面は、前記および本明細書の他の場所において大まかに説明された内皮前駆細胞が濃縮された単離された細胞集団を提供する。
本発明のさらに別の局面は、前記および本明細書の他の場所において大まかに説明された内皮前駆細胞または細胞集団を含む生体適合性移植片を提供する。
一部の態様において、移植片は、血管プロテーゼ、血管グラフト、補綴臓器を血管循環につなぐための取付け具、血管ステントおよび非血管ステント(例えば、胃腸ステント、肺ステント、または胆管ステント)を含むステント、カバー付きステント、人工心臓弁、人工心臓、心臓プロテーゼ(例えば、人工心臓弁)、生物心臓代用弁(例えば、ブタなどの動物に由来する-生体適合性を高め、血栓が少なくなるように異種移植片をEPCでコーティングすることができる)、静脈弁、腹部大動脈瘤グラフト、血管フィルター(例えば、大静脈フィルター)、カテーテル、ガイドワイヤ、バルーン、肺塞栓症を防ぐ装置(例えば、塞栓コイル、血管塞栓術用の塞栓材料など)、整形外科用移植片(例えば、骨プロテーゼまたは関節プロテーゼ)、血管縫合糸、スキャフォールド、平滑な移植片または多孔性の移植片、腔内装置、血管補綴フィルター、ペースメーカー、ペースメーカーリード線、電極、除細動器、皮下移植片および/または筋肉内移植片、血管閉塞、心室シャント、血管シース、薬物送達装置およびポート、中隔閉鎖装置、縫合糸、神経刺激装置、埋め込み型ワイヤレスセンサ(例えば、血糖モニタおよび血圧モニタ)、人工濾過システムまたは他の人工臓器、インシュリンポンプ、人工酸素供給器などより選択される。このタイプの例示的な例では、移植片は少なくとも1種類の生理活性剤をさらに含む。適宜、移植片は生分解性または非生分解性である。
本発明の内皮前駆細胞は、対象において組織を修復または再生するのに有用である。従って、別の局面において、本発明は、対象において組織を修復または再生する方法であって、組織を、前記および本明細書の他の場所において大まかに説明された内皮前駆細胞、細胞集団、または移植片と接触させ、それによって、組織を修復または再生する工程を含む、方法を提供する。
関連する局面において、本発明は、対象において血管形成を強化するための方法であって、(適宜、血管形成を必要とする)対象の組織を、前記および本明細書の他の場所において大まかに説明された内皮前駆細胞、細胞集団、または移植片と接触させ、それによって、血管形成を強化する工程を含む、方法を提供する。
別の関連する局面において、本発明は、対象において脈管形成を強化するための方法であって、(適宜、脈管形成を必要とする)対象の組織を、前記および本明細書の他の場所において大まかに説明された内皮前駆細胞、細胞集団、または移植片と接触させ、それによって、脈管形成を強化する工程を含む、方法を提供する。
適宜、組織は、筋肉組織、骨格筋組織、心臓組織、神経組織、肝臓組織、膵臓組織、骨組織、軟骨、腎臓組織、眼組織、皮膚組織、または過剰な細胞死を特徴とする組織である。
一部の態様において、対象は、心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢血管閉塞性疾患、虚血、下肢虚血、脳卒中、一過性虚血、再灌流傷害、ならびに皮膚創傷、糖尿病足もしくは潰瘍(diabetic foot or ulcers)、壊疽、および糖尿病性創傷を含む創傷からなる群より選択される疾患を有するか、または発症するリスクがある。
関連する局面において、本発明は、対象において虚血関連組織損傷を回復させるための方法であって、(a)前記および本明細書の他の場所において大まかに説明された内皮前駆細胞、細胞集団、または移植片を対象に投与する工程;および(b)対象の組織において血管形成または脈管形成を強化し、それによって対象において虚血関連組織損傷を回復させる工程を含む、方法を提供する。
一部の態様において、虚血関連組織損傷は、心不全、心筋梗塞、他の虚血性心疾患、下肢虚血、脳卒中、一過性虚血、または再灌流傷害に関連する。
別の関連する局面において、本発明は、対象において心不全を回復させるための方法であって、(a)前記および本明細書の他の場所において大まかに説明された内皮前駆細胞、細胞集団、または移植片を対象の心臓組織に投与する工程;および(b)対象の心臓組織おいて血管形成または脈管形成を強化し、それによって対象において心不全を回復させる工程を含む、方法を提供する。
本発明のさらに別の局面は、対象の組織において創傷治癒を強化するための方法であって、(a)前記および本明細書の他の場所において大まかに説明された内皮前駆細胞、細胞集団、または移植片を組織に投与する工程;ならびに(b)血管形成または脈管形成を増やし、それによって創傷治癒を高める工程を含む、方法を提供する。
前記および本明細書の他の場所において大まかに説明された本発明の処置方法において、内皮細胞または細胞集団は、ドナー対象(例えば、処置される対象と組織適合性のドナー対象)から適切に単離されているか、またはドナー対象(例えば、処置される対象と組織適合性のドナー対象)に由来する。
さらなる局面において、本発明は、前記および本明細書の他の場所において大まかに説明された内皮前駆細胞または細胞集団ならびに薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物を提供する。
本発明のさらに別の局面は、対象において組織を修復または再生するためのキットであって、治療的有効量の前記および本明細書の他の場所において大まかに説明された内皮前駆細胞または細胞集団、ならびに組織を修復または再生するための説明書を備える、キットを提供する。
一部の態様において、対象は、心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢血管閉塞性疾患、虚血、下肢虚血、脳卒中、一過性虚血、再灌流傷害、ならびに皮膚創傷、糖尿病足もしくは潰瘍、壊疽、および糖尿病性創傷を含む創傷からなる群より選択される疾患を有するか、または発症するリスクがある。キットは、適宜、疾患を処置するための説明書を備える。
胎盤消化およびソーティング戦略の模式図である。 DYNABEADSを用いてCD45+細胞を枯渇させ、MACSソーティングを用いて細胞をCD34について濃縮する。これにより10倍に濃縮される。フローサイトメトリーを用いて、本発明者らは、CD31発現レベルに従って、この集団を3つの亜集団にさらにばらばらにすることができる。最も高い内皮幹細胞活性はCD31lo/-細胞にあるのに対して、CD31+細胞には、限られたコロニー形成能しかない。 胎盤EPCを培養して10日後の高増殖能内皮コロニー形成細胞(EPP-ECFC)を示した顕微鏡写真。これらのEPCには、ECFCの説明された特徴がある。プレートして10日後に50個以上の細胞があるかどうかに基づいてHPPコロニーを計数する。 蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)。胎盤ECFCは胎児起源である。X=緑色、Y=赤色。新生児の男児の胎盤から増殖させたサイトスピンしたECFCにおけるX染色体およびY染色体の蛍光インサイチューハイブリダイゼーションを示した写真。細胞の95％超が1本のX染色体および1本のY染色体を示した。このことから、これらの細胞は胎児起源であることがはっきりと分かる。 本発明者らの単離方法に示したように胎盤EPCを培養して内皮細胞を入手した。次いで、細胞を免疫蛍光によって染色し、アイソタイプ対照を用いた染色と比較した(示さず)。CD34、VEGFR2(AおよびB)、CD31、CD105、CD144(A)、ならびにCD146(B)を含む内皮マーカーについて陽性染色が示され、造血マーカーCD45および間葉系マーカーCD73(C)について陰性染色が示された。 本発明者らの単離方法に示したように胎盤EPCを培養して内皮細胞を入手した。(A)細胞を、予想通り内皮集団から取り込み可能なDiI(赤色)で標識したアセチル化低密度リポタンパク質(Ac-LDL)とインキュベートした。(B)マトリゲル上で培養したHPP-ECFCは管を形成することができた。このことからも機能的な内皮特性が証明された。 (A)本発明者らの単離方法に示したように胎盤EPCを培養して入手した50万個の内皮細胞をマトリゲルと混合し、ヌードマウスに皮下注射した。7日後にマトリゲルプラグを回収し、免疫蛍光によって評価した。核の特異的抗ヒトラミンA/C抗体染色(緑色)を用いてヒト細胞を回収した。ヒト細胞はマトリゲルプラグ内に管状構造を形成した。(B)ラミンA/C染色によって生着を証明するためにECFCをマトリゲルプラグに注入した(スケールバーは100μmを表す)。(C)ラミンA/C染色および血管形成(CD49f)。結果を平均+/-SEMで示した;n=3。 MSC単離のための全ソーティング戦略。満期胎盤を、EPCについて説明したように消化して細胞懸濁液にする。最初に、磁気ソーティング戦略を用いてCD45+細胞を枯渇させる。さらに、これに続いて、再度、磁気ソーティング戦略を用いてCD34+細胞の濃縮を行う。この濃縮によって、2つの集団、CD34-CD45-(フローサイトメトリープロット上では青色ゲートにある)およびCD34+CD45-(赤色ゲートにある)が生じる。CD34-CD45-画分は培養されたら母体MSCを生じる。次いで、CD34+CD45-集団をCD31レベルに従ってさらに分画する。CD31-/lo画分は、説明したようにEPCを生じた。CD31-細胞はMSCと見なされ、MSCを生じた。これは純粋に胎児起源であった。 母体MSCまたは胎児MSCの他の公知の供給源と比較した、胎盤CD45-CD34+CD31-(fMSC)画分から単離したMSC集団の細胞表面特徴。継代4で、fMSC画分を、MSC上に見出される特徴的な細胞表面分子についてフローサイトメトリーによって分析した。結果を、MSCの胎児供給源(胎児骨髄)および成体MSCの供給源(胎盤全体)と比較した。実際に、胎盤全体の培養物からは、常に、純粋な母体MSC集団が得られる。両画分から、MSCとしての資格があると国際細胞治療学会(international society of cell therapy)が定義する必要な細胞表面発現をもつ線維芽細胞型細胞が生じた。 fMSC画分の分化特徴。fMSC画分ならびにCD45-CD34-画分から入手したMSCを骨形成条件(A, B)または脂肪生成条件(C, D)に供した。試験した全画分が、アリザリン染色で図示したように骨芽細胞を形成する能力(上パネル)およびオイルレッドO染色で図示したように脂肪細胞を形成する能力(下パネル)を示した。CD45-CD34-は図示しなかった。胎児骨髄由来MSCと比較して、全画分が低い骨形成分化能を示したが、同様のまたは高い脂肪生成分化能を示した。 fMSC画分は純粋に胎児起源である。様々な細胞の母体起源と胎児起源を区別するために、男の子を身ごもっている女性から入手した満期胎盤を分析した。胎盤全体からのCD34-CD45-細胞ならびにMSCは母体起源のMSCのみを生じた。(A)X染色体およびY染色体蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)をカルノア固定細胞に対して行った。X染色体を赤色で図示し、Y染色体を緑色で図示した。継代2で試験したfMSC画分は胎児起源の細胞しか示さなかった(100％)。次に、本発明者らは、この組成が経時変化するかどうかを評価した。DMEMまたはEGM2中で、培養細胞は継代8まで純粋に胎児型のままであった(B, C)。 胎盤画分に由来するfMSCは自己複製することができる。8回の継代にわたって増殖および集団倍化を測定した。fMSC集団倍化はある期間にわたって安定であることが分かった。fMSC集団倍化はDMEM培地と比較してEGM2培地の方が速かった。 PL-ECFC対UCB-ECFCの比較インビトロ分析。ECFC培養アッセイを用いて、胎盤および臍帯血(UCB)両方のコロニー形成を評価した。各実験(n=6)について50gの胎盤絨毛組織および20mLのUCB。UCB-ECFCよりPL-ECFCからのHPPコロニー(50個を超える細胞を含むコロニー)の方が多かった。(A):1試料につき得られたHPPコロニーを外挿することによって、胎盤全体(約500〜600g)から1,230個のHPPコロニーが得られる。これに対して、UBC全体(約60mL)から45個のHPPが得られる(p<0.001、PL-ECFC対UCB-ECFC、HPP;p<0.001、PL-ECFC対UCB-ECFC、全コロニー)。(B〜G):培養中、HPP-ECFCコロニーは形態がPL-ECFCとUCB-ECFCとの間で同一であり、HPPコロニーが再プレートされたときに同じインビトロコロニーヒエラルキーを示した(スケールバー=100μm)。これらは、ある期間(継代2〜10)にわたってほぼ同一の細胞増殖と集団倍加時間を有した。酵素結合免疫測定システムを用いて、インテグリン発現を測定した。これも、PL-ECFCとUCB-ECFCとの間に差違は観察されなかった。バーはSDを示す。統計解析にはウィルコクソン-マンホイットニー検定を使用した。 PL-ECFCとUCB-ECFCとの間で差次的に発現した33個の遺伝子のマイクロアレイヒエラルキークラスター地図。RNAを継代2 PL-ECFC(n=4)対UCB-ECFC(n=4)から単離し、遺伝子発現差について分析した。基準化後に0.05のカットオフp値を用いると、33個の差次的に発現した遺伝子しか観察されなかった。 マウス後肢虚血モデルを用いたPL-ECFC機能の評価。(A):片肢の大腿動脈を結紮し、食塩水(n=16)、PL-ECFC(n=8)、またはUCB-ECFC(n=10)を注射した後に、ある特定の時点で下肢灌流をドップラによって測定した(中央値で表した)。7日目までに、食塩水対照と比較して、PL-ECFC(食塩水に対して1.85倍増加)、p<0.02)またはUCB-ECFC(食塩水に対して2.1倍増加、p<0.007)で処置した虚血下肢では灌流が有意に改善した。この同じパターンが14日目(食塩水に対して1.75倍増加)、p<0.02)および21日目(PL-ECFCでは食塩水に対して1.5倍増加、p<0.05;UCB-ECFCでは食塩水に対して1.4倍増加、p<0.03)に観察された。緑色、食塩水;赤色、PL-ECFC;黒色、UCB-ECFC。(B):3つの実験群の2日目および21日目での灌流レベルを示した代表的なドップラ画像。赤色、肢に血流あり、青色、肢に血流なし。
発明の詳細な説明
本発明は、部分的には、以前に可能であったものより多量の、有意に純度の高い内皮前駆細胞集団を日常的かつ確実に単離する新規の方法の開発に基づいている。この方法は、特定の一連の細胞表面マーカーを標的化することに向けられた正の選択工程および負の選択工程からなる独特の多段階組み合わせに基づいている。従って、比較的稀な内皮前駆細胞集団を、効果的な治療的処置レジメンおよび予防的処置レジメンに望ましい純度レベルで効率的かつ確実に単離することが以前は不可能であった場合、今や、この発見によって、この重大な障害が克服された。なおさらに、このプロトコールに関連して、母体間葉系幹細胞集団を含む間葉系幹細胞集団とは別々に、純粋な胎児間葉系幹細胞の集団も単離することができる。従って、生物学的出発材料に存在する複数の前駆体細胞集団を、都合よくかつ確実に単離し、かつ生じる単回多段階プロトコールが開発されている。この目的のために、胎盤は、実際に、自己複製能を示す内皮前駆細胞の豊富な供給源となることも確かめられており、従って、豊富な数の内皮前駆細胞を日常的かつ効率的に検出および単離することが可能になり、それによって、細胞の入手が限られていたために以前は臨床上実現不可能であったインビトロおよびインビボでの応用が可能になった。内皮由来細胞または間葉系由来細胞が曝露され得る潜在的な処理方式または培養方式の有効性および/または毒性を日常的に評価する手段も容易になる。
従って、本発明の一局面は、哺乳動物内皮前駆細胞を単離する方法であって、以下の工程:
(i)哺乳動物細胞集団を単離する工程;
(ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;
(iii)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程;および
(iv)CD31lo/-表現型プロファイルを発現する、工程(iii)に由来するCD34+細胞の亜集団を単離し、それによって内皮前駆細胞を単離する工程
を含む方法に関する。
さらに詳細には、哺乳動物内皮前駆細胞を単離する方法であって、以下の連続工程:
(i)哺乳動物細胞集団を単離する工程;
(ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;
(iii)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程;および
(iv)CD31lo/-表現型プロファイルを発現する、工程(iii)に由来するCD34+細胞の亜集団を単離し、それによって内皮前駆細胞を単離する工程
を含む方法が提供される。
関連する局面において、本発明は、哺乳動物間葉系幹細胞を単離する方法であって、以下の工程:
(i)哺乳動物細胞集団を単離する工程;
(ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;ならびに
(a)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程、およびCD31-表現型プロファイルを発現する、前記CD34+細胞の亜集団を単離する工程;ならびに/または
(b)CD34-表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を単離し、それによって間葉系幹細胞を単離する工程
を含む方法に関する。
さらに詳細には、哺乳動物間葉系幹細胞を単離する方法であって、以下の連続工程:
(i)哺乳動物細胞集団を単離する工程;
(ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;ならびに
(a)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程、およびCD31-表現型プロファイルを発現する、前記CD34+細胞の亜集団を単離する工程;ならびに/または
(b)CD34-表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を単離し、それによって間葉系幹細胞を単離する工程
を含む方法が提供される。
内皮前駆細胞は、内皮細胞に分化する能力を有する、血中を循環する稀な細胞の集団である。本発明をいずれか1つの理論にも作用機序にも限定することはないが、最初、内皮前駆細胞は、胚形成中に血管を形成する幹細胞である血管芽細胞だと考えられていた。何年もわたって胚血管芽細胞は存在することが知られていたが、成体マウスの血液から単離されたCD34+細胞からなる精製された集団がインビトロで内皮細胞に分化できたはずであるとAsaharaと同僚らが発表した後、1990年代に成体内皮前駆細胞は特徴付けられたと最初に考えられた。従って、「内皮前駆細胞」についての言及は、内皮細胞が示す機能的特徴または構造的特徴の1つまたは複数を示す細胞に発生する可能性を示すあらゆる細胞についての言及であると理解されるはずである。本発明を全く限定しないが、「内皮細胞」についての言及は、血管、リンパ管、または他の漿膜腔、例えば、体液で満たされた空洞を裏打ちする扁平上皮細胞についての言及であると理解されるはずである。句「内皮細胞」はまた、内皮細胞の形態、表現型、および/または機能活性の1つまたは複数を示す細胞についての言及であるとも理解されるはずであり、その変異体または変種についての言及でもある。前記内皮細胞は、内皮前駆細胞段階後の発生の任意の分化段階にあってよい。「変種」は、内皮細胞の形態学的特徴もしくは表現型特徴または機能活性の全てではないが一部を示す細胞を含むが、これに限定されない。「変異体」は、遺伝子組換えされた内皮細胞、例えば、本発明の方法による単離後であるが、内皮細胞系列に沿って方向付けられた分化を受ける前に遺伝子組換えされた内皮前駆細胞に由来する内皮細胞を含むが、これに限定されない。好ましくは、対象内皮細胞は血管内皮細胞(すなわち、血管を形成する内皮細胞)であるか、または増殖および分化して血管を形成するが、それにもかかわらず内皮前駆細胞より成熟している未熟型内皮細胞である。
この態様によれば、哺乳動物内皮前駆細胞を単離する方法であって、以下の工程:
(i)哺乳動物細胞集団を単離する工程;
(ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;
(iii)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程;および
(iv)CD31lo/-表現型プロファイルを発現する、工程(iii)に由来するCD34+細胞の亜集団を単離し、それによって内皮前駆細胞を単離する工程を含み、
前記内皮前駆細胞が血管内皮細胞に分化することができる方法が提供される。
一態様において、工程(ii)〜(iv)は連続して行われる。本発明をいずれか1つの理論にも作用機序にも限定することはないが、造血幹細胞を含む骨髄間質に加えて、間葉系幹細胞と呼ばれる他の非造血幹細胞を含むことも知られている。後者の細胞タイプは中胚葉に由来し、これも自己複製および分化することができ、特に、骨、軟骨、筋肉、腱、靱帯、間質、髄、脂肪、ニューロン、および星状細胞に分化することができる。間葉系幹細胞はまた、非常に稀にあり、100,000個の骨髄細胞に1個の推定頻度で存在する点で造血幹細胞に似ている。成熟し、完全に分化した間葉系由来細胞は、中胚葉形成(mesogenesis)と呼ばれる段階的な成熟プロセスの結果である。骨髄への局在化に加えて、間葉系幹細胞は、脂肪、骨、歯髄、および子宮を含むが、これに限定されない様々な他の組織においても見出される。
これもまた本発明を全く限定しないが、間葉系幹細胞から生じる成熟細胞タイプは、問題となっている臓器の結合組織形成に寄与することができる。「結合組織」とは、大なり小なり特殊化し得る中胚葉由来組織の一般化した用語である。例えば、軟骨および骨は、特殊化した結合組織の一種であり、血液も同様である。他の種類の、あまり特殊化していない結合組織には、細胞外マトリックスが豊富にあり、高秩序の他の組織および臓器を取り囲んでいる組織が含まれる。従って、結合組織は、様々な機能を示す多くの細胞タイプを含む。
従って、「間葉系幹細胞」についての言及は、間葉系細胞または間葉系由来細胞が示す機能的特徴または構造的特徴の1つまたは複数を示す細胞に発育する可能性を示すが、内胚葉由来細胞タイプまたは中胚葉由来細胞タイプなどの非間葉系由来細胞に発育する可能性を示さない、あらゆる細胞についての言及だと理解されるはずである。間葉系幹細胞はまた、「ストローマ幹細胞」、「胎児幹細胞」、「成体幹細胞」、「脂肪由来幹細胞」、「吸引脂肪組織由来幹細胞」および「出生後幹細胞」とも知られる。この目的のために、「間葉系由来細胞」についての言及は、多能性(pluripotent)間葉系細胞より分化し、かつ間葉系幹細胞から生じた細胞タイプについての言及であると理解されるはずである。これらの細胞は、間葉系細胞から生じることが知られており、かつ上で詳述された組織の細胞に対応する。例えば、対象間葉系由来細胞は、特定の細胞系列、例えば、筋細胞前駆体細胞または脂肪細胞前駆体細胞に沿って分化することが不可逆的に決められた細胞でもよく、これらの系列の1つの部分的にまたは高度に分化した特定の細胞サブタイプ型に対応してもよい。従って、間葉系幹細胞は、適切な条件下で間葉系列の1つまたは複数の細胞タイプに分化する能力を示す。
