BR112020019773A2

BR112020019773A2 - células-tronco/progenitoras das glândulas duodenais de brunner, métodos de isolamento e seus usos

Info

Publication number: BR112020019773A2
Application number: BR112020019773-4A
Authority: BR
Inventors: Guido Carpino; Vincenzo Cardinale; Lola M. Reid; Domenico Alvaro; Eugenio Gaudio
Original assignee: The University Of North Carolina At Chapel Hill; Sapienza Universita Di Roma
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2019-03-28
Publication date: 2021-02-17
Also published as: IL311366A; AU2019242887A1; MX2020010223A; AR115304A1; IL277552A; KR20200140836A; CN112272698A; EP3781181A4; EP3781181A1; JP2021519585A; SG11202009428YA; CA3112650A1; IL277552B1; PH12020551584A1; WO2019191402A1; US20190300849A1; TW202002997A

Abstract

CÉLULAS-TRONCO/PROGENITORAS DAS GLÂNDULAS DUODENAIS DE BRUNNER, MÉTODOS DE ISOLAMENTO E SEUS USOS. São divulgadas aqui células-tronco / progenitoras da glândula de Brunner (BGSCs) com traços fenotípicos de células-tronco endodérmicas e positivas para marcadores de pluripotência e métodos de isolá-las do duodeno humano. Além disso, a presente divulgação prevê que BGSCs são facilmente isoladas do duodeno de doadores humanos, podem ser expandidas em cultura ou induzidas para se diferenciar em linhagens hepáticas e pancreáticas e podem representar uma fonte de células para programas clínicos de medicina regenerativa.

Description

CÉLULAS-TRONCO/PROGENITORAS DAS GLÂNDULAS DUODENAIS DE BRUNNER, MÉTODOS DE ISOLAMENTO E SEUS USOS REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDOS DE PATENTES RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório US 62/650,208, depositado em 29 de março de 2018, incorporado aqui em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Vários nichos de células-tronco/progenitoras persistem em localizações anatômicas específicas dentro da árvore biliar humana fetal e pós-natal. Embora as populações de células-tronco/progenitoras tenham sido reconhecidas há muito tempo em tecidos fetais, sua persistência em tecidos adultos é recentemente reconhecida. Os elementos glandulares, glândulas peribiliares (PBGs), com paralelos às criptas intestinais, estão localizados nos dutos biliares extra-hepáticos, nos grandes dutos biliares intra-hepáticos e no duto comum hepato-pancreático; células- tronco/progenitoras de estágio posterior e derivadas daquelas em PBGs são encontradas dentro da vesícula biliar. A rede continua desde o tronco / progenitores nas PBGs do duto comum hepato-pancreático até os progenitores comprometidos nas glândulas do duto pancreático (PDGs) dentro do pâncreas. As células-tronco / progenitoras em todos esses nichos são denominadas coletivamente Células- tronco/progenitoras da árvore biliar (BTSCs). BTSCs dentro de PBGs têm características de células-tronco/progenitoras endodérmicas, incluindo capacidades proliferativas, auto- renovação e multipotência; elas têm características de progenitores em PDGs que incluem capacidades proliferativas e multipotência, mas menos capacidade autorreplicativa do que as células-tronco/progenitoras em PBGs.

[003] BTSCs localizados ao nível da ampola hepato- pancreática são primitivos, co-expressam vários marcadores de pluripotência (por exemplo, OCT4, SOX2, NANOG), podem se auto-renovar ou se diferenciar em hepatócitos funcionais, colangiócitos e ilhotas pancreáticas (se eles também podem dar origem às células acinares está sendo considerado em estudos em andamento). Nichos contendo BTSCs se estendem até o fígado e o pâncreas. Estudos anatômicos detalhados em humanos revelaram um eixo proximal-distal para a organização do nicho BTSC que vai do sítio proximal, a ampola hepato- pancreática, onde as células-tronco mais primitivas estão localizadas, até o sítio distal, o fígado ou o pâncreas, onde células maduras são encontradas. Este eixo recapitula a organogênese desses órgãos e reflete sua origem embriológica comum. Na verdade, do ponto de vista embriológico, os precursores comuns do fígado, sistema de ducto biliar e pâncreas existem em estágios iniciais de desenvolvimento na endoderme ventral definitiva que forma o intestino anterior. Neste estágio de desenvolvimento, o duodeno primitivo abriga células-tronco/progenitoras endodérmicas ventrais.

[004] As células-tronco/progenitores mais primitivas identificadas são aqueles encontradas nas glândulas de Brunner, localizadas dentro da submucosa do duodeno. Essas células podem ser o ponto de partida de toda a rede de nichos-tronco / progenitores que dão origem ao fígado e ao pâncreas. O isolamento dessas células de duodenos adultos tem sido difícil e não foi alcançado por métodos divulgados no estado da técnica até o momento. O significado prático dessas células é múltiplo. Por exemplo, essas células podem ser usadas para avaliações in vitro dos efeitos dos fármacos e para a geração de sistemas modelo (por exemplo, organoides) para análises do desenvolvimento, função, manutenção e / ou reparo do fígado e do pâncreas (dado que estes contêm os precursores de ambos órgãos) para outros testes clínicos ou analíticos pertinentes ao fígado, pâncreas e outro tecido endodérmico, e para diagnóstico ou tratamento de doenças ou condições envolvendo ou afetando o fígado, pâncreas e / ou outro tecido endodérmico. As células das glândulas de Brunner são únicas entre as fontes de células-tronco endodérmicas / progenitoras por estarem em um local, o duodeno, acessível por endoscopia e, portanto, úteis para obtenção de células-tronco/progenitoras para terapias de células autólogas ou heterólogas ou terapias genéticas. Além disso, os tumores derivados dessas glândulas de Brunner são alvos lógicos para várias formas de terapias contra o câncer. Assim, permanece uma necessidade na técnica de desenvolver métodos para isolar as células de interesse, conhecidos como "células-tronco/progenitoras da glândula de Brunner".

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a uma célula-tronco / progenitora isolada de um duodeno (referida como uma célula-tronco / progenitora da glândula de Brunner ou BGSC), que expressa um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em Tra-l-60, Tra-l-8l,

OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9 e citoqueratina 7 (CK7) e que é ainda caracterizado como capaz de proliferação, com diferenciação limitada ou mínima, em condições de cultura que suportam a autorrenovação.

[006] Em outro aspecto, a presente divulgação se refere a uma célula-tronco / progenitora isolada de um duodeno (referida como uma célula-tronco / progenitora da glândula de Brunner ou BGSC), que expressa um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em Lgr5, NIS, CD44 e CK19 e que é ainda caracterizado como capaz de proliferação, com diferenciação limitada ou mínima, em condições de cultura que suportam a autorrenovação.

[007] Em outro aspecto, a presente divulgação se refere a uma célula-tronco / progenitora isolada de um duodeno (referida como uma célula-tronco / progenitora da glândula de Brunner ou BGSC), que expressa SOX17 e PDX1 e que é ainda caracterizada como capaz de proliferação, com diferenciação limitada ou mínima, em condições de cultura que apoiam a auto-renovação.

[008] Em outro aspecto, a presente divulgação se refere a uma célula-tronco / progenitora isolada de um duodeno (referida como uma célula-tronco / progenitora da glândula de Brunner ou BGSC), que expressa um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em Tra-l-60, Tra-l-8l, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44 e CK19, ou que expressa SOX17 e PDX1, e que é ainda caracterizado como capaz de proliferação, com limitação ou diferenciação mínima, em condições de cultura que apoiam a auto-renovação.

[009] Em algumas concretizações, a BGSC é substancialmente livre de patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos. Em algumas concretizações, a BGSC pode ser proliferado, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos um mês. Em algumas concretizações, a BGSC pode ser proliferado, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos dois meses. Em algumas concretizações, a BGSC pode ser proliferado, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos seis meses. Em algumas concretizações, a BGSC pode ser proliferado, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos doze meses.

[0010] Em algumas concretizações, as condições de cultura que suportam a autorrenovação da BGSC compreendem um meio sem soro, opcionalmente Meio de Kubota. Em algumas concretizações, as condições de cultura que suportam a autorrenovação compreendem um meio contendo soro.

[0011] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a uma população de células-tronco/progenitoras isoladas do duodeno, na qual pelo menos algumas ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste de Tra-l-60, Tra-l-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9 e CK7.

[0012] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a uma população de células-tronco/progenitoras isoladas do duodeno, na qual pelo menos algumas ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste de Lgr5, NIS, CD44 e CK19.

[0013] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a uma população de células-tronco/progenitoras isoladas do duodeno, na qual pelo menos algumas ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam SOX17 e PDX1.

[0014] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a uma população de células-tronco/progenitoras isoladas do duodeno, na qual pelo menos algumas ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste de Tra-l-60, Tra-l-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44 e CK19, ou em que pelo menos alguns ou uma parte substancial de, ou a maioria de as células expressam SOX17 e PDX1.

[0015] Em algumas concretizações, a população de células-tronco/progenitoras é substancialmente livre de patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos.

[0016] Em algumas concretizações, a população de células-tronco/progenitoras pode ser proliferada, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos um mês. Em algumas concretizações, a população de células- tronco/progenitoras pode ser proliferada, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos dois meses. Em algumas concretizações, a população de células-tronco/progenitoras pode ser proliferada, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos seis meses. Em algumas concretizações, a população de células-tronco/progenitoras pode ser proliferada, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos doze meses.

[0017] Em algumas concretizações, as condições de cultura que suportam a autorrenovação da população de células-tronco/progenitoras compreendem um meio sem soro, opcionalmente Meio de Kubota. Em algumas concretizações, as condições de cultura que suportam a autorrenovação da população de células-tronco/progenitoras compreendem um meio contendo soro.

[0018] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a um método de isolamento de um ou mais BGSCs, ou a uma população de BGSCs de um duodeno de um sujeito, uma porção do mesmo ou uma amostra retirada do mesmo, compreendendo: (a) contatar uma camada mucosa de um duodeno, que está substancialmente livre de muco intestinal, com um meio ou solução com propriedades de osmolalidade fora de uma faixa fisiológica sob condições que induzem choque osmótico às células da camada mucosa; (b) remover ou dissolver pelo menos uma porção da camada mucosa ou das células desta por métodos mecânicos, cirúrgicos e / ou químicos, deixando e / ou expondo um restante que pode incluir uma camada submucosa; (c) digerir ou dissociar o restante; e (d) isolar um ou mais BGSC ou a população de BGSC do restante digerido.

[0019] Em algumas concretizações, a etapa de isolamento compreende isolar BGSCs que expressam, ou uma população de BGSCs em que pelo menos algumas, ou uma parte substancial de, ou a maioria das células expressam, um ou mais marcadores selecionados do grupo Tra-l-60, Tra-l-8l, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44 e CK19.

[0020] Em algumas concretizações, a etapa de isolamento compreende isolar BGSCs, que expressam, ou uma população de BGSCs em que pelo menos algumas ou uma parte substancial de, ou a maioria das células expressam, SOX17 e PDX1.

[0021] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a um método de isolamento de um ou mais BGSCs, ou a população de BGSCs de um duodeno de um sujeito, uma porção do mesmo ou uma amostra retirada do mesmo, compreendendo as seguintes etapas, nas quais a etapa para matar, inativar ou remover substancialmente patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos pode ser realizada a qualquer momento ou mais de uma vez: (a) remoção do muco intestinal; (b) aplicar um meio ou solução com propriedades de osmolalidade fora de uma faixa fisiológica em condições sob condições que induzem choque osmótico nas células da camada mucosa; (c) remover ou dissolver pelo menos uma porção da camada mucosa ou das células desta por métodos mecânicos, cirúrgicos e / ou químicos, deixando e / ou expondo um resto que pode incluir uma camada submucosa; (d) aplicar à camada mucosa e / ou ao restante um meio ou solução para matar, inativar ou remover substancialmente patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos; (e) aplicar digestão ou dissociação à camada submucosa para produzir uma digestão, material celular dissociado ou uma suspensão de células; (f) opcionalmente cultivar pelo menos parte do material digerido, celular dissociado ou células da suspensão celular; e (g) isolar aquelas células que expressam, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam, um ou mais de Tra-l-60, Tra-l-8l, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19; e / ou as células que expressam SOX17 e PDX1.

[0022] Em algumas concretizações, a remoção do muco intestinal compreende apertar o tecido duodeno.

[0023] Em algumas concretizações, o meio ou solução com propriedades de osmolalidade fora de uma faixa fisiológica compreende uma solução hipotônica, hipoosmótica, hipertônica ou hiperosmótica.

[0024] Em algumas concretizações, o meio ou solução com propriedades de osmolalidade fora de uma faixa fisiológica compreende uma solução de glicose, uma solução com alto teor de sal ou água destilada.

[0025] Em algumas concretizações, a remoção é realizada por ruptura química que compreende o uso de um emulsificante e / ou detergente.

[0026] Em algumas concretizações, o detergente e / ou emulsificante está em água, solução salina e / ou um tampão.

[0027] Em algumas concretizações, o detergente e / ou emulsificante é aplicado por um breve período (menos de 15 minutos).

[0028] Em algumas concretizações, o emulsificante é selecionado a partir de um grupo que compreende lecitina, monolaurato de polioxietileno sorbitano (polissorbato 20),

monooleato de polioxietileno sorbitano (polissorbato 80), monopalmitato de polioxietileno sorbitano (polisorbato 40), polioxietileno sorbitano monostearato de polioxietileno (polisorbitano monostearato de sorbitano) Polissorbato 65), Fosfatídeos de Amônio, Sais de Sódio, Potássio e Cálcio de Ácidos Graxos, Sais de Magnésio de Ácidos Graxos, Mono e Diglicerídeos de Ácidos Graxos, Ésteres de Ácido Acético de Mono e Diglicerídeos de Ácidos Graxos, Ésteres de Ácido Lático de Mono e Diglicerídeos de ácidos graxos, ésteres de ácido cítrico de mono e diglicerídeos de ácidos graxos, ésteres de ácido mono- e diacetil tartárico de mono e diglicerídeos de ácidos graxos, ésteres de ácido tartárico e acético misto de mono- e diglicerídeos de ácidos graxos,Ésteres de sacarose de ácidos graxos, sucroglicerídeos, ésteres de poliglicerol de ácidos graxos, poliglicerol Poliricinoleato, propano-1, 2-Diol ésteres de ácidos graxos, óleo de soja termicamente oxidado que interage com mono- e diglicerídeos de ácidos graxos, estearoil-sódio Lactilato, Estearoil-2-Lactilato de Cálcio, Monoestearato de Sorbitano, Triestearato de Sorbitano, Monolaurato de Sorbitano, Monooleato de Sorbitano, Monopalmitato de Sorbitano e suas combinações.Monopalmitato de sorbitano e suas combinações.Monopalmitato de sorbitano e suas combinações.

[0029] Em algumas concretizações, o detergente é selecionado de um grupo que compreende ácido l- heptanossulfônico; N-Laurilsarcosina, Lauril Sulfato, 1 - Octano Sulfônico Ácido e Ácido Taurocólico, Cloreto de Benzalcônio, Cetilpiridínio, Cloreto de Metilbenzetônio,

Brometo de Decametônio, Alquil Betainas, Alquil Amidoalquil Betainas, N-Dodecmonil-Nodecmonil-Dimetil, Propanossulfonato, Fosfatidilcolina, N-Decil AD- Glucopiranosídeo, N-Decil AD-Maltopiranosídeo, N-Dodecil BD- Maltosídeo, N-Octil BD-Glucopiranosídeo, N-Tetradecil BD- Maltosídeo, Tritons (Triton X-100), Nonidet -40, Poloxamer 188, Lauril Sulfato de Sódio, Desoxicolato de Sódio, Dodecil Sulfato de Sódio e suas combinações.

[0030] Em algumas concretizações, o restante compreende uma camada submucosa.

[0031] Em algumas concretizações, a digestão ou dissociação é realizada enzimaticamente.

[0032] Em algumas concretizações, o meio ou solução para matar substancialmente, inativar ou remover patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos compreende uma solução aquosa de hipoclorito de sódio (NaClO) ou qualquer solução (ões) ou agente (s) utilizado (s) para desinfecção de pele ou superfícies.

[0033] Em algumas concretizações, a aplicação de um meio ou solução para matar, inativar ou remover substancialmente patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos ocorre antes da aplicação do detergente e / ou emulsificante, ou ocorre após a digestão ou dissociação, ou ocorre após a remoção do muco.

[0034] Em algumas concretizações, a amostra de tecido é picada antes da etapa de digestão ou dissociação.

[0035] Em algumas concretizações, a etapa de digestão ou dissociação e / ou a etapa de isolamento é realizada em placas de baixa fixação.

[0036] Em algumas concretizações, a etapa de isolamento é realizada usando seleção de cultura com condições de cultura que compreendem um meio sem soro, opcionalmente, Meio de Kubota.

[0037] Em algumas concretizações, a etapa de isolamento é realizada usando seleção de cultura com condições de cultura que compreendem um meio contendo soro.

[0038] Em algumas concretizações, as células isoladas são cultivadas em condições que suportam ou produzem esferoides, um ou mais organoides, aglomerados de células ou agregados de células.

[0039] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a um esferoide, organoide, agregado celular ou grupo de células produzido por cultura de BGSCs ou a população de BGSCs em uma placa de baixa fixação.

[0040] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a um esferoide, organoide, agregado celular ou grupo de células produzido por cultura de BGSCs ou a população de BGSCs em suspensão ou condições de cultura 3D.

[0041] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a um método de tratamento de um sujeito diagnosticado com uma doença ou condição envolvendo ou afetando o fígado, pâncreas, estômago, intestino ou outro tecido endodérmico, compreendendo a administração a um sujeito em necessidade de uma quantidade eficaz de BGSCs ou uma população de BGSCs.

[0042] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a um método de tratamento de um sujeito diagnosticado com uma doença ou condição envolvendo ou afetando o fígado, pâncreas, estômago, intestino ou outro tecido endodérmico que compreende a administração de uma quantidade eficaz das BGSCs.

[0043] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a um método de tratamento de um sujeito diagnosticado com uma doença ou condição envolvendo ou afetando o fígado, pâncreas, estômago, intestino ou outro tecido endodérmico que compreende a administração de uma quantidade eficaz da população de BGSCs.

[0044] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a um método de célula autóloga ou terapia gênica que compreende a administração de um número eficaz de BGSCs, ou população de BGSCs.

[0045] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a um método de célula alogênica ou terapia gênica que compreende a administração de um número eficaz de BGSCs ou população de BGSCs.

[0046] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a um método de tratamento de um sujeito diagnosticado com uma doença ou condição envolvendo ou afetando o fígado, pâncreas, estômago, intestino ou outro tecido endodérmico, compreendendo a administração a um sujeito em necessidade de uma quantidade eficaz de BGSCs ou uma população de BGSCs, em que as células são células geneticamente concebidas ou modificadas.

[0047] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a um método de tratamento de um sujeito diagnosticado com uma doença ou condição envolvendo ou afetando o fígado, pâncreas, estômago, intestino ou outro tecido endodérmico compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de

BGSCs, em que o as células são células geneticamente concebidas ou modificadas.

[0048] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a um método de tratamento de um sujeito diagnosticado com uma doença ou condição envolvendo ou afetando o fígado, pâncreas, estômago, intestino ou outro tecido endodérmico compreendendo a administração de uma quantidade eficaz da população de BGSCs, em que as células são células geneticamente concebidas ou modificadas.

[0049] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a um método de célula autóloga ou terapia gênica que compreende a administração de um número eficaz de BGSCs, ou população de BGSCs, em que as células são geneticamente concebidas ou células modificadas.

[0050] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a um método de célula alogênica ou terapia gênica que compreende a administração de um número eficaz de BGSCs, ou população de BGSCs, em que as células são células geneticamente concebidas ou modificadas.

[0051] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a um uso das células de BGSCs para o tratamento de uma doença ou condição envolvendo ou afetando o fígado, pâncreas, estômago, intestino ou outro tecido endodérmico para células autólogas ou alogênicas ou terapia genética para um ser humano e / ou um animal.

[0052] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a um uso das células de BGSCs para o tratamento de uma doença ou condição envolvendo ou afetando o fígado, pâncreas, estômago, intestino ou outro tecido endodérmico para células autólogas ou alogênicas ou terapia genética para um ser humano e / ou um animal, no qual as células são geneticamente concebidas ou modificadas.

[0053] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a um uso da população da população de BGSCs para o tratamento de uma doença ou condição envolvendo ou afetando o fígado, pâncreas, estômago, intestino ou outro tecido endodérmico, para células autólogas ou alogênicas ou terapia genética para um humano e / ou animal.

[0054] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a um uso da população da população de BGSCs para o tratamento de uma doença ou condição envolvendo ou afetando o fígado, pâncreas, estômago, intestino ou outro tecido endodérmico, para células autólogas ou alogênicas ou terapia genética para um humano e / ou animal, no qual as células são geneticamente concebidas ou modificadas.

[0055] Em algumas concretizações, o esferoide, organoide, agregado celular ou grupo de células, compreendendo ainda condições de cultura que são capazes de diferenciar BGSCs, ou a população de BGSCs, em células de estágios de linhagem posteriores, incluindo células maduras.

[0056] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a um método de isolamento de células-tronco/progenitoras da glândula de Brunner (BGSCs), ou a população de BGSCs, de um duodeno de um sujeito, uma porção do mesmo ou uma amostra retirada do mesmo, compreendendo: (a) digerir ou dissociar um duodeno, uma porção do mesmo, ou uma amostra retirada do mesmo para fornecer um material celular digerido ou dissociado;

(b) obter o material celular digerido ou dissociado: (i) as células que expressam, ou uma população de células em que pelo menos algumas, uma porção substancial ou a maioria das células expressam, um ou mais de Tra-l-60, Tra-l-8l, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44 e CK19; e / ou (ii) aquelas células que expressam, ou uma população de células em que pelo menos algumas, uma porção substancial ou a maioria das células expressam, tanto SOX17 quanto PDX1.

[0057] Em algumas concretizações, o duodeno, uma porção do mesmo, uma amostra retirada do mesmo, o material celular dissociado ou digerido ou combinações dos mesmos, são colocados em contato com um meio ou solução para matar, inativar ou remover substancialmente patógenos e / ou patogênicos e / ou micróbios benéficos.

[0058] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a um método de isolamento de uma ou mais células multipotentes que expressam um ou mais biomarcadores desejados, ou uma população de células em que pelo menos algumas ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais biomarcadores desejados, a partir de um tecido (ou porção ou amostra do mesmo) tendo uma camada mucosa e uma camada submucosa, compreendendo as seguintes etapas, que podem ocorrer na seguinte sequência ou, em outras concretizações, podem ocorrer em uma sequência diferente: (a) contatar uma camada mucosa de um tecido tendo uma camada mucosa e uma camada submucosa com um meio ou solução tendo propriedades de osmolalidade que caem fora de uma faixa fisiológica sob condições que induzem choque osmótico para as células da camada mucosa; (b) remover ou dissolver pelo menos uma porção da camada mucosa ou das células desta por métodos mecânicos, cirúrgicos e / ou químicos, deixando e / ou expondo um restante, que pode incluir uma camada submucosa; (c) contatar o restante com um meio ou solução para matar, inativar ou remover substancialmente patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos; (d) digerir ou dissociar o restante; (e) isolar uma ou mais células multipotentes, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais biomarcadores desejados.

[0059] Em algumas concretizações, o método de isolamento de uma ou mais células multipotentes que expressam um ou mais biomarcadores desejados, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais biomarcadores desejados, de um tecido (ou porção ou amostra do mesmo) tendo uma camada mucosa e uma camada submucosa, compreendendo ainda a remoção do muco superficial.

