CN107354125A - 一种胎盘潜能细胞及其培养方法 - Google Patents

一种胎盘潜能细胞及其培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种胎盘潜能细胞的培养方法，包括如下步骤：(1)在无菌条件下获取胎盘细胞和/或组织；(2)将所述胎盘细胞和/或组织接种在培养基中培养，并在所述培养基中加入细胞生长调节剂，以使胎盘潜能细胞生长使所述胎盘细胞和/或组织进入增殖状态；及(3)培养所述胎盘潜能细胞，使其持续增殖并具有干细胞特性的细胞。本发明而且找到了能维持、支持、潜能细胞的生命物质，用生命物质代替药物；可以通过组织器官的复制，及时生理性修补组织器官，维持生命器官的平衡，治疗疑难顽症和疾病，使病人摆脱医疗痛苦和损伤；并有望用顺应细胞调控的方法，攻克癌症。

Description

一种胎盘潜能细胞及其培养方法
技术领域
本发明涉及一种潜能细胞及其培养方法，尤其是一种来源于动物胎盘的潜能细胞及其培养方法。
背景技术
20世纪末以来，生命科学研究发现：干细胞可在体外培养成人体的各个器官特征的细胞/组织。因此，体外培养“建造器官”，有望在不久的将来进行“自体器官”移植治疗疾病；或者，将干细胞注射在人体的某一部位，让干细胞在局部发挥一个器官的功能，最终实现对疾病的治疗。但在干细胞的培养过程中，体外干细胞培养技术受限于干细胞的迅速老化和自我分化并失去其干细胞的干性。
现有技术中，细胞培养是指模拟体内环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使细胞生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。
细胞培养的环境要求无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞缺失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培 养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。
细胞培养的温度是维持培养细胞旺盛生长的另一条件，培养时要求有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。
气体也是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。培养时一般把细胞置于95％空气加5％二氧化碳混合气体环境中。
二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值。大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。细胞培养液pH浓度的调节最常用的为加NaHCO3的方法，因为NaHCO3可供CO2，但二氧化碳易于逸出，故最适用于封闭培养，而羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)因其对细胞无毒性，也起缓冲作用，有防止pH迅速变动的特性而用于开放细胞培养技术中，其最大优点是在开放式培养时能维持较恒定的pH值。
再者，细胞培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生长、增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类很多，按其来源分为合成培养基和天然培养基。
(1)合成培养基：合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严 格配制而成的。内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量元素和细胞生长因子等。单独使用时细胞虽有生存但不能很好的生长增殖。