本発明の方法に従って特定された間葉系幹細胞は、高度に分化していない細胞と定義される。従って、対象細胞は、全ての間葉系列、さらにはいくつかの非間葉系列、例えば、神経外胚葉細胞(すなわち、多能性間葉系細胞)に沿って分化できることが好ましい態様であるが、間葉系列の一部だけに沿って分化できる細胞にも対応してよい。
「前駆細胞」および「幹細胞」とは、細胞が完全に分化しておらず、成熟するにはさらなる分化を必要とすることを意味する。このような細胞はまた、典型的には、完全に分化した細胞が示す増殖能より高度の増殖能も示す。この増殖能は自己複製能とも呼ばれる。前駆細胞は完全に分化した細胞より大きなコロニーを形成することができる(すなわち、高レベルの増殖を受ける)のに対して、前駆細胞より分化した細胞は小さなコロニーを形成する。完全に分化した細胞はコロニーを形成しない。前駆細胞および幹細胞はまた、時として、「前駆体」細胞、「複能性」細胞、または「多能性」細胞とも呼ばれる(が、後者の用語は、一般的に、広範な可能性を示す細胞のために取ってある)。この点に関して、幹細胞はまた、一般的に、本明細書において例示されるように前駆細胞より広い可能性を示す細胞とみなされる。この場合、間葉系幹細胞は内皮前駆細胞より広範囲の体細胞タイプに分化する能力を有する。本発明の内皮前駆細胞は単能性でもよく複能性でもよいことが理解されるはずである。単能性細胞は、内皮細胞系列にのみ分化することができる細胞である。複能性前駆細胞は、内皮細胞系列または非内皮細胞系列のいずれかに分化することができる細胞である。本発明を全く限定しないが、内皮前駆細胞は単能性であると一般に考えられている。しかしながら、適切な人工条件下、特に、インビトロでは、前駆細胞は、時として、インビボでは自然に起こらない系列に沿って分化するように追い込まれる場合があることが当業者によって認められるだろう。従って、本発明の単離された内皮前駆細胞が本発明に従って単離されており、かつ内皮可能性を示すのであれば、分化を非内皮細胞系列に向けることができると発見されても、本明細書において定義された「内皮前駆細胞」の範囲内にあることが理解されるはずである。
本発明の内皮前駆細胞集団および間葉系幹細胞集団は単一の表現型プロファイルの中で分化状態の何らかの変化を示す可能性があることが理解されるはずである。すなわち、単一の表現型プロファイルの中で、そのプロファイルを含む細胞は、類似した表現型特徴および/または機能特徴を実質的に示す可能性があるが、それにもかかわらず、ある程度の違いを示す可能性がある。これは、例えば、問題となっている表現型プロファイルを含む細胞のトランスクリプトームプロファイルまたは(本明細書において定義されたマーカー以外の)細胞表面マーカー発現の違いに関して明らかになる可能性がある。例えば、CD45-/CD34+/CD31lo/-、CD45-/CD34+/CD31-、またはCD45-/CD34-細胞は、高度に特異的な、かつはっきり区別されている段階ではない可能性があり、この段階に分化した細胞と、この段階から脱して成熟する間際にある細胞を比較するとしたら、移行または時期を反映する多数の、はっきり区別されている細胞亜集団によって特徴付けられる可能性がある。これは、典型的には、例えば、遺伝子発現に対する連続した一連の変化の発生によって特徴付けられる。本明細書において定義される特徴的な表現型プロファイルが変化する前に、これらの2つ以上が発生することが必要とされる。従って、本発明の単一の表現型プロファイルの中にある細胞亜集団の存在が包含される。
この態様によれば、単能性哺乳動物内皮前駆細胞または複能性哺乳動物内皮前駆細胞を単離する方法であって、以下の工程:
(i)哺乳動物細胞集団を単離する工程;
(ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;
(iii)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程;および
(iv)CD31lo/-表現型プロファイルを発現する、工程(iii)に由来するCD34+細胞の亜集団を単離し、それによって内皮前駆細胞を単離する工程
を含む方法が提供される。
別の態様において、前記内皮前駆細胞は血管内皮細胞に分化することができる。
対象内皮前駆細胞および間葉系幹細胞は、胚組織、臍帯組織、胎児組織、胎盤組織、または出生後組織、例えば、成体組織を含む任意の適切な哺乳動物組織源に由来してもよい。この目的のために、「哺乳動物」についての言及には、ヒト、霊長類、家畜動物(例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ロバ)、実験室試験動物(例えば、マウス、ラット、モルモット)、コンパニオンアニマル(例えば、イヌ、ネコ)、および捕獲された野生動物(例えば、カンガルー、シカ、キツネ)が含まれる。好ましくは、前記哺乳動物はヒトである。
「哺乳動物細胞集団」についての言及は、前記で定義された哺乳動物組織供給源に由来する細胞集団についての言及であると理解されるはずである。単離された細胞集団(または「組織試料」または「生物学的試料」-これらの用語は同義に用いられる)は、細胞物質(例えば、骨髄もしくは脂肪吸引液)、生物学的液体(例えば、血液)、組織生検標本(例えば、子宮生検)、手術標本(例えば、子宮摘出組織)、または胎盤組織などがあるが、これに限定されない、細胞を含み、哺乳動物に由来する生物学的材料のあらゆる試料についての言及であると理解されるはずである。
本発明の方法に従って試験される生物学的試料は直接試験されてもよく、試験前に何らかの形の処理を必要としてもよい。例えば、生検材料または手術試料は試験前にホモジナイゼーションまたは他の形の細胞分散を必要とする場合がある。さらに、生物学的試料が液体の形をとらない程度まで、試料を切断し、細胞懸濁液を作り出すために、緩衝液などの試薬の添加を必要とする場合がある。または、生物学的試料は、凝固を阻止するために何らかの他の形の前処理、例えば、試料が全血試料である場合にはヘパリン化を必要とする場合がある。
対象組織(「細胞」についての言及を含む)は、個体(例えば、処置の対象になり得る個体)から新鮮に単離されている単細胞懸濁液または細胞凝集物でもよく、新鮮でない供給源、例えば、培養物(例えば、細胞数が増やされた、および/もしくは分化シグナルを受け入れるように細胞が培養された培養物)、またはある初期の時点で個体もしくは別の供給源から単離されている細胞の凍結ストックから得られてもよい。対象細胞は本発明の方法に従って分析を受ける前に、濃縮もしくは精製、細胞周期状態の改変、または細胞株の形成などがあるが、これに限定されない他の何らかの形の処理または操作を受けていてもよいことも理解されるはずである。従って、本細胞は初代細胞でもよく二次細胞でもよい。初代細胞とは、個体から単離されている細胞である。二次細胞とは、単離された後、本発明の方法が適用される前に何らかの形のインビトロ操作を受けている細胞である。
特定の一態様において、前記哺乳動物細胞集団は、臍帯血または胎盤、特に、分娩後胎盤に由来する。
この態様によれば、哺乳動物内皮前駆細胞を単離する方法であって、以下の工程:
(i)哺乳動物胎盤由来細胞集団を単離する工程;
(ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;
(iii)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程;および
(iv)CD31lo/-表現型プロファイルを発現する、工程(iii)に由来するCD34+細胞の亜集団を単離し、それによって内皮前駆細胞を単離する工程
を含む方法が提供される。
関連する態様において、本発明は、哺乳動物間葉系幹細胞を単離する方法であって、以下の工程:
(i)哺乳動物胎盤由来細胞集団を単離する工程;
(ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;ならびに
(a)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来する前記CD45-細胞の亜集団を濃縮する工程、およびCD31-表現型プロファイルを発現する、前記CD34+細胞の亜集団を単離する工程、ならびに/または
(b)CD34-表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を単離し、それによって間葉系幹細胞を単離する工程
を含む方法に関する。
別の態様において、工程(ii)〜(iv)は連続して行われる。
「胎盤由来」細胞物質についての言及は、胎盤を構成する細胞の不均一な集団の一部または全てについての言及であると理解されるはずである。本発明をいずれか1つの理論にも作用機序にも限定することはないが、ヒトでは、胎盤の長さは平均22cmであり、厚みの平均は2〜2.5cmであり、中央が最も厚く、端が最も薄い。胎盤の重量は典型的に約500グラムである。胎盤は濃い赤みがかった青色(dark reddish-blue)または深紅色を示し、長さが約55〜60cmの臍帯によって胎児とつながっている。臍帯には2本の臍帯動脈および1本の臍帯静脈がある。臍帯は絨毛膜板に付着している。血管は胎盤一面に枝分かれし、さらに分かれて、薄い細胞層で覆われた網状組織を形成する。これによって絨毛樹状構造が形成される。母体側には、これらの絨毛樹状構造は分葉と呼ばれる小葉に分類される。ヒトの胎盤は通常、円盤状であるが、様々な哺乳動物種間で大きさはかなり異なる。
胚盤胞が母体子宮内膜に着床すると胎盤は発達し始める。胚盤胞の外層は、胎盤の外層を形成する栄養膜になる。この外層は2つのさらなる層:下部にある栄養膜細胞層および上部にある栄養膜合胞体細胞層に分けられる。栄養膜合胞体細胞は、胎盤表面を覆う多核性の連続した細胞層である。これは、胎盤発生全体を通して継続するプロセスである、下部にある栄養膜細胞の分化および融合の結果として形成する。それによって、栄養膜合胞体細胞(他に合胞体とも知られる)は胎盤のバリアー機能に寄与する。胎盤は妊娠全体を通して成長する。母体から胎盤への血液供給の発達は妊娠第一期(約12〜13週間)までに完了する。
一態様において、前記胎盤由来細胞集団は分葉の細胞集団である。本発明を全く限定しないが、一態様では、帝王切開後に得られた無傷の胎盤などの分娩後胎盤が用いられる。胎盤分葉を単離するために、脱落膜成分が切り離される。次いで、これらの分葉はコラゲナーゼ、ディスパーゼ、およびDNアーゼなどの酵素カクテル中で消化され、その後に、本発明の方法に従って処理するために出発細胞集団を得るために濾過される。
本発明のこの特定の態様によれば、任意の発生段階にある胎盤を使用できることが理解されるはずである。分娩後胎盤が最も都合よく得られるが、流産または他の妊娠終了が起こった場合など、もっと初期の妊娠段階からの胎盤も使用することができる。下記でさらに詳細に議論されるように、胎盤、特に、臍帯血は、本発明者らが開発した方法に従って今や効率的に単離することができる内皮前駆細胞および間葉系幹細胞の優れた供給源となる。従って、これは、女性が、将来、内皮前駆細胞を収集するために胎盤/臍帯組織もしくは血液(例えば)を日常的に単離および保管する可能性、または他に、将来使用するために内皮前駆細胞を新鮮に収集し、次いで、凍結する可能性をもたらす。従って、これは、自己由来内皮前駆細胞、ドナーに関連する個体の場合は、別の方法で利用可能な可能性のある内皮前駆細胞よりMHCがぴったりと一致する内皮前駆細胞を処理する可能性をもたらす。これらの場合は両方とも、ドナー内皮前駆細胞は、その細胞のレシピエントに関して組織適合性であると定義される。
従って、一態様では、哺乳動物内皮前駆細胞を単離する方法であって、以下の工程:
(i)哺乳動物胎盤分葉細胞物質を単離する工程;
(ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;
(iii)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程;および
(iv)CD31lo/-表現型プロファイルを発現する、工程(iii)に由来するCD34+細胞の亜集団を単離し、それによって内皮前駆細胞を単離する工程
を含む、方法が提供される。
さらに別の態様において、哺乳動物間葉系幹細胞を単離する方法であって、以下の工程:
(i)哺乳動物胎盤分葉細胞物質を単離する工程;
(ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;ならびに
(a)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程、およびCD31-表現型プロファイルを発現する、前記CD34+細胞の亜集団を単離する工程;ならびに/または
(b)CD34-表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を単離し、それによって間葉系幹細胞を単離する工程
を含む方法が提供される。
別の態様において、前記哺乳動物はヒトである。
内皮細胞ヒエラルキーに関連する信頼性の高いマーカープロファイルの特定が困難であったので、本発明の細胞集団の表現型特徴付けは大きな進展だと認められるだろう。本発明をいずれか1つの理論にも作用機序にも限定することはないが、
(i)CD45は、PTPRCとも知られるタンパク質チロシンホスファターゼ受容体C型であり、ヒトではPTPRC遺伝子によってコードされる酵素である。CD45は当初、白血球共通抗原またはT200と呼ばれていた。この遺伝子によってコードされるタンパク質はタンパク質チロシンホスファターゼ(PTP)ファミリーのメンバーである。PTPは、細胞増殖、分化、有糸分裂サイクル、および癌化を含む様々な細胞プロセスを調節するシグナル伝達分子であることが分かっている。CD45ファミリーは、1つの複合体遺伝子の全産物である複数のメンバーからなる。この遺伝子は34個のエキソンを含み、一次転写物のうち3個のエキソンはオルタナティブスプライシングされて、8個までの異なる成熟mRNAと、翻訳後に8個の異なるタンパク質産物を生じる。これらの3個のエキソンはRA、RB、およびRCアイソフォームを生じる。CD45の様々なアイソフォーム: CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RAB、CD45RAC、CD45RBC、CD45R0、CD45R(ABC)が存在する。
(ii)CD34は細胞表面糖タンパク質であり、細胞間接着因子として機能する。CD34もまた、骨髄細胞外マトリックスへの幹細胞の付着、または直接、ストローマ細胞への幹細胞の付着を媒介する可能性がある。CD34はタンパク質をコードするヒト遺伝子の名前でもある。CD34タンパク質は、初期造血性の血管関連組織上で発現を示す1回膜貫通シアロムチンタンパク質ファミリーのメンバーである。CD34を発現する細胞は、通常、造血細胞、間葉系幹細胞のサブセット、内皮前駆細胞、血管内皮細胞として臍帯および骨髄に見出されるが、リンパ管(胸膜リンパ管を除く)、マスト細胞、間質内にある、および皮膚真皮の付属器周囲にある(第XIIIa因子陰性の)樹状細胞亜集団、ならびにDFSP、GIST、SFT、HPCのような軟部組織腫瘍にある細胞では見出されない。
(iii)CD31とも知られる血小板内皮細胞接着分子(PECAM-1)は、ヒトでは、17番染色体上に見出されるPECAM1遺伝子によってコードされるタンパク質である。PECAM-1は、血小板、単球、好中球、およびいくつかのタイプのT細胞の表面に見出され、内皮細胞の細胞間接合部の大部分を構成する。コードされるタンパク質は免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、白血球遊走、血管形成、およびインテグリン活性化に関与する可能性が高い。CD31は、通常、内皮細胞、血小板、マクロファージおよびクッパー細胞、顆粒球、T/NK細胞、リンパ球、巨核球、破骨細胞、ならびに好中球上に見出される。
本発明の文脈において、「CD45」、「CD34」、および「CD31」についての言及は、これらの分子の全種類およびその機能的断片、変異体、または変種についての言及であると理解されるはずである。CD45、CD34、およびCD31 mRNAのオルタナティブスプライシングから生じ得る、あらゆるアイソフォーム、またはこれらの分子の異性体型もしくは多型型についての言及を含むとも理解されるはずである。
「表現型プロファイル」についての言及は、対象マーカーをコードする遺伝子の転写および/または対象マーカーをコードする遺伝子から翻訳された発現産物の細胞表面発現の存在または非存在についての言及であると理解されるはずである。特許請求の範囲に記載された内皮前駆細胞集団の範囲の中にある、ほとんどの細胞は、細胞表面に繋ぎ止められた発現産物としての対象マーカーの存在または非存在によって特徴付けられるが、例えば、ある特定のマーカーの転写がアップレギュレートされているが、細胞表面に繋ぎ止められた発現産物をまだ生じていない可能性があるときに、定義された集団の中にある一部の細胞は最初、トランスクリプトームレベルでしか変化を示さない場合があることが認められるはずである。一般的に、新たな分化段階に進む細胞は、発現産物レベルに対する変化に関連してまだ明らかになっていない遺伝子発現変化を一過的に示す。しかしながら、これらの細胞は、それにもかかわらず、特許請求の範囲に記載された細胞集団の範囲の中にあるが、細胞表面マーカー発現のような時期が発生するまで、本明細書において定義された方法によって単離することができないだろう。
本発明の内皮前駆細胞集団および間葉系幹細胞集団は、定義された表現型プロファイルによって特徴付けられるが、これらの細胞は、関心対象の細胞集団の表現型特徴付けおよび単離に関して関係のない様々な他の細胞内マーカーおよび/または細胞表面マーカーを発現するとも認められるはずである。なおさらに、本発明のある特定の内皮前駆細胞集団が様々な亜集団を含む程度まで、これらの亜集団は、本明細書において定義されたプロファイルの発現のばらつき以外に細胞内マーカーまたは細胞表面マーカーの発現のばらつきを示す場合がある。
CD45およびCD34細胞表面マーカーは、細胞表面にあるマーカーの存在または非存在について言及することによって定義されるが、CD31発現は発現レベル、具体的には、低い発現レベル(本明細書では「CD31lo/-」と呼ばれる)について言及することによって定義される。本明細書において例示される本発明の態様では、「CD31lo/-」亜集団はアイソタイプ対照に基づいてFACSゲートを定義することに基づいている。この例示された態様では、CD31のアイソタイプ対照だけが用いられ、他の全ての抗体は等しく保たれる。3つの集団がCD31発現レベルに基づいて認められる。1番目の集団はCD31陰性であり、胎児間葉系幹細胞を生じる。内皮前駆細胞を生じる2番目の集団はポジティブゲート(positive gate)が開始する集団である。最後に、増殖能が限られているCD31+集団がある。分析がセットアップされる特定のやり方、および使用されるログ(log)はFACS電圧により異なる場合があることが当業者により認められるだろう。しかしながら、これらのパラメータは当業者によって日常的な手順の問題として定めることができる。
CD31lo/-に関して用いられる「lo/-」という用語は当技術分野において周知であり、CD31の発現レベルを指し、この細胞表面マーカーの発現レベルは、全体として分析されている細胞集団における、このマーカーの発現レベルと比較すると低い。CD31loに関する「lo」という用語は、1つまたは複数の他の別個の細胞または細胞集団より低いレベルでCD31を発現する別個の細胞または細胞集団を指す。従って、CD31lo/-およびCD31loという用語は、対象単離方法に起因する内皮前駆細胞を指すために本明細書において同義に用いられる。
特定の態様において、CD31lo細胞または細胞集団が発現するCD31レベルは、HUVEC集団またはHUVEC集団が発現するCD31レベルの50％未満(ならびに1％以上〜49％未満およびこの間にある全ての整数パーセント、適切には、1％以上〜40％未満およびこの間にある全ての整数パーセント、適切には、1％以上〜30％未満およびこの間にある全ての整数パーセント、適切には、1％以上〜20％未満およびこの間にある全ての整数パーセント、さらに適切には、1％以上〜10％未満およびこの間にある全ての整数パーセント)である。
「+」および「-」という用語は当技術分野において周知であり、関心対象の細胞マーカーの発現レベルを指し、「+」に対応する細胞マーカーの発現レベルは高レベルまたは中レベルであり、「-」に対応する細胞マーカーの発現レベルはゼロである。染色強度の上位2％、3％、4％、または5％にある細胞は「hi」と呼ばれることが多く、集団の上位半分にある細胞は「+」に分類される。蛍光強度の50％未満にある細胞は「lo」細胞と呼ばれ、1％未満にある細胞は「-」細胞と呼ばれる。
「高」または「hi」または「明るい」という用語は当技術分野において周知であり、関心対象の細胞マーカーの発現レベルを指し、この細胞マーカーの発現レベルは、全体として分析されている細胞集団における、この細胞マーカーの発現レベルと比較すると高い。
CD45-/CD34-間葉系幹細胞集団に関して、この集団はかなりの母体間葉系幹細胞集団を生じる。本発明をいずれか1つの理論にも作用機序にも限定することはないが、この細胞画分は実際は不均一であると考えられている。しかしながら、これらの細胞を間葉系幹細胞に適した条件下でインビトロ培養すると、間葉系細胞以外の細胞は増殖せず、それによって、大部分が母体起源の間葉系幹細胞からなる集団が生じる。
本発明はまた、前記および本明細書の他の場所において大まかに説明された内皮前駆細胞および/または間葉系幹細胞を含有する単離された細胞集団も包含する。本明細書で使用する「および/または」とは、関連する列挙された項目の1つまたは複数からなる任意のおよび全ての可能性のある組み合わせ、ならびに択一的な場合(または)には組み合わせが無いことを指し、かつ包含する。特定の態様において、単離された細胞集団は、出発細胞集団よりEPCおよび/またはMSCが濃縮された集団、すなわち、EPCおよび/またはMSCが出発細胞集団または試料より多い細胞数で、または細胞パーセントとして存在する集団である。EPCが濃縮された細胞集団は、本明細書に記載のEPCおよび/またはMSCを作製するための方法を用いて適切に作製される。
ある特定の態様において、単離された集団の中にあるEPCは、集団の中にある細胞の20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、70％以上、80％以上、90％以上、97％以上までを含む10％以上であり、単離された集団の中にある細胞の100％を含む。
ある特定の態様において、単離された集団の中にあるMSCは、集団の中にある細胞の20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、70％以上、80％以上、90％以上、97％以上までを含む10％以上であり、単離された集団の中にある細胞の100％を含む。