[0060] Em algumas concretizações, o método de isolamento de uma ou mais células multipotentes que expressam um ou mais biomarcadores desejados, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais biomarcadores desejados, a partir de um tecido (ou porção ou amostra do mesmo) tendo uma camada mucosa e uma camada submucosa, em que o meio ou solução com propriedades de osmolalidade fora de uma faixa fisiológica compreende uma solução hipotônica, hiposmótica, hipertônica ou hiperosmótica.

[0061] Em algumas concretizações, o método de isolamento de uma ou mais células multipotentes que expressam um ou mais biomarcadores desejados, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais biomarcadores desejados, a partir de um tecido (ou porção ou amostra do mesmo) tendo uma camada mucosa e uma camada submucosa, o meio ou solução com propriedades de osmolalidade fora de uma faixa fisiológica compreende uma solução de glicose, uma solução com alto teor de sal ou água destilada.

[0062] Em algumas concretizações, o método de isolamento de uma ou mais células multipotentes que expressam um ou mais biomarcadores desejados, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais biomarcadores desejados, a partir de um tecido (ou porção ou amostra do mesmo) possuindo uma camada mucosa e uma camada submucosa, a remoção é realizada por rompimento químico, que compreende a utilização de um emulsionante e / ou detergente.

[0063] Em algumas concretizações, o método de isolamento de uma ou mais células multipotentes que expressam um ou mais biomarcadores desejados, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais biomarcadores desejados, a partir de um tecido (ou porção ou amostra do mesmo) tendo uma camada mucosa e uma camada submucosa, o detergente e / ou emulsionante está em água, solução salina e / ou um tampão.

[0064] Em algumas concretizações, o método de isolamento de uma ou mais células multipotentes que expressam um ou mais biomarcadores desejados, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais biomarcadores desejados, a partir de um tecido (ou porção ou amostra do mesmo) possuindo uma camada mucosa e uma camada submucosa, o detergente e / ou emulsificante é aplicado por um breve período (menos de 15 minutos).

[0065] Em algumas concretizações, o método de isolamento de uma ou mais células multipotentes que expressam um ou mais biomarcadores desejados, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais biomarcadores desejados, a partir de um tecido (ou porção ou amostra do mesmo) tendo uma camada mucosa e uma camada submucosa, o emulsificante é selecionado a partir de um grupo que compreende lecitina, monolaurato de polioxietileno sorbitano (polissorbato 20), monooleato de polioxietileno sorbitano (polissorbato 80), monopalmitato de polioxietileno sorbitano 40), Monoestearato de Polioxietileno Sorbitano (Polissorbato 60), Triestearato de Polioxietileno Sorbitano (Polissorbato 65), Fosfatídeos de Amônio, Sais de Sódio, Potássio e Cálcio de ácidos Graxos, Sais de Magnésio de Ácidos Graxos, Mono e Diglicerídeos de Ácidos Graxos, Ésteres de ácido acético de mono- e diglicerídeos de ácidos graxos,

ésteres de ácido láctico de mono e diglicerídeos de ácidos graxos, ésteres de ácido cítrico de mono- e diglicerídeos de ácidos graxos, ésteres de ácido mono- e diacetil tartárico de mono- e diglicerídeos de ácidos graxos Ácidos, ésteres de ácido tartárico e acético misto de mono- e diglicerídeos de ácidos graxos, ésteres de sacarose de ácidos graxos, sucroglicerídeos, ésteres de poliglicerol de ácidos graxos, poliglicerol poliricinoleato, propanol, 2-dióis ésteres de ácidos graxos, soja termicamente oxidada Óleo que interage com mono- e diglicerídeos de ácidos graxos, estearoil-2- lactilato de sódio, estearoil-2-lactilato de cálcio, monostearato de sorbitano, triestearato de sorbitano, monolaurato de sorbitano, monooleato de sorbitano e monopalmitato de sorbitano..

[0066] Em algumas concretizações, o método de isolamento de uma ou mais células multipotentes que expressam um ou mais biomarcadores desejados, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais biomarcadores desejados, a partir de um tecido (ou porção ou amostra do mesmo) tendo uma camada mucosa e uma camada submucosa, o detergente é selecionado a partir de um grupo que compreende ácido l-heptanossulfônico; N- Laurilsarcosina, Lauril Sulfato, 1 -Octano Sulfônico Ácido e Ácido Taurocólico, Cloreto de Benzalcônio, Cetilpiridínio, Cloreto de Metilbenzetônio, Brometo de Decametônio, Alquil Betainas, Alquil Amidoalquil Betainas, N-Dodecmonil-l- Nodecmonil-Dimetil, Propanossulfonato, Fosfatidilcolina, N- Decil AD-Glucopiranosídeo, N-Decil AD-Maltopiranosídeo, N-

Dodecil BD-Maltosídeo, N-Octil BD-Glucopiranosídeo, N- Tetradecil BD-Maltosídeo, Tritons (Triton X-100), Nonidet- P-40, Poloxâmero 188, Lauril Sulfato de sódio, Deoxicolato sódico, e lauril Dodecil de sódio.

[0067] Em algumas concretizações, o método de isolamento de uma ou mais células multipotentes que expressam um ou mais biomarcadores desejados, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais biomarcadores desejados, a partir de um tecido (ou porção ou amostra do mesmo) tendo uma camada mucosa e uma camada submucosa, o meio ou solução para matar substancialmente, inativar ou remover patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos compreende uma solução aquosa de hipoclorito de sódio (NaClO) ou qualquer solução (ões) ou agente (s) usado (s) para desinfecção da pele ou superfícies.

[0068] Em algumas concretizações, o método de isolamento de uma ou mais células multipotentes que expressam um ou mais biomarcadores desejados, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais biomarcadores desejados, a partir de um tecido (ou porção ou amostra do mesmo) tendo uma camada mucosa e uma camada submucosa, a aplicação de um meio ou solução para matar, inativar ou remover substancialmente patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos ocorre antes da aplicação do detergente e / ou emulsionante, ou ocorre após a digestão ou dissociação, ou ocorre após a remoção do muco.

[0069] Em algumas concretizações, o método de isolamento de uma ou mais células multipotentes que expressam um ou mais biomarcadores desejados, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais biomarcadores desejados, de um tecido (ou porção ou amostra do mesmo) tendo uma camada mucosa e uma camada submucosa, o restante compreende uma camada submucosa.

[0070] Em algumas concretizações, o método de isolamento de uma ou mais células multipotentes que expressam um ou mais biomarcadores desejados, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais biomarcadores desejados, a partir de um tecido (ou porção ou amostra do mesmo) tendo uma camada mucosa e uma camada submucosa, a digestão ou dissociação é realizada enzimaticamente.

[0071] Em algumas concretizações, o método de isolamento de uma ou mais células multipotentes que expressam um ou mais biomarcadores desejados, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais biomarcadores desejados, de um tecido (ou porção ou amostra do mesmo) tendo uma camada mucosa e uma camada submucosa, a amostra de tecido é picada antes da etapa de digestão ou dissociação.

[0072] Em algumas concretizações, o método de isolamento de uma ou mais células multipotentes que expressam um ou mais biomarcadores desejados, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais biomarcadores desejados, a partir de um tecido (ou porção ou amostra do mesmo) tendo uma camada mucosa e uma camada submucosa, a digestão ou dissociação quebra o tecido submucoso em uma suspensão celular, mistura de células, aglomerados, aglomerados ou agregados e / ou fragmentos de tecido.

[0073] Em algumas concretizações, o método de isolamento de uma ou mais células multipotentes que expressam um ou mais biomarcadores desejados, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais biomarcadores desejados, a partir de um tecido (ou porção ou amostra do mesmo) tendo uma camada mucosa e uma camada submucosa, a etapa de isolamento é realizada usando seleção de cultura com condições de cultura compreendendo um meio sem soro, opcionalmente, Meio de Kubota.

[0074] Em algumas concretizações, o método de isolamento de uma ou mais células multipotentes que expressam um ou mais biomarcadores desejados, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais biomarcadores desejados, a partir de um tecido (ou porção ou amostra do mesmo) tendo uma camada mucosa e uma camada submucosa, a etapa de isolamento é realizada usando seleção de cultura com condições de cultura compreendendo um meio contendo soro.

[0075] Em algumas concretizações, o método de isolamento de uma ou mais células multipotentes que expressam um ou mais biomarcadores desejados, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais biomarcadores desejados, a partir de um tecido (ou porção ou amostra do mesmo) tendo uma camada mucosa e uma camada submucosa, a etapa de isolamento é realizada em placas de fixação baixas.

[0076] Em algumas concretizações, o método de isolamento de uma ou mais células multipotentes que expressam um ou mais biomarcadores desejados, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais biomarcadores desejados, a partir de um tecido (ou porção ou amostra do mesmo) tendo uma camada mucosa e uma camada submucosa, as células isoladas ou população de células são cultivadas sob condições que suportam ou produzem esferoides, um ou mais organoides, aglomerados de células ou agregados de células

[0077] Em algumas concretizações, o método de isolamento de uma ou mais células multipotentes que expressam um ou mais biomarcadores desejados, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais biomarcadores desejados, a partir de um tecido (ou porção ou amostra do mesmo) tendo uma camada mucosa e uma camada submucosa, compreende ainda uma ou mais etapas de lavagem usando um meio fisiologicamente aceitável.

[0078] Em algumas concretizações, o método de isolamento de uma ou mais células multipotentes que expressam um ou mais biomarcadores desejados, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais biomarcadores desejados, de um tecido (ou porção ou amostra do mesmo) tendo uma camada mucosa e uma camada submucosa, na qual o tecido é um tecido endodérmico.

[0079] Em algumas concretizações, o método de isolamento de uma ou mais células multipotentes que expressam um ou mais biomarcadores desejados, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais biomarcadores desejados, a partir de um tecido (ou porção ou amostra do mesmo) tendo uma camada mucosa e uma camada submucosa, em que o tecido é selecionado a partir de um grupo que compreende traqueia, brônquio principal, esôfago, estômago, duodeno, intestino delgado, intestino grosso e reto.

[0080] Em algumas concretizações, o método de isolamento de uma ou mais células multipotentes que expressam um ou mais biomarcadores desejados, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais biomarcadores desejados, a partir de um tecido (ou porção ou amostra do mesmo) tendo uma camada mucosa e uma camada submucosa, em que o tecido é selecionado a partir de um grupo que compreende fígado, pâncreas, vesícula biliar e dutos da árvore biliar, em que os dutos da árvore biliar compreendem dutos comuns e císticos dutos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0081] A FIG. 1 representa A) Duodeno humano corado com Ácido Periódico-Schiff (PAS). A mucosa duodenal é elevada em vilosidades intestinais e dobrada em criptas intestinais (pontas de seta). A submucosa (SM) está repleta de PAS +elementos glandulares (glândulas de Brunner: BGs, linha pontilhada). BGs estão em continuidade anatômica com criptas intestinais através da mucosa muscolaris (MM). Poucos ácinos BG estão localizados dentro da lâmina própria da mucosa e estão em continuidade com as criptas intestinais (setas na imagem à direita). B) Imunohistoquímica para citoqueratina 7 (CK7) no duodeno humano. CK7 é expressa especificamente por BGs, mas não por criptas intestinais. C) Imunohistoquímica para SOX9 em duodeno humano. Tanto as criptas intestinais quanto os BGs contêm células que expressam SOX9 (setas). D) Imunofluorescência para SOX9 (vermelho) e CK7 (verde); os núcleos são exibidos em azul. Em BGs, SOX9 é co-expresso com CK7 nas mesmas células (setas).

[0082] A FIG. 2 representa A) Imunohistoquímica para Antígeno Nuclear de Célula em Proliferação (PCNA), CD44, Molécula de Adesão de Célula Epitelial (EpCAM), Repetição Rica em Leucina Contendo Receptor 5 Acoplado à Proteína G 5 (Lgr5), Tra-l-60 e Tra-l-8l no duodeno humano. As células PCNA+, CD44+, EpCAM+ e Lgr5+ estão localizadas tanto nas criptas intestinais (setas) quanto nas glândulas de Brunner (setas). As células Tra-l-60+ e Tra-l- 8l+ estão localizadas nas glândulas de Brunner (setas), mas não nas criptas intestinais. MM = muscolaris mucosae. B)

Imunohistoquímica e imunofluorescência para fatores de transcrição associados à pluripotência. Oct4A e SOX2 são positivos em células nas glândulas de Brunner e são co- expressos em células Tra-l-60+ (setas).

[0083] A FIG. 3 representa A) Seções coradas com hematoxilina e eosina (H&E) do duodeno humano antes e depois da remoção química e mecânica da mucosa. Quase todas as células epiteliais dentro do epitélio superficial (vilosidades) e criptas intestinais (pontas de seta) foram removidas, com exceção de criptas intestinais raras (círculo pontilhado na imagem à direita). As glândulas de Brunner na submucosa são preservadas (asteriscos). B) Imunohistoquímica para Citoqueratina 7 (CK7) no duodeno humano após a remoção mecânica e química da mucosa. As células CK7+ nas glândulas de Brunner são preservadas. C) Imunohistoquímica para Tra- l-60 em duodeno humano após a remoção mecânica e química da mucosa. As células Tra-l-60+ nas glândulas de Brunner são preservadas. MM = muscolaris mucosae.

[0084] A FIG. 4 representa AB) Citometria de fluxo para molécula de adesão de células epiteliais (EpCAM), receptor 5 acoplado à proteína G contendo repetição rica em leucina (Lgr5) e Tra-l-60 em células isoladas da submucosa duodenal. Os procedimentos de imunosorting EpCAM e Tra-l-60 resultaram no enriquecimento parcial das populações EpCAM+ (A) e Tra-l-60+ (B), respectivamente. CD) Estratégias de seleção de cultura ainda selecionaram células Tra-l-60+. Em C, as células foram semeadas em uma densidade clonal em plástico em meio de Kubota. As células começaram a proliferar após um período de atraso de 1-2 dias e formaram pequenos grupos de 10-15 células após 6-8 dias. Após 14 dias, grandes colônias foram observadas. Cada colônia foi formada por Tra-l-60 +células pequenas, densamente compactadas e uniformes. Em D, as células foram cultivadas em condições adaptadas para a formação de organóides; As células-tronco da glândula de Brunner (BGSCs) começaram a se auto-organizar em estruturas esféricas que se expandiram em tamanho e número. A formação de organoides determinou o enriquecimento para células Tra- l-60 + que representam o fenótipo predominante formando os organóides. Ph-C: contraste de fase. Barras de escala = 200 pm.

[0085] A FIG. 5 representa AB) colorações de contraste de fase (Ph-C), hematoxilina e eosina (H&E) e ácido periódico-Schiff (PAS), imunohistoquímica e imunofluorescência para endoderme e marcadores de pluripotência. No painel A, as células-tronco da glândula de Brunner (BGSCs) foram cultivadas em condições de autorreplicação (isto é, meio de Kubota sem soro). No painel B, as BGSCs foram cultivadas em condições adaptadas para a formação organoide. Em ambas as condições, as células em cultura apresentaram um fenótipo típico comparável ao observado in situ pelas células formadoras das glândulas de Brunner. Os núcleos são exibidos em azul. CD) Análise de RT- PCR confirmou a expressão dos genes endoderme (C) e pluripotência (D). Células-tronco/progenitoras da árvore biliar (BTSCs) e a linha celular Ntera foram usadas como controles positivos para genes de endoderme e pluripotência, respectivamente. * = p <0,05 em relação ao outro grupo. GOI

= Gene de interesse.

[0086] A FIG. 6 representa A) Diferenciação de hepatócitos in vitro. Contraste de fase (Ph-C), coloração de ácido periódico -Schiff (PAS) e imunofluorescência para albumina em células-tronco/progenitoras da glândula de Brunner humana (hBGSCs) cultivadas em um meio definido hormonalmente para diferenciação de hepatócitos (HDM- H). Após 14 dias em HDM-H, a morfologia da maioria das células mudou visivelmente para células de formato poligonal. Estas células agregaram-se para formar cordões multicelulares, foram PAS positivas (armazenamento de glicogênio) e albumina expressa. Os núcleos são exibidos em azul. PCR em tempo real para marcadores de hepatócitos em células cultivadas em HDM-Liver por 14 dias. Genes específicos de hepatócitos, incluindo albumina (ALB), transferrina (TF) e citocromo P450 3A4 (CYP3A4), foram aumentados quando comparados com células em condições de autorreplicação (ou seja, meio de Kubota sem soro: KM). Hepatócitos humanos primários (hHeps) são usados como controle positivo. * = p <0,05 versus outros grupos. GOI = Gene de interesse. B) Diferenciação pancreática endócrina in vitro. Coloração de Ph-C, hematoxilina e eosina (H&E) e imunofluorescência para neurogenina 3 (NGN3) e insulina em células-tronco/progenitoras da glândula de Brunner humanas (hBGSCs) cultivadas em um meio hormonalmente definido para diferenciação de células das ilhotas pancreáticas (HDM- P). Após 14 dias em HDM-P, estruturas semelhantes a ilhotas apareceram em culturas; esses agregados eram NGN3 e insulina positivos. Os núcleos são exibidos em azul. PCR em tempo real para marcadores endócrinos pancreáticos em células cultivadas em HDM-P por 14 dias. PDX1, insulina e glucagon foram altamente aumentados quando comparados com células em condições de autorreplicação (isto é, meio de Kubota: KM). As células das ilhotas pancreáticas normais foram utilizadas como controles positivos. * = p <0,05 versus hBGSCs em KM. GOI = Gene de interesse.

[0087] A FIG. 7 representa o transplante in vivo de células-tronco da glândula de Brunner humana (hBGSCs) para o fígado de camundongos SCID por injeção intra-esplênica. A) Após 30 dias, as células que expressam o antígeno mitocondrial humano (hMito) estavam presentes em fígados murinos e principalmente localizadas em torno dos espaços da tríade portal (setas). Nenhuma célula positiva estava presente em camundongos injetados com solução salina (Veh). B) as células hMito positivas representaram quase 5% dos hepatócitos no fígado murino. C) A expressão do gene da albumina humana (hALB) foi detectada por RT-qPCR no fígado de camundongos injetados com hBGSC, mas não em camundongos injetados com Veh (ND: não detectado). Dados expressos como média ± DP para três experimentos. DE) A dupla imunofluorescência confirmou a expressão de marcadores de hepatócitos humanos maduros, como albumina humana (hAlb), Hep-Par 1 e hMito nas mesmas células. Os núcleos (Nu) foram exibidos em azul.

[0088] A FIG. 8 representa a solubilização seletiva da mucosa do duodeno. A) Método de lavagem; B) pinçamento das extremidades do duodeno; C) corte de tecido e remoção de muco; D) filtragem mecânica por peneira.

[0089] A FIG. 9 representa imunohistoquímica para citoqueratina 7 (CK7) no duodeno humano. A parede duodenal é composta pelas camadas Mucosa, Submucosa e Muscolar. Glândulas de Brunner (BG) estão localizadas dentro da camada submucosa. CK7 é expressa especificamente por BGs, mas não por células em criptas intestinais. As áreas nas caixas são ampliadas nas imagens à direita.

[0090] A FIG.10 representa A) Imunofluorescência para SOX9 (vermelho) e Lgr5 (verde) no duodeno humano. Os núcleos são exibidos em azul. Nas glândulas de Brunner (compreendidas na linha pontilhada), Lgr5 co-localizado com SOX9 (setas), e sua expressão foi maior em ácinos localizados dentro da mucosa muscolaris e em continuidade com criptas intestinais (pontas de seta) do que em ácinos mais profundos localizados dentro da camada submucosa. MM = muscolaris mucosae. B-D) Immunohistochemistry for Sodium / Iodide Symporter (NIS). O NIS é expresso na parte inferior das criptas intestinais (pontas de seta nos painéis A e C) e nas glândulas de Brunner (setas nos painéis A e B).

[00142] A FIG. 11 descreve protocolos e procedimentos malsucedidos para a remoção de células epiteliais da mucosa combinados com a preservação da viabilidade da submucosa. Procedimento # 1: dissecção cirúrgica, # 2 mucosectomia por injeção prévia de soro fisiológico sob a mucosa, # 3 raspagem da mucosa. Essas estratégias resultaram na remoção parcial da camada de mucosa e na preservação das vilosidades intestinais (pontas de seta) e criptas (setas), conforme mostrado nas colorações de Hematoxilina e Eosina (H&E) e Ácido Periódico-Schiff (PAS).

[00143] A FIG. 12 representa PCR em tempo real em células-tronco/progenitoras da glândula de Brunner humana (hBGSCs) cultivadas sob um meio definido hormonalmente para diferenciação de células de ilhotas pancreáticas (HDM-P) por 7 dias. Os genes PDX1 e glucagon, mas não o gene da insulina, estão altamente aumentados após 7 dias quando comparados com células em condições de autorreplicação (isto é, Meio de Kubota: KM). Células de ilhotas pancreáticas normais foram usadas como controle positivo. * = p <0,05 versus hBGSCs em KM. GOI = Gene de interesse.

[00144] A FIG. 13 descreve que as glândulas submucosas duodenais em camundongos representam um compartimento distinto em relação às criptas intestinais e mostra características proliferativas. A) descreve coloração com Hematoxilina e Eosina (H&E) e coloração de imunofluorescência para Citoqueratina 19 (Ckl9), SOX9 e Antígeno Nuclear de Célula em Proliferação (PCNA) em duodeno murino (m). A linha pontilhada individualiza a interface entre as criptas intestinais e as glândulas submucosas (SGs: asterisco). Os GVs no duodeno são distinguíveis porque têm citoplasma mais claro em comparação com criptas e por causa de seu conteúdo mucoso. No duodeno de roedores, criptas intestinais e vilosidades são Ckl9 positivas, enquanto os SGs (asterisco branco) são quase negativos. As células SOX9 + estão localizadas principalmente em SGs (células verdes) e as células PCNA + estão localizadas principalmente em criptas intestinais (células vermelhas). Os núcleos são exibidos em azul. B) descreve a coloração com hematoxilina e eosina e a coloração com imunofluorescência para Ckl9,

SOX9 e PCNA em jejuno murino (m). No jejuno de roedores, criptas intestinais e vilosidades são Ckl9 positivas. As distinções em relação ao duodeno são que as células SOX9 + estão localizadas em criptas e co-expressam o PCNA (setas amarelas). Os núcleos são exibidos em azul. Barras de escala = 200 pm (H&E e Ckl9) ou 100 pm (SOX9 / PCNA). C) descreve a imunofluorescência para Ckl9 e TdTomato (Td-Tom) em camundongos Krtl9CreTdTomatoLSL 14 dias após a injeção de tamoxifeno. No jejuno murino (m), a maioria das criptas intestinais são Td-Tom + (setas vermelhas) com criptas negativas (seta verde) localizadas perto das positivas. Villi localizados acima das criptas Td-Tom + são completamente td-Tom positivos. No duodeno murino, os SGs são principalmente td-Tom- e Ckl9-, excluindo assim sua origem das criptas td-Tom + (setas vermelhas). Os asteriscos brancos indicam SGs. As linhas pontilhadas individualizam a interface entre as criptas intestinais e os SGs. Os núcleos são exibidos em azul. Barras de escala = 200 pm. D) No duodeno murino, as células PCNA + 505 e SOX9 + são sempre Td-Tom negativas (setas vermelhas). Setas amarelas e verdes apontam criptas intestinais Td-Tom + que no duodeno são PCNA positivas e SOX9 negativas. Os núcleos são exibidos em azul. As linhas pontilhadas individualizam a interface entre as criptas intestinais e os SGs. Imagens na FIG. 13 eram representativos de n = 5 animais.