(2)天然培养基：使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及多种活性物质。与合成培养基合用，能使细胞顺利增殖生长。常见使用浓度最为5-20％。
体外培养细胞根据它们在培养器皿中是否能贴附于支持物上的生长特征，可分为贴附型生长和悬浮型生长两大类。贴附型细胞在培养时能贴附在支持物表面生长，常见的贴附型细胞是成纤维型细胞、上皮型细胞生长和游走型细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。
1、成纤维型细胞
在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维型细胞。本型细胞因形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵园形核，胞质向外伸出长短不同的突起，除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。
2、上皮型细胞
此类型细胞在培养器皿支持物上生长具有扁平不规则多角形特征，细胞中央有园形核，细胞紧密相连呈单层膜样生长。起源于内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等组织细胞培养时，皆呈上皮型形态 生长。
3、游走型细胞
本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型或成纤维细胞形态。常见于羊水细胞培养的早期。
培养细胞形态分析
培养细胞随贴附支持物形状不同而形态各异，最常见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。细胞在生长期常有1-2个核仁在细胞机能状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。若胞质中时而出现颗粒和空泡等，表明细胞代谢不良。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胎盘来源的潜能细胞，命名为胎盘潜能细胞，它是具有干细胞增殖潜能并以普通组织细胞形态存在于组织中的细胞。
本发明的又一目的在于提供一种胎盘来源的潜能细胞培养方法。
本发明的另一目的在于提供一种细胞生长调节剂，它用于体外细胞培养，尤其是人的细胞培养。
本发明的另一目的在于提供一种含有本发明细胞生长调节剂的培养基。
本发明的再一目的在于提供一种经本发明方法在体外培养得到胎盘潜能细胞的用途。
相应地，为达到以上目的，本发明提供一种本发明涉及一种体外能够连续增殖的人胎盘潜能细胞，其特征在于，它是具有干细胞增殖潜能的、以普通组织细胞形态存在于组织中的细胞。该胎盘潜能细胞的培养方法包括如下步骤：
(1)在无菌条件下获取胎盘细胞和/或组织；
(2)将所述胎盘细胞和/或组织接种在培养基中培养，并在所述培养基中加入细胞生长调节剂，以使胎盘潜能细胞生长使所述胎盘细胞和/或组织进入增殖状态。
(3)培养所述胎盘潜能细胞，使其持续增殖并具有干细胞特性的细胞。
优选地，增殖后的细胞在体外诱导的条件下，形成各种组织。
优选地，所述步骤(2)中将所述胎盘细胞和/或组织接种在培养基中培养包括如下步骤：
(2-A)将所述胎盘组织用至少两种抗生素包括：青霉素和链霉素冷磷酸缓冲液(PBS)连续洗涤至少2次，每次30秒至3分钟；
(2-B)将所述胎盘组织置于含双抗的完全培养液中冲洗至少2次，每次30秒至3分钟；
(2-C)将所述胎盘组织剪成极小的器官型植块，大小约1-5mm3；