適切に胎盤から得られる本発明のEPCは、臍帯血(UCB)に由来するEPCにおける遺伝子発現パターンと比べた遺伝子発現パターンによって特徴付けることができる。「発現」または「遺伝子発現」という用語は、RNAの生成だけ、またはRNAの生成とRNAからタンパク質またはポリペプチドへの翻訳を指す。どちらのタイプの遺伝子発現の検出も本発明に包含される。
特に、本発明のEPCは、UBC由来EPC中の対応する遺伝子の発現と比べて、表1に示した遺伝子を差次的に発現する。
Figure 2016513962
従って、対象EPCは、表1に示した1つまたは複数のマーカー遺伝子を、UCBに由来するEPC中の対応するマーカー遺伝子の発現レベルと少なくとも10％異なる(例えば、高いまたは低い)レベルで発現することを特徴としてもよい。特定の態様において、本発明のEPCは、MFGE8、MATN2、ELN、IGFBP2、SERPINH1、P4HA3、FN1、PKNOX2、FOXC1、NFIX、SMAD6、PRRX2、LRRC17、CTSK、PLA2G4A、DIRAS3、PDLIM3、ABCA8、CFB、PTK7、PTGFRN、SETBP1、LOC652900、SLC22A17、TANC2、SEZ6L2、およびARRDC4からなる群より選択される少なくとも1種類のマーカー遺伝子(例えば、少なくとも1種類、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、10種類、11種類、12種類、13種類、14種類、15種類、16種類、17種類、18種類、19種類、20種類、21種類、22種類、23種類、24種類、25種類、26種類、または27種類のマーカー遺伝子)を、UCB由来EPC中の対応するマーカー遺伝子の発現レベルと少なくとも10％(ならびに少なくとも11％〜少なくとも1000％およびこの間にある全ての整数パーセント)高いレベルで発現する。ある特定の態様において、本発明のEPCは、PODXL、MEOX2、MMP4、FAM107A、LOC647543、およびSCAMP5からなる群より選択される少なくとも1種類のマーカー遺伝子(例えば、少なくとも1種類、2種類、3種類、4種類、5種類、または6種類のマーカー遺伝子)を、UCB由来EPC中の対応するマーカー遺伝子の発現レベルの90％未満(ならびに89％未満〜0.001％未満およびこの間にある全ての整数および小数パーセント)のレベルで発現する。
本発明の方法は、内皮前駆細胞および間葉系幹細胞を効果的かつ効率的に単離する多段階単離方法に基づいている。これは、細胞表面マーカーCD45、CD34、およびCD31の発現をスクリーニングすることに基づく一連の濃縮工程および単離工程によって成し遂げられる。上で詳述したように、非常に稀な細胞である内皮前駆細胞は、CD45、CD34、およびCD31スクリーニングが出発細胞集団を段々と精製し、これらの稀な細胞を単離し、母体間葉系幹細胞集団および胎児間葉系幹細胞集団を単離するのを可能にする特定の直線的な一連の工程で行われた場合にのみ効果的かつ効率的に単離できることが確かめられている。当業者によって認められるように、生物学的試料中にある関心対象の細胞タイプの数が少ない場合、細胞表面マーカーをベースとする精製プロセス中に、これらの細胞が容易に非特異的に失われるため、その精製プロセスはかなり難しくなる。
本発明の文脈において、生物学的試料が最初にCD45-濃縮工程に供された場合に、内皮前駆細胞および間葉系幹細胞は効果的に単離できることが確かめられている。これは、最も都合よく、CD45を発現する細胞の亜集団が、典型的にはCD45結合分子、例えば、抗CD45抗体を用いて特定され、生物学的試料から取り除かれる負の選択工程または枯渇工程を介して成し遂げられる。次いで、これによって、最初の試料に、CD45結合分子によって選択されず、取り除かれなかったCD45-細胞亜集団が残る。別の例では、この工程は勾配分離(gradient separation)によって成し遂げることができる。次いで、この濃縮された細胞集団は、CD34+細胞亜集団またはCD34-細胞亜集団を得るためにさらに濃縮される。これは、都合よく、CD34と特異的に相互作用する分子を用いた正の選択工程として行われる。フローサイトメトリー(例えば、FACS)、マイクロ流体、または磁気に基づくソーティングなどの細胞表面分離法が用いられるのであれば、CD34-細胞集団およびCD34+細胞集団は同時にソーティングおよび採取することができる。
好ましくは連続して行われる、これらの2つの工程に関して、「濃縮する」についての言及は、出発試料中にある望ましい表現型を発現しない細胞に対する望ましい表現型を発現する細胞の比の増加についての言及であると理解されるはずである。これは、望ましい表現型を発現しない細胞を取り除くか、または別の方法で、望ましい表現型を発現しない細胞の数を減らすことによって成し遂げられる。濃縮についての言及は、試料から、望ましい表現型を発現しない細胞を全て試料から取り除く濃縮工程に限定されないことが理解されるはずである。もっと正確に言うと、濃縮についての言及は、試験試料中にある、これらの適切に望ましくない細胞の濃度を下げることについての言及である。従って、濃度の低下は様々な程度のものでよい。本発明の方法は、望ましい亜集団の純度を改善するために(例えば、2回以上の連続したCD45-濃縮工程または2回以上のCD34+またはCD34-濃縮工程を行うことによって)1回または複数回の繰り返される連続した濃縮工程を行うことまで及ぶと理解されるはずである。1回または複数回の濃縮工程が任意の段階で行われることが必要かどうかは個々別々に当業者によって決定することができる。(例えば、胎盤葉試料中にある)標的内皮前駆細胞の数が比較的多い場合、望ましい亜集団を濃縮するためには1回の濃縮工程で十分な場合がある。しかしながら、(極めて少ない数の内皮前駆細胞を含む)血液などの試料が用いられた場合、望ましい細胞亜集団の純度を最大にするためには各濃縮工程を2回以上行うことが望ましい場合がある。
CD45-濃縮工程およびCD34+濃縮工程の後に、これに由来する細胞の亜集団はCD31発現レベルについてスクリーニングされる。3つの別個の細胞亜集団(胎児間葉系幹細胞(fMSC)、胎児内皮前駆細胞、および分化した内皮前駆細胞)が単離される。FACS分析が用いられる場合、例えば、1回の分析工程によって、試料中の全細胞がCD31発現レベルに関して同時に分類され、それによって、CD31-CD31lo/-集団およびCD31+集団が別々に特定され、個々に単離される。この目的のために、「単離」についての言及は、CD31-細胞、CD31lo/-細胞、およびCD31+細胞を互いに分離し、かつこの表現型を発現しない細胞から分離することについての言及であると理解されるはずである。CD45-濃縮工程の後にCD34+細胞集団が単離される程度まで、この「単離」についての言及はCD31-単離の意味に対応する意味を有すると理解されるはずである。これはFACSソーティングなどの任意の適切な方法によって成し遂げることができる。しかしながら、この「単離」についての言及は、事実上、高度に濃縮された細胞集団の実現についての言及であると理解されるはずである。この単離された細胞集団が純粋であることが望ましいが、いかなる生物系でも細胞混入が起こり得るので、これは実現できない場合がある。従って、依然として、少ない割合の混入細胞がある場合がある。しかしながら、存在し得る混入レベルは非常に低いので、かなりの数の混入細胞、例えば、造血幹細胞および間葉系幹細胞を含んでいる、先行技術の方法によって得られた内皮前駆細胞集団よりかなり大幅に改善したことが本発明者らによって確かめられている。間葉系幹細胞集団の状況では、混入母体間葉系幹細胞を取り除くことができる。これらの混入細胞は内皮前駆細胞集団の治療有用性に悪影響を及ぼした。しかしながら、これらの母体間葉系幹細胞は、今や、これらのCD45-/CD34-表現型によって個々に単離することができる。
従って、この態様によれば、哺乳動物内皮前駆細胞を単離する方法であって、以下の連続工程:
(i)哺乳動物細胞集団を単離する工程;
(ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を負の選択によって濃縮する工程;
(iii)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を正の選択によって濃縮する工程;および
(iv)CD31lo/-表現型プロファイルを発現する、工程(iii)に由来するCD34+細胞の亜集団を正の選択によって単離し、それによって内皮前駆細胞を単離する工程
を含む方法が提供される。
別の態様において、本発明は、哺乳動物間葉系幹細胞を単離する方法であって、以下の工程:
(i)哺乳動物細胞集団を単離する工程;
(ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を負の選択によって濃縮する工程;ならびに
(a)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を正の選択によって濃縮する工程、およびCD31-表現型プロファイルを発現する、前記CD34+細胞の亜集団を正の選択によって単離する工程;ならびに/または
(b)CD34-表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を単離し、それによって間葉系幹細胞を単離する工程
を含む方法に関する。
一態様において、前記CD34+CD31-集団は胎児間葉系幹細胞集団である。
別の態様において、前記CD34-集団は母体間葉系幹細胞を含む。
さらに別の態様において、前記細胞集団は胎盤由来集団である。
これらの細胞集団を本発明の方法に従って単離することに関して、様々な周知の技法を行うことができる。抗体、ならびに他のCD45、CD34、および/またはCD31に特異的な細胞表面結合分子が特に有用である。例えば、分離を可能にするために抗体が固体支持体に取り付けられてもよい。分離するための手順には、抗体磁気ビーズを用いた磁気分離、アフィニティクロマトグラフィー、固体マトリックスに取り付けた抗体を用いた「パニング」、または他の任意の便利な技法、例えば、レーザーキャプチャー法が含まれ得る。特に正確な分離を行う他の技法には蛍光標識細胞分取が含まれる。さらに別の例ではあるが、具体的には、CD45負の選択工程の状況では、CD45+細胞集団からCD45-細胞亜集団を物理的に分離するのではなく、CD45+細胞を標識し、次いで、標識されたCD45+細胞を溶解する標的化溶解シグナル、例えば、細胞溶解性、アポトーシス性、または毒性のシグナルを送達する方法が用いられる場合がある。別の例では、抗体の後に補体が投与されるオプソニン化によって、同じアウトカムが得られる場合がある。
関連する局面において、本発明の方法の適用に従って得られた細胞は任意の望ましいやり方で操作または使用できることが理解されるはずである。例えば、インビトロで、分化した体細胞集団を作製するために、本発明の方法の適用に従って得られた細胞の分化を誘導することを選んでもよい。別の例では、内皮前駆細胞の成熟がインサイチューで起こるように、これらの前駆細胞をインビボで投与することを選んでもよい。さらに別の例では、将来使用するために内皮前駆細胞を保管する、例えば、液体窒素に入れて凍結状態で保管することを選んでもよい。さらに別の例では、単に、生存率および未熟状態を維持するために、またはさらにはインビトロまたはインビボで使用するための細胞数を増やすように、内皮前駆細胞状態を維持しながら自己複製および増殖を誘導するために、これらの細胞を培養状態で維持することを選んでもよい。
この目的のために、特定の一用途では、本発明の方法によって単離された内皮前駆細胞または間葉系幹細胞は長期培養で維持される。このような培養方法は従来より成功しておらず、利用可能でもなかったが、インビトロで内皮前駆細胞の生存率を維持し、内皮前駆細胞を自己複製および/または増殖するために、最近になって開発された、内皮コロニー形成細胞(ECFC)を誘導する方法が開発された(Ingram, D.A., et al., Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood, Blood 104: 2752-2760 (2004))。この方法はこの分野における新たなゴールドスタンダードである。本発明をいずれか1つの理論にも作用機序にも限定することはないが、初代内皮において発見された、細胞表面抗原を発現するECFCはクローン増殖し、二次ECFCおよび三次ECFCに再プレートし、造血性でなく、インビトロで管様構造を形成する。これらの細胞は、宿主脈管構造と一体となる血管を形成することができる。この培養方法は、内皮前駆細胞を維持および増殖する信頼性の高い方法となる。代表例では、本発明の方法に従って得られたCD34+/CD31lo/-/CD45-細胞は、10％胎仔ウシ血清を添加したEGM-2を含むプレコーティング済コラーゲン組織培養プレートにプレートされる。細胞を10日にわたって培養し、その結果、臍帯血から得られるものと同じ高増殖性内皮コロニー形成細胞コロニーが形成される(Fisk, N.M. & Atun, R., Public-private partnership in cord blood banking, BMJ 336, 642-644 (2008))。
本発明はまた、本発明の方法に従って単離された細胞を培養状態で維持または保管することに加えて、本発明の方法によって単離された内皮前駆細胞(EPC)または間葉系幹細胞(MSC)の分化を後で誘導するように適合させることもできる。例えば、本発明の一態様の状況において、内皮前駆細胞は、血管、リンパ管、および漿膜腔を裏打ちする細胞である内皮細胞を生じる。別の態様において、間葉系幹細胞は単独で、または特定のマトリックスと混合されて骨、脂肪、または軟骨に分化する場合がある。前記細胞が、関心対象の対象である、これらのさらに完全に分化した細胞タイプの1つまたは複数である程度まで、インビトロまたはインビボのいずれかで、関心対象の系列に沿って部分的または完全に分化させるのに必要な特定の刺激に対象内皮前駆細胞を導入する、さらなる工程を含むように本発明の方法を合わせることができる。または、内皮前駆細胞は、関心対象の系列(例えば、人工多能性幹細胞(iPS細胞))に沿った分化を引き起こす特定の刺激に曝露されてもよい。
前記のように、このさらなる誘導分化事象は都合よくインビトロで行われるが、インビボでも成し遂げることができる。これは下記でさらに詳細に議論される。しかしながら、特定の系列に沿って内皮前駆細胞の分化を誘導するのに必要とされる必要なシグナル範囲を、都合良く、ある特定のインサイチュー環境が提供する場合がある。
従って、「EPC由来細胞」についての言及は、内皮前駆細胞より分化している、または分化しておらず、かつ本発明の方法によって単離された内皮前駆細胞から生じた細胞タイプについての言及だと理解されるはずである。これらの細胞は、内皮前駆細胞が、例えば、脈管構造を生じることが知られている系列の細胞に対応する。対象EPC由来細胞は、さらに分化した前駆体細胞でもよく、体細胞でもよいことが理解されるはずである。従って、本発明のこの局面の範囲内にある細胞は、任意の内皮前駆細胞後の幹細胞分化発生段階にあってもよいことが理解されるはずである。上で詳述したように、このさらなる分化は構成的に行われてもよく、1つまたは複数のさらなるシグナルを必要としてもよい。これらのシグナルは、インビトロで、例えば、小規模インビトロ組織培養もしくは大規模バイオリアクター生産の状況において供給されてもよく、例えば、内皮前駆細胞がさらに分化するように適切な組織微小環境に移植されるのであれば、インビボ微小環境において供給されてもよい。間葉系幹細胞から生じることが知られている分化系列の状況であっても、「MSC由来細胞」に関する対応する定義が、前記で詳述したように適用される。
従って、本発明の関連する局面において、哺乳動物EPC由来細胞の作製を容易にする方法であって、本発明の方法に従って単離された内皮前駆細胞を刺激物質と接触させて、前記内皮前駆細胞から内皮表現型への分化を誘導する工程を含む、方法が提供される。
別の態様において、前記EPC由来細胞は、血管、リンパ管、または漿膜腔の扁平上皮細胞である。
従って、本発明の関連する局面において、哺乳動物MSC由来細胞の作製を容易にする方法であって、本発明の方法に従って単離された間葉系幹細胞を刺激物質と接触させて、前記間葉系幹細胞の分化を間葉系表現型に向ける工程を含む方法が提供される。
本発明のこの局面の状況において、細胞凝集物、例えば、組織(例えば、脈管構造、骨、脂肪、もしくは軟骨)または細胞懸濁液が両方とも生成され得ることが理解されるはずである。
本発明のこの局面の培養系は不均一な細胞集団を生じる可能性があることが理解されるはずである。これは、例えば、出発前駆細胞集団の細胞の全てが成熟した均一な表現型に分化するように誘導されるとは限らない場合に起こり得る。こういった事情なので、出発集団の細胞の全てが、EPC由来表現型またはMSC由来表現型に分化するとは限らない場合があり、得られるEPC由来細胞またはMSC由来細胞の生産量そのものが不均一な場合があるので、本発明の方法は、望ましい表現型を示す細胞を特定および分離するためにスクリーニング工程および選択工程の適用を必要とする場合がある。特定する方法は当業者に周知であり、以下を含むが、これに限定されない。
(i)細胞系列特異的構造の検出
細胞系列特異的構造の検出は、例えば、特定しようとする構造のタイプに応じて、光学顕微鏡、蛍光アフィニティー標識、蛍光顕微鏡、または電子顕微鏡を介して行うことができる。光学顕微鏡は形態的特徴を検出するのに使用ことができる。電子顕微鏡は、サルコメア、Xバンド(X-band)、Zボディ(Z-body)、介在板、ギャップ結合、またはデスモソームなどの構造を検出するのに使用することができる。蛍光アフィニティー標識および蛍光顕微鏡は、問題となっている構造に特異的に結合し、フルオロフォアに直接的または間接的に結合体化される分子、一般的に抗体を蛍光標識することによって細胞系列特異的構造を検出するのに使用ことができる。このような構造の自動定量化は適切な検出システムおよび計算システムを用いて行うことができる。
(ii)細胞系列特異的タンパク質の検出
細胞系列特異的タンパク質、例えば、細胞表面タンパク質または細胞内タンパク質の検出は、都合よく、例えば、蛍光アフィニティー標識および蛍光顕微鏡を介して行われる場合がある。特異的タンパク質は細胞全体および組織の両方で検出することができる。または、ウェスタンイムノブロッティングまたはハイブリダイゼーションマイクロアレイ(「タンパク質チップ」)などの技法が用いられる場合がある。この方法を介して検出することができるタンパク質は、ある特定の細胞集団に特徴的な任意のタンパク質でよい。例えば、前駆体/前駆細胞タイプのクラスは、1種類または複数種の細胞表面分子の発現の存在または非存在を介して区別することができる。この点に関して、この方法を利用して、いずれか1つまたは複数の分子の発現に基づく正の選択工程または負の選択工程を介して細胞タイプを特定することができる。さらに成熟した細胞は、通常、文献において詳細に明らかにされている様々な特異的な細胞表面タンパク質または細胞内タンパク質の発現によって特徴付けることができる。
(iii)細胞系列特異的RNAまたはDNAの検出
この方法は、好ましくは、RT-PCRまたはリアルタイム(qRT-PCR)を用いて行われる。または、使用することができる他の方法には、ハイブリダイゼーションマイクロアレイ(「RNAチップ」)またはノザンブロッティングまたはサザンブロッティングが含まれる。RT-PCRは、本質的に任意のタンパク質、例えば、上記の項目(ii)において詳述したタンパク質、または分泌型のタンパク質もしくは別の方法で、項目(ii)において詳述した方法を介して都合よく検出できないタンパク質をコードする特定のRNAを検出するのに使用することができる。
(iv)細胞系列特異的機能活性の検出
細胞集団の機能に関する細胞集団の分析は、一般的に、項目(i)〜(iii)のスクリーニング法より不便な方法であるとみなされているが、場合によっては、このことが当てはまらないかもしれない。
本発明の方法のこの局面の適用を介して得られた細胞の集団を特徴付けることに関連して、前記で詳述された技法のいずれか1つまたは複数を利用できることが理解されるはずである。
インビトロEPC由来集団またはMSC由来集団を単離または濃縮することに関してもまた、実施することができる様々な周知の技法がある。上で詳述したように、特定の細胞系列および/または分化段階に関連したマーカーを特定するために、抗体、およびレクチンなどの他の細胞表面結合分子が特に有用である。分離を可能にするために、抗体は固体支持体に取り付けられる場合がある。しかしながら、他の細胞分離法には、物理的特徴の差違に基づく細胞分離法(密度勾配遠心分離法および対流遠心エルトリエーション(counter-flow centrifugal elutriation))ならびに生命に関する染色特性の差違に基づく細胞分離法(ミトコンドリアに結合する色素ローダミン123およびDNAに結合する色素Hoechst33342)が含まれる。
分離のための手順には、抗体もしくはレクチンコーティング磁気ビーズを用いる磁気分離、アフィニティクロマトグラフィー、固体マトリックスに取り付けられた抗体を用いる「パニング」、または他の任意の便利な技法が含まれ得る。特に正確な分離をもたらす他の技法には蛍光標識細胞分取が含まれる。この技法もまた、前方光散乱対側方光散乱によって識別可能な形態学的特徴に基づいて細胞を分離するのに適用することができる。これらの技法は正の選択または負の選択の状況において適用することができるが、さらなる負の選択技法には、細胞溶解性、アポトーシス性、そうでなければ毒性の薬剤の部位特異的投与が含まれるが、これに限定されない。これは、この特異的送達を容易にするために、このような薬剤とモノクローナル抗体とのカップリングを介して最も都合よく成し遂げられる場合がある。別の例では、抗体の後に補体が投与されるオプソニン化によって同じアウトカムが得られる場合がある。
これらの技法は、望ましいレベルの精製または濃縮を成し遂げるために一段階プロトコールまたは多段階プロトコールのいずれかとして行うことができる。
本発明の細胞および組織の増殖能はある特定の用途に、例えば、損傷した脈管構造を修復するのに、または治療的処置方法の影響を試験するのに絶対必要な場合があるので、十分なレベルの増殖能を示している細胞をスクリーニングすることが望ましい場合がある。細胞の増殖能は非常に多くの標準的な技法によって確かめることができる。好ましくは、増殖は3[H]-チミジンまたは125I-ヨードデオキシウリジン取り込みアッセイを介して確かめられる。または、増殖能を確かめるために、XTTなどの代謝性色素を用いた比色アッセイまたは直接的な細胞計数が用いられる場合がある。増殖能はまたKi-67などの細胞周期マーカーの発現を介して評価することもできる。
上で詳述したように、本発明の方法はインビトロで行われてもよく、インビボで行われてもよい。インビトロ技術に関して、今や、EPC由来細胞またはMSC由来細胞を小規模または大規模で日常的かつ確実に生産する手段が提供される。例えば、組織培養フラスコ中で行われ得る小規模生産に関して、これは、ある特定の個体用の、およびある特定の状態の状況において細胞集団を生産することに特に適している場合がある。大規模生産に関して、本発明の方法に従って、このような生産を成し遂げる手段の1つがバイオリアクターの使用を介した手段である。