[00145] A FIG. 14 mostra que células Tra-l-60+ isoladas da submucosa duodenal podem ser restritas ao pâncreas endócrino in vitro e mostram potência in vivo para se diferenciar em células insulina +. A - C) Diferenciação pancreática endócrina in vitro.

O painel A) mostra contraste de fase (Ph-C) e coloração de Hematoxilina e Eosina (H&E) de células isoladas de glândulas submucosas duodenais humanas e cultivadas em um meio definido para diferenciação pancreática (PM) ou em condições de autorreplicação (Meio de Kubota: KM ) No PM, estruturas semelhantes a ilhotas aparecem após 7 dias (PM7) e aumentam em número após 14 dias (PM14); * p <0,001 versus outros grupos.

Barras de escala = 100 µm. n = 5 repetições biológicas.

B) Tempo real (RT) -PCR mostra aumento da expressão do gene PDX1 em PM7-14; A expressão de 583 Pdxl nuclear é confirmada por imunofluorescência. n = 4 repetições biológicas.

C) descreve que a expressão dos genes da insulina (INS) e do glucagon (GLU) aumentam após PM14 (n = 4 repetições biológicas). As células das ilhotas pancreáticas humanas (ISL) são utilizadas como referência (n = 3 repetições biológicas). Na PM de 14 dias, estruturas semelhantes a ilhotas mostram expressão de insulina e glucagon por imunofluorescência.

Barra de escala = 100 µm.

D-G) descreve que o diabetes induzido experimentalmente em camundongos pode desencadear a proliferação e as características pancreáticas em dSGs in vivo (n = 5 animais para cada grupo). D) descreve que camundongos tratados com estreptozotocina (STZ) têm extensão aumentada da fração de área dSG (asteriscos) em comparação com os controles (CTR). Linhas pontilhadas individualizam criptas intestinais de dSGs.

Barras de escala = 200 µm.

E) descreve que dSGs em camundongos STZ têm expressão aumentada de Antígeno Nuclear de Célula em Proliferação (PCNA), Pdx-l, Neurogenina3 (Ngn3) e Insulina em comparação com controles conforme determinado por imunofluorescência (IF). Barras de escala = 100 horas. F) descreve um mapa de calor da pontuação IF. G) descreve que as amostras do duodeno de roedores têm uma expressão ligeiramente aumentada dos genes NGN3 e INS em camundongos STZ em comparação com os controles, conforme determinado por análise de RT-PCR. Tecidos pancreáticos dos mesmos camundongos são usados como referência. H) descreve estudos de expressão de insulina em duodenos humanos obtidos de pacientes afetados por Diabetes tipo 2 (T2D). Nestes órgãos (n = 5 duodenos), células raras de insulina + estão presentes em SGs (setas). O tecido pancreático é mostrado à direita. Barras de escala = 50 µm. Na imunofluorescência, os núcleos são exibidos em azul. Para A-D e G, as barras de erro indicam a média ± dp. Para A-D e G, os valores de p foram determinados por teste t bicaudal.

[00146] A FIG. 15 descreve a obtenção de células da glândula de Brunner autorreplicantes obtidas por biópsia endoscópica do bulbo duodenal humano. A) mostra coleção de camada submucosa com glândulas de Brunner (asterisco) por biópsia (painel esquerdo). As células que expressam SOX9 na glândula de Brunner são indicadas com setas (painel direito). B) mostra colônias de células in vitro (linhas pontilhadas) obtidas a partir da cultura de células da glândula de Brunner isoladas do duodeno fetal em condições de autorreplicação.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições

[00147] Conforme usado na descrição da invenção e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e

"o" se destinam a incluir as formas plurais também, a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[00148] O termo "cerca de", conforme usado neste relatório descritivo quando se refere a um valor mensurável, tal como uma quantidade ou concentração e semelhantes, destina-se a abranger variações de 20%, 10%, 5%, 1%, 0,5% ou mesmo 0,1% da quantidade especificada.

[00149] Os termos ou "aceitável", "eficaz" ou "suficiente" quando usados para descrever a seleção de quaisquer componentes, faixas, formas de dosagem, etc. divulgados neste relatório descritivo pretendem que o referido componente, faixa, forma de dosagem, etc. seja adequado para o propósito divulgado.

[00150] Também como usado neste relatório descritivo, "e / ou" se refere a e abrange todas e quaisquer combinações possíveis de um ou mais dos itens listados associados, bem como a falta de combinações quando interpretado na alternativa ("ou").

[00151] Conforme usado neste relatório descritivo, o termo "compreendendo" se destina a significar que as composições e métodos incluem os elementos recitados, mas não excluem outros. Tal como aqui utilizado, a frase de transição "consistindo essencialmente em (e variantes gramaticais) deve ser interpretada como englobando os materiais ou etapas recitadas" e aqueles que não afetam materialmente as características básicas e novas "da modalidade recitada. Ver, In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 USPQ 461, 463 (CCPA 1976) (ênfase no original); ver também MPEP § 2111.03. Assim, o termo "consistindo essencialmente em” como aqui utilizado não deve ser interpretado como equivalente a "compreendendo". "Consistindo em' significará excluir mais do que traços ou elementos menores de outros ingredientes e etapas substanciais do método para administrar as composições aqui divulgadas.

[00152] Os termos "equivalente" ou "equivalente biológico" são usados alternadamente quando se referem a uma determinada molécula, material biológico ou celular e se referem àqueles com homologia mínima, embora ainda mantendo a estrutura ou funcionalidade desejada.

[00153] Conforme usado neste relatório descritivo, o termo esferoide é usado quando se refere a um agregado de substancialmente ou principalmente o mesmo tipo de células que se organizaram em uma estrutura tridimensional (3D) permitindo que as células interajam em um ambiente de cultura em suspensão.

[00154] Conforme usado neste relatório descritivo, o termo organoide é usado quando se refere a um agregado de um ou mais tipos de células que se organizaram em uma estrutura tridimensional (3D) permitindo que as células interajam em um ambiente de cultura em suspensão. Em alguns casos, um organoide pode imitar aspectos da estrutura e função de um órgão ou tecido [humano ou animal].

[00155] Tal como aqui utilizado, o termo micróbio se refere a um microrganismo que pode ou não ser patogênico ou causar uma doença, ou pode ou não ser benéfico, que pode residir dentro ou fora de um tecido sendo processado para obter células ou população de células desejadas.

[00156] Tal como aqui utilizado, o termo "expressão" se refere ao processo pelo qual o DNA ou polinucleotídeos são transcritos em mRNA e / ou o processo pelo qual o mRNA transcrito é subsequentemente traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Se o polinucleotídeo é derivado de DNA genômico, a expressão pode incluir splicing do mRNA em uma célula eucariótica. O nível de expressão de um gene pode ser determinado, por exemplo, medindo a quantidade de mRNA ou proteína em uma célula ou amostra de tecido; além disso, o nível de expressão de vários genes pode ser determinado para estabelecer um perfil de expressão para uma amostra particular.

[00157] Conforme usado neste relatório descritivo, o termo "funcional" pode ser usado para modificar qualquer molécula, material biológico ou celular com a intenção de atingir certo efeito.

[00158] O termo "gene" ou "genético", tal como aqui utilizado, pretende incluir amplamente qualquer sequência de ácido nucleico, que pode ou não ser transcrita em uma molécula de RNA, seja o DNA ou RNA codificador (por exemplo, mRNA) ou não codificante (por exemplo, ncRNA). Os termos "ácido nucleico", "polinucleotídeo" e "oligonucleotídeo" são usados indistintamente e referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, seja desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos ou análogos dos mesmos. Os polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional e podem desempenhar qualquer função, conhecida ou desconhecida. Os seguintes são exemplos não limitativos de polinucleotídeos: um gene ou fragmento de gene (por exemplo, uma sonda, iniciador, EST ou etiqueta SAGE), exons, íntrons, RNA mensageiro (mRNA), microRNA, RNA de transferência, RNA ribossomal, RNAi, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores.

[00159] O termo "geneticamente concebido ou modificado", tal como aqui utilizado, pretende incluir amplamente qualquer forma de modificação de uma célula ou seu material genético, incluindo, mas não se limitando a, deleção, adição ou modulação de genes ou material genético, tecnologia de DNA recombinante, genética modificações através de vetores virais ou eletroporação, direcionamento de genes ou edição através de CRISPER (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) ou de outra forma, deleção ou adição de um fragmento de DNA, correção de uma mutação genética, e assim por diante.

[00160] Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeos. Se presente, modificações na estrutura do nucleotídeo podem ser transmitidas antes ou depois da montagem do polinucleotídeo. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode ser modificado posteriormente após a polimerização, tal como por conjugação com um componente de marcação. O termo também se refere a moléculas de fita simples e dupla. A menos que especificado ou exigido de outra forma, qualquer aspecto desta tecnologia que seja um polinucleotídeo abrange tanto a forma de fita dupla quanto cada uma das duas formas de fita simples complementares conhecidas ou previstas para formar a forma de fita dupla.

[00161] O termo "proteína", "peptídeo" e "polipeptídeo" são usados indistintamente e em seu sentido mais amplo para se referir a um composto de duas ou mais subunidades de aminoácidos, análogos de aminoácidos ou peptidomiméticos. As subunidades podem ser ligadas por ligações peptídicas. Em outro aspecto, a subunidade pode ser ligada por outras ligações, por exemplo, éster, éter, etc. Uma proteína ou peptídeo deve conter pelo menos dois aminoácidos e nenhuma limitação é colocada no número máximo de aminoácidos que podem compreender uma proteína ou sequência do peptídeo. Tal como aqui utilizado, o termo "aminoácido" se refere a aminoácidos naturais e / ou não naturais ou sintéticos, incluindo glicina e ambos os isômeros ópticos D e L, análogos de aminoácidos e peptidomiméticos.

[00162] Conforme usado neste relatório descritivo, o termo "sujeito" e "paciente" são usados alternadamente e se destinam a significar qualquer humano ou animal. Em algumas concretizações, o sujeito pode ser um mamífero. Em outras concretizações, o sujeito pode ser um animal humano ou não humano (por exemplo, um camundongo ou rato).

[00163] O termo "tecido" é usado neste relatório descritivo para se referir a tecido de um organismo vivo ou falecido ou qualquer tecido derivado de ou projetado para imitar alguns aspectos de um organismo vivo ou falecido. O tecido pode ser saudável, doente e / ou ter mutações ou modificações genéticas. O termo "tecido natural" ou "tecido biológico" e suas variações, conforme usado neste relatório descritivo, referem-se ao tecido biológico conforme existe em seu estado natural ou em um estado não modificado desde quando foi derivado de um organismo. Um "microrganismo" se refere a um segmento de "tecido da bioengenharia" que é modelado ou imita o "tecido natural".

[00164] O tecido biológico pode incluir qualquer tecido único (por exemplo, uma coleção de células que podem estar interconectadas) ou um grupo de tecidos constituindo um órgão ou parte ou região do corpo de um organismo. O tecido pode compreender material celular homogêneo ou heterogêneo, ou pode ser uma estrutura composta, como a encontrada em regiões do corpo, incluindo o tórax, que por exemplo pode incluir tecido pulmonar, tecido esquelético e / ou tecido muscular. Tecidos exemplares incluem, mas não estão limitados a aqueles derivados de fígado, pulmão, tireoide, pele, pâncreas, vasos sanguíneos, bexiga, rins, cérebro, árvore biliar, duodeno, aorta abdominal, veia ilíaca, coração e intestinos, incluindo qualquer combinação dos mesmos.

[00165] O termo "isolado", tal como aqui utilizado, se refere a moléculas ou materiais biológicos ou celulares que são substancialmente isentos de outros materiais. O termo "isolado" também é usado para descrever materiais que foram removidos de seu ambiente natural (por exemplo, de in vivo para ex vivo ou in vitro). O termo "estéril", conforme usado neste relatório descritivo, se refere a um material que está livre de bactérias ou outros microrganismos vivos

(ou seja, asséptico, esterilizado, livre de germes, antisséptico, desinfetado ou semelhantes). Células-tronco/progenitoras da glândula de Brunner isoladas e meio de cultura celular

[00166] Conforme usado neste relatório descritivo, o termo "célula" se refere a uma célula eucariótica. Em várias concretizações, esta célula é de origem humana ou animal e pode ser uma célula-tronco ou progenitora ou uma célula somática. O termo "população de células" se refere a um grupo de uma ou mais células do mesmo ou diferente tipo de célula em que pelo menos algumas, ou uma parte substancial ou a maioria das células têm a mesma ou diferente origem e / ou estágio de linhagem. Em algumas concretizações, esta população de células pode ser derivada de uma linha celular; em algumas concretizações, esta população de células pode ser derivada de um órgão ou tecido, uma porção do mesmo ou uma amostra do mesmo.

[00167] O termo “célula-tronco” se refere a populações de células que podem se autorreplicar (produzir células-filhas idênticas à célula-mãe) e que são multipotentes, ou seja, podem dar origem a mais de um tipo de célula adulta. O termo "célula progenitora" ou "precursor", tal como aqui utilizado, também é multipotente, embora o escopo ou extensão da multipotência de uma célula progenitora ou precursora possa ser mais limitada do que a multipotência de uma célula-tronco. O termo "célula progenitora" ou "precursora" também é amplamente definido para abranger a progênie de células-tronco e seus descendentes. Progenitoras são populações de células que podem ser multipotentes, bipotentes ou unipotentes, mas podem ter uma capacidade mais limitada de autorreplicação do que as células-tronco. Progenitores comprometidos são aqueles que podem se diferenciar em uma linhagem específica. Exemplos não limitativos de células-tronco incluem, mas não estão limitados a células-tronco embrionárias (ES), células-tronco pluripotentes induzidas (iPS), células-tronco da camada germinativa, células-tronco determinadas, células-tronco adultas, células-tronco perinatais, células-tronco derivadas de líquido amniótico células, células-tronco mesenquimais (MSCs) e angioblastos. Os intermediários entre as células-tronco e progenitores comprometidos incluem populações de células, como hepatoblastos e progenitores ductais pancreáticos e outras formas de células de amplificação de trânsito que podem ser multipotentes, mas podem ter capacidade auto- replicativa limitada.

[00168] As células de interesse na presente divulgação são referidas aqui como células- tronco/progenitoras da glândula de Brunner (BGSCs) e podem ser derivadas do duodeno de um ser humano ou animal (mas em nenhum outro lugar no intestino). Esses BGSCs são distinguíveis das células-tronco intestinais com base, pelo menos, nas seguintes características:

TRAÇOS FENOTÍPICOS (MARCADORES) Célula-tronco intestinal* Citoqueratina 7 Citoqueratina 19

PROPRIEDADES FUNCIONAIS (FORMAÇÃO DO ORGANOIDE E CAPACIDADE DE DIFERENCIAÇÃO) Formação de organoide Linhagens endócrina pancreática Linhagens do fígado

[00169] Os requerentes foram os primeiros a reconhecer o duodeno e suas glândulas de Brunner como importantes nichos de células-tronco/progenitoras que fazem parte de uma rede de nichos células-tronco/progenitores em glândulas localizadas na submucosa do duodeno, dando origem ao fígado, pâncreas e outras células endodérmicas e tecidos e persistindo na idade adulta. As BGSCs são uma pequena subpopulação (por exemplo, ~ 5%) das células nas glândulas de Brunner (também conhecidas como glândulas submucosas duodendais) e são reconhecíveis como aquelas que expressam genes de pluripotência, como TRA-l-60, Tra-l-8l, OCT4 , SOX2 e NANOG. As BGSCs são relevantes para o fígado, árvore biliar, pâncreas, intestino e outros tecidos endodérmicos com biomarcadores que podem incluir Lgr5, NIS, CD44, CK19, SOX9 e EpCAM e / ou podem incluir SOX17 e PDX1.

[00170] As BGSCs são distintas das células-tronco intestinais como descrito acima: as BGSCs expressam Tra-l- 60, Tra-l-8l, OCT4 e CK7, enquanto as células-tronco intestinais não. As BGSCs também são distintas das células- tronco hepáticas e das células-tronco pancreáticas, em que as BGSCs expressam SOX17 e PDX1, enquanto as células-tronco hepáticas expressam SOX17, mas não PDX1, e as células-tronco pancreáticas expressam PDX1, mas não SOX17.

[00171] Por conseguinte, em um aspecto, esta divulgação se refere a uma BGSC isolada de um duodeno que expressa um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em Tra-l-60, Tra-l-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9 e CK7, e que é ainda caracterizado como capaz de proliferação, com diferenciação limitada ou mínima, em condições de cultura que suportam a autorrenovação. Em outro aspecto, a BGSC isolado de um duodeno expressa um ou mais marcadores selecionados do grupo que consiste em Lgr5, NIS, CD44 e CK19, e a BGSC é ainda caracterizado como capaz de proliferação, com diferenciação limitada ou mínima, sob condições de cultura que suportam auto-renovável. Em outro aspecto, a BGSC isolado de um duodeno expressa SOX17 e PDX1, e a BGSC é ainda caracterizada como capaz de proliferação, com diferenciação limitada ou mínima, em condições de cultura que apoiam a auto-renovação. Em algumas concretizações, a BGSC isolado pode expressar um ou mais marcadores do grupo que consiste em Tra 1-60, Tra-l-8l, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44, CKl9 e SOX17 e PDX1. Em algumas concretizações, a BGSC isolado é substancialmente livre de patógenos e / ou livre de micróbios patogênicos e / ou benéficos.

[00172] Em algumas concretizações, a BGSC isolada pode ser proliferada, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos um mês. Em algumas concretizações, a BGSC isolado pode ser proliferada, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos dois meses. Em algumas concretizações, a BGSC isolada pode ser proliferado, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos seis meses ou por pelo menos doze meses.

[00173] Em algumas concretizações, as condições de cultura que suportam a autorrenovação da BGSC compreendem um meio sem soro. Em algumas concretizações, o meio sem soro compreende meio de Kubota.

[00174] O termo "cultura" ou "cultura de células" significa a manutenção de células em um ambiente in vitro. Um "sistema de cultura de células" é usado neste relatório descritivo para se referir às condições de cultura nas quais uma população de células pode ser cultivada ex vivo (fora do corpo). As culturas podem ser constituídas por um único tipo de célula ou uma mistura de diferentes tipos de células.

[00175] As culturas de células incluem aquelas que são monocamadas nas quais as células são semeadas em uma superfície com ou sem um revestimento, como um revestimento de componentes da matriz extracelular e em um meio nutriente (minerais, vitaminas, aminoácidos, lipídeos) suplementado com um produto biológico fluido (por exemplo, soro ou linfa) e / ou com uma mistura definida de hormônios, fatores de crescimento e citocinas (um meio definido hormonalmente ou HDM). Os HDM são definidos empiricamente por sua utilidade com um determinado tipo de célula ou uma população de células, em um determinado estágio de linhagem maturacional.

[00176] As culturas de células também podem ser aglomerados flutuantes ou agregados de células plaqueadas em placas de baixa fixação e / ou podem estar em cultura em suspensão. Os meios de suporte de aglomerados ou agregados flutuantes e / ou de cultura em suspensão podem ser os mesmos meios usados para a cultura em monocamada. O meio pode ser isento de soro ou conter soro. O meio livre de soro carece de proteínas de fixação (por exemplo, fibronectinas) que podem fazer com que agregados flutuantes gerem monocamadas. Se os agregados flutuantes são compostos substancialmente ou principalmente por um tipo de célula, eles são referidos como esferóides. Se eles são compostos de vários tipos de células [por exemplo, epitélio e um parceiro (s) de célula mesenquimal], eles são referidos como organoides, b Aglomerados ou agregados celulares, esferóides e organoides flutuando em culturas em suspensão são considerados em um microambiente 3D, e as células são capazes de interagir em três dimensões.

[00177] O "Meio de cultura" é usado neste relatório descritivo para se referir a uma solução nutritiva para a cultura, crescimento ou proliferação de células. O meio de cultura pode ser caracterizado por propriedades funcionais, tais como, mas não se limitando a, a capacidade de manter as células em um estado particular (por exemplo, um estado pluripotente, um estado quiescente, etc.), para facilitar a maturação das células e, em alguns casos, para promover a diferenciação de células multipotentes em células de uma linhagem particular.

[00178] Exemplos não limitativos de meios de cultura são meios suplementados com soro (SSM), sendo qualquer meio basal suplementado com soro (derivado de animais rotineiramente abatidos para produtos comerciais e agrícolas) em níveis que são tipicamente ~ 10%.

[00179] O termo "isolado", tal como aqui utilizado, se refere a moléculas ou materiais biológicos ou celulares que são substancialmente livres de outros materiais (exceto meio de cultura e / ou matriz extracelular e seus respectivos componentes). O termo "isolado" também é usado para descrever materiais que foram removidos de seu ambiente natural (por exemplo, de in vivo para ex vivo ou in vitro).

[00180] O termo "estéril, higienizado ou desinfetado", tal como aqui utilizado, se refere a um material que está livre de patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos (ou seja, asséptico, esterilizado, livre de germes, anti-séptico, desinfetado ou semelhantes). População Isolada de BGSCs

[00181] Em outro aspecto, esta divulgação se refere a uma população de células-tronco/progenitoras isoladas do duodeno, em que pelo menos algumas, ou uma parte substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em Tra -l-60, Tra-l-8l, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9 e CK7 e que é ainda caracterizado como capaz de proliferação, com diferenciação limitada ou mínima, em condições de cultura que suportam a autorrenovação. Em outro aspecto, esta divulgação se refere a uma população de células-tronco/progenitoras isoladas do duodeno em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em Lgr5, NIS, CD44 e CK19. Em outro aspecto, esta divulgação se refere a uma população de células-tronco/progenitoras isoladas do duodeno na qual pelo menos algumas, ou uma parte substancial de, ou a maioria das células expressam SOX17 e PDX1. Em algumas concretizações, pelo menos algumas ou uma porção substancial de, ou a maioria das células na população de célula-tronco / progenitora isolada do duodeno expressam um ou mais marcadores do grupo que consiste em Tra 1-60, Tra- l-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19 e ambos SOX17 e PDX1.

[00182] Em algumas concretizações, a população isolada de tronco / progenitores descritos no parágrafo anterior é substancialmente livre de patógenos e / ou livre de micróbios patogênicos e / ou benéficos

[00183] Em algumas concretizações, a presente divulgação se refere a uma composição que compreende uma população BGSC isolada, expressando um ou mais marcadores selecionados do grupo que consiste em Tra-1-60, Tra-l-8l, OCT4, SOX2, NANOG EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19,

CD44, CK19 e ambos, SOX17 e PDX1, e, em algumas concretizações esta população de BGSC foi esterilizada, higienizada ou desinfetada.

[00184] Em outro aspecto, esta divulgação se refere a um organoide produzido pela cultura de uma população de BGSC isolada na qual pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais marcadores selecionados do grupo que consiste em Tra 1-60 , Tra-l-8l, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9 e CK7, Lgr5, NIS, CD44 e CK19, e ambos SOX17 e PDX1, e que é ainda caracterizado como capaz de proliferação, com diferenciação limitada ou mínima, sob condições de cultura que suportam a auto-renovação, opcionalmente em placa de fixação baixa ou em suspensão. Em algumas concretizações, o organoide compreende ainda um meio de cultura, em que o meio de cultura é capaz de diferenciar BGSCs em células de estágio de linhagem posterior, incluindo células maduras.

[00185] Em algumas concretizações, as condições de cultura que suportam a autorrenovação compreendem um meio sem soro. Em algumas concretizações, o meio sem soro compreende meio de Kubota.