(2-D)将植块置于培养板的培养孔中央，间隔约1-5mm，轻轻按压每块植块，使其紧贴培养板的表面；
(2-E)沿着培养孔的边缘，每孔中加入约0.1-1.0ml的完全培养液，勿使培养液与植块接触；
(2-F)将培养板置于37℃，1-10％CO2培养箱中预孵育0.5-2小时；
(2-G)每个培养孔加完全培养液，轻拿轻放，切勿使植块飘起，加细胞生长调节剂。
优选地，所述步骤(2)中将所述胎盘细胞和/或组织接种在培养基中培养包括如下步骤：
(2-a)为将组织块离散为单个细胞，首先将组织块置入含有至少两种抗生素包括：青霉素和链霉素的4℃预冷的磷酸缓冲盐水(PBS)中，洗涤至少3次，每次30秒至3分钟,然后将此组织块切成1-5mm3的小组织块，再用含有双抗的冷PBS洗涤两遍，将经过洗涤的组织块置入用无菌PBS配制的0.1-0.5％中性蛋白酶溶液或者0.5-2％胶原酶溶液中消化，条件是36.5-37℃恒温振荡，时间0.5-3小时；
(2-b)用加样器或者吸管反复吹打组织块，或者将组织块连同消化液一起倾倒至不锈钢滤网上，用注射器栓研磨组织块，直到组织块完全离散，成为单个细胞为止,将此含有细胞和本领域技术人员公知的消化酶溶液的混合物静置2-8分钟，弃去沉淀的大块以及不易消化的结缔组织，将含大量细胞和消化酶的上清液移至另一离心管，用不锈钢滤网过滤此上清 一次，得一消化酶和细胞混合物；
(2-c)在4℃条件下，1000-3000转/分钟，离心3-20分钟，弃去含有消化酶的上清液，加0.5-6℃预冷PBS旋涡振荡将细胞旋起，再加0.5-6℃预冷PBS，混匀；
(2-d)在0.5-6℃条件下，1000-3000转/分钟，离心3-20分钟，弃去上清液，加冷PBS旋涡振荡将细胞旋起，再加0.5-6℃预冷PBS，混匀，计数细胞；
(2-e)在0.5-6℃条件下，1000-3000转/分钟，离心3-20分钟，弃去上清液，加含10-20％胎牛血清的alpha MEM培养液，旋涡振荡将细胞旋起，再加所述含10-20％胎牛血清的alpha MEM培养液，并调整细胞浓度为1×105个/ml，混匀，得到定量细胞悬液；
(2-f)将细胞悬液加至塑料多孔培养板中(96孔板、24孔板、12孔板或6孔板)，96孔板每孔加200μl、24孔板每孔加1ml、12孔板每孔加2ml、6孔板每孔加4ml；
(2-g)将所塑料多孔培养板置于36.5-37℃，5％CO2细胞培养箱12-48小时，直至细胞全部贴壁。
进一步优选地，所述步骤(2)中将所述胎盘细胞和/或组织接种在培养基中培养包括如下步骤：
(2-A’)将所述胎盘组织用至少两种抗生素包括：青霉素和链霉素冷磷酸缓冲液(PBS)连续洗涤至少2次，每次1分钟；
(2-B’)将所述胎盘组织置于含双抗的完全培养液中冲洗至少2次，每次1分钟；
(2-C’)将所述胎盘组织剪成极小的器官型植块，大小约2mm×2mm；
(2-D’)将植块置于培养板的培养孔中央，间隔约2mm，布局合理，轻轻按压每块植块，使其紧贴培养板的表面；
(2-E’)沿着培养孔的边缘，每孔中加入约0.5ml的完全培养液，勿使培养液与植块接触；
(2-F’)将培养板置于37℃，5％CO2培养箱中预孵育1小时；
(2-G’)每个培养孔加完全培养液2ml，轻拿轻放，切勿使植块飘起，加细胞生长调节剂。
进一步优选地，所述步骤(2)中将所述胎盘细胞和/或组织接种在培养基中培养包括如下步骤：
(2-a’)为了将组织块离散为单个细胞，首先将组织块置入含有至少两种抗生素包括：青霉素和链霉素的4℃预冷的磷酸缓冲盐水(PBS)中，洗涤至少3次，然后将此组织块切成2mm3的小组织块，再用含有双抗的冷PBS洗涤两遍，将经过洗涤的组织块置入用无菌PBS配制的0.25％中性蛋白酶溶液或者1％胶原酶溶液中消化，条件是37℃恒温振荡，时间1小时；