バイオリアクターは、インビボでの栄養分濃度および速度を模倣する制御された濃度および速度で培地および酸素を送達することができる培養プロセスを提供するように設計されている。バイオリアクターは何年も市販されているが、様々なタイプの培養技術を使用する。哺乳動物細胞培養に用いられる様々なバイオリアクターのうちほとんどが、単細胞タイプの高密度培養物を生じるように、従って、本発明において有用なように設計されている。これらの高密度システムの代表的な用途は、最終産物として、細胞が産生した条件培地を生産することである。これは、例えば、ハイブリドーマによるモノクローナル抗体作製およびウイルスベクター作製用のパッケージング細胞株の場合に当てはまる。しかしながら、これらの応用例は、治療用最終産物が、本発明のように、収集された細胞そのものである応用例とは異なる。
バイオリアクターは運転可能になったら、自動調節された培地の流れ、酸素送達、ならびに温度制御およびpH制御を提供し、一般的に、多数の細胞の生産を可能にする。従って、バイオリアクターは労力を節約し、プロセス中の混入の可能性を最小化する。ほとんどの高性能バイオリアクターは、最小限の手作業の必要性とオープンプロセッシング工程を伴うセットアップ手順、増殖手順、選択手順、および収集手順を可能にする。このようなバイオリアクターは最適には、本発明によって意図される均質な細胞混合物または塊状の細胞集団と使用するように設計される。本発明において使用するための適切なバイオリアクターには、米国特許第5,763,194号、米国特許第5,985,653号および同第6,238,908号、米国特許第5,512,480号、米国特許第5,459,069号、同第5,763,266号、同第5,888,807号、および同第5,688,687号に記載のバイオリアクターが含まれるが、これに限定されない。
いかなる大量細胞培養でも、いくつかの基本パラメータはほぼ一定の制御を必要とする。本発明において、幹細胞維持、内皮前駆細胞増殖、内皮前駆細胞分化(恐らく、いくつかの別々の分化培養および条件の状況における)、ならびに最終的な細胞培養/保存を可能にする培地を用いて培養物を提供しなければならない。典型的には、培地を定期的に供給および交換するバイオリアクター内にあるポンプ機構によって様々な培地が細胞に送達される。交換プロセスによって培養物から副産物を取り除くことが可能になる。細胞または組織を増殖させるには酸素源も必要である。異なる細胞タイプが異なる酸素要件を有する場合がある。従って、酸素を細胞に提供するための融通がきき、かつ調節可能な手段が望ましい構成要素である。
特定の培養に応じて、培養チャンバーへの細胞集団および培地供給の均一な分配が重要なプロセス制御である場合がある。このような制御は、多くの場合、細胞間相互作用が重要でない場合に効果的であり得る懸濁培養設計を使用することによって成し遂げられる。懸濁培養システムの例には、様々なタンクリアクター設計およびガス透過性プラスチックバックが含まれる。三次元構造への組み立てを必要としない細胞またはストローマ層もしくはフィーダー層への近接を必要とする細胞の場合、このような懸濁設計が用いられる場合がある。
培養プロセス完了時に細胞が効率的に採取されることが、効果的な細胞培養システムの重要な特徴である。製品として細胞を生産するためのアプローチの1つは、細胞製品を単に溶出することによって、この目的のために設計された市販の閉鎖系細胞洗浄器における最終洗浄に適用可能な管理しやすい濃縮した体積の細胞が得られるように、回収するための物理的障壁がない規定された空間内で細胞を培養することである。最適には、このシステムは、防腐剤または細胞保存用化合物と共に、または伴わずに、薬学的に許容される担体の添加を可能にし、適切な無菌のパッケージへの効率的な収集を行う。最適には、収集プロセスおよびパッケージングプロセスは、培養チャンバーの流体経路の無菌障壁を壊すことなく完了する場合がある。
いかなる細胞培養手順でも、主な関心事は無菌性である。製品細胞が患者に移植される場合(多くの場合、患者が病気であるか、または免疫無防備状態であるときに)、微生物が存在しないことが要求される。手作業のプロセスより優れた本発明の細胞生産装置の利点は、説明された多くのバイオリアクターシステムと同様に、培養が開始したら培養チャンバーおよび流体経路は無菌の閉じた環境で維持されることである。
所望であれば、本発明の細胞(例えば、EPCおよび/またはMSC)は、異種遺伝子を発現するように遺伝子操作することができるか、または分子的に改変することができる。異種遺伝子の例示的な例には、例えば、血栓形成、再狭窄、もしくは血小板接着を直接的または間接的に阻害する、または細胞生存率を上げる、または抗炎症特性を有する因子またはタンパク質が含まれる。例えば、遺伝子、偽遺伝子、変異遺伝子、例えば、ドミナントネガティブ遺伝子、または遺伝子サイレンシング構築物、例えば、ショートヘアピンRNA(shRNA)またはマイクロRNA(miRNA)を含む発現カセットを含む、ベクター(例えば、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、AAVキメラベクター、もしくはレトロウイルスベクター、またはシュードタイプ(pseudotyped)ウイルスベクター)を構築することができる。適切な発現カセットは数多くのいろいろな従来のクローニング法を用いて構築することができる。ウイルスベクターを介した遺伝子送達の使用が好ましいが、非ウイルス法、例えば、リポソーム試薬、リポプレックスまたはポリプレックス、エレクトロポレーション、ソノポレーション、水力学的遺伝子送達、「遺伝子銃」の使用、ならびにヌクレオフェクター法およびナノ粒子送達を介したプラスミドまたはコスミドDNA送達も使用することができる。
本明細書で使用する「遺伝子」という用語は、任意のおよび全てのはっきり区別されているゲノムコード領域ならびに関連する非コード領域および調節領域を指す。遺伝子はまた、任意で、1つまたは複数のイントロンならびに発現調節に関与する隣接する5'および3'非コードヌクレオチド配列を含む、1つまたは複数の特定のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを意味することも意図される。この点に関して、さらに、遺伝子は、ある特定の遺伝子と天然で関連する制御シグナル、例えば、プロモーター、エンハンサー、終結シグナル、および/またはポリアデニル化シグナルを含んでもよく、異種制御シグナルを含んでもよい。従って、「遺伝子」という用語は、mRNA、アンチセンスRNA、siRNA、shRNA、miRNAなどの生成ために使用することができる核酸分子を含み、かつ包含する。遺伝子は機能的タンパク質を産生するのに使用できてもよく、使用できなくてもよい。遺伝子はコード領域と非コード領域を両方とも含むことができる。
「異種遺伝子」という用語は、宿主細胞(例えば、本発明のEPCまたはMSC)のゲノムに人工的に導入された、または人工的に導入されようとしており、その宿主細胞の子孫に伝えられる遺伝物質を説明するために本明細書において用いられる。異種遺伝子は、典型的には、適切な条件下でRNAに転写することができ、任意で翻訳および/または発現することができるポリヌクレオチドを含む。一部の態様において、異種遺伝子は、異種遺伝子が導入される組換え宿主細胞に望ましい特性を付与するか、そうでなければ、望ましい治療アウトカムまたは診断アウトカムにつながる。一部の態様において、異種遺伝子は、転写もしくは翻訳を妨げる分子(例えば、アンチセンス分子)またはRNA干渉を媒介する分子(例えば、siRNAもしくはshRNA)に転写される。
特定の態様において、本発明の細胞(例えば、EPCおよび/またはMSC)は、都合よく、トロンボモジュリン(TM)の抗凝血剤としての特性および抗炎症分子としての特性を考慮してトロンボモジュリン(TM)を過剰発現するように操作される。TMは、さらなるトロンビン生成を阻止するためにトロンビンのタンパク質分解活性が利用される、血液凝固における最も重要な抗凝血フィードバックループの1つに関与する。さらに、TMによって誘導される活性化プロテインC生成は抗炎症機能および抗アポトーシス機能を内皮細胞に及ぼす(Dahlback and Villoutreix (2005) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 25(7):1311-1320)。
一部の態様において、本発明は、トロンビン-TM複合体によるプロテインC(PC)活性化速度を速める、内皮細胞プロテインC受容体(EPCR)(Fukudome et al. (1994) J Biol Chem 269:26486-91); L-アルギニン誘導体一酸化窒素を合成し、従って、強力な血小板接着・凝集阻害剤として働き、サイトカインおよびエンドトキシンによって誘導される組織因子発現を低減する、内皮一酸化窒素合成酵素(Yang et al. (2002) Circulation 101:2144-8);抗トロンビンおよびヘパリン補因子IIと相互作用することによって血栓形成促進性タンパク質の効果を打ち消す、ヘパリン様分子(Stern et al. (1985) J Exp Med 162:1223-35); 凝血促進性トロンビン分子を阻害することによって働く、ヘパリン補因子IIの亜種(Shirk et al. (1996) Arterioscler Thromb Vasc Biol 16:1138-46); プラスミノゲンをプラスミンに変換し、従って、フィブリン分解を可能にする、プラスミノゲンアクチベーター(例えば、組織プラスミノゲンアクチベーターおよびウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーター); 組織因子と組み合わせて活性化凝固因子VIIaを阻害する、組織因子経路阻害剤(Osterud et al. (1995) Thromb Haemost 73:873-5); 負に荷電している膜リン脂質に対して高親和性を有する非グリコシル化タンパク質として、凝固因子に取って代わり、血小板接着を阻害することによって働く、アネキシンV(He et al. (2008) J Biol Chem 283:19192-200); サイクリックアデノシン一リン酸をアップレギュレートすることによって血小板凝集を阻害する、プロスタサイクリン(PGI2)(Willis et al. (1986) Lancet 2:682-3); 抗炎症タンパク質、例えば、トランスフォーミング増殖因子-β1(Smith et al. (1996) J Immunol 157:360-8); インターロイキン-10(Mulligan et al. (1993) J Immunol 151:5666-74); インターロイキン-4(Mulligan et al. (1993) 前記); 高密度リポタンパク質(Cockerill et al. (2001) Circulation 103:108-12); ZPIと複合体を形成し、リン脂質表面に結合し、リン脂質表面において、活性化した第IX因子、第X因子、および第XI因子を阻害する、プロテインZ(Corral et al. (2007) Br. J. Haematol. 137:99-108)、ならびにホーミング経路、抗凝固経路、線維素溶解経路、および抗炎症経路に関与する他のタンパク質、因子、および受容体を含むが、これに限定されない他のポリペプチド/タンパク質を発現するように遺伝子操作された細胞(例えば、EPCおよび/またはMSC)を含む。一部の態様において、遺伝子操作された細胞または遺伝子組換えされた細胞(例えば、EPCおよび/またはMSC)は、標的(例えば、傷ついた、または炎症した)脈管構造を含む標的組織または身体部位への細胞のホーミングを強化するホーミング分子を発現する。このタイプの例示的な例では、ホーミング分子は、ケモカイン受容体、インテグリン受容体、インターロイキン受容体、増殖因子受容体、およびホルモン受容体より選択される。特定の態様において、遺伝子組換えされたEPC用のホーミング分子は、適宜、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体4(CXCR4)、CX3Cケモカイン受容体1(CX3CR1)、C-Cケモカイン受容体5型(CCR5)、およびインシュリン様増殖因子2受容体(IGFR2)、β2-インテグリン、ならびにCXCR2より選択される。
本細胞(例えば、EPCおよび/またはMSC)の遺伝子操作は、有利な遺伝子の過剰発現または付加に限定されず、プラスミノゲンからプラスミンへの変換の作用を阻害するプラスミノゲンアクチベーター阻害剤-1をコードする遺伝子(Rijken et al. (2009) J Thromb Haemost 7:4-13); 活性化または損傷した内皮細胞において発現することができ、外因系凝固経路の活性化において中心的な役割を果たす組織因子(Osterud et al. (1995) Thromb Haemost 73:873-5); 血小板活性化因子受容体(Derian et al. (2003) Expert Opin Investig Drugs 12:209-2); 炎症促進性インターロイキン;および凝固タンパク質の接着を強化する細胞表面リン脂質、ならびに凝固経路、抗線維素溶解経路、および炎症促進経路に関与する他のタンパク質、因子、および受容体を含むが、これに限定されない不利な遺伝子の阻害、ダウンレギュレーション、および「ノックアウト」も含む。
従って、今や、本発明の開発は、対象を治療的または予防的に処置するための手段の開発を容易にしている。特に、本発明の好ましい態様の状況において、不適当な、不十分な、または異常な内皮細胞機能を示す患者を処置するための手段は、これらの対象に、本発明の方法に従って単離されている内皮前駆細胞または部分的もしくは完全に分化したEPC由来細胞を投与することに基づいて提供される。同様に、間葉系幹細胞分化が必要とされる場合、本発明の方法は胎児間葉系幹細胞または母体間葉系幹細胞の供給源を提供する。
この方法は、創傷治癒(例えば、皮膚創傷、糖尿病足もしくは潰瘍、壊疽、または糖尿病性創傷の治癒)、虚血(例えば、重症下肢虚血、重症腎臓虚血、腸間膜虚血、下肢虚血、一過性虚血)、心筋梗塞、脳卒中、うっ血性心不全、末梢血管閉塞性疾患、再灌流傷害、および、例えば、組織を修復または再生するために血管形成または脈管形成が望ましい他の任意の状態を含む広範囲の状態に適用することができる。
従って、様々な局面において、本発明は、対象において組織を修復または再生する方法であって、組織を、本発明のEPC、EPCが濃縮された集団、または移植片と接触させ、それによって、組織を修復または再生する工程を含む、方法を意図する。特定の態様において、これらの方法は、対象において血管形成および/または脈管形成を強化するための方法である。適宜、組織は、筋肉組織、骨格筋組織、心臓組織、神経組織、肝臓組織、膵臓組織、骨組織、軟骨、腎臓組織、眼組織、皮膚組織、または過剰な細胞死を特徴とする組織である。
一部の態様において、対象は、心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢血管閉塞性疾患、虚血、下肢虚血、脳卒中、一過性虚血、再灌流傷害、動脈解離、動脈瘤、ならびに皮膚創傷、糖尿病足もしくは潰瘍、壊疽、および糖尿病性創傷を含む創傷からなる群より選択される疾患を有するか、または発症するリスクがある。
従って、関連する局面において、本発明は、対象において虚血関連組織損傷を回復させる方法であって、(a)本発明のEPC、EPCが濃縮された集団、または移植片を対象に投与する工程;および(b)対象の組織において血管形成または脈管形成を強化し、それによって対象において虚血関連組織損傷を回復させる工程を含む、方法を包含する。一部の態様において、虚血関連組織損傷は、心不全、心筋梗塞、他の虚血性心疾患、下肢虚血、脳卒中、一過性虚血、または再灌流傷害に関連する。
他の関連する局面において、本発明は、対象において心不全を回復させる方法であって、(a)本発明のEPC、EPCが濃縮された集団、または移植片を対象の心臓組織に投与する工程;および(b)対象の心臓組織おいて血管形成または脈管形成を強化し、それによって対象において心不全を回復させる工程を含む、方法を意図する。
本発明はまた、対象の組織において創傷治癒を強化するための方法であって、(a)本発明のEPC、EPCが濃縮された集団、または移植片を組織に投与する工程;ならびに(b)血管形成を増やし、それによって創傷治癒を高める工程を含む、方法にある。
本発明による処置方法は、移植後の1つまたは複数の時点で、望ましい部位における内皮細胞の産生速度を測定する工程、ならびに対象にある新たに形成された内皮細胞含有組織の性能に関する情報を得る工程を含んでもよい。測定されるパラメータには、患者の移植部位に存在する投与細胞の生存、局在、および数が含まれ得る。細胞生着または再構成の程度は、任意の様々なスキャニング法、例えば、コンピューター断層撮影(CATもしくはCT)スキャン、磁気共鳴画像法(MRI)、ドプラ画像法、またはポジトロン放出断層撮影(PET)スキャンを用いて確かめることができる。対象への本発明による移植細胞の機能的組込みは、傷ついた、もしくは病気になった機能の回復または内皮細胞の存在に関連する機能の増大を調べることによって評価することができる。細胞移植片の生着、局在、および生存はまた、標的組織の一部を取り出し、視覚的に調べることによって、または顕微鏡によって(例えば、死後分析において)調べることによって行うこともできる。
脈管構造の移植および修復において使用するためのインビトロでの脈管構造作製、例えば、スキャフォールドを用いることによるインビトロでの脈管構造作製も容易になる。なおさらに、本発明の方法は、炎症、例えば、移植片対宿主病、組織修復、がん、および臓器不全の状況において使用するための細胞供給源を提供する。エクスビボで器官培養物を形成するために、細胞を生体材料およびマトリックスに組み込む手段も提供される。
「異常な内皮細胞機能」を特徴とする状態についての言及は、少なくとも一つには、内皮細胞の機能もしくは発生の点から見た欠損または不要なもしくは望ましくないアウトカムに起因する、あらゆる状態についての言及であると理解されるはずである。これは均一な細胞集団または不均一な細胞集団に対応し得る。対象欠損は、十分でない数の内皮細胞が産生されることを含む、正常でない細胞または他の点で望ましくない細胞のあらゆる構造特徴または機能特徴についての言及であると理解されるはずである。対応する定義が「異常な間葉系由来細胞機能」にも当てはまる。
従って、本発明の別の局面は、哺乳動物における状態を治療的および/または予防的に処置する方法であって、有効な数の内皮前駆細胞または部分的もしくは完全に分化したEPC由来細胞を前記哺乳動物に投与する工程であって、前記内皮前駆細胞が本発明の方法に従って単離されている工程を含む、方法に関する。
別の局面において、本発明は、哺乳動物における状態を治療的および/または予防的に処置する方法であって、有効な数の間葉系幹細胞または部分的もしくは完全に分化したMSC由来細胞を前記哺乳動物に投与する工程であって、前記間葉系幹細胞が本発明の方法に従って単離されている工程を含む、方法に関する。
有効な数の本発明の細胞を個体に「投与する」ことについての言及は、本発明の方法に従って単離されている細胞のエクスビボ集団を哺乳動物に導入することについての言及であると理解されるはずである。インビボで内皮前駆細胞または間葉系幹細胞を投与する場合、内皮細胞を分化させるために、分化を誘導するのに必要な刺激物質はインサイチューで存在してもよく、さらなる刺激、例えば、適切なサイトカインを投与することが必要であってもよいことが理解されるはずである。
好ましくは、前記方法は、脈管形成を必要とする局所部位への内皮前駆細胞のインビボ投与によって行われる。この目的のために、自己由来組織を収集し、内皮前駆細胞を単離し、任意で、細胞を保管(例えば、凍結保存)し、その後に、これらの細胞を、脈管形成を必要とする部位に移植してもよい。
これらの処置方法によれば、本細胞は、好ましくは、特定され、単離され、および/またはエクスビボで、要求される表現型に分化し、最初に収集された個体に戻って移植される自己由来細胞である。しかしながら、本発明は、それにもかかわらず、処置の対象である個体と同じ主要組織適合性プロファイルを示す、他の任意の適切な供給源に由来する細胞の使用まで及ぶことが理解されるはずである。従って、このような細胞は、外来MHCプロファイルを示す細胞の移植に通常関連する組織適合性問題を引き起こさないので事実上、自己由来である。このような細胞は「自己由来」の定義の中にあると理解されるはずである。例えば、ある特定の状況では、本細胞は一卵性双生児から単離されることが望ましい場合があるか、必要な場合があるか、または実際に重要である場合がある。前記細胞はまた望ましい主要組織適合性プロファイルを示すように操作されていてもよい。このような細胞の使用は、組織移植および臓器移植の状況において元来、付き物の困難を乗り越える。しかしながら、自己由来細胞を単離または作製することが可能でないか、または実現できない場合、同種異系幹細胞を利用することが必要な場合がある。「同種異系」細胞は、処置されている対象と同じ種から単離されているが、異なるMHCプロファイルを示す細胞である。治療の状況では、このような細胞の使用は免疫抑制処置の使用を必要とする可能性が高いが、それにもかかわらず、処置されている対象のMHCプロファイルと類似性を示すMHCプロファイルを示す細胞、例えば、兄弟姉妹、親、または子供などの血族から単離/作製された細胞集団を用いることによって、この問題を最小化することができる。本発明はまた異種間移植にも及ぶことが理解されるはずである。すなわち、本発明の方法に従って単離され、患者に導入される細胞は、処置されている対象の種以外の種から単離される。
本発明をいずれか1つの理論にも作用機序にも限定することはないが、異常な細胞集団によって提供されない血管機能の部分的回復でさえも多くの状態の症状を回復するように働く。従って、「有効な数」についての言及は、望ましい効果を少なくとも部分的に得るのに必要な細胞の数、あるいは処置されている特定の状態の発症を遅らせるのに必要な細胞の数、処置されている特定の状態の進行を阻害するのに必要な細胞の数、または処置されている特定の状態の発症もしくは進行を完全に止めるのに必要な細胞の数を意味する。このような量は、もちろん、処置されている特定の状態、状態の重篤度、ならびに年齢、身体状態、大きさ、体重、生理学的状態、併用療法、病歴、および問題となっている障害に関連するパラメータを含む患者一人一人のパラメータに左右される。当業者であれば、過度の実験なく、有効な用量を構成する本発明の細胞および組織の数ならびにその最適な投与方法を確かめることができるだろう。この後者の問題は下記でさらに議論される。これらの要因は当業者に周知であり、日常的な実験を超えない実験によって対処することができる。一般的に、最大の細胞数、すなわち、妥当な医学的判断に従う最大の安全な数が用いられることが好ましい。しかしながら、医学的な理由、心理的な理由、または他の任意の理由で、これより少ない細胞数が投与され得ることが当業者により理解される。
