CN108611317A - N-乙酰半胱氨酸用于制备猪胎盘滋养层细胞体外培养剂中的应用 - Google Patents

N-乙酰半胱氨酸用于制备猪胎盘滋养层细胞体外培养剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了N‑乙酰半胱氨酸的一种新的用途，具体地，N‑乙酰半胱氨酸用于在制备猪胎盘滋养层细胞体外培养剂中的应用，可用于促进猪胎盘滋养层细胞体外增殖，或抑制猪胎盘滋养层细胞体外增殖。

Description

N-乙酰半胱氨酸用于制备猪胎盘滋养层细胞体外培养剂中的 应用
技术领域
本发明涉及家畜养殖技术领域，具体涉及N-乙酰半胱氨酸在猪胎盘滋养层细胞体外培养中的应用。
背景技术
胎盘屏障是由滋养层细胞、绒毛毛细血管内皮细胞和基膜共同组成，是母体和胎儿之间营养物质和代谢产物进行交换的场所，同时也是阻止各种病原体由母体进入胎儿的天然屏障。胎盘发育是滋养层细胞增殖分化的结果，胎盘滋养层细胞是胎盘形成发育关键。
N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是硫醇类化合物，是天然氨基酸L-半胱氨酸与谷胱甘肽的前体物质，分子式为C5H9NO3S，相对分子质量为163.2，是一种含活性巯基化合物，其生物活性主要在于硫基，而乙酰基使其活性更加稳定。NAC作为小分子物质，易于进入细胞，进入机体后97％被小肠迅速吸收，并经小肠和肝脏细胞代谢与蛋白质肽链结合形成多种代谢产物。NAC在体内脱去乙酰基后形成半胱氨酸，半胱氨酸是谷胱甘肽的前体，可通过血脑屏障和神经细胞膜转化成细胞内的谷胱甘肽，具有较强的清除活性氧自由基的能力；另外，有研究表明，NAC还有增强组织对抗药物过量及毒物损伤的能力。
NAC在畜牧生产中应用广泛，主要发挥着抗氧化、抑制炎症反应、免疫调节和改善呼吸功能的作用。在猪上，NAC添加在猪精子常温保存液中，可显著提高猪精液的保存时间和保存质量，在猪冷冻精液的制作过程中，冷冻稀释液中添加NAC可显著提高精子解冻后的质量；饲粮中添加NAC可以缓解脂多糖应激引起的肠黏膜损伤、乙酸刺激引起的结肠炎及改善小肠吸收功能，对维护猪肠道健康具有重要意义；NAC也能缓解脂多糖导致的仔猪生长抑制，提高猪的生长性能。
NAC在畜牧业生产中应用前景广阔，但迄今为止，没有有关NAC对猪胎盘滋养层细胞影响的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供N-乙酰半胱氨酸的一种新的用途，用于在制备猪胎盘滋养层细胞体外培养剂中的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
N-乙酰半胱氨酸用于在制备猪胎盘滋养层细胞体外培养剂中的应用。
如上所述的应用，优选地，所述N-乙酰半胱氨酸用于制备促进猪胎盘滋养层细胞体外增殖或抑制增殖的试剂或药品。
如上所述的应用，优选地，所述N-乙酰半胱氨酸用于制备促进猪胎盘滋养层细胞体外增殖的促进剂。
如上所述的应用，优选地，所述N-乙酰半胱氨酸用于制备抑制猪胎盘滋养层细胞体外增殖的抑制剂。
如上所述的应用，优选地，所述N-乙酰半胱氨酸在体外培养剂中的用量为10nmol/L-1μmol/L，用于促进猪胎盘滋养层细胞体外增殖。
如上所述的应用，优选地，所述N-乙酰半胱氨酸在体外培养剂中的用量为1mmol/L～10mmol/L，用于抑制猪胎盘滋养层细胞体外增殖。
如上所述的应用，优选地，所述体外培养剂为DMEM：F12培养基。
本发明还提供一种细胞体外培养基，其含有N-乙酰半胱氨酸。
如上所述的体外培养基，优选为含有1mmol/L～10mmol/L或10nmol/L～1μmol/L所述N-乙酰半胱氨酸的DMEM：F12培养基。
进一步，所述体外培养基中还含有ITS、青霉素和链霉素。
本发明的有益效果在于：
本发明提供N-乙酰半胱氨酸用于在制备猪胎盘滋养层细胞体外培养剂中的应用，具体地说，N-乙酰半胱氨酸可用于制备猪胎盘滋养层细胞在体外培养所需能快速增殖或抑制的促进剂或抑制剂，可用于猪胎盘滋养层细胞的增殖，或抑制猪胎盘滋养层细胞的生长。可满足实验不同目的的需求。还可用于制备临床研究相关的用于促进猪胎盘滋养层细胞增殖，或抑制增殖的试剂或药物。
附图说明
图1为N-乙酰半胱氨酸对猪胎盘滋养层细胞增殖的影响结果。
图2为不同含量的N-乙酰半胱氨酸对不同细胞的增殖的影响结果。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所用试剂和激素的来源可为如下：N-乙酰半胱氨酸购自Sigma(上海)，DMEM：F12培养基、青霉素/链霉素双抗溶液、胎牛血清(FBS)购自Gibco(上海)，ITS购自ScienCell(San Diego，CA)。
实施例1N-乙酰半胱氨酸对猪胎盘滋养层细胞增殖的影响
1.细胞培养
猪胎盘滋养层细胞pTr(porcine trophectoderm cell)由中国农业大学动物营养实验室提供。在37℃水浴锅解冻后将细胞吸出，加入2mL完全培养液(100mL完全培养液中含88mL的DMEM：F12，10mL的胎牛血清，1mL的ITS和1mL的青霉素/链霉素双抗溶液)混匀，1000转离心4分钟后弃上清，用2mL完全培养液重悬后置于75T细胞培养瓶中在5％CO2和95％空气条件下培养，培养48小时或细胞融合度达70％时倒掉培养基，PBS洗涤2次，之后用400μL胰酶消化2min，3mL完全培养液终止消化。充分吹打后将细胞液转移至离心管中1000转离心4分钟后弃上清，用完全培养液重悬后按1×105细胞/孔接种到含1mL完全培养液的24孔板培养48小时，吸取上清液后用PBS洗涤2次待用。
2.N-乙酰半胱氨酸对猪胎盘滋养层细胞的处理
步骤1中获得的猪胎盘滋养层细胞分别用含1nM、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM、1mM、10mM浓度N-乙酰半胱氨酸的DMEM：F12培养基(100mL培养液中含98mL的DMEM:F12，1mL的ITS和1mL的青霉素/链霉素双抗溶液)培养24h，并设空白对照。结束培养后，收集细胞用于细胞计数。此实验设计3个不同的重复，每一个重复4孔。
3.检测方法
细胞计数用TZ20TM计数器(BIO-RAD)进行。具体如下：弃掉上清液，细胞用0.5mL的PBS洗涤2次，加0.25％胰蛋白酶0.5mL消化5分钟，再用0.5mL完全培养液终止消化，吹打均匀后将1mL细胞混合液转移至离心管中，吸10μL用细胞计数板(BIO-RAD)测量。
4.检测结果
细胞计数用SPSS软件中的单因子ANOVA分析。不同平均数用Tukey法比较，数据用平均数±标准误表示。
结果如图1所示，表明培养基中添加N-乙酰半胱氨酸对猪胎盘滋养层细胞呈现剂量依赖性效应，即共培养24h，随着处理浓度增加细胞数呈现先上升后下降的趋势，其中当N-乙酰半胱氨酸浓度在1nM～100nM范围时对猪胎盘滋养层细胞增殖呈现剂量依赖性促进，100nM浓度的N-乙酰半胱氨酸处理24h对细胞增殖的刺激效应最明显(P<0.05)；当N-乙酰半胱氨酸浓度在100nM～10mM范围内时，对猪胎盘滋养层细胞增殖呈现剂量依赖性抑制，10mM的N-乙酰半胱氨酸处理24h对细胞增殖的抑制效应最明显(P<0.05)。
实施例2
采用含有100nM和10mM的N-乙酰半胱氨酸的DMEM：F12培养基(100mL培养液中含98mL的DMEM：F12，1mL的ITS和1mL的青霉素/链霉素双抗溶液)对猪胎盘滋养层细胞、猪大卵泡颗粒细胞、猪大卵泡膜细胞(其中，猪大卵泡颗粒细胞和膜细胞均分离自屠宰场收集的母猪卵巢)，培养24h，并对这些细胞采用不含N-乙酰半胱氨酸的DMEM：F12培养基作为空白对照。结束培养后，收集细胞用于细胞计数。此实验设计3个不同的重复，每一个重复4孔。
按实施例1中的细胞计数方法进行计算，获得的结果是：对于含100nM的N-乙酰半胱氨酸的培养基，猪胎盘滋养层细胞增殖与空白对照相比达到1.6倍(P<0.05)，而猪大卵泡颗粒细胞和猪大卵泡膜细胞则与空白对照增殖情况差不多，结果如图2所示。
对于含10mM的N-乙酰半胱氨酸的培养基，猪胎盘滋养层细胞增殖与空白对照相比达到缩减为0.6倍(P<0.05)，而猪大卵泡颗粒细胞和猪大卵泡膜细胞则与空白对照增殖情况差不多，结果如图2所示，图中0nM、100nM、10mM分别是指N-乙酰半胱氨酸含量为0nmol/L(即空白对照)，100nmol/L，10mmol/L。说明含N-乙酰半胱氨酸的培养基对猪胎盘滋养层细胞具有增殖或抑制的作用，而对猪大卵泡颗粒细胞和猪大卵泡膜细胞则没有此作用。