[00186] Em algumas concretizações, as condições de cultura sem soro são meio definido por hormônio (HDM) projetado para estágios de linhagem maturacional específicos de células, sejam células epiteliais ou mesenquimais. Além do SSM, existem meios de HDM sem soro projetados para determinados estágios de linhagem maturacional de células, sejam células epiteliais ou mesenquimais. Um exemplo disso é o Meio de Kubota, um meio sem soro desenvolvido para tronco

/ progenitores endodérmicos e composto de um meio basal (meio nutriente contendo minerais, aminoácidos, açúcares, sais, vitaminas, lipídios) sem cobre e com baixo teor de cálcio e suplementado com insulina, transferrina / Fe e vários lipídios, mas sem citocinas ou fatores de crescimento. Este meio pode suportar células-tronco/progenitoras endodérmicas do fígado, pâncreas, pulmão e intestino.

[00187] "Meio de Kubota", tal como aqui utilizado, se refere a qualquer meio sem cobre, mas contendo cálcio (<0,5 mM), selênio, zinco, insulina, transferrina / Fe, uma mistura de ácidos graxos livres ligados a albumina purificada e, opcionalmente, também alta lipoproteína de densidade (HDL). Em algumas concretizações, o Meio de Kubota compreende qualquer meio (por exemplo, RPMI 1640 ou DMEM- F12) sem cobre, baixo cálcio (por exemplo, 0,3 mM), ~ 10-9 M de selênio, ~ 0,1% de albumina de soro bovino ou albumina de soro humano (altamente purificado e livre de ácidos graxos), ~ 4,5 mM de nicotinamida, ~ 0,1 nM de sulfato de zinco hepta- hidratado, ~ 10-8 M de hidrocortisona (componente opcional usado para precursores hepáticos, mas não pancreáticos), ~ 5 µg/ml de transferrina / Fe, ~ 5 µg/ml de insulina, ~10 µg/ml de lipoproteína de alta densidade e uma mistura de ácidos graxos livres purificados que são adicionados após ligá-los à albumina de soro purificada. A mistura de ácidos graxos livres consiste em -100 mM cada de ácido palmítico, ácido palmitoléico, ácido oleico, ácido linoléico, ácido linolênico e ácido esteárico. Métodos exemplares não limitativos para a preparação deste meio foram publicados em outros lugares, por exemplo, Kubota H, Reid LM,

Proc. Nat. Acad. Scien. (EUA) 2000; 97: 12132-12137, cuja divulgação é aqui incorporada.

[00188] Existem outros HDM sem soro que podem ser projetados para conduzir o tronco / progenitores a destinos adultos específicos, como hepatócitos (HDM-H) ou colangiócitos (HDM-C). Alguns desses HDM são definidos mais detalhadamente a seguir. Em algumas concretizações, o meio pode ser um "meio de semeadura" usado para apresentar ou introduzir células em um determinado ambiente. Em outras concretizações, o meio pode ser um "meio de diferenciação" usado para facilitar a diferenciação de células.

[00189] Tais meios são compostos de um "meio basal", uma mistura de nutrientes, minerais, aminoácidos, açúcares, lipídios e oligoelementos (exemplos incluem meio de Eagle modificado por Dulbecco ou DME e F10 ou F12 de Ham's e RPMI 1640, um meio basal definido estabelecido no Roswell Park Memorial Institute). Esses meios basais podem ser suplementados com soro (meio suplementado com soro ou SSM) ou com uma mistura definida de hormônios purificados, fatores de crescimento e nutrientes, um meio hormonalmente definido (HDM) e usado para manutenção de células ex vivo. Conforme usado neste relatório descritivo, "HDM-H" é um HDM usado para organóides ou para culturas em monocamada plaqueadas em substratos de colágeno tipo IV e laminina para conduzir a diferenciação de tronco / progenitores endodérmicos para hepatócitos maduros.

[00190] Composições particulares de meios definidos hormonalmente (HDM) são descritas em mais detalhes abaixo: • KM modificado (MKM): Todos os três HDM abaixo fizeram uso de KM suplementado ainda com cálcio para atingir uma concentração de 0,6 mM, 10 12 M de cobre e 20 ng / ml de FGF. • Diferenciação de hepatócitos (HDM-L): foi preparado suplementando MKM com 7 pg / L de glucagon, 2g / L de galactose, lnM de triiodotiroxina 3 (T3), 10 ng / ml de Oncostatina M (OSM); 10 ng / ml de fator de crescimento epidérmico (EGF), 20 ng / ml de fator de crescimento de hepatócitos (HGF) e 1 pm de dexametasona. • Diferenciação de colangiócitos (HDM-C): foi preparada suplementando o MKM com 20 ng / ml de fator de crescimento de células endoteliais vasculares (VEGF) 165 e 10 ng / ml de HGF. • Meio definido para diferenciação pancreática (PM ou HDM-P): foi preparado usando MKM sem hidrocortisona e adicionalmente suplementado com 2% B27, ácido ascórbico 0,1 mM, ciclopamina 0,25 pM, ácido retinóico 1 pM, o bFGF foi usado para o primeiros 4 dias e substituídos por 50 ng / ml de exendina-4 e 20 ng / ml de HGF para o restante do tempo.

[00191] Os meios basais são tampões usados para cultura de células e são compostos de aminoácidos, açúcares, lipídios, vitaminas, minerais, sais, oligoelementos e vários nutrientes em composições que imitam os constituintes químicos do fluido intersticial ao redor das células. Além disso, os meios de cultura de células são geralmente compostos de meios basais suplementados com uma pequena porcentagem (tipicamente 2-10%) de soro para fornecer as moléculas de sinalização necessárias (hormônios, fatores de crescimento) necessárias para conduzir um processo biológico

(por exemplo, proliferação, diferenciação). Embora o soro possa ser autólogo para os tipos de células usados em culturas, é mais comumente soro de animais rotineiramente abatidos para fins agrícolas ou alimentares, como soro de vacas, ovelhas, cabras, cavalos, etc. O soro também é usado para inativar enzimas que fazem parte dos processos de dissociação dos tecidos. Métodos de isolamento de células multipotentes de um tecido com uma camada de mucosa e uma camada de submucosa.

[00192] Em outro aspecto, esta divulgação se refere a um método de isolamento de uma ou mais células-tronco / progenitoras multipotentes que expressam um ou mais biomarcadores desejados, ou uma população em que pelo menos alguns ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam o biomarcador (es) desejado (s), de um tecido com uma camada mucosa e uma camada submucosa compreendendo: (a) contatar uma camada mucosa de um duodeno, que está substancialmente livre de muco intestinal, com um meio ou solução com propriedades de osmolalidade fora de uma faixa fisiológica sob condições que induzem choque osmótico às células da camada mucosa; (b) remover ou dissolver pelo menos uma porção da camada mucosa ou das células desta por métodos mecânicos, cirúrgicos e / ou químicos, deixando e / ou expondo um restante que pode incluir uma camada submucosa; (c) digerir ou dissociar o restante; e (d) isolar um ou mais BGSC ou a população de células do restante digerido.

[00193] Conforme usado neste relatório descritivo, o termo "choque osmótico" se refere a uma mudança na pressão osmótica em relação à pressão osmótica fisiológica dentro da célula que causa danos à célula. Em algumas concretizações, as células são danificadas por choque osmótico pela aplicação de um meio ou solução com propriedades de osmolalidade fora de uma faixa fisiológica sob condições que induzem choque osmótico às células. O meio ou solução com propriedades de osmolalidade fora de uma faixa fisiológica pode ser uma solução hipotônica ou hipoosmolar ou hipoosmótica com osmolalidade mais baixa do que a osmolalidade fisiológica. O meio ou solução com propriedades de osmolalidade fora de uma faixa fisiológica pode ser uma solução hipertônica ou hiperosmolar ou hiperosmótica com osmolalidade mais alta do que a osmolalidade fisiológica. O meio ou solução com propriedades de osmolalidade fora de uma faixa fisiológica pode ser uma solução de qualquer tipo. Em algumas concretizações, o meio ou solução com propriedades de osmolalidade fora de uma faixa fisiológica pode ser água, água ultrapura, água destilada, solução de glicose a 5%, uma solução com alto teor de sal e semelhantes.

[00194] O choque osmótico pode ser induzido aplicando o meio ou solução com propriedades de osmolalidade fora de uma faixa fisiológica ao lúmen em uma quantidade que pode levar o duodeno a distender, ou aplicando tal meio ou solução à camada mucosa de um tecido. Em algumas concretizações, o meio ou solução com propriedades de osmolalidade fora de uma faixa fisiológica pode estar em contato com o lúmen ou camada da mucosa por cerca de 0,5 minutos, 1 minuto, cerca de 2 minutos, cerca de 5 minutos, cerca de 10 minutos ou cerca de

15 minutos.

[00195] Em algumas concretizações, o método de isolamento de uma ou mais células multipotentes, ou uma população incluindo tais células, expressando um ou mais biomarcadores desejados de um tecido com uma camada mucosa e uma camada submucosa compreende um processamento adicional da mistura em uma suspensão de células antes para a etapa de seleção ou isolamento. Em algumas concretizações, o método de isolamento de uma ou mais células multipotentes, ou uma população incluindo tais células, expressando um ou mais biomarcadores desejados de um tecido com uma camada mucosa e uma camada submucosa compreende uma ou mais etapas de lavagem usando um meio fisiologicamente aceitável.

[00196] O método de isolamento de uma ou mais células multipotentes, ou uma população incluindo tal expressando um ou mais biomarcadores desejados de um tecido com uma camada mucosa e uma camada submucosa pode ser usado para isolar células-tronco multipotentes de qualquer tecido adequado tendo uma camada mucosa e uma camada submucosa. Em algumas concretizações, o tecido é tecido endodérmico. Em algumas concretizações, o tecido é selecionado do grupo que compreende intestino delgado, intestino grosso, reto. Em algumas concretizações, o tecido é selecionado a partir do grupo que compreende traqueia, brônquio principal, esôfago, estômago e duodeno.

[00197] Em um aspecto particular, esta divulgação se refere a um método de isolamento de um ou mais BGSCs ou uma população incluindo BGSCs de um tecido, uma porção de tal tecido ou uma amostra do mesmo, retirado de um duodeno de um sujeito compreendendo: (a) remoção do muco intestinal; (b) aplicar um meio ou solução com propriedades de osmolalidade fora de uma faixa fisiológica em condições sob condições que induzem choque osmótico nas células da camada mucosa; (c) remover ou dissolver pelo menos uma porção da camada mucosa ou das células desta por métodos mecânicos, cirúrgicos e / ou químicos, deixando e / ou expondo um resto que pode incluir uma camada submucosa; (d) aplicar à camada mucosa e / ou ao restante um meio ou solução para matar, inativar ou remover substancialmente patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos; (e) aplicação de digestão ou dissociação ao restante, incluindo a camada submucosa, para produzir uma digestão, material celular dissociado ou uma suspensão celular; (f) opcionalmente cultivar pelo menos parte do material digerido, celular dissociado ou células da suspensão celular; e (g) isolar aquelas células que expressam, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam, um ou mais de Tra-l-60, Tra-l-8l, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19; e / ou as células que expressam SOX17 e PDX1.

[00198] Conforme usado neste relatório descritivo, o termo "restante" se refere a um tecido, uma porção do mesmo ou amostra do mesmo, com a camada mucosa parcial ou totalmente rompida e / ou removida, de modo que a camada submucosa seja exposta. As células multipotentes desejadas, como as BGSCs, estão contidas na camada submucosa restante.

[00199] Em algumas concretizações do método de isolamento de um ou mais BGSCs, ou uma população incluindo BGSCs, de um duodeno de um sujeito, uma porção do mesmo ou uma amostra do mesmo, a etapa de remoção é realizada por ruptura química, que compreende um uso de um emulsificante e / ou um detergente. Em algumas concretizações, a sanitização ou esterilização é realizada com uma solução de hipoclorito de sódio na etapa (d). Em algumas concretizações, a digestão é realizada enzimaticamente. Em algumas concretizações do método de isolamento de um ou mais BGSCs ou uma população incluindo BGSCs, o restante após a etapa de remoção ou dissolução compreende uma camada submucosa e o restante digerido compreende fragmentos de tecido. Em algumas concretizações do método de isolamento de um ou mais BGSCs ou uma população incluindo BGSCs, o tecido ou porção de tecido ou amostra é picada antes da etapa de digestão (e). Em algumas concretizações do método de isolamento de um ou mais BGSCs ou uma população incluindo BGSCs, a etapa de isolamento (f) é realizada usando a seleção de cultura com condições de cultura compreendendo um meio sem soro, opcionalmente, Meio de Kubota. Em algumas concretizações do método de isolamento de um ou mais BGSCs ou uma população incluindo BGSCs, a etapa de isolamento (f) é realizada usando a seleção de cultura com condições de cultura contendo soro. Em algumas concretizações do método de isolamento de um ou mais BGSCs ou uma população incluindo BGSCs, a etapa de digestão (e) e / ou a etapa de isolamento (f) é realizada em placas de baixa fixação. Em algumas concretizações do método de isolamento de um ou mais BGSCs, as células isoladas são cultivadas em suspensão ou condições 3D que suportam ou produzem esferóides, um ou mais organóides, aglomerados de células ou agregados de células.

[00200] A ruptura mecânica / mucosectomia pode ser feita por vários procedimentos e ferramentas possíveis que removem a camada mucosa. Em algumas concretizações, a camada de superfície celular é removida. Muitos métodos diferentes de ruptura mecânica das camadas de células são conhecidos, como o uso de pequenos grânulos para cortar a parede celular, o uso de sonicação para romper as paredes celulares, o uso de trituração com almofariz e pilão, o uso de liquidificadores, o uso de ciclos de congelamento e descongelamento, o uso de microondas para romper as ligações dentro das paredes celulares e desnaturar as proteínas, ou usando alta pressão e semelhantes.

[00201] Em algumas concretizações do método de isolamento de um ou mais BGSCs ou uma população de células incluindo BGSCs, a etapa de remoção ou dissolução é realizada por ruptura química, que compreende o uso de um emulsificante selecionado do grupo que compreende Lecitinas, Polioxietileno Sorbitano Monolaurato (Polissorbato 20), Monooleato de Polioxietileno Sorbitano (Polissorbato 80), Monopalmitato de Polioxietileno Sorbitano (Polissorbato 40), Monoestearato de Polioxietileno Sorbitano (Polissorbato 60), Tristearato de Sorbitano Polioxietileno Sorbitano (Polissorbato de sódio e fosfato de cálcio 65), Sais de magnésio de ácidos graxos, Mono- e diglicerídeos de ácidos graxos, Ésteres de ácido acético de mono e diglicerídeos de ácidos graxos, Ésteres de ácido láctico de mono e diglicerídeos de ácidos graxos, Ésteres de ácido cítrico de mono- e diglicerídeos de ácidos graxos , Ésteres de ácido mono- e diacetil tartárico de mono e diglicerídeos de ácidos graxos, ésteres de ácido tartárico e acético misto de mono - e diglicerídeos de ácidos graxos, ésteres de sacarose de ácidos graxos, sucroglicerídeos, ésteres de poliglicerol de ácidos graxos, poliglicerol poliricinoleato, propano, ésteres de 2-diiol de ácidos graxos, óleo de soja termicamente oxidado interagindo com mono e diglicerídeos de ácidos graxos , Estearoil-2-Lactilato de Sódio, Estearoil- 2-Lactilato de Cálcio, Monoestearato de Sorbitano, Triestearato de Sorbitano, Monolaurato de Sorbitano, Monooleato de Sorbitano e Monopalmitato de Sorbitano.

[00202] Em algumas concretizações do método de isolamento de um ou mais BGSCs, a etapa de remoção ou dissolução é realizada por ruptura química, que compreende o uso de um detergente selecionado de um grupo que compreende ácido l-heptanossulfônico; N-Laurilsarcosina, Lauril Sulfato, 1 -Octano Sulfônico Ácido e Ácido Taurocólico, Cloreto de Benzalcônio, Cetilpiridínio, Cloreto de Metilbenzetônio, Brometo de Decametônio, Alquil Betainas, Alquil Amidoalquil Betainas, N-Dodecmonil-l-Nodecmonil- Dimetil, Propanossulfonato, Fosfatidilcolina, N-Decil AD- Glucopiranosídeo, N-Decil AD-Maltopiranosídeo, N-Dodecil BD- Maltosídeo, N-Octil BD-Glucopiranosídeo, N-Tetradecil BD- Maltosídeo, Tritons (Triton X-100), Nonidet -40, Poloxamer 188, Lauril Sulfato de Sódio, Desoxicolato de Sódio e Dodecil

Sulfato de Sódio.

[00203] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a um método de isolamento de um ou mais BGSCs ou uma população de células que inclui BGSCs de uma amostra de tecido retirada de um duodeno de um sujeito que compreende: (a) contatar a camada mucosa com uma solução com propriedades de osmolalidade fora de uma faixa fisiológica sob condições sob condições para induzir choque osmótico às células da camada mucosa (b) remover ou dissolver pelo menos uma porção da camada mucosa ou das células desta por métodos mecânicos, cirúrgicos e / ou químicos, deixando e / ou expondo um restante, que pode incluir uma camada submucosa; (c) contatar o restante com um meio ou solução para matar, inativar ou remover substancialmente patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos; (d) digerir ou dissociar o restante para fornecer uma suspensão de células; (e) opcionalmente cultivar pelo menos algumas das células do material digerido ou dissociado celular ou de tecido; e (f) isolar uma ou mais células multipotentes que expressam, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam, um ou mais biomarcadores desejados.

[00204] Em algumas concretizações, o muco é removido do tecido ou porção de tecido ou amostra antes de entrar em contato com a camada mucosa com uma solução com propriedades de osmolalidade fora de uma faixa fisiológica sob condições para induzir choque osmótico às células da camada mucosa.

[00205] Em outro aspecto, esta divulgação se refere a um método de isolamento de BGSCs de um duodeno, uma porção do mesmo ou uma amostra retirada do mesmo, compreendendo: (a) digerir ou dissociar um duodeno, uma porção do mesmo, ou uma amostra retirada do mesmo para fornecer um material celular digerido ou dissociado; (b) obtenção do material celular digerido ou dissociado: (i) as células que expressam, ou uma população de células em que pelo menos algumas, uma porção substancial ou a maioria das células expressam, um ou mais de Tra-l -60, Tra-l-8l, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44 e CK19; e / ou (ii) aquelas células que expressam, ou uma população de células em que pelo menos algumas, uma porção substancial ou a maioria das células expressam, tanto SOX17 quanto PDX1.

[00206] Em algumas concretizações do método de isolamento de BGSCs ou uma população de células incluindo BGSCs, o duodeno, uma porção dos mesmos, uma amostra retirada do mesmo, o restante e / ou o material celular ou de tecido digerido ou dissociado, ou combinações dos mesmos, são postos em contato com um desinfetante ou meio de higienização, solução ou agente (s).

[00207] Tal como aqui utilizado, o termo "desinfetante" é contemplado para incluir todos os meios, soluções ou agentes que destroem patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos, como bactérias, vírus e fungos, e também incluem meios, soluções ou agentes que irão matar esporos bacterianos ou fúngicos. Em algumas concretizações,

o desinfetante é uma solução de hipoclorito. Em algumas concretizações, o desinfetante é uma solução com cerca de 0,01% a cerca de 0,1% de hipoclorito de sódio ou de cerca de 0,1% a cerca de 0,2% de hipoclorito de sódio. Em algumas concretizações, o desinfetante é uma solução de hipoclorito de sódio a 0,01%, solução de hipoclorito de sódio a 0,02%, solução de hipoclorito de sódio a 0,05%, solução de hipoclorito de sódio a 0,1%, solução de hipoclorito de sódio 0,15% ou solução de hipoclorito de sódio 0,2%. Em uma concretização preferencial, o desinfetante é 0,05% de solução de hipoclorito de sódio.

[00208] Alternativamente, em algumas concretizações, o desinfetante pode ser um meio, solução ou agente selecionado do grupo que compreende álcool, hidróxido de sódio, aldeídos, agentes oxidantes, peroxi e peroxoácidos, fenólicos, compostos de amônio quaternário, compostos inorgânicos (tais como cloro, iodo, ácidos e bases, metais) ou terpenos, etc. Tal como aqui utilizado, os desinfetantes também incluem antibióticos, tais como penicilinas, polimixinas, rifamicinas, lipiarmicinas, quinolonas ou sulfonamidas, etc.

[00209] É uma descoberta da presente divulgação que o contato do duodeno, uma porção do mesmo ou uma amostra retirada do mesmo com um desinfetante ou meio de higienização, solução ou agente resulta nos BGSCs obtidos da população de células, incluindo BGSCs, está substancialmente livre de patógenos e / ou livre de micróbios patogênicos e / ou benéficos. Qualquer técnico versado no assunto entenderá que fenômenos biológicos e químicos raramente, ou nunca, vão para a conclusão e / ou prosseguem para a perfeição ou alcançam ou evitam um resultado absoluto. O termo "substancialmente" é, portanto, usado aqui para capturar a falta potencial de completude inerente a muitos fenômenos biológicos e químicos. Por exemplo, em algumas concretizações, o termo "substancialmente livre de patógenos e / ou livre de micróbios patogênicos e / ou benéficos" pode se referir a uma situação em que a presença de patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos está em um nível que pode ser aceitável para o uso desejado ou pode não impedir o uso desejado dos BGSCs ou população de células incluindo BGSCs, ou a um nível que não pode ser detectado na amostra de interesse, conforme determinado por métodos comumente conhecidos. Esses métodos incluem por exemplo, testes de esterilidade padrão para bactérias gram +, gram-, bactérias aeróbias e anaeróbias, testes de micoplasma e endotoxinas. O mesmo se aplica ao termo "substancialmente livre de patógenos e / ou livre de micróbios patogênicos e / ou benéficos" em conexão com células ou populações de células diferentes de BGSCs obtidas de um tecido, ou porção de tecido ou amostra, de acordo com os métodos de esta divulgação.

[00210] Por conseguinte, as composições desta divulgação podem compreender BGSCs ou uma população de células incluindo BGSCs que são substancialmente livres de patógenos e / ou livres de micróbios patogênicos e / ou benéficos, expressando um ou mais dos marcadores Tra-l-60, Tra-l- 8l, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19 e ambos SOX17 e PDX1.

[00211] As composições desta divulgação também podem compreender BGSCs isolados ou outras células multipotentes, ou uma população de células incluindo tais células, em combinação com um meio fisiologicamente aceitável. Conforme usado neste relatório descritivo, o termo "meio fisiologicamente aceitável" se refere a qualquer meio que as práticas farmacêuticas convencionais usam para formular composições farmacêuticas para administração a um sujeito, como um paciente humano. O meio fisiologicamente aceitável pode compreender soro fisiológico ou uma solução isotônica contendo glicose e outros suplementos, tais como carboidratos, tais como glicose, manose, sacarose ou dextranos, manitol; proteínas; polipeptídeos ou aminoácidos, tais como glicina; antioxidantes; vitaminas, agentes quelantes como EDTA ou glutationa; adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio); e conservantes.

[00212] Por conseguinte, esta divulgação se refere a uma composição de BGSCs ou uma população incluinda BGSCs substancialmente livre de patógenos e / ou livre de micróbios patogênicos e / ou benéficos, expressando um ou mais de Tra- l-60, Tra-l-8l, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19 e ambos SOX17 e PDX1, e um meio fisiologicamente aceitável. Métodos de utilização de células-tronco/progenitoras da glândula de Brunner isoladas (BGSC)

[00213] As BGSCs e / ou população de células incluindo BGSCs aqui divulgados são contemplados para uso em tratamento médico.