(2-b’)用加样器或者吸管反复吹打组织块，或者将组织块连同消 化液一起倾倒至不锈钢滤网上，用注射器栓研磨组织块，直到组织块完全离散，成为单个细胞为止,将此含有细胞和本领域技术人员公知的消化酶溶液的混合物静置5分钟，弃去沉淀的大块以及不易消化的结缔组织等，将含大量细胞和消化酶的上清液移至另一离心管，用不锈钢滤网过滤此上清一次，得一消化酶和细胞混合物；
(2-c’)在4℃条件下，1500转/分钟，离心5分钟，弃去含有消化酶的上清液，加冷PBS旋涡振荡将细胞旋起，再加冷PBS，混匀；
(2-d’)在4℃条件下，1500转/分钟，离心5分钟，弃去上清液，加冷PBS旋涡振荡将细胞旋起，再加冷PBS，混匀，计数细胞；
(2-e’)在4℃条件下，1500转/分钟，离心5分钟，弃去上清液，加含15％胎牛血清的alpha MEM培养液，旋涡振荡将细胞旋起，再加所述含15％胎牛血清的alpha MEM培养液，并调整细胞浓度为1×105个/ml，混匀，得到定量细胞悬液；
(2-f’)将细胞悬液加至塑料多孔培养板中(96孔板、24孔板、12孔板或6孔板)，96孔板每孔加200μl、24孔板每孔加1ml、12孔板每孔加2ml、6孔板每孔加4ml；
(2-g’)将所塑料多孔培养板置于37℃，5％CO2细胞培养箱24小时，直至细胞全部贴壁。
优选地，所述胎盘的来源包括自然流产的人的胎盘，小鼠胎盘，仓鼠胎盘，猪胎盘，牛胎盘或牛胎盘。
优选地，所述培养基的成分包括：
1)75-85％质量百分比的氨基酸,，选自如下组合中的一种或多种：精氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸；
2)3-5％质量百分数的维生素，选自如下组合中的一种或多种：生物素、胆碱、叶酸、烟碱、泛酸、维生素B6、维生素B1和核黄素；
3)0.6-1.2％质量百分比的盐，包括如下组合中的一种或多种：NaCl,KCl,NaHPO4,NaHCO3,CaCl2和MgCl2；
4)8-12％质量百分比的蛋白质，如胰岛素、运铁蛋白；及
5)1.8-2.4％质量百分比的葡萄糖、1.2-1.8％质量百分比的青霉素和1.2-1.8％质量百分比的链霉素。
优选地，所述细胞生长调节剂选自如下组合白藜芦醇(Resveratrol)，氨基酸及胎牛血清，人血清。
一种由上述方法培养而成胎盘潜能细胞。
优选地，所述白藜芦醇(Resveratrol)在培养基的含量为10-60ng/mL。
一种所述胎盘潜能细胞的应用。
可以用倒置显微镜观察得到的培养结果，采用明视野、相差、微分干射、霍夫曼和荧光等不同方法动态观察；细胞计数；生物染料或荧光染料染色；细胞增殖检测；细胞组织化学检测；免疫细胞组织化学检测等。
经过加入本发明的细胞生长调节剂，使用本发明的培养基可以连续培养人的各种细胞或组织，在条件适宜的情况下，其培养时间可以长达90-180天或更长。
另外，现有技术中，一般人们都试图在体外直接培养干细胞，使其能够分化成所需要的体细胞。而本发明的目的是，在人的干细胞直接经过本发明的方法，在本发明所述的培养基上获得相应的具有各种细胞/组织功能的正常细胞和组织。
本发明体外培养获得的细胞、组织可以作为功能实验模型，对药物进行安全、有效性实验；筛选对组织、细胞的、维持、保障再生功能的生命物质；筛选针对组织本身疾病的治疗物质。
由此可见，本发明利用在体外培养为具有较持续生理增殖能力的细胞；再培养这些持续增殖的细胞继续克隆复制，形成具有功能的组织。
通过本发明的细胞培养方法培养的潜能细胞中提取蛋白成分，可针对病患、损伤的组织进行修复，诱导癌细胞凋亡。
由此可见，本发明的目的在于：
1、研究探讨体外细胞和组织的研究模型；
2、通过寻找和维持、支持组织器官的物质；
4、用细胞研究保障人或动物体生命的整体平衡，实现其预防和治疗疾病，健康长寿。
5、用获得的“细胞，组织”的生命物质，修复受损的细胞和抑制癌细 胞。
根据本发明的结果，本发明的有益效果表现在：
