CN106038597A

CN106038597A - 间充质干细胞在制备治疗急性肺损伤制剂中的应用

Info

Publication number: CN106038597A
Application number: CN201610359976.7A
Authority: CN
Inventors: 宫黎明; 周满红; 徐绍华; 李晓飞; 肖建辉; 杨智敏; 罗克燕
Original assignee: Affiliated Hospital of Zunyi Medical University
Current assignee: Affiliated Hospital of Zunyi Medical University
Priority date: 2016-05-27
Filing date: 2016-05-27
Publication date: 2016-10-26
Anticipated expiration: 2036-05-27
Also published as: CN106038597B

Abstract

本发明公开了间充质干细胞在制备治疗急性肺损伤制剂中的应用。间充质干细胞来源于产后丢弃物人胎盘组织表面的羊膜层——人羊膜间充质干细胞。急性肺损伤是百草枯诱导的急性肺损伤。本发明采用人羊膜组织分离出来的间充质干细胞，以腹膜腔注射PQ制作急性肺损伤动物模型，经舌下静脉移植hAD‑MSCs制剂对急性肺损伤有很好的治疗效果。本发明比骨髓和脐带来源的间充质干细胞，具有取材容易，扩增能力强，治疗效果佳的优势。

Description

间充质干细胞在制备治疗急性肺损伤制剂中的应用

技术领域

本发明涉及间充质干细胞制剂在治疗百草枯致急性肺损伤制剂中的应用，尤其涉及人羊膜间充质干细胞制剂在治疗百草枯致急性肺损伤中的应用。

背景技术

百草枯（Paraquat，PQ）是一种快速灭生型除草剂，因其具有高效的除草效果曾被广泛应用，但由于PQ对人体毒性极大，其吸收后随血液循环分布至全身各组织器官，其中绝大部分被肺组织摄取，引起广泛的肺泡细胞损伤，从而导致急性肺损伤（acute lunginjury，ALI）以及其继发的纤维化，其中肺组织强烈的炎症反应是导致ALI和肺纤维化的中心环节，口服中毒致死率达90%以上。我国虽已停止PQ水剂在国内的销售和使用，但目前因PQ中毒就诊的患者仍屡见不鲜，目前尚无特效解毒药。临床上常规的治疗措施主要包括：1、抑制毒物吸收，如清洗染毒皮肤、催吐、洗胃及导泄等；2、加速体内PQ排泄，如血液灌流、血液透析等；3、药物治疗，如清除氧自由基、减少肺纤维化，以及对症支持等治疗。但抑制炎症因子、改善氧合及促进肺内液体吸收等治疗措施都未能有效地缓解百草枯中毒所致肺损伤的病程进展，死亡率居高不下。

随着干细胞相关技术迅速发展，其所具有的低免疫原性和向多个胚层分化及旁分泌等特点为治疗肺损伤性疾病开创了新的思路和方法。研究发现移植骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSCs）对PQ诱导的肺损伤具有保护作用，其可以减轻肺水肿、脂质过氧化以及抑制炎症介质的释放。人脐带间充质干细胞对百草枯中毒性急慢性肺损伤有一定的治疗作用，这种作用可能是通过旁分泌机制实现的。这些研究均证实间充质干细胞对多种原因引起的ALI具有治疗作用。

近年来研究发现人羊膜间充质干细胞（human amnion-derived mesenchymalstem cells, hAD-MSCs）是一种比骨髓和脐带来源间充质干细胞具有更强的扩增能力。在特定的体外诱导培养条件下，hAD-MSCs可分化成来自三个胚层的所有细胞，包括神经细胞、心肌细胞、成骨和软骨细胞及胰腺细胞等。作为干细胞其具有向损伤组织迁移的潜能，此外，研究发现，hAD-MSCs具有免疫调节的特性，能够抑制损伤组织炎症反应。且hAD-MSCs来源丰富，分离周期短，扩增能力强，性状稳定，疗效显著。所具有的这些特性使其在PQ中毒所致的ALI治疗中具有更大的临床应用潜能。