[00214] Por exemplo, esta divulgação se refere a um método de tratamento de um sujeito diagnosticado com uma doença ou condição envolvendo ou afetando o fígado, pâncreas, estômago, duodeno, intestino delgado, intestino grosso, reto e / ou outro tecido endodérmico, compreendendo a administração a um sujeito em precisam disso uma quantidade eficaz de uma população de BGSCs.

[00215] Em algumas concretizações, esta divulgação se refere a um método de tratamento de um sujeito diagnosticado com uma doença ou condição envolvendo ou afetando o fígado, pâncreas, estômago, duodeno, intestino delgado, intestino grosso, reto e / ou outro tecido endodérmico que compreende a administração de um tecido endodérmico eficaz quantidade de uma população de células incluindo pelo menos alguns, ou uma porção substancial de, ou uma maioria de BGSCs que expressam um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em Tra-l-60, Tra-l-8l, OCT4, SOX2 , NANOG, EpCAM, SOX9 e CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19 e ambos SOX17 e PDX1.

[00216] Em outro aspecto, esta divulgação se refere a um método de célula autóloga ou terapia gênica compreendendo a administração de um número eficaz de BGSCs, ou população de células incluindo pelo menos alguns, ou uma porção substancial de, ou a maioria das BGSCs, que expressam um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em Tra-l-60, Tra-l-8l, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9 e CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19 e ambos SOX17 e PDX1, e que são ainda caracterizados como capazes de proliferação, com diferenciação limitada ou mínima, em condições de cultura que suportam a autorrenovação. Em algumas concretizações do método de célula autóloga ou terapia genética, as células são células geneticamente concebidas ou modificadas.

[00217] Em outro aspecto, esta divulgação se refere a um método de célula alogênica ou terapia gênica compreendendo a administração de um número eficaz de BGSCs ou uma população de células incluindo pelo menos alguns, ou uma porção substancial de, ou a maioria das BGSCs que expressam um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em Tra-l-60, Tra-l-8l, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9 e CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19 e ambos SOX17 e PDX1, e que são caracterizado ainda como capaz de proliferação, com diferenciação limitada ou mínima, em condições de cultura que suportam a autorrenovação. Em algumas concretizações do método de célula alogênica ou terapia gênica, as células são células modificadas ou geneticamente concebidas.

[00218] Em outro aspecto, esta divulgação se refere a um uso de BGSCs que expressam um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em Tra-l-60, Tra-l-8l, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9 e CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19 e ambos SOX17 e PDXland que são ainda caracterizados como capazes de proliferação, com diferenciação limitada ou mínima, em condições de cultura que suportam a auto-renovação para o tratamento de uma doença ou condição envolvendo ou afetando o fígado, pâncreas, estômago, duodeno, intestino delgado, intestino grosso, reto e / ou outro tecido endodérmico e / ou uso para células autólogas ou alogênicas ou terapia genética, opcionalmente com células que são geneticamente concebidas ou modificadas.

[00219] Em outro aspecto, esta divulgação se refere a um uso de população de células incluindo pelo menos alguns, ou uma porção substancial de, ou uma maioria de BGSCs, expressando um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em Tra-l-60, Tra-l-8 l, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9 e CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19 e ambos SOX17 e PDX1 para o tratamento de uma doença ou condição envolvendo ou afetando o fígado, pâncreas, estômago, duodeno, pequeno intestino, intestino grosso, reto e / ou outro tecido endodérmico e / ou uso para células autólogas ou alogênicas ou terapia genética, opcionalmente com células que são geneticamente concebidas ou modificadas.

[00220] Conforme usado neste relatório descritivo, "tratar" ou "tratamento" de uma doença em um sujeito se refere- a (1) prevenir que os sintomas ou doença ocorram em um sujeito que ainda não apresenta sintomas da doença ou exibe sintomas limitados; (2) inibir a doença ou interromper seu desenvolvimento; ou (3) melhorar ou causar regressão da doença ou dos sintomas da doença. Conforme entendido na técnica, "tratamento" é uma abordagem para obter resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clínicos. Para os fins da presente tecnologia, os resultados benéficos ou desejados podem incluir um ou mais, mas não estão limitados a, alívio, melhoria ou cessação de um ou mais sintomas, diminuição da extensão de uma condição (incluindo uma doença), estabilizado (ou seja, sem agravamento) estado de uma condição (incluindo doença), atraso ou desaceleração da progressão da condição (incluindo doença), melhoria ou paliação da condição (incluindo doença) estados e remissão (seja parcial ou total), sejam detectáveis ou indetectáveis.

[00221] Tal como aqui utilizado, o termo "quantidade eficaz" ou "quantidade eficaz" se refere a uma quantidade que é suficiente para tratar a doença ou condição a ser tratada. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens. Tal entrega depende de uma série de variáveis, incluindo o período de tempo em que a unidade de dosagem individual deve ser usada, a biodisponibilidade da composição, a via de administração, etc. Entende-se, no entanto, que quantidades específicas das composições para qualquer determinado paciente pode depender de uma variedade de fatores, incluindo a atividade do agente específico empregado, a idade, peso corporal, saúde geral, co-mobidades, sexo e dieta do paciente, o tempo de administração, a taxa de metabolismo e / ou excreção, a combinação da composição, a gravidade da doença ou condição específica (por exemplo, doença hepática) sendo tratada e a forma de administração Modos de Realizar a Divulgação

[00222] Esta divulgação aqui demonstra que: i) um duodeno humano e / ou animal contém células, incluindo dentro das glândulas de Brunner, que são aqui referidas como células-tronco/progenitoras da glândula de Brunner (BGSCs), com as características fenotípicas de células- tronco/progenitoras endodérmicas positivas para marcadores de pluripotência ou multipotência e outros biomarcadores de células-tronco ou “severidade”; ii) essas células têm um fenótipo distinto daquele das células-tronco intestinais nas criptas mucosas, incluindo, mas não se limitando a, expressão de Tra-l-60, Tral-8l, OCT4 e CK7; iii) essas células também têm um fenótipo distinto daquele das células-tronco hepáticas (que expressam SOX17, mas não PDX1) e daquele de células-tronco pancreáticas (que expressam PDX1, mas não SOX17), pois BGSCs podem expressar SOX17 e PDX1; iv) BGSCs podem ser isolados por produtos químicos, procedimentos ou métodos mecânicos e / ou cirúrgicos que destroem as células epiteliais da mucosa (vilosidades e criptas) pelo menos em parte, mas mantêm a camada submucosa pelo menos em parte; v) BGSCs podem ser selecionados in vitro, onde apresentam propriedades de autorrenovação, capacidade de se formar e crescer como esferoides, organoides, agregados celulares ou aglomerados de células e exibem multipotência; vi) in vivo, as BGSCs são capazes de enxertar em tecidos e se diferenciar em linhagens associadas a tais tecidos, por exemplo, enxerto no fígado de camundongos SCID e diferenciação em hepatócitos maduros.

[00223] As glândulas de Brunner são glândulas mucinosas únicas localizadas dentro da camada submucosa do duodeno. Estas glândulas não foram encontradas no estômago, nem nas outras porções do intestino delgado (isto é, jejuno e íleo) nem no intestino grosso. Suas principais funções conhecidas residem na produção de muco que protege a mucosa duodenal da acidez dos materiais vindos do estômago. O número de glândulas de Brunner diminui progressivamente do orifício pilórico em direção à flexura duodenojejunal, quase desaparecendo nas porções duodenal inferior e ascendente. Na parede duodenal, as glândulas de Brunner são separadas das criptas intestinais (ou glândulas) por mucosas muscolaris, mas estão em contato direto em continuidade anatômica com eles. As criptas intestinais contêm uma população específica de células-tronco implicadas na renovação contínua do epitélio intestinal, seguindo um eixo cripta-vilosidade.

[00224] Os dados fornecidos neste relatório descritivo estabelecem que, além das células mucinosas, as glândulas de Brunner abrigam uma população de células que expressam uma constelação específica de marcadores de células-tronco, como SOX9, Lgr5, EpCAM, CD44 e / ou SOX17 e PDX1. Essas células são pequenas, com citoplasma escasso e com alta razão núcleo-citoplasma, e seu fenótipo é compatível com o perfil do endoderma ventral em embriões. Além disso, uma subpopulação restrita dessas células (quase 5%) expressam marcadores de pluripotência, como Oct4A, SOX2, Tra-l-60 e Tra-1-81. Além disso, os BGSCs mostraram a expressão do marcador de proliferação PCNA, indicando, assim, sua atividade replicativa, provavelmente implicada na renovação de células produtoras de mucina. Curiosamente, a expressão dos marcadores de células-tronco foi precisamente distribuída: os fabricantes de pluripotência foram expressos em células localizadas em ácinos mais profundos, enquanto Lgr5 e PCNA estavam em células próximas à mucosa muscolaris e em continuidade com criptas intestinais. Esta distribuição sugere a presença de duas populações BGSC diferentes, mas sobrepostas: uma população tem um fenótipo primitivo, é quiescente e está localizada profundamente na submucosa; a outra mostra características de amplificação do trânsito, atravessa a mucosa muscolaris e está espacialmente associada a criptas intestinais. No entanto, tanto as populações BGSC “quiescentes” e amplificadoras de trânsito mostraram um fenótipo (Lgr5 + / VCK7 + / CKl9 + / Tra-l-60 +) que as distinguia claramente das células das criptas intestinais (Lgr5 + / CK7 / CKl9 + / Tra- l-60-).

[00225] Aspectos que são divulgados neste relatório descritivo se referem a uma abordagem que foi desenvolvida para isolar BGSCs, ou uma população com pelo menos alguns, ou uma parte substancial de, ou a maioria das BGSCs, do duodeno humano, incluindo: ruptura química, mecânica ou cirúrgica do camada mucosa para eliminar pelo menos parcialmente o epitélio da superfície, deixando um resto que pode expor a camada submucosa; digestão ou dissociação da camada submucosa; isolamento de células, ou uma população de células que inclui células, que expressam os marcadores descritos nesta divulgação; Este método pode incluir condições de seleção de cultura, como culturas de esferoides, organoides, agregados de células ou aglomerados de células mantidos em meio de Kubota sem soro. Uma vez isoladas, as células in vitro corresponderam ao fenótipo descrito no órgão (por exemplo, Lgr5 + /VCK7 + / CKl9 + / Tra-l-60 + / genes de pluripotência+), confirmando a depleção de células-tronco intestinais a partir da preparação celular. In vitro, as BGSCs foram capazes de crescer como esferoides, organoides, agregados celulares ou aglomerados de células e manter seu fenótipo indiferenciado com expressão nula de marcadores de células maduras e nenhuma evidência de produção de mucina. Notavelmente, as BGSCs foram capazes de amadurecer rapidamente em direção a vários destinos, incluindo pelo menos em relação às linhagens pancreáticas hepatocíticas, colangiocíticas e endócrinas, quando transferidos para condições de diferenciação específicas.

[00226] Curiosamente, um estudo anterior indicou que as células epiteliais e duodenais gástricas humanas não mostraram comportamento de células-tronco e multipotência (ver tabela) sem reprogramação. Os resultados aqui divulgados demonstram, ao contrário, que as células- tronco/progenitoras (BGSCs) são encontradas no duodeno humano e animal, incluindo as glândulas de Brunner. Dada a sua posição dentro do órgão, esses BGSCs ou uma população de células incluindo esses BGSCs são facilmente isoláveis usando os métodos descritos nesta divulgação e não precisam de reprogramação, mas mostram intrinsecamente características de haste / progenitor endodérmica, caráter e capacidades, e têm propriedades multipotentes.

[00227] Neste estudo, a capacidade de diferenciação para destinos endodérmicos maduros foi testada. Por exemplo, BGSCs foram injetados em fígados murinos por meio de uma rota vascular.

[00228] No campo das doenças hepáticas, o transplante ortotópico de fígado atualmente representa o único tratamento curativo para insuficiência hepática aguda e doença hepática crônica em estágio terminal. Uma vez que o transplante de fígado é limitado por uma grave escassez de doadores de órgãos, as estratégias de terapia celular podem representar uma opção alternativa viável para apoiar as funções hepáticas enquanto se aguarda a alocação de órgãos. No entanto, a abordagem da medicina regenerativa para doenças hepáticas requer a identificação de fontes de células sustentáveis e prontamente disponíveis.

[00229] Esta divulgação fornece um novo nicho de células-tronco com capacidade multipotente e os procedimentos para isolar as células aplicáveis do duodeno pós-natal. BGSCs humanos representam uma fonte potencial prontamente disponível obtida de doadores humanos. As células não requerem reprogramação genética ou manipulação importante e devem ser mais facilmente utilizáveis (e potencialmente uma abordagem mais segura) em programas clínicos em comparação com células reprogramadas. Além disso, eles têm o potencial único como uma fonte celular que pode ser recuperada por endoscopia e então usada para células autólogas ou alogênicas e terapias genéticas. Abreviações

[00230] AFP, α-fetoproteína; ALB, albumina; BTSCs, células-tronco da árvore biliar, CD, determinante comum; CD44, receptores de hialorÕnico; CD133, Prominina; CFTR, regulador da condutância transmembrana da fibrose cística; cGMP, boas práticas de fabricação atuais, € K, proteína citoqueratina; CXCR4, receptor CXC-quimiocina 4 (também chamado de fusina ou CD184; também chamado de fator plaquetário 4; DAPI, 6-diamidino-2-fenilindol; DPBS, solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco; EGF, fator de crescimento epidérmico, EpCAM, molécula de adesão de células epiteliais ; FBS, soro fetal bovino (ou FCS, soro fetal de bezerro), FGF, fator de crescimento de fibroblastos (FGF10 é uma das muitas formas de FGF); HBs, hepatoblastos; HDM, meio definido hormonalmente; HDM-C, um HDM projetado para células restritas de linhagem para colangiócitos; HDM-H, um HDM projetado para células restritas de linhagem para hepatócitos; HDM-P, um HDM projetado para células restritas de linhagem para um destino pancreático; HGF, fator de crescimento de hepatócitos, HpSCs, células-tronco hepáticas; IF, imunofluorescência; IHC, imunohistoquímica; KM, meio de Kubota, um meio sem soro projetado para células-tronco endodérmicas; KRT, gene da citoqueratina, Lgr5, Receptor 5 acoplado à proteína G contendo repetição rica em leucina que se liga à R-espondina; MKM, meio de Kubota modificado que consiste em meio de Kubota suplementado com cálcio, cobre e bFGF; NANOG, um fator de transcrição criticamente envolvido com a autorrenovação, NCAM, molécula de adesão de células neurais; NIS, simportador de sódio / iodeto; OCT4, (fator de transcrição de ligação a octâmero 4) também conhecido como POU5F1 (domínio POU, classe 5, fator de transcrição 1), um gene expresso por células-tronco; PBS, solução salina tamponada com fosfato; PDX1, homeobox 1 pancreático e duodenal, um fator de transcrição crítico para o desenvolvimento pancreático; PBGs, glândulas peribiliares, nichos de células-tronco para células-tronco da árvore biliar; RMPI, Roswell Memorial Park Institute - a sigla é usada para várias meios basais estabelecidas pelos investigadores do Instituto; RT-PCR, Reação em cadeia da polimerase por transcrição reversa; SALL4, proteína 4 semelhante ao Sal. considerada importante para a autorreplicação de células-tronco; SOX, caixa HMG relacionada a Sry; SOX2, um fator de transcrição essencial para a manutenção da autorrenovação ou piuripotência em células embrionárias e determinadas células-tronco.

SOX9, fator de transcrição associado aos tecidos endodérmicos

(fígado, intestino, árvore biliar e pâncreas); SOXI7, um fator de transcrição essencial para a diferenciação do fígado; VEGF, fator de crescimento de células endoteliais vasculares. árvore e pâncreas. Materiais e métodos Suprimento de tecido humano

[00231] Os duodenos humanos foram obtidos de doadores de órgãos do Departamento de Cirurgia Geral e Transplante de Órgãos “Paride Stefanini”, Universidade Sapienza de Roma, Roma, Itália. O consentimento informado para o uso de tecidos para fins de pesquisa foi obtido em nosso programa de transplante. Os protocolos receberam a aprovação do Conselho de Revisão Institucional e o processamento foi compatível com as Boas Práticas de Fabricação (cGMP) atuais. O protocolo de pesquisa foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética em Umberto I Policlinico de Roma. Meios e Soluções

[00232] Todos os meios foram filtrados por esterilização (filtro de 0,22 pm) e mantidos no escuro a 4 ° C antes do uso. RPMI-1640, o meio basal para todas as culturas de células, e soro fetal bovino (FBS) foram obtidos na GIBCO / Invitrogen (Carlsbad, CA). Todos os reagentes foram obtidos da Sigma (St. Louis, MO), a menos que especificado de outra forma. Os fatores de crescimento, exceto aqueles mencionados, foram adquiridos da R&D Systems (Minneapolis, MN).

[00233] O meio de Kubota (KM) consiste em qualquer meio basal (sendo RPMI 1640) sem cobre, baixo teor de cálcio (0,3 mM), 10 9 M de selênio, 0,1% de albumina de soro bovino

(BSA), 4,5 mM de nicotinamida, 0,1 nM de sulfato de zinco hepta-hidratado, 108 M de hidrocortisona (ou dexametasona), 5 µg / ml de transferrina / Fe, 5 µg / ml de insulina, 10 µg / ml de lipoproteína de alta densidade e uma mistura de ácidos graxos livres que são adicionados ligados à albumina de soro humano purificada. O protocolo detalhado de sua preparação foi relatado pela primeira vez por Kubota e Reid como um meio definido para hepatoblastos2. O Meio de Kubota já se mostrou eficaz para células-tronco hepáticas murinas, de roedores e humanas, células-tronco da árvore biliar, hepatoblastos, células-tronco derivadas da vesícula biliar e progenitores pancreáticos3-9.

[00234] Para estudos de diferenciação, KM livre de soro foi suplementado com cálcio (concentração final: 0,6 mM), cobre (1012 M) e 20 ng / ml de bFGF e referido como meio de Kubota modificado (MKM). O MKM foi usado como base e com suplementos específicos para preparar diferentes meios definidos hormonalmente (HDM) usados para induzir a diferenciação seletiva de células BG em relação aos destinos hepáticos (HDM-H) versus ilhotas pancreáticas (HDM-P): • HDM-H para diferenciação hepática: foi preparado suplementando MKM com 7 pg / L de glucagon, 2 g / L de galactose, lnM de triiodotiroxina 3 (T3), 10 ng / ml de Oncostatina M (OSM); 10 ng / ml de fator de crescimento epidérmico (EGF), 20 ng / ml de fator de crescimento de hepatócitos (HGF) e 1 pm de dexametasona. • HDM-P para diferenciação de células das ilhotas pancreáticas: MKM sem hidrocortisona, suplementado com 2% de B27, ácido ascórbico 0,1 mM, ciclopamina 0,25 pM, ácido retinóico 1 pM; O bFGF foi adicionado durante os primeiros 4 dias e depois substituído por 50 ng / ml de exendina-4 e 20 ng / ml de HGF. Procedimentos de classificação magnética

[00235] As células foram classificadas para EpCAM ou TRA-l-60 usando imunosseleção de esferas magnéticas por um protocolo especificado pelo fabricante (Miltenyi Biotec Inc., Alemanha). Resumidamente, as células positivas foram magneticamente marcadas com EpCAM MicroBeads (Miltenyi Biotec Inc., catálogo # 130-061-101) ou com TRA-l-60 MicroBeads (Miltenyi Biotec Inc., catálogo # 130-100- 832). Em seguida, a suspensão de células foi carregada em uma coluna MACS LS (Miltenyi Biotec Inc., catálogo # 130- 042-401) que foi colocada no campo magnético de um separador MACS. As células marcadas magneticamente foram retidas dentro da coluna enquanto as células não marcadas percorriam. Depois de remover a coluna do campo magnético, as células retidas magneticamente foram eluídas como uma fração de células selecionada positivamente. As células positivas foram avaliadas por contagem de células e viabilidade celular conforme descrito anteriormente. As células positivas foram suspensas em meio basal a uma concentração de 300.000 células por ml e usadas como a suspensão celular final. Recolheram-se alíquotas N. 4, contendo aproximadamente 200.000 células, para citometria de fluxo. Isolamento de células sob condições de GMP e teste de esterilidade

[00236] Para produzir células-tronco/progenitoras BG em condições de cGMP para futura aplicação clínica, duodena foram processados de acordo com “As regras que regem os medicamentos na União Europeia” e as diretrizes europeias de boas práticas de fabricação de medicamentos para uso humano (EudraLex - Volume 4 Good diretrizes de práticas de fabricação). O teste de esterilidade foi realizado sob condições cGMP por um “método de inoculação direta” e de acordo com as diretrizes de boas práticas de fabricação de medicamentos para uso humano e veterinário. Culturas celulares e expansão clonal

[00237] Células não classificadas e classificadas (aproximadamente 3 x 105), obtidas de espécimes duodenais, foram semeadas em placas de cultura de plástico de 3 cm de diâmetro e mantidas durante a noite (-12 horas) em KM com FBS a 10%. Posteriormente, as culturas de células foram mantidas em KM sem soro e observadas por pelo menos 2 meses. Para testar a expansão clonal, uma única suspensão de células foi obtida e as células foram plaqueadas a uma densidade de semeadura clonal de 500 células/cm2 em KM sem soro, um meio de autorreplicação. Preparação e cultura organoide

[00238] Após centrifugação, os sedimentos celulares foram suspensos em KM e 3 x 105 células foram colocadas em placas de cultura de plástico com 12 poços de 2,2 cm de diâmetro e mantidas durante a noite (-12 horas) em KM com FBS a 10%; depois disso, as culturas foram fornecidas com KM isento de soro. As células foram cultivadas em KM em incubadora a 37° C, com oxigênio atmosférico e 5% de CO2 por 1 semana permitindo a obtenção de mais população celular. Após 7 dias, as células foram removidas das placas de 12 poços e o pellet de células foi embebido em 400 µl de Matrigel frio (Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, fenol red-free). Os requerentes semearam um volume de 400 ml de gel, contendo 2 X 105 células por placa de 12 poços. Após a polimerização (15 min, 37° C), os géis foram cobertos com 500 mL de meio de cultura organoide. O meio de cultura organoide foi baseado em Ad- DMEM / Fl2 (Life Technologies) suplementado com B27, N2 (Life Technologies) e 1,25 mM de N-acetilcisteína (Sigma-Aldrich), 10 nM de gastrina (Sigma-Aldrich) e os fatores de crescimento : 50 ng / ml de EGF (Peprotech), l µg / ml R-Spondin-I humano recombinante (Perotech), 100 ng / ml de FGF10 (Peprotech), 25 ng / ml de HGF (Peprotech), 10 mM de nicotinamida (Sigma- Aldrich), 5 mM de A83-01 (Tocris) e 10 mM de Forskolin (FSK). Os aplicadores trocavam o meio a cada 2-3 dias, controlando o tamanho e o número de organoides microscopicamente.

[00239] Após 10-14 dias, os organoides foram removidos do Matrigel, usando solução de recuperação de células (Corning) e PBS gelado. Os organoides em géis de cultura foram suavemente interrompidos com solução de recuperação de células (Corning) para quebrar o Matrigel em pequenos fragmentos, preservando os organoides como esferas inteiras. Os organoides foram então centrifugados suavemente para obter organoides intactos coletados no fundo do tubo. A maior parte do sobrenadante foi removida com uma pipeta e os pellets organoides foram fixados com formalina a 4% para análise posterior.

