JP2021519585A - 十二指腸ブルンナー腺由来の幹／前駆細胞ならびにそれらの単離および使用方法 - Google Patents

十二指腸ブルンナー腺由来の幹／前駆細胞ならびにそれらの単離および使用方法 Download PDF

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Abstract

内胚葉系幹細胞の表現型形質を有し、多能性マーカーが陽性であるブルンナー腺幹／前駆細胞（ＢＧＳＣ）、およびそれらをヒト十二指腸から単離する方法が、本明細書において開示される。さらに、本開示は、ＢＧＳＣがヒトドナー由来の十二指腸から容易に単離され、培養で増殖されるか、または肝臓および膵臓系統に分化するように誘導されることができ、再生医薬の臨床プログラムのための細胞源を表し得ることを提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年３月２９日に出願された米国仮出願第６２／６５０，２０８号の優先権を主張するものであり、その全体が本明細書に組み込まれる。
複数の幹／前駆細胞微小環境は、胎児および出生後のヒト胆管内の特定の解剖学的部位に残っている。幹／前駆細胞集団は、胎児組織では長い間認識されてきたが、成人組織でのその持続性が新たに認識されている。腸管陰窩と平行する腺成分である胆道周囲の腺（ＰＢＧ）は、肝外胆管内、巨大な肝内胆管内、および肝膵総胆管内に位置し、ＰＢＧにおける後期の幹／前駆細胞およびそれから誘導されるものは、胆のう内で見出される。このネットワークは、肝膵総胆管のＰＢＧの幹／前駆細胞から、膵臓内の膵管腺（ＰＤＧ）内の運命付けられた前駆細胞まで継続する。これらの微小環境の全てにおける幹／前駆細胞は、胆管幹／前駆細胞（ＢＴＳＣ）と総称される。ＰＢＧ内のＢＴＳＣは、増殖能、自己再生能および多能性を含む内胚葉系幹細胞／前駆細胞の形質を有し、これらは、増殖能および多能性を含むＰＤＧ内の前駆細胞の形質を有するが、ＰＢＧ内の幹／前駆細胞よりも自己再生能は低い。
肝−膵管間膨大部のレベルに位置するＢＴＳＣは原始的であり、いくつかの多能性マーカー（例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ）を同時発現し、自己再生するか、または機能的肝細胞、胆管細胞および膵島に分化することができる（それらが腺房細胞も生じ得るかどうかは、進行中の研究で検討されている）。ＢＴＳＣを含有する微小環境は、肝臓および膵臓にまで広がる。ヒトにおける詳細な解剖学的研究により、ＢＴＳＣ微小環境組織の近位から遠位への軸が、最も原始的な幹細胞が位置する近位部位である肝膵管膨大部から、成熟細胞が見つかる遠位部位である肝臓または膵臓へと進むことが明らかにされている。この軸は、これらの臓器の器官形成を再構築し、その一般的な胚発生の起源を反映する。実際に、発生学的観点から、肝臓、胆管系および膵臓の共通の前駆細胞が、前腸を形成する確定的な近位内胚葉の発生の早期段階に存在する。この発生段階では、原始十二指腸は近位内胚葉系幹／前駆細胞を保持する。
特定された最も原始的な幹／前駆細胞は、十二指腸の粘膜下層内にあるブルンナー腺内に見られるものである。これらの細胞は、肝臓および膵臓になる、幹／前駆細胞微小環境のネットワーク全体の出発点であり得る。成人十二指腸からのこれらの細胞の単離は困難であり、これまでに当該技術分野において開示されている方法によって達成されていない。これらの細胞の実質的な意義は多様である。例えば、これらの細胞は、インビトロでの薬物効果の評価、モデルシステム（例えば、オルガノイド）の生成、肝臓および膵発生、機能維持ならびに／または修復の分析（但し、これらは両方の臓器の前駆細胞を含む）、肝臓、膵臓および他の内胚葉系組織に関連する他の臨床または分析検査、肝臓、膵臓および／または他の内胚葉系組織に関与するかまたは影響を及ぼす疾患または状態の診断または治療のため使用することができる。ブルンナー腺由来の細胞は、内視鏡検査によりアクセス可能である位置である十二指腸に存在する内胚葉系幹／前駆細胞源の中で稀であり、自己細胞療法もしくは異種細胞療法または遺伝子療法のための幹／前駆細胞の供給に有用である。さらに、これらのブルンナー腺由来の腫瘍は、様々な形態の癌治療の論理的標的である。したがって、当技術分野において、「ブルンナー腺幹／前駆細胞」として知られている、目的の細胞を単離する方法を開発する必要が依然として存在する。
一態様では、本開示は、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９およびサイトケラチン７（ＣＫ７）からなる群から選択される一つまたは複数のマーカーを発現し、自己再生を支持する培養条件下で、限定的または最小限の分化での増殖能としてさらに特徴付けられる、十二指腸から単離された幹／前駆細胞（ブルンナー腺幹／前駆細胞またはＢＧＳＣと称される）に関する。
別の態様では、本開示は、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４およびＣＫ１９からなる群から選択される一つまたは複数のマーカーを発現し、自己再生を支持する培養条件下で、限定的または最小限の分化での増殖能としてさらに特徴付けられる、十二指腸から単離された幹／前駆細胞（ブルンナー腺幹／前駆細胞またはＢＧＳＣと称される）に関する。
別の態様では、本開示は、ＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現し、自己再生を支持する培養条件下で、限定的または最小限の分化での増殖能としてさらに特徴付けられる、十二指腸から単離された幹／前駆細胞（ブルンナー腺幹／前駆細胞またはＢＧＳＣと称される）に関する。