人的胎盘潜能细胞，可以不断的增殖补充已凋亡、退化、损伤坏死的组织细胞，以维持其组织架构和功能来实现的；在体内，这些细胞以普通细胞形式参与组织器官的架构和功能形成，与增殖的干细胞形成的组织共同组合成器官。当组织器官的细胞凋亡、退化、损伤坏死时，这些潜能细胞启动自身增殖的功能，再生复制新的细胞，来及时补充器官中的细胞、组织、功能空缺，从而及时恢复器官的结构和功能，保障器官组织功能的正常发挥。
通过本发明，完成临床实现皮肤大器官和胃肠粘膜器官的原位复制。
通过本发明，体外用胎盘潜能细胞培养出软骨、骨髓、脂肪、内皮、神经等“组织”；最终有望实现所有组织器官的复制。
换言之，本发明的科学及医学和经济价值是具有重大意义的，一方面，它不仅仅找到了人体组织器官及功能延续的源头，即再生潜能细胞，为人类寻找到了一条顺应生命的医疗和健康长寿的方法，而且找到了能维持、支持、潜能细胞的生命物质，用生命物质代替药物。
另一方面通过本发明蛋白提取物对修复组织器官的作用研究，获得保障人体组织器官的生理功能，实现其健康长寿、预防组织器官疾病的发生的方法；
再一方面，可以通过组织器官的复制，及时生理性修补组织器官， 维持生命器官的平衡；治疗疑难顽症和疾病；使病人摆脱医疗痛苦和损伤。
本发明还可从本研究创立的细胞正常生态条件入手，用顺应细胞调控的方法，攻克癌症。
本发明的细胞生长调节剂也可以用于其它细胞或组织等的培养。
本发明中使用的术语
为了便于阐述本发明的研究过程，首先确定本发明中所使用的名词术语，以区别于与传统概念的异同，确立本发明专用名词如下：
组织器官：
现有技术中，人体组织、器官中的“器官”的概念在国际上统一的医学概念是具有功能的组织单位。张朝佑著的《人体解剖学》中(1996年人民卫生出版社)认为“不同类型的细胞，以一种细胞为主题，分别构成不同组织，各种组织构成器官”。
王敬美著《人体解剖学》(1994年人民卫生出版社)中认为：“许多形态相似、功能相近的细胞由细胞间质结合在一起，形成的结构成为组织；几种不同的组织按照一定的规律分布，组成一定形态和机能的结构，成为器官。”
本发明所述的“组织”是指再生的原位和体外的“组织”是由“胎盘潜能细胞”首先形成细胞，而后再组织形成有功能的单位。
胎盘潜能细胞：
本发明的发明人在研究中发现：人的胎盘中具有再生能力的细胞，命名为胎盘潜能细胞，它是具有干细胞增殖潜能的、在特定条件下可以分化成组织的细胞。也称潜能细胞(Potential Cell)。在组织学上，潜能细胞可以成其他组织细胞，甚至也可以变成原始的细胞。因此，当器官病变坏死时，胎盘潜能细胞能够及时地再生一种或多种细胞，以补偿空缺，这样就不会出现人体器官坏死的现象。
因此，胎盘中的潜能细胞可以及时不断地增殖补充凋亡、退化、损伤坏死的组织细胞，以维持其组织架构和功能来实现的。这些细胞与正常的组织细胞在一起时，并不是像干细胞一样增殖或者分化，所以把它定名为“潜能细胞”。当组织器官的细胞凋亡、退化、损伤坏死时，这些潜能细胞启动自身增殖的功能，再生复制新的细胞，及时补充器官中的细胞、组织空缺，及时恢复器官的结构和功能，保障器官组织功能的正常发挥。人体所有器官的这项修复功能发挥正常，人体就能维护整体生命的平衡，实现其健康长寿；如果某一器官或组织的这一功能不能发挥或低下，某器官或组织就会产生疾病。
本发明的这些目的，特点，和优点将会在下面的具体实施方式，附图，和权利要求中详细的揭露。
附图说明
图1为潜能细胞的产生过程说明图，细胞就是所发现的具有增殖能力的潜能细胞。
图2、图3为实施例1中实验组培养后的显微镜图片，细胞是能够持续增殖分裂，具有分化成多种组织的潜能细胞。
图4为实施例2对贴壁的胎盘潜能细胞添加脂肪诱导剂，培养21天后固定，用油红染色(油红溶于脂类，不溶于水，故常用于脂类物质染色)，图中可见分化后的细胞内有脂滴。(放大倍数10×).