发明内容

本发明发明的目的是提供间充质干细胞制剂在治疗百草枯致急性肺损伤制剂中的应用。

本发明首次发现人羊膜间充质干细胞制剂对百草枯诱导的急性肺损伤具有显著的治疗疗效，人羊膜间充质干细胞制剂可以在百草枯诱导的急性肺损伤方面实现应用。该间充质干细胞来源于产后丢弃物人胎盘组织表面的羊膜层——人羊膜间充质干细胞。

本发明采用人羊膜组织分离出来的间充质干细胞，制备成人羊膜间充质干细胞制剂；以腹膜腔注射百草枯制作急性肺损伤大鼠动物模型，经舌下静脉注射hAD-MSCs制剂。其中，人羊膜间充质干细胞移植所需剂量为约5×10⁶个细胞/kg。

人羊膜间充质干细胞制剂为注射剂，主要由人羊膜间充质干细胞和LG-DMEM组成，细胞浓度至少为5×10⁶个细胞/ml。人羊膜间充质干细胞冷冻保存、复苏使用，其冷冻保存液由20%胎牛血清、10%二甲基亚砜、LG-DMEM和终浓度为10 ng/ml bFGF组成，复苏液由2mML-谷氨酰胺、10%胎牛血清、LG-DMEM和终浓度为10 ng/ml bFGF组成。复苏液悬浮后继续培养扩增或在紧急需要时用生理盐水涮洗后，用LG-DMEM重悬制备成注射液使用。百草枯剂量为30 mg/kg，造模时含20%百草枯的水溶液一次性腹腔内注射。人羊膜间充质干细胞移植时机为造模后4h。

本发明原代人羊膜间充质干细胞按5×10⁵/ml接种最多可达40瓶（25 cm²培养瓶），细胞总数可达1×10⁸个，细胞制剂用无血清的LG-DMEM悬浮，可以使用含20%胎牛血清和10%二甲基亚砜添加到终体积70%的LG-DMEM中细胞冻存液中液氮中冻存，并经复苏后重新悬浮于无血清的LG-DMEM使用，也可以在紧急需要时用生理盐水涮洗后，用LG-DMEM重悬制备成注射液直接使用。经扩增后，3-6代细胞总数最多可达6.4×10⁹个。

本发明采用人羊膜组织分离出来的间充质干细胞，以腹膜腔注射PQ制作急性肺损伤动物模型，经舌下静脉移植hAD-MSCs制剂对急性肺损伤有很好的治疗效果。

本发明比骨髓和脐带来源的间充质干细胞，具有取材容易，扩增能力强，治疗效果佳的优势。

附图说明

图1表示hAD-MSCs生长形态；

图2表示P3代hAD-MSCs的流式细胞术检测（一）；

图3表示P3代hAD-MSCs的流式细胞术检测（二）；

图4表示P3代hAD-MSCs的流式细胞术检测（三）；

图5表示Kaplan-Meier生存分析法；

图6表示肺组织H.E染色；

图7表示肺组织Masson染色；

图8表示肺组织天狼星红染色；

图9表示各组大鼠血清中TGF-β1、HYP浓度（一）；

图10表示各组大鼠血清中IL-10、IL-17浓度（二）。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：

hAD-MSCs的分离、培养与扩增：在无菌条件下，用镊子将羊膜从胎盘上剥离，用含双抗（终浓度为青霉素：100 IU/ml，链霉素：0.1 mg/ml，现配现用）的D-PBS液冲洗一遍后，用不含有双抗的D-PBS液反复冲洗羊膜组织，去除残留的血渍和粘液。剪碎羊膜，加入0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA-2Na溶液，37℃恒温水平摇床（200 rpm/min）消化30 min，200目不锈钢滤网过滤，弃滤液，剩余羊膜组织碎片用D-PBS液冲洗，加入0.75 mg/ml Ⅱ型胶原酶-0.075mg/ml DNaseⅠ消化液，37 ℃、200 rpm/min消化2～3 h，至组织消化完全，200目不锈钢滤网过滤，收集细胞滤液，2400 rpm/min，离心16 min，弃上清，沉淀用含2mM L-谷氨酰胺、10%胎牛血清和终浓度为10 ng/ml bFGF的LG-DMEM培养基混悬，即hAD-MSCs悬液，2%台盼蓝染色检测细胞活力，根据细胞活力接种于25 cm²培养瓶内，细胞密度按按5×10⁵/ml接种，置于37℃、5% CO₂，饱和湿度条件下培养，24 h后更换新培养基，待贴壁细胞融合约80%～90%时，D-PBS液冲洗，加入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA-2Na消化液，37℃孵育1 min，显微镜下观察消化情况，待细胞开始收缩时用含有10%FBS的培养基终止消化，收集细胞并行传代扩增培养，倒置显微镜观察细胞生长情况。