Controles positivos

[00240] A linhagem de células embrionárias humanas pluripotentes Dl do clone NTERA-2 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA; código: 01071221) foi usada como controles positivos para marcadores de pluripotência (SOX2, OCT4A e NANOG), para citometria de fluxo, cultura de células e RT Experimentos - PCR10. Além disso, fragmentos de seminoma testicular humano têm sido usados como controles positivos para experimentos de imunohistoquímica em marcadores de pluripotência.

[00241] HT-29, uma linhagem de células de adenocarcinoma do cólon humano (LGC Standards SrL, Milan, Italy; código: ATCC-HTB-38) foi usado como controle positivo para o anticorpo Lgr5 para experimentos de citometria de fluxo e RT-PCR. Células de ilhotas pancreáticas normais têm sido utilizadas como controle para experimentos de diferenciação de ilhotas pancreáticas e foram adquiridas na ProdoLab, Irvine CA US (HIR-001)

[00242] Hepatócitos humanos primários (Clonetics™ Human Hepatocyte Cell Systems NHEPS ™ Cells, código: CC-2591 S) foram adquiridos comercialmente na Lonza (Basel, Suíça) e usados como um controle positivo para experiências de diferenciação de hepatócitos.

[00243] As células das ilhotas pancreáticas normais têm sido usadas como controle para experimentos de diferenciação das ilhotas pancreáticas e foram adquiridas na ProdoLab, Irvine CA US (HIR-001). Microscopia de luz (Imuno-histoquímica LML (IHC) e Imunofluorescência (IF)

[00244] As amostras foram fixadas em formalina tamponada a 10% por 2-4 horas, embebidas em parafina de fusão a baixa temperatura (55-57 ° C), e as seções de 3-4 µm foram coradas com hematoxilina-eosina e Sirius red / Fast green, de acordo com para protocolos padrão.

Para IHC, a atividade da peroxidase endógena foi bloqueada por uma incubação de 30 min em peróxido de hidrogênio metanólico (2,5%). Os antígenos foram recuperados, conforme indicado pelo vendedor, aplicando Proteinase K (Dako, código S3020) por 10 min em temperatura ambiente.

As seções foram então incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpos primários (Tabela 1 suplementar). As amostras foram enxaguadas duas vezes com PBS por 5 min, incubadas por 20 min em temperatura ambiente com anticorpo biotinilado secundário (LSAB + System-HRP, Dako, código K0690; Glostrup, Dinamarca) e depois com estreptavidina-HRP (LSAB + System-HRP, Dako, código K0690). Diaminobenzidina (Dako) foi usada como substrato, e os cortes foram contrastados com hematoxilina.

Para imunofluorescência em cultura de células, as câmaras de lâminas foram fixadas em acetona por 10 min em temperatura ambiente e, em seguida, enxaguadas com PBS-Tween 20. A ligação não específica à proteína foi bloqueada por 5% de soro de cabra normal.

As células fixas foram incubadas com anticorpos primários.

Em seguida, as células foram lavadas e incubadas por 1 h com anticorpos secundários específicos do isótipo marcado (anti-AlexaFluor-546 de camundongo, Alexafluor-488 anti-camundongo, Alexafluor-488 anti-coelho, AlexaFluor-546 anti-cabra, Invitrogen, Life Technologies Ltd, Paisley, UK) e contrastado com 4,6-diamidino-2- fenilindol (DAPI) para visualização dos núcleos das células. Para todas as imunorreações, controles negativos também foram incluídos e consistiram na substituição do anticorpo primário por soro pré-imune. As seções / culturas foram examinadas de forma codificada por Leica Microsystems DM 4500 B Light and Fluorescence Microscopy (Weltzlar, Alemanha) equipado com Jenoptik Prog Res C10 Plus Videocam (Jena, Alemanha). A coloração de IF também foi analisada por Microscopia Confocal (Leica TCS-SP2). As observações LM, IHC e IF foram processadas com um sisteme de análise de imagem (IAS - Delta Sistemi, Roma- Itália) e foram realizados de forma independente por dois pesquisadores de forma à cega.

[00245] A área ocupada pelos BGs foi avaliada por um Sistema de Análise de Imagens (IAS - Delta Sistemi, Roma- Itália). Usando-o, os Requerentes determinaram que o volume ocupado pelos BGs foi calculado como a área total ocupada pelos ácinos glandulares e expresso como a porcentagem em relação ao total da submucosa duodenal. Todas as contagens foram realizadas em seis campos não sobrepostos (ampliação x 20) para cada slide; pelo menos 3 lâminas diferentes foram retiradas de cada amostra.

[00246] Para a coloração IHC / IF, o número de células positivas foi contado de forma aleatória e cega em seis campos não sobrepostos (ampliação x 20) para cada lâmina / cultura e os dados são expressos como % de células positivas. As colorações IF também foram digitalizadas por um scanner digital (AperioScanscope FL System, Aperio Technologies, Inc, Oxford, UK) e processadas por ImageScope. Um algoritmo de análise de imagem foi usado para quantificar a proporção da área de pixel positiva para um fluoróforo único ou a área com co-localização de dois fluoróforos. Para testar a capacidade de armazenamento de glicogênio, um sistema de coloração de ácido periódico- Schiff (PAS) (Sigma Aldrich, INC, Catálogo No. 395) e a- amilase (Sigma Aldrich, INC, Catálogo No. A 3176) procedimento de digestão (seguido por corante PAS) foi usado de acordo com o procedimento do fabricante. Análise de citometria de fluxo (CF)

[00247] As células em cultura foram tripsinizadas, dissociadas por pipetagem suave e suspensas em aproximadamente 2 x 10 5células / ml em PBS. As células isoladas foram marcadas com anticorpos primários fluorescentes ou controles de isotipo. Para antígenos intracelulares, as células foram fixadas em paraformaldeído 4% e permeabilizadas com PBS-Saponina 0,5% - FCS 10%, antes da incubação com o anticorpo primário. Os anticorpos primários incluídos EpCAM (EpCAM-FITC, MiltenyiBiotec Inc., catálogo nº 130-080-301), Lgr5 (Lgr5-PE, Origene Technologies Inc., Rockville, MD, catálogo dos EUA nº TA40000l), TRA-l-60 (TRA -1-60-PE, MiltenyiBiotec Inc., catálogo # 130-100-347). As células foram analisadas por um citômetro de fluxo BD FACScanto ™ (Becton, Dickinson and Company, NJ, EUA). Dez mil eventos foram adquiridos e analisados pelo software BD FACSDiva ™ (Becton, Dickinson and Company, NJ, EUA). Reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa (análise RT-PCR1)

[00248] As extrações de RNA foram realizadas em tecidos ou culturas mantidas por 6 dias em KM sem soro e, em seguida, com uma incubação adicional de sete dias (13 dias no total) no KM ou em um dos HDMs. O RNA total foi extraído pelos procedimentos de Chomczynski e Sacchi u. A qualidade e a quantidade do RNA foram avaliadas com o RNA do Experion Automated Electrophoresis System equipado com o RNA StSens Analysis Chip (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, ETSA) como descrito anteriormente. As extrações de RNA foram realizadas em culturas mantidas por 6 dias em KM sem soro e que passaram por uma incubação adicional de sete dias (13 dias no total) no KM ou em um dos HDMs. A expressão dos genes albumina (ALB), citocromo P450 (CYP3A4), insulina (INS), Glucagon (GLUC), PDX-l, SOX17, OCT4A, SOX2 e NANOG foi realizada por transcrição reversa e amplificação por PCR realizada em um ambiente fechado tubo (OneStep RT-PCR da Qiagen, Hamburgo, Alemanha) em amostras de RNA total extraídas de células e tecidos. Esses genes foram co- amplificados com o gene housekeeping GAPDH usado como referência. A expressão gênica foi medida pela quantificação dos amplicons com microeletroforese capilar on-chip realizada com o Experion System (Bio-Rad, ETC). A expressão do gene de interesse foi calculada pela razão das concentrações do gene de interesse e do gene de referência GAPDH (relatado por instrumento em nmol / L) (Tabela Complementar 2). Transplante in vivo de BGSCs em fígados de camundongos normais

[00249] Cinco camundongos machos SCID (imunodeficiência combinada grave) foram alojados em uma sala a uma temperatura média constante de 22 ° C com um ciclo claro-escuro de 12 horas e livre acesso a ração padrão e água. Os protocolos do estudo foram realizados de acordo com nossas diretrizes institucionais. Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Diretiva EEG 2010/63 / EU da Sapienza ETniversity de Roma e Hospital Universitário Umberto I de Roma (Prot: 541). Suspensões de 2x10 6 de BGSCs humanos em 100 µl de solução salina foram injetadas no fígado através da artéria esplênica. Camundongos controles simulados foram infundidos apenas com 100 µl de solução salina. Todos os animais foram monitorados de perto até a recuperação e tiveram livre acesso a comida e água. Nenhuma mortalidade foi observada.

[00250] Um mês após o transplante, os animais foram sacrificados e seus fígados colhidos. Fragmentos de fígado foram colocados em formalina tamponada a 10% para histologia e imunohistoquímica e em reagente Trizol para análise de expressão gênica. Necrose e fibrose foram avaliadas respectivamente nas colorações de Hematoxilina e Eosina (H&E) e Sirius Red.

[00251] O enxerto de BGSC humano em fígados murinos e sua diferenciação foi avaliada por imuno-histoquímica para anticorpos anti-humanos (anti-mitocôndria humana, anti- HepPar-1 humano, anti-albumina humana) que não reagem com antígenos de camundongo como descrito em outro lugar. As lâminas coradas por imuno-histoquímica (mitocôndrias anti- humanas) foram digitalizadas por um scanner digital (Aperio Scanscope CS System, Aperio Technologies, Inc, Oxford, UK) processadas por ImageScope. Um algoritmo de análise de imagem foi quantificar a proporção da área ocupada por células anti-mitocôndrias humanas positivas.

[00252] O RT-PCR para albumina humana em camundongos foi realizado conforme descrito anteriormente. Resumidamente, iniciadores específicos para albumina humana (Tabela Suplementar 2) foram concebidos como sequência específica programável para discriminar especificamente o gene da albumina humana do gene murino, usando o Universal Probe Library Assay Design Center (Roche). Análise Estatística

[00253] Os dados são expressos como média ± desvio padrão (DP). As análises estatísticas foram realizadas pelo software estatístico SPSS (SPSS Inc. Chicago IL, EUA). As diferenças entre os grupos para parâmetros não normalmente distribuídos foram testadas pelos testes U de Mann- Whitney. A significância estatística foi definida para um valor de p <0,05. Exemplo 1 - Isolamento de células da mucosa

[00254] Duodenos humanos compreendendo ampola hepato- pancreática e pâncreas foram obtidos de doadores de órgãos do Departamento de Cirurgia Geral e Transplante de Órgãos “Paride Stefanini”, Universidade Sapienza de Roma, Roma, Itália. O consentimento informado para o uso de tecidos para fins de pesquisa foi obtido por meio de nosso programa de transplante. Todas as amostras derivaram de adultos com idades entre 19 e 73 anos. Os protocolos receberam a aprovação do nosso Comitê de Revisão Institucional e o processamento estava em conformidade com as Boas Práticas de Fabricação (cGMP) atuais. O protocolo de pesquisa foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Universitário Umberto I, Roma.

Um duodeno humano foi cuidadosamente separado do pâncreas, e o intestino contendo a ampola hepato-pancreática foi removido cirurgicamente.

O duodeno foi cortado em fatias com um bisturi.

Posteriormente, as amostras de tecido foram processadas conforme descrito anteriormente.

Em resumo, os tecidos foram digeridos em RPMI 1640 suplementado com 0,1% de albumina de soro bovino, 1 nM de selênio, antibióticos, colagenase tipo I (300 unidades de digestão de colágeno / ml) (Sigma-Aldrich Itália), 0,3 mg / ml de desoxi-ribonuclease (Sigma - Aldrich, Itália), a 37 ° C com agitação frequente durante 30-45 min.

As suspensões foram filtradas através de um filtro de malha metálica de 800 mícrons (IDEALE ACLRI9 aço inoxidável) e giradas a 270g por 10 min antes da ressuspensão.

Depois disso, as suspensões de células foram passadas consecutivamente por filtros de malha de 100 e 30 mícrons; em seguida, a contagem de células foi realizada por Fast-Read 102 (Biosigma Srl, Veneza, Itália) e a viabilidade celular pelo ensaio Trypan Blue (expressa como% de células viáveis sobre o total de células). O mesmo método previamente desenvolvido e utilizado com sucesso para o fígado e a árvore biliar, quando empregado no duodeno humano, resultou na criação de macroagregados.

Esses macroagregados continham células revestidas e trituradas, que constantemente (N = 10) levaram a células isoladas inviáveis e impossibilitaram a obtenção de culturas celulares.

Especulou-se que isso se deve às propriedades físicas e químicas dos tecidos digeridos que são altamente saturados com muco e produtos de degradação liberados pelas células epiteliais da mucosa, e que isso leva a uma espécie de teia molecular incorporando células que são esmagadas durante o procedimento. . Na verdade, os métodos estabelecidos em animais ou humanos para isolar células do intestino evitam a destruição do epitélio da mucosa.

[00255] Outra característica das culturas obtidas por este método foi a contaminação frequente (6/10). Diante desses resultados, uma estratégia adotada foi separar o epitélio da mucosa da submucosa para manter as glândulas de Brunner e evitar os problemas de contaminação microbiana descritos acima. Quatro estratégias diferentes foram tentadas: 1) dissecção cirúrgica (N = 3), 2) mucosectomia por injeção prévia de solução salina normal sob a mucosa (N = 3), 3) raspagem da mucosa (N = 3), 4) solubilização seletiva de a mucosa (N = 10). Todos os métodos se mostraram ilógicos e produziram resultados idênticos ao método inicial, com exceção da solubilização seletiva da mucosa do duodeno por uma solução detergente específica injetada na luz intestinal. Procedimentos de isolamento mal-sucedidos e abaixo do ideal

[00256] Um duodeno humano foi cuidadosamente separado do pâncreas e toda a parte do intestino contendo a ampola hepato-pancreática foi removida cirurgicamente. O duodeno foi cortado em fatias com um bisturi. Posteriormente, as amostras de tecido foram digeridas em RPMI 1640 suplementado com 0,1% de albumina de soro bovino, 1 nM de selênio, antibióticos, colagenase tipo I (300 unidades de digestão de colágeno / ml) (Sigma-Aldrich Itália), 0,3 mg / ml de desoxirribonuclease (Sigma -Aldrich, Itália), a 37° C com agitação frequente durante 30-45 min.

[00257] As suspensões foram filtradas através de um filtro de malha metálica de 800 mícrons (IDEALE ACLRI9 de aço inoxidável) e centrifugadas a 270g por 10 min antes da ressuspensão. Depois disso, as suspensões de células foram passadas consecutivamente por filtros de malha de 100 e 30 mícrons; em seguida, a contagem de células foi realizada por Fast-Read 102 (Biosigma Srl, Veneza, Itália) e a viabilidade celular pelo ensaio Trypan Blue (expressa como% de células viáveis sobre o total de células).

[00258] O mesmo método previamente desenvolvido e utilizado com sucesso para o fígado e a árvore biliar, quando empregado no duodeno humano (N = 5), resultou no isolamento de 40.816.000 (Desvio Padrão) células e apenas metade delas eram vitais pelos ensaios do Azul de Tripan (viabilidade 43 +/- 12,8%). Independentemente do número de células viáveis, as células isoladas foram incapazes de aderir e sobreviver em cultura onde apareceram macroagregados contendo células revestidas e esmagadas, levando à morte celular e impossibilitando a obtenção de culturas celulares. Além disso, as culturas obtidas por esse método estavam sempre contaminadas por bactérias (5/5).

[00259] Este resultado sem sucesso pode ser devido às propriedades físicas e químicas dos tecidos digeridos que estão altamente saturados com muco e produtos de degradação liberados pelas células epiteliais da mucosa, e que isso leva ao aprisionamento de células nos restos da mucosa e são esmagados durante o procedimento.

[00260] Outro ponto crucial foi a presença do nicho de células-tronco intestinais (criptas intestinais) dentro da camada mucosa. Diante desses achados, optamos por separar o epitélio da mucosa da submucosa. Isso foi feito por 4 estratégias diferentes: 1) dissecção cirúrgica (N = 3), 2) mucosectomia após injeção de solução salina normal sob a mucosa (N = 3), 3) raspagem da mucosa (N = 3) e 4) seletiva solubilização da camada mucosa (N = 10). A melhor estratégia em termos de remoção de mucosa foi a estratégia # 4, uma vez que as estratégias # 1-3 resultaram na remoção parcial da camada mucosa com a presença de criptas intestinais (FIG. 11). Além disso, a estratégia # 4 resultou na melhor abordagem em termos de isolamento e viabilidade celular. Solubilização seletiva da mucosa do duodeno por uma solução detergente específica injetada na luz intestinal.

[00261] Após a separação do duodeno próximo à cabeça do pâncreas, a ampola de Vater foi completamente removida e o intestino fechado por pinçamento com pinça cirúrgica. As extremidades do duodeno foram abertas; o muco intestinal foi removido espremendo-o para fora da incisão inferior, pressionando o tecido de cima para baixo. Esta parte da operação é muito importante, porque o tecido deve estar o mais livre de muco possível. Usando uma pipeta sorológica de 25 ml, aproximadamente 200 ml de água destilada (Gibco, Itália) foram injetados no duodeno a partir da incisão da extremidade superior; a incisão da extremidade inferior foi mantida pinçada para coletar a água (FIG. 8A). Depois disso, o intestino foi mantido completamente preenchido com água destilada pelo clampeamento de ambas as extremidades por cerca de 20 minutos para induzir dano osmótico seletivo às células epiteliais da mucosa. Desta forma, o duodeno ficará túrgido (FIG. 8B). Após a abertura da extremidade inferior e retirada da água, o duodeno interno foi lavado duas vezes com 100 ml de DPBS (Gibco), utilizando pipetas sorológicas de 25 ml. Usando uma pipeta sorológica de 25 ml, aproximadamente 200 ml de DPBS (Gibco, Itália) foram injetados no duodeno a partir da incisão da extremidade superior. Adotando procedimento semelhante, o duodeno interno foi preenchido e mantido preenchido por 1 minuto com a solução detergente (100 ml), constituída de 0,5 ml de Fosfatidilcolina (Sigma-Aldrich, Itália), 20 mg de ácido desoxicólico (Sigma-Aldrich, Itália), 99,5 ml de DPBS (Gibco, Itália). A solução foi novamente removida abrindo a extremidade inferior, e o duodeno interno foi lavado com 100 ml de DPBS. Finalmente, o duodeno foi transferido para uma placa de Petri estéril de 10 cm e aberta por uma incisão longitudinal (FIG. 8C).

[00262] Uma nova descamação da mucosa foi obtida com o uso de bisturi estéril tanto na direção para cima / para baixo quanto na transversal, prestando muita atenção para remover o muco da pequena plica (prega) do tecido. O tecido foi lavado em recipiente estéril com 100 ml de DPBS (Gibco, Itália). Uma passagem de esterilização foi obtida imergindo o tecido por alguns segundos em 200 ml de hipoclorito de sódio a 0,05% seguido por uma lavagem por enxágue com solução de DPBS. Em seguida, o tecido foi cortado em pequenos pedaços com tesoura estéril e bisturi. Após os procedimentos mecânicos e químicos para retirada da mucosa, os espécimes foram coletados e processados para análise histo-

morfológica. Posteriormente, os espécimes de tecido foram processados conforme descrito anteriormente (FIG. 8D). Resumidamente, os fragmentos de tecido foram coletados em dois tubos M (Milteny Biotec, Alemanha) preenchidos com tampão de digestão e agitados. Para atingir o estado de dissociação do tecido, foram realizados um ou dois ciclos do programa do Dissociador MACS (Milteniy Biotec, Alemanha) (a opacidade da solução deve ser observada juntamente com o escoamento de pedaços de tecido muito pequenos). O tampão de digestão foi pré-aquecido a 34 ° C por 10 minutos (a temperatura na qual a enzima tem a melhor eficiência). Após a dissecção mecânica, a solução contendo os fragmentos de tecido foi diluída em uma solução contendo DTT (Sigma- Aldrich, Itália) (ver detalhes da composição abaixo) e colocada em dois tubos Falcon de 50 ml.

[00263] Os tubos Falcon foram centrifugados durante 5 minutos a 1.300 rpm (300 g). Os peletes foram coletados e inseridos em um frasco de cultura de 75 cm quadrado na presença de 150 ml de tampão de digestão. O frasco foi lacrado com parafilme (Parafilm, EUA) e colocado horizontalmente em um aquecedor de água a 37 ° C e 5% de CO2 por cerca de 30 minutos com agitação de vez em quando para controlar a digestão. Em seguida, o frasco foi colocado verticalmente por aproximadamente 10 minutos para permitir que as células sedimentassem por gravidade. O sobrenadante flutuante na superfície da solução contém impurezas e pode ser descartado com uma pipeta sorológica de 10 ml.

[00264] Após a digestão enzimática, o tampão contendo os fragmentos de tecido foi colocado em quatro tubos Falcon de 50 ml. Os tubos Falcon foram centrifugados durante 5 minutos a 1.300 rpm (300 g). Os sedimentos foram recolhidos em dois tubos Falcon de 50 ml e diluídos com uma solução contendo DTT (ver detalhes da composição abaixo) e, em seguida, os tubos foram centrifugados durante 5 minutos a

1.300 rpm (300 g). Os sobrenadantes foram coletados e colocados em filtro de malha metálica de 800 mícrons (IDEALE ACLRI9 de aço inoxidável) para serem filtrados com nova lavagem celular. O material filtrado foi coletado em um recipiente estéril. Um raspador e o êmbolo de uma seringa (Terumo #SS - 20ES2) foram usados para facilitar a passagem e dissecar posteriormente o tecido durante a filtração. A suspensão resultante, em média 200 ml, foi tratada com dois frascos de DNase Pulmozyme 2500 U / 2,5 ml (Roche, Itália) (FIG. 8D). Isolamento de BGSC do duodeno fetal e da biópsia duodenal endoscópica realizada em indivíduos adultos

[00265] Os métodos de isolamento de BGSC de biópsias duodenais e órgão fetal são menos complexos em comparação com procedimentos otimizados para obtenção de células de duodeno adulto intacto.

[00266] As biópsias duodenais foram realizadas no nível do bulbo e distalmente usando uma pinça durante a gastroscopia no Departamento de Medicina Translacional e de Precisão. Este método é usado por gastroenterologistas treinados para obter material para um amplo espectro de doenças. O procedimento foi feito endoscopicamente com endoscópio flexível. O endoscópio foi introduzido por via oral. As biópsias foram obtidas à vista, evitando-se artérias ou veias. O exame histológico das biópsias coletadas revelou que os BGs estão presentes nas biópsias obtidas do bulbo, mas não do duodeno distal (FIG. 15A); Os BGs encontram-se na camada submucosa logo abaixo da muscular da mucosa. Em seguida, duas a quatro biópsias do bulbo duodenal por paciente foram coletadas durante esse procedimento e usadas para isolar células.

[00267] O duodeno fetal foi colhido de fetos (18ª, 22ª semanas: aborto terapêutico no Departamento de Ginecologia e Obstetrícia) por corte proximal ao nível do piloro e distalmente ao nível do ligamento de Treitz. O pâncreas e o ducto biliar intrapancreático foram removidos por eliminação ao nível da ampola hepato-pancreática.