上で議論されたように、本発明の方法はその範囲内に、本明細書において定義された状態に罹患している個体に、移行した細胞または完全もしくは部分的に分化した細胞を導入することを包含するが、必ずしも、個体に導入された集団のあらゆる細胞が関心対象のEPC由来表現型またはMSC由来表現型を獲得しているとは限らないことも理解されるはずである。例えば、内皮前駆細胞集団または間葉系幹細胞集団が体細胞内皮細胞への移行を経ており、全て投与された場合、要求される表現型を示す細胞への移行を経ていない、ある割合の細胞が存在する可能性がある。従って、それによって導入された細胞の関係する部分が、前記で定義された「有効な数」を構成するのであれば、本発明は成し遂げられる。しかしながら、特に好ましい態様において、分化を経ている細胞の集団は、首尾良く分化した細胞の特定、尾良く分化した細胞の単離、および対象個体への導入に供される。これは、EPC由来細胞もしくはMSC由来細胞の不均一な集団を選択するための手段、または投与用の特定の細胞亜集団を選択して除外する手段となる。適用のために選択される方法のタイプは、処置されている状態がどういったものであるかに左右される。しかしながら、一般的に、潜在的な副作用を避けるために、純粋な細胞集団を投与することが望ましいことが予想される。または、場合によっては、内皮前駆細胞集団を分化に供することが実行可能な場合があり、この集団が全体として、要求される機能活性を示すことが分かっているのであれば、無関係の細胞タイプが事前に取り除かれることなく、この集団が全体として対象個体に導入される場合がある。従って、「有効な数」についての言及は、この場合、対象状態の処置である本発明の目的を実現する活性レベルを生じるために、分化した細胞の数が十分になるような、導入するのに必要な細胞の総数についての言及であると理解されるはずである。
前記細胞は任意の適切な方法によって個体に導入することができる。例えば、細胞懸濁液は直接注射することによって導入されてもよく、または細胞が血餅の中で動かなくなっている血餅内部に導入されてもよく、それによって、移植が容易になる。前記細胞はまた移植前にカプセル化されてもよい。カプセル化は、増殖し続ける可能性のある(すなわち、不死の特徴を示す)細胞の散在を阻止するのに有用な技法、または組織不適合性拒絶反応の問題を最小化するのに有用な技法である。しかしながら、カプセル化の有用性は、提供するために移植細胞が必要とされる機能に左右される。例えば、主として可溶性因子を分泌させることが目的で移植細胞が必要とされる場合、カプセル化された細胞からなる集団はこの目的を実現する可能性が高い。しかしながら、脈管構造を発達させるために移植細胞が必要とされる場合、既存の脈管構造と一体化することが求められる。カプセル化された細胞は、これを効率的に行うことができないだろう。
患者に投与される細胞は任意の適切な経路によって単回投与または複数回投与として投与することができる。好ましくは、かつ可能な場合、単回投与が利用される。注射を介した投与を、必要とされる修復のタイプに応じて組織または臓器の様々な領域に向けることができる。
本発明のこれらの局面によれば、患者に投与される細胞は任意の適切な形をとってもよく、例えば、細胞懸濁液でもよく、または組織グラフト(例えば、脈管構造)の形をとってもよいことが認められるだろう。単細胞懸濁液の作製に関して、細胞懸濁液の維持に有利なように分化プロトコールが設計されてもよい。または、細胞凝集物または組織が形成するのであれば、これらは細胞懸濁液に分散されてもよい。細胞懸濁液の利用に関して、患者に投与するために特定の細胞亜集団を選択して除外することも望ましい場合がある。組織が患者に移植されることが望ましい程度まで、これには通常、(針またはカテーテルを介した投与とは対照的に)外科的移植が必要である。または、この組織の一部分だけを移植することができる。別の例では、標準的な組織工学技法を介して、例えば、設計された形を有する組織工学スキャフォールドに本発明の細胞を播種し、播種された細胞および組織によりスキャフォールドを定着させ、それによって、形成された組織を生じる条件下で、播種されたスキャフォールドを培養することによって、操作された組織を作製することができる。次いで、形成された組織は、例えば、標準的な外科的移植技法を用いてレシピエントに投与される。例えば、細胞外マトリックス成分、例えば、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンなどを含む生体適合性生分解性のポリマー繊維またはフォームを用いた適切なスキャフォールドが用いられてもよい。適切なスキャフォールドを作製または入手するための詳細なガイドライン、このようなスキャフォールドを培養するための詳細なガイドライン、およびこのようなスキャフォールドを治療的に移植するための詳細なガイドラインは文献において入手可能である(例えば、Kim S.S. and Vacanti J.P., 1999. Semin Pediatr Surg. 8:119、Osiris, Therapeutics, Inc.への米国特許第6,387,369号; Bell E.への米国特許出願第US20020094573A1号を参照されたい)。
本発明の方法に従って、他のタンパク質分子または非タンパク質分子が対象細胞の導入と共に、対象細胞の導入の前に、または対象細胞の導入の後に共投与されてもよい。「共投与される」とは、同じ経路もしくは異なる経路を介して同じ製剤もしくは異なる製剤に入れて同時に投与されること、または同じ経路もしくは異なる経路を介して連続して投与されることを意味する。「連続」投与とは、これらの細胞の導入とタンパク質分子もしくは非タンパク質分子の投与との間の、またはこれらの細胞の機能活性の開始とタンパク質分子もしくは非タンパク質分子の投与との間の数秒、数分、数時間、または数日の時間差を意味する。このような共投与が必要とされ得る状況の例には、以下が含まれるが、これに限定されない。
(i)対象に非同系の細胞または組織が投与された場合、通常、対象によって、このような細胞または組織の免疫拒絶反応が起こる。この場合、このような拒絶反応を最小化するために、免疫抑制レジメンで患者を処置する、好ましくは、このような投与前に免疫抑制レジメンを開始することも必要であろう。同種異系移植片拒絶反応を阻害するための免疫抑制プロトコール、例えば、シクロスポリンA、免疫抑制抗体などの投与を介した免疫抑制プロトコールは一般に普及した、かつ標準的な行為である。
(ii)処置されている状態がどういったものであるかに応じて、状態の症状を軽減するために、移植細胞が一体化し、完全に機能するときまで患者への投薬を維持することが必要な場合がある。または、状態が処置されたときに、損傷の再発を予防するために薬の長期使用を開始することが必要な場合がある。例えば、対象損傷の原因が高コレステロール(例えば、アテローム性動脈硬化症の状況において発生する)である場合、コレステロール降下剤の継続使用が必要とされる場合がある。
本発明の方法は、問題となっている状態を処置するために単独で行われてもよく、対象処置を容易にする、または増強するように設計された1つまたは複数のさらなる技法と一緒に行われてもよいことも理解されるはずである。これらのさらなる技法は、上で詳述したように他のタンパク質分子または非タンパク質分子の共投与の形をとってもよい。
本発明の別の局面は、哺乳動物における状態を処置するための医用薬剤の製造における内皮前駆細胞またはEPC由来細胞の集団の使用であって、前記細胞が本発明の方法に従って単離されている、使用に関する。
本発明のさらに別の局面は、内皮前駆細胞またはEPC由来細胞の単離された集団であって、前記内皮前駆細胞が本発明の方法に従って単離されている、単離された集団に関する。
本発明の別の局面は、哺乳動物における状態を処置するための医用薬剤の製造における間葉系幹細胞またはMSC由来細胞の集団の使用であって、前記細胞が本発明の方法に従って単離されている、使用に関する。
本発明のさらに別の局面は、間葉系幹細胞またはMSC由来細胞の単離された集団であって、前記間葉系幹細胞が本発明の方法に従って単離されている、単離された集団に関する。
本発明の関連する局面において、処置または予防を受けている対象は、治療的処置または予防的処置を必要とする任意のヒトまたは動物でよい。この点に関して、本明細書における「処置」および「予防」についての言及は最も広い文脈で考えなければならない。「処置」という用語は、必ずしも、完全に回復するまで哺乳動物が処置されることを意味しない。同様に、「予防」とは、必ずしも、対象が最後まで疾患状態にかからないことを意味しない。従って、処置および予防は、特定の状態の症状の回復、または特定の状態を阻止すること、もしくは特定の状態を発症するリスクを別の方法で下げることを含む。「予防」という用語は特定の状態の発病の重篤度を下げることとみなされる場合がある。「処置」もまた既存の状態の重篤度を下げる場合がある。
今や、インビトロで内皮前駆細胞、EPC由来細胞間葉系幹細胞、およびMSC由来細胞を作製する方法が開発されたことで、既存のまたは潜在的な処理方式または培養方式の有効性および毒性を試験するためのインビトロベースのスクリーニング系の開発は容易になった。
従って、本発明のさらに別の局面によれば、内皮前駆細胞またはEPC由来細胞の表現型状態または機能状態に及ぼす処理方式または培養方式の影響を評価する方法であって、前記間葉系幹細胞またはEPC由来細胞を前記処理方式に供する工程であって、前記間葉系幹細胞が上で定義された方法に従って単離されている工程、および機能状態または表現型状態の変化についてスクリーニングする工程を含む、方法が提供される。
本発明の局面は本発明のEPCの治療的使用に関し、特定の態様では、本発明は、前記および本明細書の他の場所において詳述されたEPCを含有する組成物を治療的に有用な形で提供する。従って、本発明は、単離されたEPC、またはEPCが濃縮された単離された細胞集団、および薬学的に許容される担体を含有する組成物を含む。「薬学的に許容される担体」とは、EPCの治療的使用に適合するように、単離されたEPCと組み合わせることができる任意の組成物を意味する。EPCならびに薬学的に許容される担体の治療的使用の非限定的な例は下記で示される(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2004/0009589号も参照されたい)。
従って、本発明のEPCまたは本発明のEPCに由来する細胞は、例えば、脈管形成および/または血管形成を必要とする治療的用途を含む多数の治療的用途のうちのいずれにおいても使用することができる。血管形成および脈管形成は胚における血管系発達を担っている。脈管形成とは、内皮細胞に分化する、EPCまたは血管芽細胞から血管が新規に発達することを指す。対照的に、血管形成とは、完全に分化した内皮細胞の増殖、移動、およびリモデリングによって既存の血管から新たな脈管構造が形成されることを指す。特定の態様において、本発明のEPCまたは本発明のEPCに由来する細胞は、虚血性の肢および心臓の修復を含む、血液および/もしくはリンパ脈管構造の修復に有用であるか、または血管部位に治療剤を送達するための標的化ベクターとして有用である。特定の態様において、本発明のEPCは、心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢血管閉塞性疾患、虚血、下肢虚血、脳卒中、一過性虚血、再灌流傷害、ならびに皮膚創傷、糖尿病足もしくは潰瘍、壊疽、および糖尿病性創傷を含む創傷を治療するのに有用である。
EPCは任意の治療的に許容される担体に溶解して対象に投与することができる。EPC(またはEPCに由来する細胞)が投与される対象は、EPCが治療利益をもたらす任意の状態、損傷、または疾患を有してもよい。例えば、対象の特定の部位、例えば、心臓に血管細胞損傷があれば、EPCは対象の損傷部位に投与されてもよい(ある特定の態様では全身に投与されてもよく、この場合、EPCまたはEPCに由来する細胞は損傷部位に向かう)。
ある特定の治療用途では、EPCは、対象に細胞が投与される前に内皮細胞誘導条件下で培養されてもよい。この例示的な例には、移植前に内皮細胞産生を誘導することが含まれる。例えば、EPCは、血管内皮細胞を形成するように、例えば、医療装置または手術装置、スキャフォールドもしくはマトリックスまたは他の構造(例えば、チューブ)の上に血管内皮細胞を形成するように誘導され、次いで、対象の内皮細胞を必要とする部位に移植されてもよい。このような態様において、任意の便利な内皮細胞産生条件を使用することができる。
一部の態様において、本発明のEPCは、埋め込み型細胞支持基材、装置、および/または薬学的に許容される担体と組み合わされる。細胞支持基材はポリマーマトリックスでもよい。ポリマーマトリックスの例示的な例には、EHSマウス腫瘍から抽出した可溶性基底膜マトリックスであるBecton-Dickinsonのマトリゲル(Kleinman et al. (1986) Biochem. 25:312)などがあるが、これに限定されないゲルが含まれる。他の態様において、ゲルはコラーゲンIゲルでもよい。このようなゲルは、他の細胞外マトリックス(ECM)成分、例えば、グリコサミノグリカン、フィブリン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、および糖タンパク質を含んでもよい。ゲルはまた、コラーゲンIVおよびラミニンなどの基底膜成分も含んでもよい。プロテイナーゼおよびコラゲナーゼなどの酵素がゲルに添加されてもよく、同様に、増殖因子および走化性物質などの細胞応答修飾物質(cell response modifier)が添加されてもよい。
ゲルと混合された、または単にリン酸緩衝食塩水(PBS)などの液体担体と混合された本発明のEPC(または本発明のEPCに由来する内皮細胞)は、血管形成/脈管形成が望ましい組織部位に直接注射されてもよい。例えば、前記細胞は、心臓または他の筋肉にある虚血組織に注射されてもよい。虚血組織において、前記細胞は、既存の心臓脈管構造と吻合して罹患組織に血液を供給する細管へと組織化する。他の組織も同様に血管新生し得る。前記細胞は虚血組織にある血管新生部位と一体となり、血管発達および吻合を促進する(Kawamoto et al., (2001) Circulation 103: 634-7を参照されたい)。結合組織、筋肉組織、神経組織、および臓器組織を含む全種類の組織を血管新生化するために、本発明による細胞が用いられることが意図される。肝臓および膵臓などの多くの臓器において非血管網状組織が見出される場合があり、このような組織における治癒を操作または促進するために本発明の技法も同様に用いられる場合がある。例えば、肝臓に注射された胚内皮細胞は管網状組織に発達することができ、この管網状組織の周囲で、元からある肝細胞が他の肝臓構造を発達することができる。
EPCはまた、血管形成術後の心臓脈管構造の治癒を助けるために用いられる場合がある。例えば、血管形成術後またはステント挿入前に、カテーテルを用いて胚内皮細胞を血管表面に送達することができる。または、ステントには胚内皮細胞が播種されてもよい。成体内皮細胞で処理された血管は迅速な再内皮化(re-endothelialization)を示し、傷つけられた血管内での再狭窄を阻止する(Parikh et al. (2000) Advanced Drug Delivery Reviews, 42:139-161)。他の態様では、胚内皮細胞はポリマーシートに播種され、血管形成術またはステント挿入を受けた血管の外側に巻き付けられてもよい(Nugent et al. (2001) J. Surg. Res., 99:228-234)。前記細胞はまたゲルと混合され、マトリックス上に直接播種される代わりにポリマーシートに注入されてもよい。
本発明はまた、EPCがポリマーマトリックス、例えば、スポンジまたはメッシュに播種され、次いで、望ましい組織部位に移植される堅い移植片も意図する。または、前記細胞はゲルと混合されてもよく、次いで、ゲルはマトリックスの内面および外面に吸収され、スポンジのようなマトリックスまたは他の多孔性マトリックスの孔の一部を満たしてもよい。毛細管力が硬化前にゲルをマトリックス上に留めておく。または、ゲルはもっと自らを支えるようにマトリックス上で硬化されてもよい。例示的な生体適合性ポリマーマトリックスには、プラスチックおよび他のポリマーを含む任意の生体適合性合成材料、半合成材料が含まれる。一部の態様において、生体適合性ポリマーマトリックスは吸収性材料または非吸収性材料から作られてもよい。生体適合性ポリマーマトリックスを作るのに有用な材料には、例えば、ポリ(エチレン)、ポリエステル、ポリ(プロピレン)、ポリ(プロピレン)ポリエステル、例えば、ポリ(プロピレン)フマレート、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ナイロン、ポリプロピレン/PTFE、ポリプロピレン/セルロース、ポリプロピレン/モノクリアル(monochryal)、ポリエステル/コラーゲン、ポリ(アクリレート)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(カーボネート)、ポリ(トリメチレンカーボネート)、ポリ(エチレン-co-酢酸ビニル)、ポリ(エーテルウレタン)、ポリ(エステルウレタン)、ポリ(アリレート)、ポリ(イミド)、ポリ(無水物-co-イミド)、ポリ(アミノ酸)、ポリデプシペプチド、ポリ(ホスプバゼン(phospbazene))、ポリ(グリコール酸)、ポリ(乳酸)、ポリ(ラクチド-co-グリコリド)、ポリ(ε-カプロラクトン)、ポリ(p-ジオキサノン)、ポリ(ラクチド-co-グリコリド)、ポリ(ε-カプロラクトン-co-グリコリド)、ポリ(グリコリド-co-トリメチレンカーボネート)、ラクチド/テトラメチルグリコリドコポリマー、ラクチド/トリメチレンカーボネートコポリマー、ラクチド-δ-バレロラクトンコポリマー、ラクチド(ε-カプロラクトンコポリマー)、ポリ(ラクチド)/ポリエチレンオキシドコポリマー、非対称3,6置換ポリ(1,4-ジオキサン-2,5-ジオン)、ポリ(β-アルカン酸)、例えば、ポリ(β-ヒドロキシブチレート)、ポリ(β-ヒドロキシブチレート)/(β-ヒドロキシバレレート)コポリマー、ポリ(β-マレイン酸)およびポリ(β-ヒドロキシプロピオネート)、ポリ(δ-ヴァレロラトン(valerolatone))、メチルメタクリレート-N-ビニルピロリドンコポリマー、ポリエステルアミド、シュウ酸のポリエステル、ポリジヒドロピラン、ポリアルキル-2-シアノアクリレート、その複合材料、セルロース材料、およびその組み合わせが含まれる。
ある特定の態様において、ポリマーマトリックスは生分解性である。適切な生分解性マトリックスは当技術分野において周知であり、コラーゲン-GAG、コラーゲン、フィブリン、PLA、PGA、およびPLA-PGAコポリマーを含む。さらなる生分解性材料には、ポリ(無水物)、ポリ(ヒドロキシ酸)、ポリ(オルトエステル)、ポリ(プロピルフメレート(propylfumerate))、ポリ(カプロラクトン)、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリアセタール、生分解性ポリシアノアクリレート、生分解性ポリウレタン、および多糖が含まれる。非生分解性ポリマーも同様に使用することができる。他の非生分解性であるが生体適合性のポリマーには、ポリピロール、ポリアニリン、ポリチオフェン、ポリスチレン、ポリエステル、非生分解性ポリウレタン、ポリ尿素、ポリ(エチレン酢酸ビニル)、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリカーボネート、およびポリ(酸化エチレン)が含まれる。当業者は、これが組織工学用途に適したポリマーの包括的ではなく例示的なリストであることを認める。
一部の態様において、交換されているECMの微細構造に似た微細構造をもつマトリックスが用いられる場合がある。周囲組織がマトリックスに加える機械的な力は人工マトリックス上にある細胞に影響を及ぼし、適切な微細構造をもつECMの再生を促進する。マトリックスの機械的特性と分解速度(分解性スキャフォールドの場合)の両方を制御するためにマトリックスの架橋密度も調節されてもよい。最終移植片の形状およびサイズは移植片部位および組織タイプに合わせなければならない。マトリックスは単に細胞用送達ビヒクルとして役に立ってもよく、構造的機能または機械的機能を提供してもよい。マトリックスは、任意の形で、例えば、粒子、スポンジ、管、球体、鎖、コイル状の鎖、毛細管網状組織、フィルム、繊維、メッシュ、またはシートとして形成されてもよい。
または、EPCは管状支持体上に播種されてもよい。例えば、ポリマーマトリックスは管または網状組織に形成されてもよい。このような管は天然または合成のECM材料、例えば、PLAまたはコラーゲンから形成されてもよく、天然源、例えば、脱細胞した管状グラフトに由来してもよい。EPCは管の内部をコーティングし、それによって、心臓バイパスに使用することができる人工導管を形成する。さらに、EPCを使用することによって移植後の血栓症が低減する場合がある(Kaushall et al. (2001) Nat Med. 7(9)1035-40を参照されたい)。
EPCは、動物に移植される前にポリマーマトリックス上または管状支持体上で増殖されてもよい。増殖中に、特定の細胞応答を刺激するために、または移植片が動物内で受ける機械的な力をまねるために、移植片に機械的な力が加えられてもよい。例えば、培地が管状支持体を通って脈打って(すなわち、フープ応力(hoop stress))、または管の内部をコーティングしている細胞に剪断応力を加えるのに十分な速度で循環されてもよい(Kaushal (2001) 前記)。または、肝臓などの臓器内に置かれる移植片には静水学的な力または圧縮力が加えられてもよく、張力を受ける組織において用いられる移植片には引張り応力が加えられてもよい。
一部の態様において、本発明のEPCは医療装置の一部として対象に投与される。本発明のEPCまたは本発明のEPCに由来する細胞でコーティングすることができる医療装置には、医学的状態の予防または療法または診断のために、ならびに生理学的パラメータのワイヤレスモニタリングのために哺乳動物に一時的または恒久的に導入される装置が含まれる。このような装置には、が含まれるが、これに限定されない。一部の態様において、医療装置は、血管プロテーゼ、血管グラフト、補綴臓器を血管循環につなぐための取付け具、血管ステントおよび非血管ステント(例えば、胃腸ステント、肺ステント、または胆管ステント)を含むステント、カバー付きステント、人工心臓弁、人工心臓、心臓プロテーゼ(例えば、人工心臓弁)、生物心臓代用弁(例えば、ブタなどの動物に由来する-生体適合性を高め、血栓が少なくなるように異種移植片をEPCでコーティングすることができる)、静脈弁、腹部大動脈瘤グラフト、血管フィルター(例えば、大静脈フィルター)、カテーテル、ガイドワイヤ、バルーン、肺塞栓症を防ぐ装置(例えば、塞栓コイル、血管塞栓術用の塞栓材料など)、整形外科用移植片(例えば、骨プロテーゼまたは関節プロテーゼ)、血管縫合糸、スキャフォールド、平滑な移植片または多孔性の移植片、腔内装置、血管補綴フィルター、ペースメーカー、ペースメーカーリード線、電極、除細動器、皮下移植片および/または筋肉内移植片、血管閉塞、心室シャント、血管シース、薬物送達装置およびポート、中隔閉鎖装置、縫合糸、神経刺激装置、埋め込み型ワイヤレスセンサ(例えば、血糖モニタおよび血圧モニタ)、人工濾過システムまたは他の人工臓器、インシュリンポンプ、人工酸素供給器などより選択される。適切な医療装置の他の例示的な例には、MCAD(例えば、流入カニューレおよび流出カニューレならびにアダプターを備える左心補助装置(LVAD))、血液透析グラフト、歯科インプラント、整形外科用移植片、再建用プロテーゼ、pHおよび血中酸素、血圧、血糖値(糖尿病での血糖管理用途の場合)を含むが、これに限定されないパラメータを測定する埋め込み型ワイヤレスバイオセンサ、埋め込み型インシュリンポンプ、埋め込み型人工酸素供給器、埋め込み型人工腎臓もしくは濾過システム、人工のもしくは組織工学により作られた膀胱および/もしくは尿管、他の埋め込み型人工臓器、埋め込み型電気機器(例えば、ペースメーカー)、またはワイヤレス微小電気機械システム(MEMS)が含まれる。医療装置は、例えば、チタンまたはチタン合金で作ることができる。チタン合金には、形状記憶合金(例えば、Nb、Ta、Zr、Mo、Fe、Siを含有するチタン合金を含むが、これに限定されない、ニチノール(NiTi)、アルミニウムおよびバナジウム合金(Ti6Al4V)および(Ti6Al4VELI)、ならびにニオブ合金(Ti6Al7Nb)、鉄合金(Ti5Al2.5Fe)が含まれる。前記装置はまた他の金属、例えば、ステンレス鋼でも作ることができる。