hAD-MSCs的纯度鉴定：取第3代hAD-MSCs，1000 rpm/min离心5 min，弃上清，D-PBS洗涤一次，混悬，调整细胞密度为2.0×10⁶cells/ml。取细胞悬液200 μl按组合方案加10 μl荧光素标记的CD44、CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CD14、CD19、CD80、CD86和HLA-DR抗体震荡混匀，室温避光孵育30 min，每管加入2ml含有0.1%BSA的D-PBS，混匀，1000 rpm/min离心5 min，弃上清，震荡悬浮细胞。每管加入200 μl 1%多聚甲醛，混匀，2～8 ℃避光保存，24小时内用流式细胞仪检测分析。每份样品的采集细胞数均≥2×10⁴个，Cell Quest软件分析。同型对照抗体为相应荧光素标记的小鼠IgG。

急性肺损伤模型制备：SPF级雄性SD大鼠（200±20g）40只，标准饲料喂养，不限饮水，饲养1周后用于实验。实验前12 h禁食，按30 mg/kg 20%百草枯水溶液一次性腹膜腔内注射，随机分为hAD-MSCs移植组（17只）、模型组（15只）和空白对照组（8只）。

hAD-MSCs移植：造模后4 h，经0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA-2Na消化液消化，用LG-DMEM培养基悬浮的hAD-MSCs，制备成200 μl注射剂（含约1×10⁶个细胞），各组大鼠按0.3ml/100g腹膜腔内注射10%水合氯醛溶液麻醉，固定于自制鼠板，暴露大鼠口腔，用镊子将大鼠舌头拉出，将注射器连接采血针，经舌下静脉穿刺，模型组经舌下静脉缓慢注射等量的LG-DMEM培养基，无菌棉球局部压迫、止血，术后予以5%葡萄糖灌胃。

大鼠血清和肺组织标本采集：hAD-MSCs移植7 d后，将各实验组未死亡大鼠10%水合氯醛麻醉，固定于鼠板，剪除大鼠胸腹部鼠毛，碘伏和75%酒精消毒，打开并向两侧牵拉胸腔，暴露心脏，采血针从右心室穿刺采集4 ml静脉血于促凝管中，室温放置10～20 min，待血液凝固，2000 rpm/min，离心20 min，收集上层血清分装于无菌EP管中，-80℃冰箱储存，待测血清中的TGF-β1、HYP、IL-10、IL-17含量。分离肺组织，0.9%生理盐水冲洗，每只大鼠均取右下肺，用10%中性甲醛固定，石蜡包埋后行病理切片，待行H.E、Masson和天狼星红染色。

肺组织病理学检查和移植细胞示踪

①HE染色

A.将石蜡切片放入60 ℃恒温烘箱中约45 min；

B.待烤干后，二甲苯脱蜡，梯度酒精入水；

C.苏木素染色5～10 min，自来水冲洗；

D.1%盐酸酒精分化 1～3 s，自来水冲洗；

E.饱和碳酸锂水溶液返蓝后，1%伊红液染色5～10 min；

F.梯度酒精脱水，二甲苯透明；

G.中性树脂封片，显微镜下观察肺组织结构变化。

②Masson染色

A.将石蜡切片放入60 ℃恒温烘箱中约45 min；

B.待烤干后，二甲苯脱蜡，梯度酒精入水；

C.30～40 ℃温热水漂洗2次，每次60 s；

D.核染液染色60 s，倒丢，冲洗液冲洗30 s；

E.浆染液染色30～60 s，倒丢，冲洗液冲洗30 s;