图5为实施例2中实验组的成骨组织的显微镜图片。同一批细胞贴壁后，加成骨诱导剂，培养21天后固定，用茜素红染色(茜素红与钙离子螯合形成复合物，可用来识别成骨细胞内的钙盐成分，(放大倍数10×)。
图6为加入诱导剂的细胞，培养21天后，经染色可见软骨形成，是实施例2的软骨组织通过染色，在显微镜下的图片。
图7A-I为实施例3经过30天的培养，用流式细胞术的方法测定细胞表面标志物。参见图7A-I，实验组细胞表达CD90，CD73，CD105，而不表达CD31,CD45，CD14，CD34，CD9和HLA-DR。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，本发明采用的技术方案是获得人的原位器官组织细胞；体外培养所述的组织细胞；促使胎盘潜能细胞克隆复制形成有功能的组织。提取蛋白质，及提取的蛋白质可以促进细胞的生长和组织的修复。
实施例1体外培养人胎盘细胞
获取人的胎盘，首先将胎盘组织置入含有双抗(青霉素和链霉素) 的4℃预冷的磷酸缓冲盐水(PBS)中，洗涤3遍，然后将此大的组织块切成2mm的小组织块，再用含有双抗的冷PBS洗涤两遍，将经过洗涤的组织块置入用无菌PBS配制的0.25％中性蛋白酶溶液或者1％胶原酶溶液中消化，条件是37℃恒温振荡，时间1小时，然后可按照下列方法进行实验。
用加样器或者吸管反复吹打该组织块，或者将组织块连同消化液一起倾倒至不锈钢滤网上，用注射器栓研磨组织块，直到组织块完全离散，成为单个细胞为止。
将此含有细胞和本领域技术人员公知的消化酶溶液，例如中性蛋白酶和胶原蛋白酶消化的混合物静置5分钟，弃去沉淀的大块以及不易消化的结缔组织等，将含大量细胞和消化酶的上清液移至另一离心管，如有必要可用不锈钢滤网过滤此上清一次，得一消化混合物；
在4℃条件下，1500转/分钟，离心5分钟，弃去含有消化酶的上清液，加少量冷PBS旋涡振荡将细胞旋起，再加多量冷PBS，混匀；
在4℃条件下，1500转/分钟，离心5分钟，弃去上清液，加少量(定量)冷PBS旋涡振荡将细胞旋起，再加定量冷PBS，混匀，计数细胞；
在4℃条件下，1500转/分钟，离心5分钟，弃去上清液，加少量(定量)含15％胎牛血清的alpha MEM，旋涡振荡将细胞旋起，再加适量(定量)培养液，并调整细胞浓度为1×105个/ml，混匀，得到定量细胞悬 液；
将细胞悬液加至塑料多孔培养板中(96孔板、24孔板、12孔板或6孔板)，96孔板每孔加200μl、24孔板每孔加1ml、12孔板每孔加2ml、6孔板每孔加4ml；
置于37℃,5％CO2细胞培养箱中培养，24小时后，细胞全部贴壁；细胞培养24小时后，镜下观察贴壁细胞生长正常，将培养孔分为两组，一组为实验组，另一组为对照组，在实验组的培养孔中加入含15％胎牛血清的alpha MEM培养液和Resveratrol。对于细胞培养基的选择本领域技术人员是公知的。对照组中不加入本发明的物质。该细胞培养调节剂的加入量为10ng－60ng/毫升培养基。
按程序要求更换培养液，换液方法为去掉一半陈旧培养液，加入等量新鲜的，含15％胎牛血清的alpha MEM培养液，以后换液时间缩短为3天，定时观察和随时观察相结合。
在培养25天后，如图1中可见人的胎盘细胞以单个形式于培养液中，这时细胞在培养液中成活，生命活跃，有的细胞呈分裂相。在这些细胞中有些细胞具有持续增殖的能力，我们称胎盘潜能细胞；有些细胞不具有持续增殖的能力。
参见图2，可见正在分裂的较大的细胞是正在复制组织器官的由胎盘潜能细胞变化来的细胞；较小的没有分裂的细胞是原有不增殖和新产生的胎盘潜能细胞；这些细胞在培养液中在特殊生命物质的作用下持续增 殖，表现为干细胞的增殖规律。在对细胞的功能测定后，可作为体外正常细胞实验模型。