本発明はまた、例えば、前記のような埋め込み型医療装置の血液接触面を本発明のEPCまたは本発明のEPCに由来する細胞でコーティングする方法に関する。細胞が広がる速度を速くするために、埋め込み型装置の血液接触面は、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、ビトロネクチン、ラミニン、フィブリン、またはプロテオグリカンを含む分子、タンパク質、もしくは構築物を含有する以下の成分のいずれか、例えば、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラチン硫酸、もしくは非プロテオグリカン多糖を含有する分子、例えば、ヒアルロン酸、またはその任意の組み合わせでプレコーティングすることができる。血液接触面はまた、ゼラチンまたはゼラチンマトリックスまたはゼラチンフォーム、例えば、Gelfoam(Pharmacia and Upjohn, Pfizer)、セルロース、ミクロフィブリルコラーゲン、トロンビン、例えば、組換えヒトトロンビン(Recothrom, ZymoGenetics)、フィブリンシーラント、例えば、Tisseel(Baxter)、またはフィブリンゲル、フィブリン糊、線維素溶解が阻害されたフィブリン糊、接着糊(adhesive glue)またはシーラント、ヒドロゲルでプレコーティングすることができる。血液接触面はまた、血清タンパク質もしくは他の血液成分、または増殖因子もしくはホルモン、例えば、血小板由来増殖因子BB、塩基性線維芽細胞増殖因子、酸性線維芽細胞増殖因子、またはトランスフォーミング増殖因子β1でもプレコーティングすることができる。プレコーティングはまた、合成ポリマー、例えば、リジン、オルニチン、もしくはアルギニンのポリマー、またはポリメチルメタクリレート、ポリアクリル酸、またはL-グルタミン酸で処理された構築物、またはグルタルアルデヒドによって保存された細胞マトリックス、または生分解性結合剤もしくはコーティング、例えば、ポリ(DL-ラクチド-co-グリコリド)、または生分解性ポリエステル、例えば、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリソルベート、またはポリアミノ酸、例えば、ポリ-L-リジン、またはキトサン、フェチュイン、またはカチオン性シリカマイクロビーズ、他のタイプのマイクロビーズもしくはカーボン蒸着表面コーティング、プラズマ放電表面改変によって変えられた、もしくは変えられていないポリエチレンテレフタレート、または共有結合的に取り付けられたアビジン、ビオチン化、またはRGDペプチド配列を含有する分子、またはRGDペプチドに架橋した構造、もしくは構築物、もしくはペプチド、または1つもしくは複数のEPC特異的インテグリン結合部位もしくは協力作用結合部位、例えば、アミノ酸配列DRVPHSRNに特異的な分子、またはEPCに特異的な抗体、ペプチド、もしくはアプタマー、または前記の任意の組み合わせを用いて行うこともできる。上述の分子は、下部にある表面、例えば、チタン/チタン合金表面に物理吸着されてもよく、共有結合されてもよい。後者の場合、シラン処理(例えば、アミノシラン架橋剤への鋼の連結)、ビオチン化、ドーパミンへの共有結合などを含む様々な方法が利用可能である。上述のタンパク質、分子、ポリマー、構造、および人工構築物に加えて、線維芽細胞、平滑筋細胞、幹細胞、中皮細胞、間葉系細胞、前駆細胞、筋細胞、または他の細胞タイプを含むが、これに限定されない他の細胞タイプを用いて、血液と接触する装置表面をプレコーティングして、EPCに適したマトリックスを提供することができる。一般的に、拒絶反応を避けるために、埋め込み型装置を自己由来細胞でプレコーティングすることが望ましい。この目的のために、線維芽細胞は、例えば、患者の皮膚の試料から容易に収集することができる。
本発明の生体適合性移植片は少なくとも1種類の生理活性剤を含んでもよい。生理活性剤の代表例には、増殖因子、鎮痛剤/解熱剤、抗喘息剤、抗生物質、抗うつ剤、抗糖尿病剤、抗真菌剤、降圧剤、抗炎症剤、抗新生物剤、抗不安剤、免疫抑制剤、抗片頭痛剤、鎮静剤/睡眠剤、統合失調症治療剤、抗躁剤、抗不整脈剤、抗関節炎剤、抗痛風剤、抗凝血剤、血栓溶解剤、抗線維素溶解剤、抗血小板剤および抗菌剤、抗ウイルス剤、殺菌剤、抗感染剤、ならびにその組み合わせが含まれる。特定の態様において、生理活性剤は、増殖因子または走化性物質などの細胞応答修飾物質である。例示的な増殖因子には、上皮細胞増殖因子、骨形成タンパク質、TGF-β、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、TGF-α、IGF-IおよびII、造血成長因子、ヘパリン結合増殖因子、ペプチド増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子および酸性線維芽細胞増殖因子、神経成長因子(NGF)、筋肉形態形成因子(MMP)、ならびに血管内皮増殖因子(VEGF)が含まれる。使用される特定の増殖因子は望ましい細胞活性に適していなければならない。例えば、EPC分化を促進するためにVEGFが用いられる場合がある。または、増殖因子は、細胞を移植片に動員する、または移植片に動員された細胞の特定の代謝活性を促進もしくは阻害するように選択される場合がある。大きな増殖因子ファミリーの調節効果は当業者に周知である。
血管形成をさらに強化することが望ましい態様では、本発明のEPCの投与と一緒に、または本発明のEPCの投与の後に内皮細胞マイトジェンも患者に投与されてもよい。内皮細胞マイトジェンは直接、例えば、動脈内、筋肉内、または静脈内に投与することができる。または、マイトジェンをコードする核酸が用いられてもよい。Baffour et al., 前記 (bFGF); Pu et al. (1993) Circulation, 88:208-215 (aFGF); Yanagisawa-Miwa et al., 前記 (bFGF); Ferrara et al. (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun., 161:851-855 (VEGF); (Takeshita et al. (1994) Circulation, 90:228-234)を参照されたい。
ECマイトジェンをコードする核酸は、例えば、米国特許第5,652,225号に記載のように、カテーテル、例えば、ヒドロゲルカテーテルを介して、虚血組織または血管損傷部位に灌流する血管に投与することができる。
前記核酸はまた、米国特許第6,121,246号に記載の方法を用いて、虚血組織に直接注射することによって送達することもできる。
本明細書で使用する「内皮細胞マイトジェン」という用語は、内皮細胞増殖を直接的または間接的に誘導することができる任意のタンパク質、ポリペプチド、ムテイン、または部分を意味する。このようなタンパク質には、例えば、酸性線維芽細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子(aFGFおよびbFGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、上皮細胞増殖因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因子αおよびβ(TGF-αおよびTFG-β)、血小板由来内皮増殖因子(PD-ECGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、肝細胞増殖因子(HGF)、インシュリン様増殖因子(IGF)、エリスロポエチン、コロニー刺激因子(CSF)、マクロファージ-CSF(M-CSF)、顆粒球/マクロファージCSF(GM-CSF)、ならびに一酸化窒素合成酵素(NOS)が含まれる。Klagsbrun et al. (1991) Annu. Rev. Physiol., 53, 217-239; Folkmnan et al. (1992) J. Biol. Chem., 267, 10931-10934およびSymes et al. (1994) Current Opinion in Lipidology, 5, 305-312を参照されたい。ムテインまたはマイトジェン断片がEC細胞増殖を誘導または促進する限り、これらが用いられる場合がある。
一部の態様において、内皮細胞マイトジェンは、タンパク質分泌を容易にする分泌シグナル配列を含有する。天然シグナル配列を有するタンパク質、例えば、VEGFが望ましい。天然シグナル配列を有さないタンパク質、例えば、bFGFを、日常的な遺伝子操作法を用いて、このような配列を含有するように改変することができる。Nabel et al. (1993) Nature, 362, 844を参照されたい。
多数のコンピュータデータベース、例えば、GenBank、EMBL、およびSwiss-Protを通じて非常に多くの内皮細胞マイトジェンのヌクレオチド配列を容易に入手することができる。この情報を用いて、所望のものをコードするDNAセグメントが化学合成されてもよい。または、このようなDNAセグメントが、当技術分野において日常的な手順、例えば、PCR増幅を用いて得られてもよい。VEGFをコードするDNAは米国特許第5,332,671号に開示される。
ある特定の状況では、治療アウトカムを最適化するために2つ以上の異なるタンパク質をコードする核酸を使用することが望ましい場合がある。例えば、2種類のタンパク質、例えば、VEGFおよびbFGFをコードするDNAが用いられてもよく、bFGF単独の使用より優れた改善をもたらす。または、標的細胞の活性を強化すると同時に血管形成を誘導するために、例えば、一酸化窒素合成酵素、L-アルギニン、フィブロネクチン、ウロキナーゼ、プラスミノゲンアクチベーター、およびヘパリンを含む他の遺伝子またはそのコードされている遺伝子産物と、血管新生因子が組み合わされてもよい。
本発明の細胞播種移植片は、結合組織、筋肉組織、神経組織、および臓器組織を含む任意の組織に移植することができる。例えば、骨欠損の中に入れられた移植片は周囲の骨から細胞を引き寄せ、この細胞がECMを合成するのに対して、EPCは血管を形成する。新たなECMが形成され、石灰化されたときに、新たな骨に血液が供給される。皮膚欠損の中に入れられた移植片は真皮形成を促進し、新たに形成された皮膚に栄養分を供給する血管網状組織となる。
移植片に動員された細胞はまた他の細胞タイプにも分化する可能性がある。骨移植片に移動した骨細胞前駆体は骨芽細胞に分化することができる。血管に移動した間葉系幹細胞は筋肉細胞に分化することができる。肝臓内の管網状組織を形成した内皮細胞は肝臓組織の形成を誘導することができる。
一部の態様において、本発明のEPCは移植前に別の細胞タイプと混合される。細胞混合物は、前記のように培養培地などの担体の中に、またはゲルの中に懸濁されてもよい。または、前記細胞はポリマーマトリックス上に同時播種されてもよく、マトリックスに吸収されるゲルと組み合わされてもよい。一部の用途にとっては、ある細胞タイプをマトリックスに直接播種し、ゲルを介して第2の細胞タイプを追加することが望ましい場合がある。EPC:他の細胞タイプの任意の比を使用することができる。当業者は、この比が特定の用途のために容易に最適化され得ることを認める。EPC:他の細胞の例示的な比は、少なくとも10％(例えば、1:9)、少なくとも25％、少なくとも50％(例えば、1:1)、少なくとも75％、少なくとも90％である。これより小さな比、例えば、10％未満も用いられる場合がある。
結合組織細胞、神経細胞、筋肉細胞、臓器細胞、または他の幹細胞を含む任意の細胞タイプをEPCと組み合わせることができる。例えば、大きな欠損における骨およびその脈管構造の同時生成を促進するために、骨芽細胞が胎児内皮細胞と組み合わされてもよい。胎児内皮細胞と組み合わされ、皮膚に挿入された線維芽細胞は、完全に血管新生した真皮を生じる。本発明の胎児内皮細胞と組み合わされ得る他の例示的な細胞には、造血細胞(造血幹細胞を含む)、靱帯細胞、肺細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、島細胞、神経細胞、肝細胞、腎臓細胞、膀胱細胞、および骨形成細胞が含まれる。
ある特定の態様において、本発明のEPCは、対象の望ましい部位に治療剤を標的化するのに用いられる。望ましい部位には、対象にある新生物細胞増殖部位、例えば、腫瘍細胞または網膜症では異常な血管増殖の部位にある脈管構造が含まれる。当技術分野において周知のように、腫瘍には、血管内皮細胞およびリンパ内皮細胞の両方を含む内皮細胞産生領域が含まれる。腫瘍関連脈管構造は腫瘍の成長および維持に重要なことが示されている。腫瘍関連リンパ管は、腫瘍細胞をばらまいて、例えば、リンパ節に転移を形成するための導管として働くことが示されている。これは多くのタイプのがんの予後について大きな意味を持つ。前述のように、本発明の局面によるEPCは二分化能性、すなわち、血管内皮細胞またはリンパ内皮細胞のいずれかに発生することができる。従って、本発明の局面によるEPCは、治療剤を腫瘍内にあるリンパ内皮細胞部位および/または血管内皮細胞部位に送達するための標的化ベクターとして有用である。抗腫瘍性または抗血管新生性の送達ベクターとしてEPCを使用する一例には、サイトカイン、ホルモン、または他のシグナル伝達物質;抗体または抗体断片などを含む1種類または複数種の抗腫瘍(または細胞毒性)タンパク質または因子を発現するようにEPCを遺伝子組換えすることが含まれる。抗腫瘍送達ベクターとしてEPCを使用する別の例には、EPCを、抗体または抗体断片、サイトカイン、ホルモン、放射性物質、細胞傷害剤、化学療法剤などを含む抗腫瘍因子または他の毒物で結合体化またはコーティングすることが含まれる。この点に関して限定は意図されない。
本発明の内皮前駆細胞は、細胞死の増加または細胞数もしくは細胞機能の減少を特徴とする様々な疾患に罹患した組織を再生または修復するのに有用である。特に、これらの細胞の移植は虚血性の肢および心臓を修復するのに有用である。このような細胞はまた、心血管疾患、例えば、心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢血管閉塞性疾患、糖尿病性ニューロパチー、虚血性ニューロパシー、中毒性ニューロパチー、または化学物質によるニューロパチーを含むが、これに限定されない様々なタイプの末梢ニューロパチー、脳卒中(脳血管疾患)、肝不全、腎不全、島細胞移植、骨疾患および関節疾患、または内皮前駆細胞療法を必要とする任意の変性疾患を処置または予防するのに用いられる場合がある。
本発明のさらに別の局面において、間葉系幹細胞またはMSC由来細胞の表現型状態または機能状態に及ぼす処理方式もしくは培養方式の影響を評価する方法であって、前記間葉系幹細胞またはMSC由来細胞を前記処理方式に供する工程であって、前記間葉系幹細胞が上で定義された方法に従って単離されている工程、および機能状態または表現型状態の変化についてスクリーニングする工程を含む、方法が提供される。
「変化した」とは、分析の対象である機能パラメータまたは表現型パラメータの1つまたは複数が未処理細胞と比べて変わったことを意味する。これは、問題となっている処理方式が細胞機能を改善するように設計されている場合、望ましいアウトカムでもよい。しかしながら、処理方式が有害なアウトカムと関連している場合、これは毒性、従って、処理方式の使用には適していないことを示してもよい。今や、特定の薬物に対する個体の応答性に関して観察された差違が、多くの場合、その個体のユニークな遺伝子構成に結び付けられることは周知である。従って、本発明の方法は、問題となっている個体に由来する核物質を用いて作製された細胞に対して既存の処理方式または新たな処理方式を試験する価値のある手段となる。これは、薬物をインビボで投与する前に、個体の細胞系に対する薬物の見込みのある有効性を評価するためのユニークな手段となる。患者の具合が極めて悪い場合、望ましくないアウトカムの原因となる処理方式によって引き起こされ得る生理学的ストレスを避けることができるか、または少なくとも最小化することができる。
従って、本発明のこの局面は、細胞機能を正常化するように設計された処理を最適化する手段を提供する。しかしながら、前記方法はまた、処理の毒性、特に、化合物による処理を評価するのに使用することもできる。従って、造血表現型または間葉系表現型に関連する特徴、例えば、本発明の細胞および組織において化合物による処理に応答した造血表現型または間葉系表現型に関連する特徴を生じないことを用いて、このような化合物の毒性を評価することができる。
従って、本発明の方法は、薬物、他の処理方式または培養条件をスクリーニングおよび/または試験するのに使用することができる。表現型変化を評価する状況において、本発明のこの局面は、対象細胞および組織の遺伝子発現プロファイルに対する変化をモニタリングするのに利用することができる。従って、本発明のこの局面による方法は、例えば、処理に応答した遺伝子発現パターン変化を確かめるのに使用することができる。
好ましくは、本発明の細胞または組織が受ける処理は化合物への曝露である。好ましくは、前記化合物は薬物または生理学的イオンである。または、前記化合物は増殖因子または分化因子でもよい。この目的のために、薬物投与前に細胞集団に及ぼすこのような副作用を予測することができる利用可能な方法を有することが極めて望ましい。
前記のように対象方法を実施するためのキットおよびシステム(下記では総称して「キット」と呼ばれる)も本発明によって提供される。例えば、キットは、治療目的または研究目的で、インビトロで適切な供給源(例えば、胎盤)からEPCを作製するための試薬および構成要素を備えてもよい。このような態様において、キットは、サイトカイン、細胞培養培地、酵素(例えば、細胞解離の場合、例えば、Accutase)、抗体および/または遺伝子プローブ(例えば、CD31、CD45、CD34、CD105、CD144、CD146、VEGFR2、HLA-ABC、CD73、およびHLA-DRに特異的な抗体または遺伝子プローブ、ならびに表1に列挙したマーカー遺伝子のいずれか1つもしくは複数またはその発現産物など)のような試薬、培養プレートまたはフラスコ、EPCストックなどを備えてもよい。本発明によるEPCの作製および/もしくは使用またはこのようなEPCに対する品質管理分析の実施において有用な任意の試薬を備えることができる。
一部の態様において、キットは内皮細胞作製のために設計され、本明細書に記載のEPCの1つまたは複数、ならびにEPCの増殖および/またはEPCからの内皮細胞生成の誘導に用いられる1つまたは複数のさらなる構成要素を備える。このようなシステムおよびキットは治療目的および/または研究目的のものでもよい。
対象システムおよびキットはまた、対象方法に従ってEPCを調製または使用するための1種類または複数種の他の試薬も備えてもよい。前記試薬は、1種類または複数種のマトリックスもしくはスキャフォールド(またはマトリックス/スキャフォールドを作製するための試薬)、水和剤(例えば、生理学的に適合する食塩水、調製済み細胞培養培地)、細胞培養支持体(例えば、培養ディッシュ、プレート、バイアルなど)、細胞培養培地(液体の形でも粉末の形でもよい)、抗生物質化合物、ホルモン、添加物などを含んでもよい。従って、前記キットは1つまたは複数の容器、例えば、バイアルまたは瓶を備えてもよく、容器ごとに、本発明による処理工程または調製工程を行うための別々の構成要素が入っている。
ある特定の態様において、前記キットは、例えば、細胞集団を必要とする実験動物または患者、例えば、EPCに基づく療法を必要とする患者への細胞集団の送達を容易にするように設計された構成要素をさらに備えてもよい。これらの後者の態様では、前記キットの構成要素は治療用途に適した形で提供されてもよい(例えば、無菌/医療グレードの構成要素として提供されてもよい)。送達構成要素は、細胞集団をカプセル化または固定化するように設計された送達構成要素(例えば、スキャフォールドまたはマトリックス)、ならびに直接、または他の構成要素(例えば、スキャフォールドまたはマトリックス)と関連して細胞を送達するように設計された送達構成要素を含んでもよく、単離された細胞を欠損部位に注射する工程、胚前駆細胞を適切なスキャフォールドまたはマトリックスと共にインキュベートおよび/または培養する工程、ならびに移植し、生体吸収性スキャフォールドとインキュベートする工程などを含む。前記で詳述したように、任意の便利なスキャフォールドまたはマトリックス、例えば、生体吸収性生体適合性スキャフォールドを使用することができる。この場合、かなりの数が治療的内皮修復、交換、または腫瘍標的化のために用いられたか、または治療的内皮修復、交換、または腫瘍標的化において使用するために試験されている。
一部の態様において、前記キットは、送達/移植された細胞集団が対象、例えば、患者の少なくとも1つの望ましい部位にあることを確認する際に使用するための構成要素を備える。このような構成要素を用いると、対象に送達された細胞の局在を確認し、さらには定量することも可能になる場合がある。
ある特定の態様において、キットの中のEPCは遺伝子組換えされる。例えば、前記で議論したように、EPCは、異種遺伝子、例えば、治療アウトカムを付与する遺伝子またはEPCに由来する細胞を後で特定するのに使用することができるマーカー遺伝子(例えば、当技術分野において周知のようなレポーター遺伝)を発現するように操作されてもよい。レポーター遺伝子には、直接的または間接的に検出可能な遺伝子、例えば、蛍光タンパク質、ルミネセンスタンパク質、酵素、細胞表面マーカーなどの遺伝子が含まれる。ある特定の態様において、互いに識別できる外因性レポーター遺伝子、例えば、異なる励起特徴および/または発光特徴を有する蛍光タンパク質を発現するように様々な細胞株が再操作される。
ある特定の態様において、前記キットは、キットの目的の用途に必要な任意のまたは全ての構成要素を備えてもよい。例えば、本発明によるキットは、多数の他の適切な物品または構成要素、例えば、チューブ、縫合糸、メス、針、注射器、手術部位を用意するための防腐剤などを備えてもよい。