F.分色液分色6～8 min，弃分色液；

G.复染液染色5 min，倒丢，无水乙醇冲洗干净；

H.待切片干后，中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。

③天狼星红染色

A..二甲苯脱蜡，梯度酒精入水；

B.天狼星红染色液滴染1 h；

C.流水稍冲洗，去除切片表面染液；

D.Mayer苏木素染色液染细胞核8～10 min；

E.流水冲洗10 min；

F.梯度酒精脱水，二甲苯透明；

G.中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。

ELISA检测大鼠血清细胞因子含量

①TGF-β1具体检测步骤如下：

A.冻存血清4 ℃冰箱缓慢解冻，待完全溶解后于室内恢复至室温；

B.TGF-β1标准品按180 ng/L、120 ng/L、60 ng/L、30 ng/L、15 ng/L 5个浓度梯度稀释，以绘制标准曲线；

C.分别于酶标包被板孔中先加样品稀释液40 μl，再加入各组血清10 μl，调零孔加10μl D-PBS，每组均设2个复孔，37℃孵育30 min；

D.洗涤液洗板5次，拍干，每孔加入酶标试剂50 μl，调零孔除外；

E.封板膜封板后37℃孵育30 min；

F.洗涤液洗板5次，拍干，每孔加入显色剂，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min；

G.每孔加入终止液50 μl，终止反应；

H.以调零孔调零，酶标仪检测450 nm波长处各孔吸光度（OD值）。

I.用绘图软件CurveExpert 1.4绘制TGF-β1的标准曲线，并计算出标准曲线的直线回归方程式，计算检测样品的TGF-β1含量。

②大鼠血清HYP、IL-10、IL-17含量检测：

A.冻存血清4 ℃冰箱缓慢解冻，待完全溶解后平衡至室温；

B.HYP、IL-10、IL-17标准品按说明书推荐的5个浓度梯度稀释，以绘制标准曲线；

E.封板膜封板后37℃孵育30 min；

G.每孔加入终止液50 μl，终止反应；

I.用绘图软件CurveExpert 1.4绘制HYP、IL-10、IL-17的标准曲线，并计算出标准曲线的直线回归方程式，计算检测样品的HYP、IL-10、IL-17含量。

统计学方法：实验数据应用SPSS 17.0软件进行统计分析，所有计量数据用均数±标准差（±S）表示，组间比较采用独立样本t检验，大鼠生存率采用Kaplan-Meier生存分析法，α=0.05。

结果：

hAD-MSCs的生长形态和表型特征：

hAD-MSCs具有贴壁生长的特性，原代培养时细胞贴壁较慢，培养3d左右原代细胞可融合80%以上，细胞形态具有多样性，呈多边形、梭形等（图1中A部分）。随着细胞传代纯化培养，hAD-MSCs的形态逐渐呈梭形或纤维样，呈放射样或漩涡样生长（图1中B部分）。

FCM分析表明，第3代hAD-MSCs高表达间充质细胞表面标志CD44，同时还高表达CD73、CD90、CD105，不表达CD14、CD19、CD34、CD45、HLA-DR（图2-图4）等造血干细胞和MHC-Ⅱ类分子等表面标志。

hAD-MSCs移植对急性肺损伤大鼠生存率的影响：

各组大鼠均观察7天，统计记录7天内（包含第7天）各组大鼠死亡数量，以Kaplan-Meier生存分析法比较各组大鼠7天以内的生存率。模型组、移植组和空白对照组大鼠的生存率表1所示。模型组、移植组和空白对照组分别对应表1和图3的1、2和3组，各组大鼠7天内（包括7天）的生存率分别为：1组40.0%、2组76.5%、3组100%（表1）。各组间生存率分别对比可以发现：1组与2组比较，P＜0.05，生存率组间差异有统计学意义；1组与3组比较，P＜0.01，生存率组间有显著差异；2组与3组比较，P＞0.05，生产率无统计学差异（图5）。

hAD-MSCs移植后大鼠肺组织病理学变化：

模型组大鼠肺组织H.E染色（图6，A、B）见肺间质显著增厚，各肺泡之间相互融合，结构明显破坏，原有肺泡结构消失，可见大量肺间质毛细血管扩张，伴有弥漫性肺出血，肺毛细血管周围和肺泡腔可见大量炎性细胞浸润；Masson染色（图7，A、B）显示肺泡腔大量破坏，肺泡间质大量纤维细胞增生，肺泡壁增厚；天狼星红染色（图8，A、B）同样发现大量肺泡原有的结构明显破坏，大量纤维细胞增生，肺间质弥漫性增厚。