参见图3，可见持续增殖的细胞在培养液中部分开始连接成组织，已连接成组织的细胞其形态由圆型变为组织细胞的形态，部分细胞仍持续增殖活跃。其形成的组织可作为体外组织实验模型。
在以上体外利用组织细胞进行培养为组织器官的研究中，发明人对具有增殖能力的源头细胞进行了研究，发现在同时培养的单个组织细胞中，部分细胞开始分裂，很快就成为终端细胞，没有形成新的组织；而另一部分细胞，则持续分裂增殖，而增殖的细胞则源源不断的形成组织，并形成不同形态的组织，几种不同形态的组织共同组合成大的组织。
实施例2形成脂肪组织、骨和软骨的诱导分化
参见图3，继续培养实验组的胎盘细胞，加入形成骨，软骨，脂肪的三种诱导剂，两周后，形成脂肪组织、骨和软骨。
参见图4-5，分别用不同的染色法，在显微镜下，形成骨，软骨，脂肪组织。
实施例3，细胞表面标志物的鉴别
参见图7，采用与实施例1相同的方法进行培养，设立对照组与实验组，对照组中不加入本发明的物质。经过30天的培养，用流式细胞术的方法测定细胞表面标志物。参见图7A-7I，实验结果显示如下。图7A显示CD90>95％,图7B显示CD34<2％,图7C显示CD14<2％，图7D显示 CD45<2％，图7E显示CD19<2％，图7F显示CD105>95％,图7G显示CD31<2％,图7H显示CD73>95％,图7I显示HLA-DR<2％。实验组细胞表达CD90，CD73，CD105，而不表达CD45，CD14，HLA-DR，对照均不表达。
实施例4将胎盘的来源替换为小白鼠，仓鼠，猪或其它动物，重复实施例1-3，结果同实施例1-3类似。
根据本发明的一个较佳实施例，所述培养基的成分包括：
1)80％质量百分比的氨基酸,，选自如下组合中的一种或多种：精氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸；
2)4％质量百分数的维生素，选自如下组合中的一种或多种：生物素、胆碱、叶酸、烟碱、泛酸、维生素B6、维生素B1和核黄素；
3)0.4％质量百分比的NaCl和0.4％质量百分比的KCl。
4)5％质量百分比的胰岛素、5％质量百分比的运铁蛋白；及
5)2.2％质量百分比的葡萄糖、1.5％质量百分比的青霉素和1.5％质量百分比的链霉素。
通过上述实施例，本发明的目的已经被完全有效的达到了。熟悉该项技艺的人士应该明白本发明包括但不限于附图和上面具体实施方式中描述的内容。任何不偏离本发明的功能和结构原理的修改都将包括在权利要求书的范围中。

Claims (9)

1.一种胎盘潜能细胞的培养方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)在无菌条件下获取胎盘细胞和/或组织；
(2)将所述胎盘细胞和/或组织接种在培养基中培养，并在所述培养基中加入细胞生长调节剂，以使胎盘潜能细胞生长使所述胎盘细胞和/或组织进入增殖状态。
(3)培养所述胎盘潜能细胞，使其持续增殖为具有干细胞特性的细胞。
2.根据权利要求1所述的胎盘潜能细胞的培养方法，进一步包括步骤：增殖后的细胞在体外诱导的条件下，形成各种组织。
3.根据权利要求1所述的胎盘潜能细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(2)中将所述胎盘细胞和/或组织接种在培养基中培养包括如下步骤：
(2-A)将所述胎盘组织用至少两种抗生素包括：青霉素和链霉素冷磷酸缓冲液(PBS)连续洗涤至少2次，每次30秒至3分钟；
(2-B)将所述胎盘组织置于含双抗的完全培养液中冲洗至少2次，每次30秒至3分钟；
(2-C)将所述胎盘组织剪成极小的器官型植块，大小约1-5mm3；
(2-D)将植块置于培养板的培养孔中央，间隔约1-5mm，轻轻按压每块植块，使其紧贴培养板的表面；