Claims (10)

1.N-乙酰半胱氨酸用于在制备猪胎盘滋养层细胞体外培养剂中的9应6用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述N-乙酰半胱氨酸用于制备促进猪胎盘滋养层细胞体外增殖或抑制增殖的试剂或药品。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述N-乙酰半胱氨酸用于制备促进猪胎盘滋养层细胞体外增殖的促进剂。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述N-乙酰半胱氨酸用于制备抑制猪胎盘滋养层细胞体外增殖的抑制剂。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述N-乙酰半胱氨酸在体外培养剂中的用量为10nmol/L～1μmol/L，用于促进猪胎盘滋养层细胞体外增殖。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述N-乙酰半胱氨酸在体外培养剂中的用量为1mmol/L～10mmol/L，用于抑制猪胎盘滋养层细胞体外增殖。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述体外培养剂为DMEM：F12培养基。
8.一种细胞体外培养基，其特征在于，其含有N-乙酰半胱氨酸。
9.根据权利要求8所述的体外培养基，其特征在于，所述体外培养基为含有1mmol/L～10mmol/L或10nmol/L～1μmol/L所述N-乙酰半胱氨酸的DMEM：F12培养基。
10.根据权利要求9所述的体外培养基，其特征在于，所述体外培养基还含有ITS、青霉素和链霉素。
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