移植组大鼠显微镜下也可见部分肺泡结构破坏、融合，少量肺间质毛细血管充血，周围见少量红细胞渗出，肺毛细血管周围和肺泡腔见炎性细胞浸润，但浸润的炎症细胞明显要少于模型组，Masson染色和天狼星红染色可见，少量肺泡壁断裂相互融合，断裂融合的肺泡周围见肺间质轻度纤维细胞增生，肺泡壁增厚，但损伤程度较模型组有显著减轻。

大鼠血清中细胞因子和氨基酸的含量：

ELISA检测结果显示(表2、图9和10)，模型组大鼠血清中纤维化标志性细胞因子TGF-β1含量显著高于hAD-MSCs移植组和空白对照组（P＜0.01，P＜0.01），而后两组之间TGF-β1含量无显著性差异（P＞0.05）；模型组中胶原纤维中的主要成分HYP含量较hAD-MSCs移植组和空白对照组，均升高（P＜0.05，P＜0.05），而hAD-MSCs移植组仍高于空白对照组（P＜0.05）；血清中IL-10含量，hAD-MSCs移植组和空白对照组显著低于模型组（P＜0.01，P＜0.01），hAD-MSCs移植组也低于空白对照组（P＜0.01）；hAD-MSCs移植组和空白对照组IL-17含量均高于模型组（P＜0.05，P＜0.01），前两组血清中IL-17含量无显著性差异（P＞0.05）。

当然，以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。

Claims

1.间充质干细胞在制备治疗急性肺损伤制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞在制备治疗急性肺损伤制剂中的应用，其特征在于：间充质干细胞来源于产后丢弃物人胎盘组织表面的羊膜层——人羊膜间充质干细胞。

3.根据权利要求1所述的间充质干细胞在制备治疗急性肺损伤制剂中的应用，其特征在于：采用人羊膜组织分离出来的间充质干细胞，制备成人羊膜间充质干细胞制剂；以腹膜腔注射百草枯制作急性肺损伤大鼠动物模型，经舌下静脉注射hAD-MSCs制剂。

4.根据权利要求3所述的间充质干细胞在制备治疗急性肺损伤制剂中的应用，其特征在于：人羊膜间充质干细胞移植所需剂量为约5×10⁶个细胞/kg。

5.根据权利要求3所述的间充质干细胞在制备治疗急性肺损伤制剂中的应用，其特征在于：人羊膜间充质干细胞制剂为注射剂，由人羊膜间充质干细胞和LG-DMEM组成，细胞浓度至少为5×10⁶个细胞/ml。

6.根据权利要求3所述的间充质干细胞在制备治疗急性肺损伤制剂中的应用，其特征在于：人羊膜间充质干细胞冷冻保存、复苏使用，其冷冻保存液由20%胎牛血清、10%二甲基亚砜、LG-DMEM和终浓度为10 ng/ml bFGF组成，复苏液由2mM L-谷氨酰胺、10%胎牛血清、LG-DMEM和终浓度为10 ng/ml bFGF组成。

7.根据权利要求6所述的间充质干细胞在制备治疗急性肺损伤制剂中的应用，其特征在于：复苏液悬浮后继续培养扩增或在紧急需要时用生理盐水涮洗后，用LG-DMEM重悬制备成注射液使用。

8.根据权利要求3所述的间充质干细胞在制备治疗急性肺损伤制剂中的应用，其特征在于：百草枯剂量为30 mg/kg，造模时含20%百草枯的水溶液一次性腹腔内注射。

9.根据权利要求3所述的间充质干细胞在制备治疗急性肺损伤制剂中的应用，其特征在于：人羊膜间充质干细胞移植时机为造模后4h。