(2-E)沿着培养孔的边缘，每孔中加入约0.1-1.0ml的完全培养液，勿使培养液与植块接触；
(2-F)将培养板置于37℃，1-10％CO2培养箱中预孵育0.5-2小时；
(2-G)每个培养孔加完全培养液，轻拿轻放，切勿使植块飘起，加细胞生长调节剂。
4.根据权利要求1所述的胎盘潜能细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(2)中将所述胎盘细胞和/或组织接种在培养基中培养包括如下步骤：
(2-a)为将组织块离散为单个细胞，首先将组织块置入含有至少两种抗生素包括：青霉素和链霉素的4℃预冷的磷酸缓冲盐水(PBS)中，洗涤至少3次，每次30秒至3分钟,然后将此组织块切成1-5mm3的小组织块，再用含有双抗的冷PBS洗涤两遍，将经过洗涤的组织块置入用无菌PBS配制的0.1-0.5％中性蛋白酶溶液或者0.5-2％胶原酶溶液中消化，条件是36.5-37℃恒温振荡，时间0.5-3小时；
(2-b)用加样器或者吸管反复吹打组织块，或者将组织块连同消化液一起倾倒至不锈钢滤网上，用注射器栓研磨组织块，直到组织块完全离散，成为单个细胞为止,将此含有细胞和本领域技术人员公知的消化酶溶液的混合物静置2-8分钟，弃去沉淀的大块以及不易消化的结缔组织，将含大量细胞和消化酶的上清液移至另一离心管，用不锈钢滤网过滤此上清一次，得一消化酶和细胞混合物；
(2-c)在4℃条件下，1000-3000转/分钟，离心3-20分钟，弃去含有消化酶的上清液，加0.5-6℃预冷PBS旋涡振荡将细胞旋起，再加0.5-6℃预冷PBS，混匀；
(2-d)在0.5-6℃条件下，1000-3000转/分钟，离心3-20分钟，弃去上清液，加冷PBS旋涡振荡将细胞旋起，再加0.5-6℃预冷PBS，混匀，计数细胞；
(2-e)在0.5-6℃条件下，1000-3000转/分钟，离心3-20分钟，弃去上清液，加含10-20％胎牛血清的alpha MEM培养液，旋涡振荡将细胞旋起，再加所述含10-20％胎牛血清的alpha MEM培养液，并调整细胞浓度为1×105个/ml，混匀，得到定量细胞悬液；
(2-f)将细胞悬液加至塑料多孔培养板中(96孔板、24孔板、12孔板或6孔板)，96孔板每孔加200μl、24孔板每孔加1ml、12孔板每孔加2ml、6孔板每孔加4ml；
(2-g)将所塑料多孔培养板置于36.5-37℃，5％CO2细胞培养箱12-48小时，直至细胞全部贴壁。
5.根据权利要求1所述的胎盘潜能细胞的培养方法，其特征在于所述胎盘的来源包括自然流产的人的胎盘，小鼠胎盘，仓鼠胎盘，猪胎盘，牛胎盘或牛胎盘。
6.根据权利要求1所述的胎盘潜能细胞的培养方法，其特征在于，所述培养基的包括：
1)氨基酸，选自如下组合中的一种或多种：精氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸；
2)维生素，选自如下组合中的一种或多种：生物素、胆碱、叶酸、烟碱、泛酸、维生素B6、维生素B1和核黄素；
3)盐，如下组合中的一种或多种：NaCl,KCl,NaHPO4,NaHCO3,CaCl2和MgCl2；
4)蛋白质，如胰岛素、运铁蛋白；及
5)葡萄糖、青霉素和链霉素。
7.根据权利要求1所述的胎盘潜能细胞的培养方法，其特征在于，所述细胞生长调节剂选自如下组合：白藜芦醇(Resveratrol)，氨基酸及胎牛血清，人血清。
8.根据权利要求1所述的胎盘潜能细胞的培养方法，其特征在于：白藜芦醇(Resveratrol)在培养基的含量为10-60ng/mL。
9.一种由权利要求1-9任意一种方法培养而成胎盘潜能细胞。
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