[00268] Posteriormente, todo o duodeno fetal ou as biópsias dudenais inteiras foram posteriormente desagregados suavemente por bisturi e um dissociador MACS (Miltenyi Biotec), e digeridos em tampão contendo 300 U / ml de colagenase tipo I (Sigma Aldrich) e 0,3 mg / ml de desoxirribonuclease (Sigma Aldrich) durante 20-30 min a 37 ° C. Células isoladas de fresco foram imunosselecionadas para células TRA1 -60-positivas usando esferas magnéticas (Miltenyi biotec).

[00269] A classificação resultou no isolamento de uma média de 12 milhões de células viáveis do duodeno fetal (N = 3) e 100.000 células viáveis de biópsias do bulbo duodenal (N = 2). A duração do procedimento de isolamento foi em média 5 horas. As células foram suspensas em solução estéril de glicose a 10% a 1 milhão de células por ml e mantidas por 45 minutos sob temperatura controlada de 4° C antes da cultura. As células da glândula de Brunner auto-replicantes de acordo com este protocolo são mostradas na FIG. 15B. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com “As regras que regem os medicamentos na União Europeia” e as directrizes europeias de BPF para medicamentos de uso humano (EudraLex- Volume 4 Boas práticas de fabrico Guidelines). Os produtos celulares foram avaliados por testes de esterilidade padrão para bactérias gram +, gram-, aeróbias e anaeróbias, micetos e com testes de endotoxinas, Exemplo 2 - Caracterização de tecidos e células Estudos em tecido duodeno humano

[00270] A mucosa do duodeno humano adulto (N = 10) foi elevada em vilosidades intestinais e dobrada nas glândulas intestinais (criptas) que podiam ser cortadas A mucosa do duodeno humano adulto (N = 10) foi elevada em vilosidades intestinais e dobrada nas glândulas intestinais (criptas) que podiam ser cortadas transversalmente e observadas profundamente na lâmina própria (FIG. 1A). Nas porções proximais (superior e descendente) do duodeno, a submucosa continha elementos glandulares (glândulas duodenais ou glândulas de Brunner: BGs) que ocupavam coletivamente 9,95 ± 2,68% da área da submucosa e 4,62 ± 1,93% da área total da parede. Os BGs eram compostos principalmente de células mucinosas PAS-positivas (FIG. 1A). BGs estavam em continuidade anatômica com criptas intestinais através da mucosa muscolaris. Poucos ácinos BG estavam localizados dentro da lâmina própria da mucosa e estavam em continuidade com criptas intestinais (FIG. 1A). Nas porções distais do duodeno (inferior e ascendente), os

BGs desapareceram gradualmente com poucos elementos glandulares (quase 1 por campo 20x) na parte inferior e virtualmente sem glândulas na porção ascendente.

[00271] No duodeno humano, a análise imuno- histoquímica indicou que as células BG e criptas intestinais compartilham parcialmente características fenotípicas. No que diz respeito à expressão de citoqueratina, tanto as criptas intestinais quanto os BGs foram positivos para CK19; em contraste, a CK7 foi expressa especificamente por algumas células BG, mas não pelas glândulas intestinais (FIG. IB e FIG. 9). Ambas as glândulas intestinais e BGs continham células que expressam SOX9 (um marcador de células-tronco endodérmicas, FIG. 1C); em BGs, SOX9 foi co-expresso com CK7 nas mesmas células.

[00272] Além disso, as glândulas intestinais e BGs continham células que expressam PCNA, um marcador de proliferação e vários outros marcadores de células- tronco/progenitoras, como CD44, EpCAM e Lgr5 (FIG. 2A). Em BGs, Lgr5 co-localizado com SOX9 e sua expressão foi maior em ácinos localizados dentro da mucosa muscolaris e em continuidade com criptas intestinais do que em ácinos localizados mais profundamente dentro da camada submucosa (FIG. 10A).

[00273] Uma subpopulação de células BG expressou marcadores de pluripotência (FIG. 2). Curiosamente, Tra-l- 60 e Tra-l-8l foram expressos por células BG, mas não por células em criptas intestinais (FIG. 2A). Tra-l-60 co- localizado com SOX2 e Oct4A nas mesmas células BG (FIG. 2B). Finalmente, os BGs continham células que expressam NIS,

que também foi expresso por criptas intestinais (FIG. 10B).

[00274] Em resumo, a análise semiquantitativa da expressão do marcador de células-tronco/progenitoras revelou que os BGs compreendem um nicho composto por células SOX9 + (9,12% ± 3,30) e por células em proliferação (PCNA+: 4,82% ± 1,33). Além disso, o nicho de BGs continha células que expressam características de células-tronco endodérmicas, como Lgr5 (4,76% ± 1,04), EpCAM (8,80% ± 0,65); quase 5% das células expressaram marcadores de pluripotência, como Tra-l-60, Tra-l-8l, Oct4A e SOX2. Curiosamente, as células PCNA+ / SOX9+ / Lgr5+ foram mais numerosas em ácinos glandulares em continuidade direta com as glândulas intestinais (SOX9 + / Lgr5+: 11,80% ± 4,40; PCNA+: 5,95% ± 2,25; p <0,05) do que naqueles localizados mais profundamente na submucosa (SOX9+ / Lgr5+: 4,80% ± 1,50; PCNA+: 0,98% ± 0,62; p <0,05). Em contraste, as células pluripotentes eram mais numerosas nos ácinos localizados em uma posição mais profunda na camada submucosa. Estudos em tecido do duodeno de roedores

[00275] Como em humanos, o duodeno de roedores continha glândulas mucinosas, localizadas na submucosa. Roedores SGs estavam em conexão direta com criptas intestinais sem uma muscular da mucosa completa. Eles eram distinguíveis das criptas graças ao seu citoplasma claro devido ao conteúdo mucoso (FIG. 13A). Os GS foram restritos às porções proximais do duodeno de roedores. Quando a expressão de SOX9 e PCNA foi estudada, as células SOX9+ residiam em SGs, enquanto as células PCNA+ estavam localizadas principalmente em criptas (26,1 ± 5,7%)

com apenas algumas células SG sendo PCNA positivas (6,7 ± 2,2%; p <0,01 versus criptas). Os SGs e criptas duodenais também diferiram quanto à expressão de Ckl9, sendo o primeiro quase negativo e o último positivo (FIG. 13A). No jejuno de camundongo, as criptas continham células que são SOX9+, PCNA+ e Ckl9+ (FIG. 13B). Com base neste perfil fenotípico e na baixa porcentagem de células PCNA+ dentro de SGs, introduzimos um modelo de rastreamento de linhagem de camundongos Krtl9CreTdTomatoLSL para avaliar se a renovação de SG procedia de células Ckl9+ / PCNA+ dentro de criptas duodenais.

Em primeiro lugar, o jejuno foi analisado para estimar a eficiência de recombinação em criptas intestinais (FIG. 13C). A porcentagem de criptas positivas para td- Tomato (Td-Tom) foi de 72 ± 6% com criptas negativas localizadas ao lado das positivas.

As vilosidades acima das criptas td-Tom + resultaram sempre em td-Tom positivo enquanto, consequentemente, as vilosidades localizadas logo acima das criptas td-Tom- eram td-Tom negativo.

Quando os duodenos de camundongos foram examinados, Ckl9-SGs eram quase todos td6 Tom- incluindo células localizadas logo abaixo de 130 criptas td-Tom+ (FIG. 13C); e consistentemente, as células PCNA+ e SOX9+ dentro de SGs foram td-Tom- (FIG. 13D). Tomados em conjunto, esses dados indicam que a taxa de proliferação celular em SGs de roedores é menor em comparação com criptas duodenais.

Além disso, em condições fisiológicas, a renovação de SG não é suportada por células da cripta duodenal e as células SOX9+ e PCNA+ em SGs não derivam de células da cripta Ckl9+.

Procedimentos de isolamento e cultura de BGSC bem-sucedidos

[00276] Após o tratamento químico e mecânico dos tecidos duodenais como no Exemplo 1, o epitélio de superfície e quase todas as criptas da camada mucosa foram removidos, enquanto o tecido conjuntivo da lâmina própria e a mucosa muscolaris permaneceram (FIG. 3A). Isso permitiu a preservação dos BGs graças à sua posição anatômica abaixo da mucosa muscolaris e dentro da submucosa; consequentemente, os BGs pareceram intactos e retiveram suas células CK7+ (FIG. 3B), Tra-l-60+ (FIG. 3C) e SOX9+ (não mostrado).

[00277] A submucosa duodenal foi posteriormente processada conforme descrito nos métodos, e quase 350 ± 100 milhões de células foram isoladas com uma viabilidade> 80% (85 ± 5%). A FC mostrou que 40,0 ± 18,5% das células isoladas de fresco eram EpCAM+. Quando as células foram imunomarcadas para EpCAM, a população de células foi enriquecida em 70,3 ± 19,3% de células EpCAM+ (p <0,05 vs pré-classificação), das quais 46,3% ± 7,3 dessas células também eram Lgr5+ (FIG. 4A). As células isoladas do duodeno também foram investigadas por citometria de fluxo (FC) para a expressão de Tra-l-60. FC mostrou que 5,8 ± 1,6% das células isoladas de fresco eram Tra-l-60+. Quando as células foram imunomarcadas para Tra-l-60, a população de células foi enriquecida para 30,4 ± 19,8% de células Tra-l-60+ (p < 0,05 vs pré-classificação) e 7,3% ± 4,2 das células Tra-l- 60+ também eram EpCAM + (gráfico de dispersão representativo é mostrado na FIG. 4B). Após o immunosorting magnético, as populações de células contaminantes foram removidas por duas abordagens diferentes de seleção de cultura em plástico e como organoides. Em primeiro lugar, uma suspensão de célula única foi obtida e semeada a uma densidade de semeadura clonal de 500 células/cm2 em plástico em meio Kubota sem soro, um meio que permite a sobrevivência e autorreplicação de progenitores / tronco endodérmicos, mas não de células maduras, de células mesenquimais. Nessas condições, apenas Tra-l-60 +as células eram capazes de proliferação (FIG. 4C); elas começaram a proliferar após um período de atraso de 1-2 dias e formaram pequenos grupos de 10-15 células após 6-8 dias em cultura (FIG. 4C). Após 14 dias, grandes colônias foram observadas (FIG. 4C). Cada colônia foi formada principalmente por células pequenas (diâmetro = 12,06 ± 5,76 pm), densamente compactadas e uniformes, com uma alta razão núcleo-citoplasma. As condições de cultura de autorreplicação resultaram no desaparecimento de quase todas as células mesenquimais (não mostradas), conforme descrito anteriormente na seleção de cultura para BTSCs. Em segundo lugar, em condições de cultura adaptadas para a formação organoide, BGSCs individuais começaram a se auto-organizar como estruturas esféricas que se expandiram em tamanho e número. Geralmente, os organóides eram visíveis após 3-5 dias em cultura, e seus diâmetros médios atingiram 2,3 ± 5 mm em aproximadamente 13-14 dias.+ células que representam o fenótipo celular predominante formando os organóides (FIG. 4D). Traços fenotípicos de colônias 2D de BGSCs e organóides derivados de BGSC

[00278] Em plástico e em KM (condições de autorreplicação, FIG. 5A), a análise fenotípica demonstrou como as culturas eram compostas por células que expressam CK7, SOX9, EpCAM, Lgr5 e marcadores de pluripotência (SOX2, Tra-l-60, Tra-l- 8l).

[00279] Paralelamente, os organoides (FIG. 5B) eram compostos por células CK7+ e CKl9+; as células organoides expressaram marcadores de células-tronco endodérmicas (EpCAM, Pdxl) e marcadores de pluripotência (Oct4A e Tra-l- 60). Os organoides eram PAS negativos (característica de células caliciformes) e negativos para

[00280] vários marcadores de células maduras, como Villin, CFTR, Albumina, Hep-Par 1 e insulina (dados não mostrados).

[00281] O fenótipo BGSC foi ainda investigado por RT- PCR; a comparação com controles positivos adequados revelou que as BGSCs em monocamadas de plástico e em organoides expressaram biomarcadores de endoderme (por exemplo, EpCAM, SOX17 e PDX1, FIG. 5C) e genes de pluripotência (por exemplo, SOX2, OCT4A e NANOG, FIG. 5D). Nessas condições, as células foram em sua maioria negativas para marcadores de linhagens de hepatócitos (ou seja, albumina), colangiócitos (ou seja, CFTR) e células b-pancreáticas (ou seja, insulina) (dados não mostrados). Potencial de diferenciação in vitro de BGSCs

[00282] O potencial de diferenciação de células isoladas de BGs foi avaliado transferindo-as para meios distintos especificamente adaptados para induzir a diferenciação em linhagens hepáticas (HDM-H) ou pancreáticas endócrinas (HDM-P).

[00283] Após 7 a 14 dias em HDM-H (FIG. 6A), a morfologia da maioria das células mudou visivelmente, de células pequenas em forma de fuso para células em formato poligonal (cuboidal). Essas células agregaram-se para formar cordões multicelulares e tiveram um diâmetro maior em comparação com as células cultivadas em KM (p <0,01); o tamanho da célula correspondia ao dos hepatócitos humanos adultos normais, diplóides. O IF mostrou que essas grandes células poligonais expressavam albumina (FIG. 6A). Além disso, a coloração de PAS mostrou a presença de células PAS- positivas em HDM-H (FIG. 6A), mas não em células em KM (não mostrado) e, após digestão com a-amilase, nenhuma coloração de PAS visível foi detectável (não mostrado) . Isso apoiou a capacidade de armazenamento de glicogênio das células cultivadas em HDM-H. A análise de RT-PCR (FIG. 6A) demonstrou que as células em HDM-H tinham expressão aumentada de genes específicos de hepatócitos, incluindo albumina (~ 2 vezes), transferrina (intermediário ou zona 2;> 100 vezes) e CYP3A4 (metabolismo de drogas, gene tardio ou da zona 3;> 100 vezes) genes quando comparados com células em KM. Após 14 dias em HDM-P, foram observadas estruturas semelhantes a ilhotas; essas estruturas eram compostas por células densamente compactadas que expressam Ngn3 e insulina (FIG. 6B). Após 7 dias em HDM-P, a análise de RT-PCR demonstrou que a expressão do gene PDX1, mas não a insulina e o glucagon, aumentou em comparação com os achados nas células em KM (FIG. 12).

[00284] Após 14 dias em HDM-P, um aumento significativo na expressão do gene PDX1, insulina e glucagon foi detectado em comparação com as células em KM (FIG. 6B).

[00285] As células duodenais Tra-l-60 + SG podem ser rapidamente restritas in vitro ao destino b-pancreático e as SGs podem gerar espontaneamente células que expressam insulina in vivo. A potência de diferenciação in vitro de células isoladas de SGs duodenais foi avaliada transferindo- as para meio adaptado (PM) para induzir a diferenciação para linhagens de ilhotas pancreáticas endócrinas. Após 7 dias em PM, foi observada a presença de estruturas semelhantes a ilhotas raras (14 ± 0,5 por cultura) (FIG. 14A) A análise de RT-PCR indicou que PDX1, mas não o gene da insulina, foi regulado positivamente em PM em comparação com KM. Em paralelo, estruturas semelhantes a ilhotas mostraram expressão de PDX1, mas não de insulina, conforme determinado por análise de imunofluorescência (FIG. 14B). Após 14 dias em PM, o número de estruturas semelhantes a ilhotas aumentou significativamente em comparação com 7 dias (4,8 ± 0,8 por cultura; p <0,0l). A expressão do gene PDX1 foi maior em PM de 14 dias em comparação com KM, mas menor em comparação com PM de 7 dias com base na análise de RT-PCR (FIG. 14B). As expressões dos genes de insulina e glucagon foram extremamente aumentadas em 14 dias (FIG. 14C), atingindo os níveis de ilhotas pancreáticas usadas como controle. Após 14 dias, as células insulina + e glucagon + apareceram em estruturas semelhantes a ilhotas (FIG. 14C).

[00286] Para estudar a potência das células SG duodenais para se comprometer in vivo com o destino pancreático endócrino, investigamos se o diabetes induzido experimentalmente em camundongos poderia desencadear a aquisição de características pancreáticas específicas. Assim, dois modelos diferentes de estreptozotocina (STZ)

foram estudados. O modelo STZ de alta dose é caracterizado por um rápido aumento dos níveis glicêmicos e alta mortalidade. O modelo STZ de baixa dosagem mostrou um aumento mais lento e menos pronunciado da glicemia e sobrevida mais longa, permitindo um tempo de observação prolongado. Quando os camundongos foram tratados com altas doses de STZ e sacrificados após 14 dias, a extensão de SG duodenal foi aumentada em comparação com os controles (FIG. 14D). Além disso, uma maior porcentagem de células SG expressou PCNA, PDX1 e NGN3 em comparação com os controles (FIG. 14E-F). Finalmente, em 2/5 camundongos tratados com STZ, mas não nos controles, as células insulina + e glucagon + foram observadas em SGs duodenais (FIG. 14E-F). No entanto, nenhuma correlação foi encontrada com o perfil glicêmico. Estes dados estavam de acordo com a análise RT-PCR de espécimes de duodenos de roedores que são caracterizados por uma expressão aumentada de genes relacionados com o destino endócrino pancreático (FIG. 14G). Quando doses baixas de STZ foram administradas, essas características não apareceram (dados não mostrados). Finalmente, a expressão da insulina foi estudada em duodenos humanos obtidos de pacientes com diabetes tipo 2 (T2D). Células insulina + raras (<5%) podem ser encontradas em SGs duodenais de pacientes com DM2, mas não em indivíduos normais (FIG. 14H). Transplante in vivo de BGSCs humanos indiferenciados em fígados murinos

[00287] O potencial da BGSC para gerar hepatócitos maduros in vivo foi investigado por transplante no fígado de camundongos SCID, via injeção pela via vascular (injeção no baço). O enxerto de BGSCs foi avaliado por imunocoloração para anticorpos específicos que reagem apenas com antígenos humanos (isto é, mitocôndrias anti-humanas, núcleos anti- humanos, anti-albumina humana e anti-HepPar-l humano), conforme relatado anteriormente. Um mês após a injeção de células, células humanas (h) mitocondriais+ foram observadas em fígados murinos (FIG. 7A); as células positivas localizavam-se principalmente em torno dos espaços portais, e algumas células também se estendiam em direção a uma posição centrolobular. Em camundongos injetados, quase 5,1 ± 1,3% da massa de hepatócitos hospedeiros foi representada por antígeno humano +células (FIG. 7B). Além disso, h- mitocôndrias + células enxertadas foram positivas para os marcadores de hepatócitos maduros, tais como albumina (Fig. 7D) e HepPar-l (fig. 7E). Raramente, células positivas para núcleos anti-humanos foram observadas nos ductos biliares interlobulares. Estas células foram positivas para CK19 (dados não mostrados).

[00288] Para confirmar o enxerto e a diferenciação eficazes de hBGSCs transplantados, os Requerentes investigaram ainda a expressão de mRNA de albumina humana em fígados murinos. O mRNA da albumina humana foi mensurável no fígado colhido de camundongos injetados (FIG. 7C), mas não detectado nos camundongos de controle simulado (infundidos com solução salina).

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Célula-tronco / progenitora isolada de um duodeno (referida como célula-tronco / progenitora da glândula de Brunner ou BGSC) caracterizada pelo fato de que expressa um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em Tra-l-60, Tra-l -8l, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9 e citoqueratina 7 (CK7) e que ainda é capaz de proliferação, com diferenciação limitada ou mínima, em condições de cultura que suportam a autorrenovação.

2. BGSC isolada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é substancialmente livre de patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos.

3. BGSC isolada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pode ser proliferada, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos um mês.

4. BGSC isolada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pode ser proliferada, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos dois meses.

5. BGSC isolada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pode ser proliferada, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos seis meses.

6. BGSC isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pode ser proliferada, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos doze meses.

7. BGSC isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as condições de cultura que suportam a autorrenovação compreendem um meio sem soro, opcionalmente, Meio de Kubota.

8. BGSC isolada, de acordo com a reivindicação 1,

caracterizada pelo fato de que as condições de cultura que suportam a autorrenovação compreendem um meio contendo soro.

9. Célula-tronco / progenitora isolada de um duodeno (referida como célula-tronco / progenitora da glândula de Brunner ou BGSC), caracterizada pelo fato de que expressa um ou mais dos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em Lgr5, NIS, CD44 e CK19 e é o ainda capaz de proliferação, com diferenciação limitada ou mínima, em condições de cultura que suportam a autorrenovação.

10. BGSC isolada, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que é substancialmente livre de patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos.

11. BGSC isolada, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que pode ser proliferada, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos um mês.

12. BGSC isolada, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que pode ser proliferada, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos dois meses.

13. BGSC isolada, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que pode ser proliferada, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos seis meses.

14. BGSC isolada, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que pode ser proliferada, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos doze meses.

15. BGSC isolada, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que as condições de cultura que suportam a autorrenovação compreendem um meio sem soro, opcionalmente, Meio de Kubota.

16. BGSC isolada, de acordo com a reivindicação 9,

17. Célula-tronco / progenitora isolada de um duodeno (referida como célula-tronco / progenitora da glândula de Brunner ou BGSC), caracterizada pelo fato de que expressa SOX17 e PDX1 e é ainda capaz de proliferação, com diferenciação limitada ou mínima, sob cultura condições que apoiam a autorrenovação.

18. BGSC isolada, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que é substancialmente livre de patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos.

19. BGSC isolada, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que pode ser proliferada, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos um mês.

20. BGSC isolada, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que pode ser proliferada, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos dois meses.

21. BGSC isolada, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que pode ser proliferada, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos seis meses.

22. BGSC isolada, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que pode ser proliferada, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos doze meses.

23. BGSC isolada, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que as condições de cultura que suportam a autorrenovação compreendem um meio sem soro, opcionalmente, Meio de Kubota.

24. BGSC isolada, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que as condições de cultura que suportam a autorrenovação compreendem um meio contendo soro.

25. Célula-tronco / progenitora isolada de um duodeno (referida como uma célula-tronco / progenitora da glândula de Brunner ou BGSC), caracterizada pelo fato de que expressa um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em Tra-l-60, Tra-l- 8l, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44 e CK19, ou que expressa SOX17 e PDX1 e ainda é capaz de proliferação, com diferenciação limitada ou mínima, em condições de cultura que apoiar a autorrenovação.

26. BGSC isolada, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que é substancialmente livre de patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos.

27. BGSC isolada, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que pode ser proliferada, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos um mês.

28. BGSC isolada, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que pode ser proliferada, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos dois meses.

29. BGSC isolada, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que pode ser proliferada, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos seis meses.

30. BGSC isolada, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que pode ser proliferada, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos doze meses.

31. BGSC isolada, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que as condições de cultura que suportam a autorrenovação compreendem um meio sem soro, opcionalmente Meio de Kubota.

32. BGSC isolada, de acordo com a reivindicação 25,

33. População de células-tronco / progenitoras isoladas do duodeno caracterizada pelo fato de que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em Tra-l-60, Tra-l-8l, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9 e CK7.

34. População, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que é substancialmente livre de patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos.

35. População, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que pode se proliferar, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos um mês.

36. População, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que pode se proliferar, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos dois meses.

37. População, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que pode se proliferar, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos seis meses.

38. População, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que pode se proliferar, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos doze meses.

39. População, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que as condições de cultura que suportam a autorrenovação compreendem um meio sem soro, opcionalmente, Meio de Kubota.

40. População, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que as condições de cultura que suportam a autorrenovação compreendem um meio contendo soro.

41. População de células-tronco / progenitoras isoladas do duodeno, caracterizada pelo fato de que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em Lgr5, NIS, CD44 e CK19.

42. População, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que é substancialmente livre de patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos.