さらなるタイプのキットも本発明の局面において提供される。
例えば、本発明によるEPCを特定および/または単離するためのキットが提供される。このようなキットは、本明細書に記載の任意の遺伝子発現マーカーを含む細胞マーカーの発現を検出するように設計された試薬を備える。このような検出試薬は、これらの遺伝子の発現産物をタンパク質または核酸(例えば、mRNA)レベルで検出するように設計されてもよい。従って、試薬には、抗体またはその特異的結合部分(例えば、検出可能に標識された抗体)、他の特異的タンパク質結合物質(例えば、リガンドまたは可溶性受容体)、ハイブリダイゼーション分析、例えば、ノザンブロット分析、マイクロアレイ分析などにおいて使用するための核酸プローブ;PCRアッセイ、例えば、定量PCRアッセイにおいて使用するためのプライマー対などが含まれ得る。
対象キットは、典型的には、対象方法を実施するためのキットの構成要素を使用するための説明書をさらに備える。対象方法を実施するための説明書は、一般的に、適切な記録媒体に記録される。例えば、説明書は紙またはプラスチックなどの支持体に印刷されてもよい。従って、説明書は、キットの添付文書として、キットまたはその構成要素の容器のラベル表示などに(すなわち、パッケージまたはサブパッケージと関連して)存在してもよい。他の態様において、説明書は、適切なコンピュータ可読記憶媒体、例えば、CD-ROM、ディスケットなどに存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の態様では、実物の説明書がキットに存在せず、離れた情報源から説明書を、例えば、インターネットを介して入手するための手段が提供される。この態様の一例は、説明書を見ることができる、および/または説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを備えたキットである。説明書と同様に、説明書を入手するためのこの手段は適切な支持体に記録される。
前述の構成要素に加えて、前記キットはまた、1つまたは複数の対照試料および試薬、例えば、2つ以上の対照試料も備えてもよい。このような対照試料は任意の形、例えば、既知のマーカープロファイルを有するさらなる細胞株、遺伝子発現データの分析において使用するための負の対照試料および正の対照試料などをとってもよい。対象キットでは任意の便利な対照試料を使用することができる。
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによってさらに説明される。
実施例
実施例1
胎盤消化およびソーティング戦略
ヒト満期胎盤を、待機的帝王切開を受けている健常な妊娠中の母親から、本発明者らの承認された倫理プロトコールにより必要とされるインフォームドコンセントを得て入手した。採取時に、脱落膜組織膜および臍帯を解剖し、分葉を確保しておいた。次いで、分葉をハンクス緩衝塩溶液(HBSS)で洗浄した後に、1mg/mLコラゲナーゼI、1mg/mL DNアーゼ-1、および75μg/mLディスパーゼ溶液に入れて37℃で2時間、消化した。消化したら、単細胞懸濁液を100μmふるいに通して濾過し、750xgで5分間、回転させた。上清を捨て、その後に、細胞ペレットを赤血球溶解緩衝液に再懸濁し、室温で10分間インキュベートした。次いで、懸濁液を510xgで5分間、回転させた。次いで、上清を捨て、細胞ペレットをHBSSで洗浄し、510xgで5分、再回転させた。細胞を氷冷MACS緩衝液(2mM EDTA、0.5％BSAを含有するリン酸緩衝液(PBS))に再懸濁し、次いで、CD45標識細胞を枯渇させるために、磁気ビーズ(DYNABEADS)で標識したCD45抗体と4℃で15分間インキュベートした後に、DYNAMAGNETホルダに入れた。次いで、残っている細胞を510xgで5分間、回転させた後に、MACS緩衝液1mLに再懸濁した。次いで、CD34 MACSビーズを添加し、4℃で15分間インキュベートした。細胞をMACS緩衝液で洗浄し、510xgで5分間、回転させた後に、細胞ペレットをMACS緩衝液3mLに再懸濁し、標識CD34+細胞を採取するために磁気カラムに通した。次いで、細胞をCD34抗体、CD31抗体、およびCD45抗体で染色し、4℃で20分間インキュベートした(図1)。
実施例2
フローソーティング戦略
混入CD45+細胞を全て除去するために、フローサイトメトリーによってCD34+細胞だけをゲーティングした。次いで、CD34+ゲーティング細胞のCD31発現レベルを、アイソタイプが一致する対照と比較して分析した(図2)。1回の例示的な実験における、それぞれのCD45-CD34+亜集団を対象にしたCD31染色の平均蛍光強度を表2に示した。
Figure 2016513962
注目すべきことに、HUVEC対照細胞株(CD31hiであることを特徴とする)について観察された平均蛍光強度は約873である。これはCD31hiCD45-CD34+細胞について観察されたものと一致している。従って、CD31hi細胞の平均蛍光強度はCD31lo/-細胞より約22倍高い。
次いで、CD34+CD31lo/-細胞を直接ソーティングして100％胎仔ウシ血清(FBS)に入れ、氷上に直接置いた。次いで、細胞を回転させ、EGM-2(10％FBS)に再懸濁し、プレコーティング済コラーゲン細胞培養プレートにプレートした。
実施例3
コロニー形成能
本発明者らは、本発明者らの特許請求の範囲に記載された方法を用いて、臍帯血と比較してかなり多くの、高い増殖能を有するECFC(HPP-ECFC)を分離することができる(図3)。10日間インビトロ培養した後にコロニーを計数する。
よく説明されているECFCアッセイを用いて、細胞をEGM-2(10％FBS)中で14日間にわたって維持し、2日ごとに培地を交換した。10日目に、HPP-ECFCを計数し、臍帯血から得られたHPP-ECFCコロニーと比較した。コロニーに50個を超える細胞を含むコロニーをHPP-ECFCとみなした。
実施例4
胎児幹細胞
増殖したコロニーは、男の子を妊娠している女性におけるX染色体およびY染色体インサイチューハイブリダイゼーションにより証明されたように100％胎児である(図4)。
細胞をカルノア固定液(75％メタノール、25％酢酸)を用いて固定した後に、SuperfrostPlusスライドの上に細胞懸濁液を一滴落とし、乾燥させた。次いで、スライドを一晩、37℃にして、細胞を「プレエージング(pre-age)」した。次いで、これらの細胞のX染色体およびY染色体に対する蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)分析を製造業者のプロトコール(Abbott Molecular, Illinois, USA)に従って行った。Zeiss Axio顕微鏡を用いてスライドを分析した。
実施例5
特徴付け
結果として生じた、培養状態のコロニーは全て内皮細胞の特徴を受け入れた。すなわち、免疫蛍光染色によって証明されたようにCD34、CD144、CD105、CD31、VEGFR2、CD146を発現するが、造血マーカーCD45も間葉系幹細胞マーカーCD73も発現しない(図5)。
コロニーを、以前に述べられたようにチャンバースライドを用いて増殖させた。次いで、細胞を氷冷アセトンで10分間、固定し、PBSを用いて3回洗浄した。PBS/0.1％Tween/3％BSAで1:250に希釈した正常ヤギ血清をブロッキング剤として使用し、細胞上で室温で20分間インキュベートした。以下の一次抗体:ウサギ-抗ヒトCD34、マウス-抗ヒトCD144、マウス-抗ヒトCD105、マウス-抗ヒトCD31、マウス-抗ヒトVEGF-R2、マウス-抗ヒトCD146、マウス-抗ヒトCD45、およびマウス-抗ヒトCD73を1:250の希釈度で使用した。以下の二次抗体:Alexa488-ヤギ-抗ウサギ、Alexa488-ヤギ-抗マウス、Alexa568-ヤギ-抗ウサギ、およびAlexa568-ヤギ-抗マウスを1:1000の希釈度で使用した。DAPIを含むProlong Gold抗退色(anti-fade)試薬を封入剤として使用し、全スライドをZeiss Axio顕微鏡を用いて分析した。
実施例6
機能の特徴付け
結果として生じたコロニーも、アセチル化低密度リポタンパク質(Ac-LDL)の取り込みによって観察されたように内皮機能特徴に一致し(図6A)、マトリゲルにプレートされたときにインビトロで管を形成する(図6B)。
(A)アセチル化LDLの取り込みを確かめるために、前記のように細胞を培養した後に、血清を12時間欠乏させた。次いで、細胞を、DiIで予め標識したAc-LDL(DiI-Ac-LDL)(10μg/mL)を含む無血清培養培地と37℃で4時間インキュベートした。次いで、細胞をPBSで2回洗浄した。DAPIを含むProlong Gold抗退色試薬を封入剤として使用し、全スライドをZeiss Axio顕微鏡を用いて分析した。
(B)96ウェル細胞培養プレートを氷上でマトリゲルでプレコーティングした後に、37℃インキュベーターに30分間入れた。次いで、1ウェルにつき2x104個の細胞をプレートし、18時間培養した。Olympus-CKX41組織培養光学顕微鏡を用いて画像を得た。
実施例7
生着
培養細胞はマウスに注射されるとインビボ(マトリゲルプラグアッセイ)で生着することができ、新規血管を形成することができる。
具体的には、α6-インテグリン(CD49f)ならびにヒト特異的核マーカーラミン A/Cによる標識によって特徴的な高増殖性ECFCコロニーが観察された(図7AおよびBを参照されたい)。
材料および方法
ヒトECFCのマトリゲルプラグアッセイおよび生着
1x106個の細胞とマトリゲル(BD Biosciences)からなる懸濁液を調製し、nu/nuマウスの両側腹部に皮下注射することによってプラグを作製した。マトリゲルプラグを7日間維持した後に、収集した。プラグを4％パラホルムアルデヒドで2時間固定した後に、PBSで3回洗浄した。次いで、プラグをOCTコンパウンドに包埋し、凍結した後に切片化した。切片化したら、スライドを1:250の希釈度の一次抗体ウサギ-抗ヒトラミン A/Cで染色した。二次抗体Alexa-488-ヤギ-抗ウサギを1:1000の希釈度で使用した。DAPIを含むProlong Gold抗退色試薬を封入剤として使用し、全スライドをZeiss Axio顕微鏡を用いて分析した。
実施例8
EPCの存在について試験した様々な画分のうち2つがEGM2内皮特異的培養培地中でも、かなりの数の線維芽細胞状細胞を増やした。これらの線維芽細胞コロニーは、出現している、いかなる内皮コロニーよりも急速に大きくなった。これらの線維芽細胞を発見することができた2つの画分はCD34-CD45-画分およびCD45-CD34+CD31-画分であった(図8を参照されたい)。これらの細胞は、DMEM培地またはEGM2培地が入っている、コラーゲンのないプラスチック上で単層で急速に増殖することができた。これらの細胞は、胎児供給源または成体供給源から得られた間葉系幹細胞(MSC)の特徴的な細胞表面分子を発現した(図9)。さらに、これらの細胞は骨芽細胞への間葉系分化能を示したが、主に脂肪細胞への間葉系分化能を示した(図10)。重要な発見は、これらの細胞の起源が特徴付けられたことであった。男の子だけを身ごもっている母親の胎盤から、これらの細胞を単離した。従って、X染色体およびY染色体FISHを用いて、細胞の起源が胎児(男性)または母体(女性)かどうかを分析することができた。CD34-CD45-画分は母体MSCで構成された。しかしながら、CD45-CD34+CD31-画分は胎児であった(図11)。以前の研究から、以前の研究から、継代すると、わずかな母体MSC混入が胎児MSCより完全に大きくなることが分かっている。従って、細胞の胎児起源を試験し、複数の継代にわたって確認した(図11)。注目すべきことに、一般に認められている基準に準じるMSCはCD34-であると広く言われている。しかしながら、本発明のデータから、CD34の存在は胎児MSCを母体MSCと区別することが証明された。最後に、継代しても胎児MSCの集団倍加時間は変わらないことも証明された。このことから、この集団は自己複製能があることがはっきりと分かった(図12)。全体的に見て、これらの結果から、満期胎盤には、本発明の方法を用いて単離することができる2つのMSC集団が共存することが証明された。
実施例9
胎盤由来ECFCと臍帯血由来ECFCとの比較
前記のように、UCB-ECFCの制約は、将来の臨床用途のために入手することができる、従って、増殖することができるコロニーの数であった。インビトロ培養アッセイを用いることによって、50gの胎盤絨毛組織から、100,000個のCD34+CD31lo/-細胞あたり123±15個のHPPコロニーを入手できることが見出された。これは、20mLのUCBに由来する全ての単核細胞をプレートすることによって得られるものよりかなり多い。20mLのUCBに由来する全単核細胞をプレートすることによって15±4個のHPPコロニーしか入手できなかった。従って、1人のドナーにつき、1個の胎盤全体(平均重量、500〜600g)につき1,230個のHPPコロニーを得ることができると見積もられた。全臍帯血(総体積の平均=約60mL;図13A)につき45個のHPPコロニーしか得られない可能性が高い。
PL-ECFCには、UCB-ECFCに記載のものと同じインビトロヒエラルキーがあった。実際に、HPPコロニーはHPPコロニーおよび多数のさらに小さなコロニーを生じた。本発明者らは、継代2で胎盤およびUCBの両方から、HPPコロニー1個あたり平均70〜90個の細胞がある15個のHPP ECFCコロニーを再プレートし、胎盤およびUCBそれぞれについて11±2個および13±3個の新たなHPPコロニーを計数した。これによって、両ECFC集団の自己複製能がほぼ同じであることが証明された(図13C)。同様に、胎盤またはUCBからHPPコロニーを継代したときに、低増殖性の内皮細胞コロニーの数に有意差は認められなかった。注目すべきことに、どちらのECFC供給源についても小さなコロニーを継代しても新しいコロニーは得られなかった。
その後の継代(継代2〜10)にわたる細胞収集および集団倍加時間もUCB-ECFCとPL-ECFCとの間で等しかった(約55時間の倍加時間)(図13D)。循環前駆細胞であるUCB-ECFCとは対照的に、PL-ECFCは血管にある前駆細胞だと仮定されたが、本発明者らは、両細胞タイプの細胞表面インテグリンプロファイルの差違をほとんど観察しなかったか、または全く観察しなかった(図13E)。さらに、本発明者らは、胎盤間葉系幹細胞とは対照的にPL-ECFCでもUCB-ECFCでも免疫抑制能を観察しなかった(図13F)。
分子表現型を比較するために、ドナーと一致するPL-ECFCおよびUCB-ECFC(n=4生物学的反復実験)から単離したRNAに対して、Illuminaマイクロアレイ発現プロファイリングを行った。ヒエラルキークラスター分析から起源によって試料を分類することができた。0.05のカットオフp値を用いると、40,000個を超える遺伝子のうち、差次的に発現した遺伝子は33個しかなかった(図14および表1を参照されたい)。
ゲノムプロファイリングにおいて観察された最低限の差違から、これらの2つのECFC集団が比較によりどういったものかがさらに証明された。これらの33個の遺伝子のうち2倍の差があったものは23個しかなかった。その中には、MFGE8(アポトーシス内皮細胞によって放出される)、SMAD6(FoxC2とも呼ばれる; 血管発達に重要)などの血管生物学において重要な遺伝子もある。PL-ECFCと比較してUCB-ECFCでは、内皮細胞におけるIGF-Iシグナル伝達を促進し、血管形成中の内皮細胞動員を増強することが知られている因子であるIGFBP2が強力にアップレギュレートされた。
関心対象の他の遺伝子には、細胞外マトリックス成分(SERPINH1、フィブロネクチン、およびエラスチン)が含まれた。p<0.2で差次的に発現した191個の遺伝子の遺伝子オントロジー経路分析から細胞接着および移動に関連する差違が証明された。
材料および方法
インビトロ培養アッセイ
最初に、組織培養プレート/フラスコ(Nunc, Oskilde, Denmark)の全てにラットテールコラーゲン1型溶液(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)でプレコーティングし、組織培養フード内で6時間、乾燥させた後に、滅菌PBSで3回洗浄した。次いで、細胞を、10％胎仔ウシ血清を添加したEGM-2(Lonza, Mount Waverley, VIC, Australia)と培養した。培地を14日間にわたって2日ごとに交換した。培養14日目に、コロニー数およびコロニー内の細胞数を計数した。50個を超える、敷石様所見(cobblestone appearance)の細胞を含むコロニーをHPPコロニーとみなした。
PL-ECFC集団およびUCB-ECFC集団のマイクロアレイ分析
全RNAをRNASY Mini Kit(Qiagen, Valencia, CA)を用いて胎盤およびUCB-ECFC(n=4; 継代3)から抽出した。Nanodrop 1000を用いてRNA収率を求め、Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Mulgrave, Victoria, Australia)を用いて量と質を検証した。全RNA(500ng)を、TotalPrep RNA Amplification Kit (Illumina Inc., San Diego, CA)を用いてビオチン化cRNAに変換し、HumanHT-12 v4 BeadChip(Illumina)にハイブリダイズさせた。ハイブリダイズされたBeadChipを洗浄し、Illumina BeadStationシステムを用いてスキャンした。マイクロアレイ分析をGeneSpring(Agilent Technologies)ソフトウェアを用いて行った。
実施例10
後肢虚血損傷
PL-ECFCの機能的能力をマウス後肢虚血(HLI)モデルにおいて評価した。動脈結紮後に、PL-ECFC、UCB-ECFC、または食塩水を注射し、その後に灌流をドップラ分析によって測定した。
0日目および2日目、細胞送達前に群間で灌流に差違は無かった。しかしながら、7日目までに、対応する食塩水注射マウスと比較して、PL-ECFC注射動物およびUCB-ECFC注射動物においてそれぞれ1.85倍および2.1倍の灌流増加が観察された(PL-ECFC対食塩水、p<0.02;UCB-ECFC対食塩水、p<0.007)。この灌流改善は14日目(PL-ECFC対食塩水では1.75倍増加、p<0.02;UCB-ECFC対食塩水では1.9倍増加、p<0.009)および21日目(PL-ECFC対食塩水で1.5倍増加、p<0.05;UCB-ECFC対食塩水で1.4倍増加、p<0.03)でも観察された。14日目に、食塩水群では4匹のマウスで、他の2つの群では0匹のマウスで完全な灌流消失が観察された(図15を参照されたい)。
注射された細胞を追跡するために、ヒト特異的ラミンA/C染色を行った。ラミンA/Cは、全てのヒト有核細胞に遍在して観察される核膜タンパク質である。予想通り、食塩水注射マウスではヒトラミンA/C陽性細胞は観察されなかった。しかしながら、PL-ECFC注射マウスおよびUCB-ECFC注射動物の両方に、ほぼ同じレベルでヒト細胞を観察することができた。抗マウスCD31による共染色から、ヒト特異的ラミンA/C陽性細胞は生着し、マウス血管に組み込まれてキメラを形成したが、これは優勢な表現型ではないことが確かめられた(図5を参照されたい)。
アテローム硬化モデルにおける後肢虚血
重症下肢虚血患者には、概して、脈管構造を通るアテローム硬化変化がある。上部大腿動脈における狭窄点は臨床重症下肢虚血の重大な特徴であるが、健常な動物に大腿動脈を結紮してもクリニカルシナリオを反映しているとは限らない。従って、ECFCが、重篤なアテローム硬化血管を有する虚血下肢において同じ効力を有するかどうか、宿主脈管構造がECFCからのパラクラインシグナルに応答して新生血管を生じることができるかどうかを認めることは難しい。ApoE-/-マウスモデルは、9〜12ヶ月齢までに動脈の多くにおいてアテローム硬化変化を自発的に発症することが知られている(Moghadasian et al, 2001を参照されたい)。本実施例では、この背景に後肢虚血が用いられる。
材料および方法
後肢虚血再灌流アッセイ
以前に述べられたマウス後肢虚血モデルに基づく改良プロトコールを使用した(Niiyama H., Huang N.F., Rollins, M.D., et al, Murine model of hindlimb ischemia, J. Vis. Exp., 2009; 23:1035)。
具体的には、8〜10週間齢、体重17=22gのヌード(nu/nu)マウスを100mg/kgケタミンおよび10mg/kgキシラジンで麻酔した。右大腿動脈の近位部分および遠位部分を結紮し、その後に動脈を単離および切除した。結紮して2日後に、5x105個のPL-ECFCもしくはUCB-ECFCまたは食塩水のみを筋肉内注射した。後肢血液灌流を、レーザードップラ灌流イメージャー(LDPI)システム(Moor Instruments Ltd., Devon, U.K.)を用いて測定した。これは、室温(25℃)で、外科手術の直前および直後、外科手術の2日後、およびその後、毎週行った。環境および個体間のばらつきからの交絡作用を排除するために、結果を右(虚血)肢対左(非虚血)肢の灌流比として表した。
後肢虚血(HLI)モデルにおいて、治療的血管新生に及ぼすECFC投与の影響を調べた。大腿動脈切除して2日後に、安定した虚血がLDPIによって確認された。対照群(n=16)には食塩水を、処置群にはPL-ECFC(n=8)またはUCB-ECFC(n=10)を全く同じように注射した。近位結紮部位付近に20μlの大量瞬時投与を4分割量で筋肉内送達した。
ApoE-/-マウスには血管形成能が元々無いので、本発明者らは、ECFC療法がこの背景に大きな影響を及ぼすと予想する。
後肢虚血Apo -/- マウス
Apo-/-マウスおよびC57B1/6対照からなる3つの群を使用する。9ヶ月齢の動物の大腿動脈を結紮する。動物に、ECFCのみ、ECFCおよびシクロスポリン(最初の3週間に限定)、またはビヒクルを注射する。42日間にわたってバイオルミネセンス画像法(BLI)、レーザードプラ画像法を用いて下肢灌流の評価を行い、生着、最後に宿主およびドナーに由来する血管形成の評価を行う。
実施例11
血管プロテーゼ
プロテーゼは、主要動脈への血管インターベンションにおいてますます大きな役割を果たしている。血管外科手術は、冠状動脈拡張、頚動脈内膜切除、腎動脈、大腿動脈バイパス、または大動脈瘤手術などの様々な血管インターベンションにおいて開発され、適用されたプロテーゼに頼ることが多い。合成血管プロテーゼに宿主内皮細胞が再定着している間の重大な合併症は血栓症および再狭窄である。本発明者らは、本発明の技術は、血管プロテーゼおよびステントをインビトロで予め内皮化する際に有効であると疑いもなく考えている。
本発明者らは、報告された60％の新生内膜厚減少および65％の内皮化増加を観察するためには、一群あたり6匹の動物で十分な力があるはずだと考える。
材料および方法
血管プロテーゼの調製
血管プロテーゼに現在、最も一般的に用いられている材料であるDacronおよびポリテトラフルオロエチレン(PTFE)グラフト(ATRIUM(登録商標))は、ECFC培養に適するようにコラーゲンI型を用いて入手およびコーティングされている。最初に、コーティング済材料の1cm2表面に、標準的な培養条件に従って、2回継代したGFP-タグ化ECFCをEGM2培地に播種する。播種密度は、104細胞/cm2、105細胞/cm2、または106細胞/cm2で異なる。最も良い条件を選択するために、ライブイメージング顕微鏡(IncuCyte)を用いて、各播種密度の各タイプの材料における集団倍加時間およびコンフルエンシーを調べ、比較する。これらの実験は、6匹の異なるドナーに由来するECFCを用いて行う。
6匹のヒツジからなる2つの群において、EGM2中に同じ時間保った、ECFCでコーティングした血管グラフトまたはコーティングしていないグラフトのいずれかを用いて大腿脛骨バイパス手術を行う。動物には、毎日、100Ui/kgのヘパリンと10mg/kgのシクロスポリンを与える。4週間後に、動物を屠殺し、組織学的分析のためにグラフトおよびすぐ隣にある動脈を採取する。開存性 (ふさがっていない管腔の％)、横断面での内膜直径、正面ホールマウント(en face whole mount)におけるCD31+細胞およびヒトGFP+細胞による被覆パーセントを測定し、両群間で比較する。
または、6匹のヒツジからなる2つの群において、ヒト抗CD34抗体でコーティングした大腿ステントを経皮的に配置する。同じカテーテル留置経路を介して、一方の群には約1000万個のCD34濃縮ECFCをすぐに与え、もう一方にはビヒクルだけを与え、ステントの近位で循環を2分間妨げる。前記のように動物の内皮化および再狭窄を評価する。
当業者は、本明細書に記載の発明が、具体的に説明されたもの以外の変更および修正の余地があることを認める。本発明はこのような変更および修正を全て含むと理解しなければならない。本発明はまた、本明細書において個々にまたは一括して言及された、または示された工程、特徴、組成物、および化合物の全て、ならびに前記工程または特徴のいずれか2つ以上の任意のおよび全ての組み合わせを含む。
文献目録
Figure 2016513962
Figure 2016513962

Claims (51)

  1. 哺乳動物内皮前駆細胞を単離する方法であって、以下の工程を含む方法:
    (i)哺乳動物細胞集団を単離する工程;
    (ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;
    (iii)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程;および
    (iv)CD31lo/-表現型プロファイルを発現する、工程(iii)に由来するCD34+細胞の亜集団を単離し、それによって内皮前駆細胞を単離する工程。
  2. 哺乳動物内皮前駆細胞を単離する方法であって、以下の連続工程を含む方法:
    (i)哺乳動物細胞集団を単離する工程;
    (ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;
    (iii)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程;および
    (iv)CD31lo/-表現型プロファイルを発現する、工程(iii)に由来するCD34+細胞の亜集団を単離し、それによって内皮前駆細胞を単離する工程。
  3. 哺乳動物間葉系幹細胞を単離する方法であって、以下の工程を含む方法:
    (i)哺乳動物細胞集団を単離する工程;
    (ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;ならびに
    (a)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程、およびCD31-表現型プロファイルを発現する、該CD34+細胞の亜集団を単離する工程、ならびに/または
    (b)CD34-表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を単離し、それによって間葉系幹細胞を単離する工程。
  4. 哺乳動物間葉系幹細胞を単離する方法であって、以下の連続工程を含む方法:
    (i)哺乳動物細胞集団を単離する工程;
    (ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;ならびに
    (a)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程、およびCD31-表現型プロファイルを発現する、該CD34+細胞の亜集団を単離する工程;ならびに/または
    (b)CD34-表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を単離し、それによって間葉系幹細胞を単離する工程。
  5. 哺乳動物内皮前駆細胞を単離する方法であって:
    (i)哺乳動物細胞集団を単離する工程;
    (ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;
    (iii)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程;および
    (iv)CD31lo/-表現型プロファイルを発現する、工程(iii)に由来するCD34+細胞の亜集団を単離し、それによって内皮前駆細胞を単離する工程
    を含み、該内皮前駆細胞が血管内皮細胞に分化することができる、方法。
  6. 単能性(monopotent)哺乳動物内皮前駆細胞または複能性(multipotent)哺乳動物内皮前駆細胞を単離する方法であって、以下の工程を含む方法:
    (i)哺乳動物細胞集団を単離する工程;
    (ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;
    (iii)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程;および
    (iv)CD31lo/-表現型プロファイルを発現する、工程(iii)に由来するCD34+細胞の亜集団を単離し、それによって単能性内皮前駆細胞または複能性内皮前駆細胞を単離する工程。
  7. 哺乳動物内皮前駆細胞を単離する方法であって、以下の工程を含む方法:
    (i)哺乳動物胎盤由来細胞集団を単離する工程;
    (ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;
    (iii)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程;および
    (iv)CD31lo/-表現型プロファイルを発現する、工程(iii)に由来するCD34+細胞の亜集団を単離し、それによって内皮前駆細胞を単離する工程。
  8. 哺乳動物間葉系幹細胞を単離する方法であって、以下の工程を含む方法:
    (i)哺乳動物胎盤由来細胞集団を単離する工程;
    (ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;ならびに
    (a)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程、およびCD31-表現型プロファイルを発現する、該CD34+細胞の亜集団を単離する工程;ならびに/または
    (b)CD34-表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を単離し、それによって間葉系幹細胞を単離する工程。
  9. 哺乳動物内皮前駆細胞を単離する方法であって、以下の工程を含む方法:
    (i)哺乳動物胎盤分葉細胞物質を単離する工程;
    (ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;
    (iii)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程;および
    (iv)CD31lo/-表現型プロファイルを発現する、工程(iii)に由来するCD34+細胞の亜集団を単離し、それによって内皮前駆細胞を単離する工程。
  10. 哺乳動物間葉系幹細胞を単離する方法であって、以下の工程を含む方法:
    (i)哺乳動物胎盤分葉細胞物質を単離する工程;
    (ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を濃縮する工程;ならびに
    (a)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を濃縮する工程、およびCD31-表現型プロファイルを発現する、該CD34+細胞の亜集団を単離する工程;ならびに/または
    (b)CD34-表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を単離し、それによって間葉系幹細胞を単離する工程。
  11. 哺乳動物内皮前駆細胞を単離する方法であって、以下の連続工程を含む方法:
    (i)哺乳動物細胞集団を単離する工程;
    (ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を負の選択によって濃縮する工程;
    (iii)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を正の選択によって濃縮する工程;および
    (iv)CD31lo/-表現型プロファイルを発現する、工程(iii)に由来するCD34+細胞の亜集団を正の選択によって単離し、それによって内皮前駆細胞を単離する工程。
  12. 哺乳動物間葉系幹細胞を単離する方法であって、以下の工程を含む方法:
    (i)哺乳動物細胞集団を単離する工程;
    (ii)CD45-表現型プロファイルを発現する、工程(i)の細胞の亜集団を負の選択によって濃縮する工程;ならびに
    (a)CD34+表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を正の選択によって濃縮する工程、およびCD31-表現型プロファイルを発現する、該CD34+の亜集団を正の選択によって単離する工程、ならびに/または
    (b)CD34-表現型プロファイルを発現する、工程(ii)に由来するCD45-細胞の亜集団を単離し、それによって間葉系幹細胞を単離する工程。
  13. CD31-集団が胎児CD31-集団であり、かつ間葉系幹細胞が胎児間葉系幹細胞である、請求項3、4、8、10、または12のいずれか一項記載の方法。
  14. CD45-/CD34-間葉系幹細胞が母体(maternal)幹細胞である、請求項3、4、8、10、または12のいずれか一項記載の方法。
  15. 哺乳動物における状態を治療的および/または予防的に処置する方法であって、有効な数の内皮前駆細胞または部分的もしくは完全に分化したEPC由来細胞を該哺乳動物に投与する工程であって、該内皮前駆細胞が請求項1、2、5〜7、9、および11のいずれか一項記載の方法に従って単離されている工程を含む、方法。
  16. 哺乳動物MSC由来細胞の作製を容易にする方法であって、請求項3、4、8、10、または12のいずれか一項記載の方法に従って単離された間葉系幹細胞を刺激物質と接触させて、該間葉系幹細胞の分化を間葉系表現型に向ける工程を含む、方法。
  17. 哺乳動物における状態を処置するための医用薬剤の製造における内皮前駆細胞またはEPC由来細胞の集団の使用であって、該細胞が請求項1、2、5〜7、9、および11のいずれか一項記載の方法に従って単離されている、使用。
  18. 哺乳動物における状態を治療的および/または予防的に処置する方法であって、有効な数の間葉系幹細胞または部分的もしくは完全に分化したMSC由来細胞を該哺乳動物に投与する工程であって、該間葉系幹細胞が請求項3、4、8、10、または12のいずれか一項記載の方法に従って単離されている工程を含む、方法。
  19. 内皮前駆細胞またはEPC由来細胞の単離された集団であって、該内皮前駆細胞が、請求項1、2、5〜7、9および11のいずれか一項記載の方法に従って単離されている、単離された集団。
  20. 哺乳動物における状態を処置するための医用薬剤の製造における間葉系幹細胞またはMSC由来細胞の集団の使用であって、該細胞が本発明の方法に従って単離されている、使用。
  21. 間葉系幹細胞またはMSC由来細胞の単離された集団であって、該間葉系幹細胞が、請求項3、4、8、10、または12のいずれか一項記載の方法に従って単離されている、単離された集団。
  22. 間葉系幹細胞またはMSC由来細胞の表現型状態または機能状態に及ぼす処理方式もしくは培養方式の影響を評価する方法であって、該間葉系幹細胞またはMSC由来細胞を該処理方式に供する工程であって、該間葉系幹細胞が請求項3、4、8、10、または12のいずれか一項記載の方法に従って単離されている工程、および機能状態または表現型状態の変化についてスクリーニングする工程を含む、方法。
  23. MFGE8、MATN2、ELN、IGFBP2、SERPINH1、P4HA3、FN1、PKNOX2、FOXC1、NFIX、SMAD6、PRRX2、LRRC17、CTSK、PLA2G4A、DIRAS3、PDLIM3、ABCA8、CFB、PTK7、PTGFRN、SETBP1、LOC652900、SLC22A17、TANC2、SEZ6L2、ARRDC4、PODXL、MEOX2、MMP4、FAM107A、LOC647543、およびSCAMP5からなる群より選択される少なくとも1つのマーカー遺伝子を、臍帯血(UCB)に由来する内皮前駆細胞中の対応するマーカー遺伝子の発現レベルと少なくとも10％異なるレベルで発現する、単離された内皮前駆細胞。
  24. MFGE8、MATN2、ELN、IGFBP2、SERPINH1、P4HA3、FN1、PKNOX2、FOXC1、NFIX、SMAD6、PRRX2、LRRC17、CTSK、PLA2G4A、DIRAS3、PDLIM3、ABCA8、CFB、PTK7、PTGFRN、SETBP1、LOC652900、SLC22A17、TANC2、SEZ6L2、およびARRDC4からなる群より選択される少なくとも1つのマーカー遺伝子を、臍帯血(UCB)に由来する内皮前駆細胞中の対応するマーカー遺伝子の発現レベルより少なくとも10％高いレベルで発現する、単離された内皮前駆細胞。
  25. PODXL、MEOX2、MMP4、FAM107A、LOC647543、およびSCAMP5からなる群より選択される少なくとも1つのマーカー遺伝子を、臍帯血(UCB)に由来する内皮前駆細胞中の対応するマーカー遺伝子の発現レベルの90％未満のレベルで発現する、単離された内皮前駆細胞。
  26. 胎盤に由来する、請求項23〜25のいずれか一項記載の単離された内皮前駆細胞。
  27. CD31lo表現型プロファイルを発現する、請求項23〜26のいずれか一項記載の単離された内皮前駆細胞。
  28. CD45-表現型プロファイルおよびCD34+表現型プロファイルからなる群より選択される少なくとも1つの表現型プロファイルを発現する、請求項23〜27のいずれか一項記載の単離された内皮前駆細胞。
  29. CD105+表現型プロファイル、CD144+表現型プロファイル、CD146+表現型プロファイル、VEGFR2+表現型プロファイル、HLA-ABC+表現型プロファイル、CD73-表現型プロファイル、およびHLA-DR-表現型プロファイルからなる群より選択される少なくとも1つの表現型プロファイルをさらに発現する、請求項23〜28のいずれか一項記載の単離された内皮前駆細胞。
  30. 請求項23〜29のいずれか一項記載の内皮前駆細胞について濃縮された、単離された細胞集団。
  31. 請求項23〜29のいずれか一項記載の内皮前駆細胞または請求項30記載の細胞集団を含む、生体適合性移植片。
  32. 細胞支持基材または医療装置より選択される、請求項31記載の移植片。
  33. 細胞支持基材がポリマーマトリックス(例えば、ゲル、スポンジ、またはメッシュ)である、請求項32記載の移植片。
  34. 医療装置が、血管プロテーゼ、血管グラフト、補綴臓器を血管循環につなぐための取付け具、血管ステントおよび非血管ステント(例えば、胃腸ステント、肺ステント、または胆管ステント)を含むステント、カバー付きステント、人工心臓弁、人工心臓、心臓プロテーゼ(例えば、人工心臓弁)、生物心臓代用弁(例えば、ブタなどの動物に由来する-生体適合性を高め、血栓が少なくなるように異種移植片をEPCでコーティングすることができる)、静脈弁、腹部大動脈瘤グラフト、血管フィルター(例えば、大静脈フィルター)、ガイドワイヤ、バルーン、肺塞栓症を防ぐ装置(例えば、塞栓コイル、血管塞栓術用の塞栓材料など)、整形外科用移植片(例えば、骨プロテーゼまたは関節プロテーゼ)、血管縫合糸、スキャフォールド、平滑な移植片または多孔性の移植片、腔内装置、血管補綴フィルター、ペースメーカー、ペースメーカーリード線、電極、除細動器、皮下移植片および/または筋肉内移植片、カテーテル、血管閉塞、心室シャント、血管シース、薬物送達装置およびポート、中隔閉鎖装置、縫合糸、神経刺激装置、埋め込み型ワイヤレスセンサ(例えば、血糖モニタおよび血圧モニタ)、人工濾過システムまたは他の人工臓器、インシュリンポンプ、人工酸素供給器などより選択される、請求項32記載の移植片。
  35. 少なくとも1種類の生理活性剤をさらに含む、請求項31〜35のいずれか一項記載の移植片。
  36. 少なくとも1種類の生理活性剤が、増殖因子、鎮痛剤/解熱剤、抗喘息剤、抗生物質、抗うつ剤、抗糖尿病剤、抗真菌剤、降圧剤、抗炎症剤、抗新生物剤、抗不安剤、免疫抑制剤、抗片頭痛剤、鎮静剤/睡眠剤、統合失調症治療剤、抗躁剤、抗不整脈剤、抗関節炎剤、抗痛風剤、抗凝血剤、血栓溶解剤、抗線維素溶解剤、抗血小板剤、および抗菌剤、抗ウイルス剤、殺菌剤、抗感染剤、ならびにその組み合わせより選択される、請求項36記載の移植片。
  37. 生分解性である、請求項31〜37のいずれか一項記載の移植片。
  38. 非生分解性である、請求項31〜37のいずれか一項記載の移植片。
  39. 対象において組織を修復または再生する方法であって、組織を、請求項1、2、5〜7、9、および11のいずれか一項に従って調製された内皮前駆細胞、または請求項23〜29のいずれか一項記載の内皮前駆細胞、または請求項30記載の細胞集団、または請求項31〜37のいずれか一項記載の移植片と接触させ、それによって、組織を修復または再生する工程を含む、方法。
  40. 対象において血管形成を強化するための方法であって、対象の組織を、請求項1、2、5〜7、9、および11のいずれか一項に従って調製された内皮前駆細胞、または請求項23〜29のいずれか一項記載の内皮前駆細胞、または請求項30記載の細胞集団、または請求項31〜37のいずれか一項記載の移植片と接触させ、それによって、血管形成を強化する工程を含む、方法。
  41. 対象において脈管形成を強化するための方法であって、対象の組織を、請求項1、2、5〜7、9、および11のいずれか一項に従って調製された内皮前駆細胞、または請求項23〜29のいずれか一項記載の内皮前駆細胞、または請求項30記載の細胞集団、または請求項31〜37のいずれか一項記載の移植片と接触させ、それによって、脈管形成を強化する工程を含む、方法。
  42. 組織が、筋肉組織、骨格筋組織、心臓組織、神経組織、肝臓組織、膵臓組織、骨組織、軟骨、腎臓組織、眼組織、皮膚組織、または過剰な細胞死を特徴とする組織である、請求項40〜42のいずれか一項記載の方法。
  43. 対象が、心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢血管閉塞性疾患、虚血、下肢虚血、脳卒中、一過性虚血、再灌流傷害、ならびに皮膚創傷、糖尿病足もしくは潰瘍(diabetic foot or ulcers)、壊疽、および糖尿病性創傷を含む創傷からなる群より選択される疾患を有するか、または発症するリスクがある、請求項40〜43のいずれか一項記載の方法。
  44. 対象において虚血関連組織損傷を回復させるための方法であって、(a)請求項1、2、5〜7、9、および11のいずれか一項に従って調製された内皮前駆細胞、または請求項23〜29のいずれか一項記載の内皮前駆細胞、または請求項30記載の細胞集団、または請求項31〜37のいずれか一項記載の移植片を対象に投与する工程;および(b)対象の組織において血管形成または脈管形成を強化し、それによって対象において虚血関連組織損傷を回復させる工程を含む、方法。
  45. 虚血関連組織損傷が、心不全、心筋梗塞、他の虚血性心疾患、下肢虚血、脳卒中、一過性虚血、または再灌流傷害に関連する、請求項45記載の方法。
  46. 対象において心不全を回復させるための方法であって、(a)請求項1、2、5〜7、9、および11のいずれか一項に従って調製された内皮前駆細胞、または請求項23〜29のいずれか一項記載の内皮前駆細胞、または請求項30記載の細胞集団、または請求項31〜37のいずれか一項記載の移植片を対象の心臓組織に投与する工程;ならびに(b)対象の心臓組織おいて血管形成または脈管形成を強化し、それによって対象において心不全を回復させる工程を含む、方法。
  47. 対象の組織において創傷治癒を強化するための方法であって、(a)請求項1、2、5〜7、9、および11のいずれか一項に従って調製された内皮前駆細胞、または請求項23〜29のいずれか一項記載の内皮前駆細胞、または請求項30記載の細胞集団、または請求項31〜37のいずれか一項記載の移植片を組織に投与する工程;ならびに(b)血管形成または脈管形成を増やし、それによって創傷治癒を高める工程を含む、方法。
  48. 内皮細胞または細胞集団が、組織適合性ドナーから適切に単離されているか、または組織適合性ドナーに由来する、請求項40〜48のいずれか一項記載の方法。
  49. 請求項1、2、5〜7、9、および11のいずれか一項に従って調製された内皮前駆細胞、または請求項23〜29のいずれか一項記載の内皮前駆細胞、または請求項30記載の細胞集団と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
  50. 対象において組織を修復または再生するためのキットであって、治療的有効量の請求項1、2、5〜7、9、および11のいずれか一項に従って調製された内皮前駆細胞、または請求項23〜29のいずれか一項記載の内皮前駆細胞、または請求項30記載の細胞集団と、組織を修復または再生するための説明書とを含む、キット。
  51. 対象が、心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢血管閉塞性疾患、虚血、下肢虚血、脳卒中、一過性虚血、再灌流傷害、ならびに皮膚創傷、糖尿病足もしくは潰瘍、壊疽、および糖尿病性創傷を含む創傷からなる群より選択される疾患を有するか、または発症するリスクがあり、かつ適宜、疾患を処置するための説明書を含む、請求項51記載のキット。
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