43. População, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que pode se proliferar, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos um mês.

44. População, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que pode se proliferar, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos dois meses.

45. População, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que pode se proliferar, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos seis meses.

46. População, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que pode se proliferar, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos doze meses.

47. População, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que as condições de cultura que suportam a autorrenovação compreendem um meio sem soro, opcionalmente Meio de Kubota.

48. População, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que as condições de cultura que suportam a autorrenovação compreendem um meio contendo soro.

49. População de células-tronco / progenitoras isoladas do duodeno, caracterizada pelo fato de que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam SOX17 e PDX1.

50. População, de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que é substancialmente livre de patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos.

51. População, de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que pode ser proliferada, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos um mês.

52. População, de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que pode se proliferar, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos dois meses.

53. População, de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que pode se proliferar, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos seis meses.

54. População, de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que pode se proliferar, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos doze meses.

55. População, de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que as condições de cultura que suportam a autorrenovação compreendem um meio sem soro, opcionalmente Meio de Kubota.

56. População, de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que as condições de cultura que suportam a autorrenovação compreendem um meio contendo soro.

57. População de células-tronco / progenitoras isoladas do duodeno, caracterizada pelo fato de que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em Tra-l-60, Tra-l-8 l, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44 e CK19, ou, em que pelo menos algumas, ou uma parte substancial de, ou a maioria das células expressam SOX17 e PDX1.

58. População, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que é substancialmente livre de patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos.

59. População, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que pode se proliferar, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos um mês.

60. População, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que pode ser proliferada, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos dois meses.

61. População, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que pode se proliferar, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos seis meses.

62. População, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que pode se proliferar, com diferenciação limitada ou mínima, por pelo menos doze meses.

63. População, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que as condições de cultura que suportam a autorrenovação compreendem um meio sem soro, opcionalmente Meio de Kubota.

64. População, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que as condições de cultura que suportam a autorrenovação compreendem um meio contendo soro.

65. Método para isolar uma ou mais BGSCs, ou a população de células, conforme definido pela reivindicação 33, reivindicação 41, reivindicação 49 e / ou reivindicação 57,

de um duodeno de um sujeito, uma porção do mesmo ou uma amostra retirada do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contatar uma camada mucosa de um duodeno, que está substancialmente livre de muco intestinal, com um meio ou solução com propriedades de osmolalidade fora de uma faixa fisiológica sob condições que induzem choque osmótico às células da camada mucosa; (b) remover ou dissolver pelo menos uma porção da camada mucosa ou das células desta por métodos mecânicos, cirúrgicos e / ou químicos, deixando e / ou expondo um restante que pode incluir uma camada submucosa; (d) digerir ou dissociar o restante; e (e) isolar uma ou mais BGSC ou a população de células conforme definido pela reivindicação 33, reivindicação 41, reivindicação 49 e / ou reivindicação 57 a partir do restante digerido.

66. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que a etapa de isolamento compreende isolar BGSCs que expressam, ou uma população de BGSCs em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam, um ou mais marcadores selecionados a partir de grupo Tra-l-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44 e CK19.

67. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que a etapa de isolamento compreende isolar BGSCs, que expressam, ou uma população de BGSCs em que pelo menos algumas, ou uma parte substancial de, ou a maioria das células expressam, SOX17 e PDX1.

68. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que o tecido duodeno é tornado substancialmente livre de muco intestinal, opcionalmente, ao apertar o tecido duodeno.

69. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que o meio ou solução com propriedades de osmolalidade fora de uma faixa fisiológica compreende uma solução hipotônica, hipoosmótica, hipertônica ou hiperosmótica.

70. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que o meio com propriedades de osmolalidade fora de uma faixa fisiológica compreende uma solução de glicose, uma solução com alto teor de sal ou água destilada.

71. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que a remoção de pelo menos uma porção da camada mucosa ou das células desta é realizada por rompimento químico, que compreende o uso de um emulsificante e / ou detergente.

72. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que o detergente e / ou emulsificante está em água, solução salina e / ou um tampão.

73. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que o detergente e / ou emulsificante é aplicado por um breve período (menos de 15 minutos).

74. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que o emulsificante é selecionado a partir de um grupo que compreende lecitina, monolaurato de polioxietileno sorbitano (polissorbato 20), monooleato de polioxietileno sorbitano (polissorbato 80), monopalmitato de polioxietileno sorbitano (polissorbato 40), polioxostearato de sorbitano ), Polioxietileno sorbitano Triestearato (polissorbato 65), fosfatídeos de amônio, sais de sódio, potássio e cálcio de ácidos graxos, sais de magnésio de ácidos graxos, mono- e diglicerídeos de ácidos graxos, ésteres de ácido acético de mono- e diglicerídeos de ácidos graxos, ésteres de ácido lático de mono - e diglicerídeos de ácidos graxos, ésteres de ácido cítrico de mono- e diglicerídeos de ácidos graxos, ésteres de ácido mono- e diacetil tartárico de mono- e diglicerídeos de ácidos graxos, ésteres de ácido tartárico e acético misto de mono e diglicerídeos de ácidos graxos, Ésteres de sacarose de ácidos graxos, sucroglicerídeos, ésteres de poliglicerol de ácidos graxos, poliglicerol poliricinoleato, propano, 2-diol ésteres de ácidos graxos, óleo de soja termicamente oxidado interagindo com mono- e diglicerídeos de ácidos graxos, estearoilato de sódio-2-estearoilato de sódio, Estearoil-2- Lactilato de Cálcio, Monoestearato de Sorbitano, Triestearato de sorbitano, monolaurato de sorbitano, monooleato de sorbitano, monopalmitato de sorbitano e suas combinações.

75. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que o detergente é selecionado a partir de um grupo que compreende o ácido l- heptanossulfônico, N-Laurilsarcosina, Lauril Sulfato, 1 - Octano Sulfônico Ácido e Ácido Taurocólico, Cloreto de Benzalcônio, Cetilpiridínio, Cloreto de Metilbenzetônio,

Brometo de Decametônio, Alquil Betainas, Alquil Amidoalquil Betainas, N-Dodecmonil-l-Nodecmonil-Dimetil, Propanossulfonato, Fosfatidilcolina, N-Decil AD- Glucopiranosídeo, N-Decil AD-Maltopiranosídeo, N-Dodecil BD- Maltosídeo, N-Octil BD-Glucopiranosídeo, N-Tetradecil BD- Maltosídeo, Tritons (Triton X-100), Nonidet-40, Poloxamer 188, Lauril Sulfato de Sódio, Desoxicolato de Sódio, Dodecil Sulfato de Sódio e suas combinações.

76. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que o restante compreende uma camada submucosa.

77. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que a digestão ou dissociação é realizada enzimaticamente.

78. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que a amostra de tecido é picada antes da etapa de digestão ou dissociação.

79. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que a etapa de digestão ou dissociação e / ou a etapa de isolamento é realizada em placas de baixa fixação.

80. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que a etapa de isolamento é realizada usando seleção de cultura com condições de cultura que compreendem um meio sem soro, opcionalmente, Meio de Kubota.

81. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que a etapa de isolamento é realizada usando seleção de cultura com condições de cultura que compreendem um meio contendo soro.

82. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que as células isoladas são cultivadas sob condições que suportam ou produzem esferoides, um ou mais organoides, aglomerados de células ou agregados de células.

83. Método de isolamento de um ou mais BGSCs, ou a população de células, conforme definido pela reivindicação 33, reivindicação 41, reivindicação 49 e / ou reivindicação 57 de um duodeno de um sujeito, uma porção do mesmo ou uma amostra retirada do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas seguintes, nas quais a etapa para matar, inativar ou remover substancialmente os patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos pode ser realizada a qualquer momento ou mais de uma vez: (a) remover o muco intestinal; (b) aplicar um meio ou solução com propriedades de osmolalidade fora de uma faixa fisiológica em condições sob condições que induzem choque osmótico nas células da camada mucosa; (c) remover ou dissolver pelo menos uma porção da camada mucosa ou das células desta por métodos mecânicos, cirúrgicos e / ou químicos, deixando e / ou expondo um resto que pode incluir uma camada submucosa; (d) aplicar à camada mucosa e / ou ao restante um meio ou solução para matar, inativar ou remover substancialmente patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos; (e) aplicar digestão ou dissociação à camada submucosa para produzir uma digestão, material celular dissociado ou uma suspensão de células; (f) opcionalmente, cultivar pelo menos parte do material digerido, celular dissociado ou células da suspensão celular; e (g) isolar as células que expressam, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam, um ou mais de Tra-l-60, Tra-l-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19; e / ou as células que expressam SOX17 e PDX1.

84. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que a remoção do muco intestinal compreende apertar o tecido duodeno.

85. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o meio ou solução com propriedades de osmolalidade fora de uma faixa fisiológica compreende uma solução hipotônica, hipoosmótica, hipertônica ou hiperosmótica.

86. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o meio ou solução com propriedades de osmolalidade fora de uma faixa fisiológica compreende uma solução de glicose, uma solução com alto teor de sal ou água destilada.

87. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que a remoção é realizada por rompimento químico que compreende o uso de um emulsificante e / ou detergente.

88. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o detergente e / ou emulsificante está em água, solução salina e / ou um tampão.

89. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o detergente e / ou emulsificante é aplicado por um breve período (menos de 15 minutos).

90. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o detergente é selecionado a partir de um grupo que compreende o ácido l- heptanossulfônico; N-Laurilsarcosina, Lauril Sulfato, 1 - Octano Sulfônico Ácido e Ácido Taurocólico, Cloreto de benzalcônio, cetilpiridínio, cloreto de metilbenzetônio, brometo de Decametônio, Alquil Betainas, Alquil Amidoalquil Betainas, N-Dodecmonil-l-Nodecmonil-Dimetil, Propanossulfonato, Fosfatidilcolina, N-Decil AD- Glucopiranosídeo, N-Decil AD-Maltopiranosídeo, N-Dodecil BD- Maltosídeo, N-Octil BD-Glucopiranosídeo, N-Tetradecil BD- Maltosídeo, Tritons (Triton X-100), Nonidet -40, Poloxamer 188, Lauril Sulfato de Sódio, Desoxicolato de Sódio, Dodecil Sulfato de Sódio e suas combinações.

91. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o emulsificante é selecionado a partir de um grupo que compreende bLecitina, Monolaurato de Sorbitano de Polioxietileno (Polissorbato 20), Monooleato de Sorbitano de Polioxietileno (Polissorbato 80), Monopalmitato de Sorbitano de Polioxietileno (Polissorbato 40), Monolaurato de Polioxietileno Sorbitano , Triestearato de polioxietileno sorbitano (polissorbato 65), fosfatídeos de amônio, sais de sódio, potássio e cálcio de ácidos graxos, sais de magnésio de ácidos graxos, mono- e diglicerídeos de ácidos graxos, ésteres de ácido acético de mono e diglicerídeos de ácidos graxos Ésteres de mono e diglicerídeos de ácidos graxos, ésteres de ácido cítrico de mono e diglicerídeos de ácidos graxos, ésteres de ácido mono- e diacetil tartárico de mono e diglicerídeos de ácidos graxos,Ésteres de ácido tartárico e acético misto de mono e diglicerídeos de ácidos graxos, ésteres de sacarose de ácidos graxos, sucroglicerídeos, ésteres de poliglicerol de ácidos graxos, poliglicerol poliricinoleato, propano, ésteres de 2- dióis de ácidos graxos, óleo de soja termicamente oxidado com mono- e diglicerídeos de ácidos graxos, estearoil-2- lactilato de sódio, estearoil-2-lactilato de cálcio, monoestearato de sorbitano, triestearato de sorbitano, monolaurato de sorbitano, monooleato de sorbitano, monopalmitato de sorbitano e suas combinações.Triestearato de sorbitano, monolaurato de sorbitano, monooleato de sorbitano, monopalmitato de sorbitano e suas combinações.Triestearato de sorbitano, monolaurato de sorbitano, monooleato de sorbitano, monopalmitato de sorbitano e suas combinações.

92. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o restante compreende uma camada submucosa.

93. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o meio ou solução para matar, inativar ou remover substancialmente patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos compreende uma solução aquosa de hipoclorito de sódio (NaClO) ou qualquer solução (ões) ou agente (s) usado para desinfecção de pele ou superfícies.

94. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que a aplicação de um meio ou solução para matar, inativar ou remover substancialmente patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos ocorre antes da aplicação do detergente e / ou emulsificante, ou ocorre após a digestão ou dissociação, ou ocorre após a remoção do muco.

95. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que a digestão ou dissociação é realizada enzimaticamente.

96. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que a amostra de tecido é picada antes da etapa de digestão ou dissociação.

97. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que a etapa de digestão ou dissociação e / ou a etapa de isolamento é realizada em placas de baixa fixação.

98. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que a etapa de isolamento é realizada usando seleção de cultura com condições de cultura que compreendem um meio sem soro, opcionalmente, Meio de Kubota.

99. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que a etapa de isolamento é realizada usando uma seleção de cultura com condições de cultura que compreendem um meio contendo soro.

100. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que as células isoladas são cultivadas em condições que suportam ou produzem esferoides, um ou mais organoides, aglomerados de células ou agregados celulares.

101. Esferoide, organoide, agregado celular ou grupo de células produzido por cultura das células, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1, 9, 17 ou 25, ou a população de células, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 33, 41, 49 ou 57 caracterizado pelo fato de que está em uma placa de fixação baixa.

102. Esferoide, organoide, agregado celular ou grupo de células produzido por cultura das células, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1, 9, 17 ou 25, ou a população de células, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 33, 41, 49 ou 57 caracterizado pelo fato de que suspensão ou condições de cultura 3D.

103. Método de tratamento de um sujeito diagnosticado com uma doença ou condição envolvendo ou afetando o fígado, pâncreas, estômago, intestino ou outro tecido endodérmico, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um sujeito em necessidade de uma quantidade eficaz de BGSCs ou uma população de BGSCs.

104. Método de tratamento de um sujeito diagnosticado com uma doença ou condição envolvendo ou afetando o fígado, pâncreas, estômago, intestino ou outro tecido endodérmico, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade eficaz das células conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1, 9, 17 ou 25

105. Método de tratamento de um sujeito diagnosticado com uma doença ou condição envolvendo ou afetando o fígado,

pâncreas, estômago, intestino ou outro tecido endodérmico, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade eficaz da população de células, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 33, 41, 49 ou

57.

106. Método de célula autóloga ou terapia gênica, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de um número eficaz de células conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1, 9, 17 ou 25, ou população de células, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 33, 41, 49 ou 57.

107. Método de célula alogênica ou terapia gênica, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de um número eficaz de células, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1, 9, 17 ou 25, ou população de células, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 33, 41, 49 ou 57.

108. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 103, 104, 105, 106 e / ou 107, caracterizado pelo fato de que as células são células geneticamente concebidas ou modificadas.

109. Uso das células conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1, 9, 17 ou 25 caracterizado pelo fato de que é para o tratamento de uma doença ou condição envolvendo ou afetando o fígado, pâncreas, estômago, intestino ou outro tecido endodérmico para células autólogas ou alogênicas ou terapia gênica para um humano e / ou animal.

110. Uso da célula conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1, 9, 17 ou 25, caracterizado pelo fato de que é apresentado na reivindicação 109, em que as células são geneticamente concebidas ou modificadas.

111. Uso da população das células, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 33, 41, 49 ou 57, caracterizado pelo fato de que é para o tratamento de uma doença ou condição envolvendo ou afetando o fígado, pâncreas, estômago, intestino ou outro tecido endodérmico, para células autólogas ou alogênicas ou terapia gênica para um ser humano e / ou animal.

112. Uso de uma população de células, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 33, 41, 49 ou 57, caracterizado pelo fato de que é estabelecida na reivindicação 111, na qual as células são geneticamente modificadas ou modificadas.

113. Esferoide, organoide, agregado celular ou grupo de células, de acordo com a reivindicação 101 ou 102, caracterizado pelo fato de que compreende ainda condições de cultura que são capazes de diferenciar BGSCs, ou a população de células, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 33, 41, 49 ou 57, em células de estágios de linhagem posteriores, incluindo células maduras.

114. Método para isolar células-tronco / progenitoras da glândula de Brunner (BGSCs), ou uma população, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 33, 41, 49 ou 57, de um duodeno de um sujeito, uma porção do mesmo ou uma amostra retirada do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) digerir ou dissociar um duodeno, uma porção do mesmo, ou uma amostra retirada do mesmo para fornecer um material celular digerido ou dissociado; (b) obter o material celular digerido ou dissociado: (i) as células que expressam, ou uma população de células em que pelo menos algumas, uma porção substancial ou a maioria das células expressam, um ou mais de Tra-l -60, Tra-l-8l, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44 e CK19; e / ou (ii) aquelas células que expressam, ou uma população de células em que pelo menos algumas, uma porção substancial ou a maioria das células expressam, tanto SOX17 quanto PDX1.

115. Método, de acordo com a reivindicação 114, caracterizado pelo fato de que o duodeno, uma porção do mesmo, uma amostra retirada do mesmo, a digestão, o material celular dissociado ou combinações dos mesmos, são colocados em contato com um meio ou solução para matar, inativar ou remover substancialmente os patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos.

116. Método de isolamento de uma ou mais células multipotentes que expressam um ou mais biomarcadores desejados, ou uma população de células em que pelo menos alguns, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais biomarcadores desejados, de um tecido (ou porção ou amostra do mesmo) tendo uma camada mucosa e uma camada submucosa caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas, que podem ocorrer na seguinte sequência ou, em outras concretizaçoes, podem ocorrer em uma sequência diferente: (a) contatar uma camada mucosa de um tecido tendo uma camada mucosa e uma camada submucosa com um meio ou solução tendo propriedades de osmolalidade que caem fora de uma faixa fisiológica sob condições que induzem choque osmótico para as células da camada mucosa; (b) remover ou dissolver pelo menos uma porção da camada mucosa ou das células desta por métodos mecânicos, cirúrgicos e / ou químicos, deixando e / ou expondo um restante, que pode incluir uma camada submucosa; (c) contatar o restante com um meio ou solução para matar, inativar ou remover substancialmente patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos; (d) digerir ou dissociar o restante; (e) isolar uma ou mais células multipotentes, ou uma população de células em que pelo menos algumas, ou uma porção substancial de, ou a maioria das células expressam um ou mais biomarcadores desejados.

117. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a remoção do muco superficial.

118. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que o meio ou solução com propriedades de osmolalidade fora de uma faixa fisiológica compreende uma solução hipotônica, hipoosmótica, hipertônica ou hiperosmótica.

119. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que o meio ou solução com propriedades de osmolalidade fora de uma faixa fisiológica compreende uma solução de glicose, uma solução com alto teor de sal ou água destilada.

120. Método, de acordo com a reivindicação 116,

caracterizado pelo fato de que a remoção é realizada por rompimento químico, que compreende o uso de um emulsificante e / ou detergente.

121. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o detergente e / ou emulsificante está em água, solução salina e / ou um tampão.

122. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que o detergente e / ou emulsificante é aplicado por um breve período (menos de 15 minutos).

123. Método, de acordo com a reivindicação 120, caracterizado pelo fato de que o emulsificante é selecionado a partir de um grupo que compreende lecitina, monolaurato de polioxietileno sorbitano (polissorbato 20), monooleato de polioxietileno sorbitano (polissorbato 80), monopalmitato de polioxietileno sorbitano (polissorbato 40), monolaurato de polioxietileno sorbitano , Triestearato de polioxietileno sorbitano (polissorbato 65), fosfatídeos de amônio, sais de sódio, potássio e cálcio de ácidos graxos, sais de magnésio de ácidos graxos, mono- e diglicerídeos de ácidos graxos, ésteres de ácido acético de mono e diglicerídeos de ácidos graxos Ésteres de mono e diglicerídeos de ácidos graxos, ésteres de ácido cítrico de mono e diglicerídeos de ácidos graxos, ésteres de ácido mono- e diacetil tartárico de mono e diglicerídeos de ácidos graxos,Ésteres de ácidos graxos mistos e acéticos tartáricos de mono e diglicerídeos de ácidos graxos, ésteres de sacarose de ácidos graxos, sucroglicerídeos, ésteres de poliglicerol de ácidos graxos, poliricinoleato de poliglicerol, propano, ésteres de 2-dióis de ácidos graxos, óleo de soja termicamente oxidado Interage com Mono- e Diglicerídeos de Ácidos Graxos, Estearoil-2- Lactilato de Sódio, Estearoil-2-Lactilato de Cálcio, Monoestearato de Sorbitano, Triestearato de Sorbitano, Monolaurato de Sorbitano, Monooleato de Sorbitano e Monopalmitato de Sorbitano.Monolaurato de Sorbitano, Monooleato de Sorbitano e Monopalmitato de Sorbitano.Monolaurato de Sorbitano, Monooleato de Sorbitano e Monopalmitato de Sorbitano.

124. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que o detergente é selecionado a partir de um grupo que compreende o ácido l- heptanossulfônico; N-Laurilsarcosina, Lauril Sulfato, ácido 1-Octano Sulfônico e Ácido Taurocólico, Cloreto de Benzalcônio, Cetilpiridínio, Cloreto de Metilbenzetônio, Brometo de Decametônio, Alquil Betainas, Alquil Amidoalquil Betainas, N-Dodecmonil-l-Nodecmonil-Dimetil, Propanossulfonato, Fosfatidilcolina, N-Decil AD- Glucopiranosídeo, N-Decil AD-Maltopiranosídeo, N-Dodecil BD- Maltosídeo, N-Octil BD-Glucopiranosídeo, N-Tetradecil BD- Maltosídeo, Tritons (Triton X-100), Nonidet-P-40, Poloxamer 188, Lauril Sulfato de Sódio, Desoxicolato de Sódio e Dodecil Sulfato de Sódio.

125. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o meio ou solução para matar, inativar ou remover substancialmente patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos compreende uma solução aquosa de hipoclorito de sódio (NaClO) ou qualquer solução (ões) ou agente (s) usado para desinfecção da pele ou superfícies.

126. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que a aplicação de um meio ou solução para matar substancialmente, inativar ou remover patógenos e / ou micróbios patogênicos e / ou benéficos ocorre antes da aplicação do detergente e / ou emulsificante, ou ocorre após a digestão ou dissociação, ou ocorre após a remoção do muco.

127. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que o restante compreende uma camada submucosa.

128. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que a digestão ou dissociação é realizada enzimaticamente.

129. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que a amostra de tecido é picada antes da etapa de digestão ou dissociação.

130. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que a digestão ou dissociação quebra o tecido submucoso em uma suspensão de células, mistura de células, aglomerados, aglomerados ou agregados e / ou fragmentos de tecido.

131. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que a etapa de isolamento é realizada usando seleção de cultura com condições de cultura compreendendo um meio sem soro, opcionalmente, Meio de Kubota.

132. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que a etapa de isolamento é realizada usando seleção de cultura com condições de cultura compreendendo um meio contendo soro.

133. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que a etapa de isolamento é realizada em placas de fixação baixas.

134. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que as células isoladas ou população de células são cultivadas sob condições que suportam ou produzem esferoides, um ou mais organoides, grupos de células ou agregados de células

135. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais etapas de lavagem usando um meio fisiologicamente aceitável.

136. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que o tecido é um tecido endodérmico.

137. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que o tecido é selecionado a partir de um grupo que compreende traqueia, brônquio principal, esôfago, estômago, duodeno, intestino delgado, intestino grosso e reto.

138. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que o tecido é selecionado de um grupo que compreende fígado, pâncreas, vesícula biliar e dutos da árvore biliar, em que os dutos da árvore biliar compreendem dutos comuns e dutos císticos