別の態様では、本開示は、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９、ＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４およびＣＫ１９からなる群から選択される一つまたは複数のマーカーを発現するか、またはＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現し、自己再生を支持する培養条件下で、限定的または最小限の分化での増殖能としてさらに特徴付けられる、十二指腸から単離された幹／前駆細胞（ブルンナー腺幹／前駆細胞またはＢＧＳＣと称される）に関する。
一部の実施形態では、ＢＧＳＣは、病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を実質的に含まない。一部の実施形態では、ＢＧＳＣは、少なくとも１カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる。一部の実施形態では、ＢＧＳＣは、少なくとも２カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる。一部の実施形態では、ＢＧＳＣは、少なくとも６カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる。一部の実施形態では、ＢＧＳＣは、少なくとも１２カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる。
一部の実施形態では、ＢＧＳＣの自己再生を支持する培養条件は、無血清培地、任意選択でクボタの培地を含む。一部の実施形態では、自己再生を支持する培養条件は、血清を含有する培地を含む。
一態様では、本開示は、十二指腸から単離された幹／前駆細胞の集団に関し、細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９およびＣＫ７からなる群から選択される一つまたは複数のマーカーを発現する。
一態様では、本開示は、十二指腸から単離された幹／前駆細胞の集団に関し、細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４およびＣＫ１９からなる群から選択される一つまたは複数のマーカーを発現する。
一態様では、本開示は、十二指腸から単離された幹／前駆細胞の集団に関し、細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、ＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現する。
一態様では、本開示は、十二指腸から単離された幹／前駆細胞の集団に関し、細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９、ＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４およびＣＫ１９からなる群から選択される一つまたは複数のマーカーを発現するか、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、ＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現する。
一部の実施形態では、幹／前駆細胞の集団は、病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を実質的に含まない。
一部の実施形態では、幹／前駆細胞の集団は、少なくとも１カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる。一部の実施形態では、幹／前駆細胞の集団は、少なくとも２カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる。一部の実施形態では、幹／前駆細胞の集団は、少なくとも６カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる。一部の実施形態では、幹／前駆細胞の集団は、少なくとも１２カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる。
一部の実施形態では、幹／前駆細胞集団の自己再生を支持する培養条件は、無血清培地、任意選択でクボタの培地を含む。一部の実施形態では、幹／前駆細胞集団の自己再生を支持する培養条件は、血清を含有する培地を含む。
一態様では、本開示は、一つまたは複数のＢＧＳＣ、またはＢＧＳＣの集団を対象の十二指腸、その一部分、またはそこから採取された試料から単離する方法であって、
（ａ）腸粘液を実質的に含まない十二指腸の粘膜層を、生理学的範囲外にある浸透圧特性を有する培地または溶液と、粘膜層の細胞に浸透圧ショックを誘発する条件下で接触させること；
（ｂ）機械的、外科的および／または化学的方法により粘膜層またはその細胞の少なくとも一部分を除去または溶解し、粘膜下層を含み得る残部を残し、および／または曝露させること；
（ｄ）残部を消化するか、または分離すること；
（ｅ）一つまたは複数のＢＧＳＣまたはＢＧＳＣの集団を消化された残部から単離すること、を含む方法に関する。
一部の実施形態では、単離工程は、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９、ＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４、およびＣＫ１９からなる群から選択される一つまたは複数のマーカーを発現するＢＧＳＣ、または細胞の少なくとも一部、または細胞の実質的な部分、または細胞の大部分が、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９、ＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４、およびＣＫ１９からなる群から選択される一つまたは複数のマーカーを発現するＢＧＳＣの集団を単離することを含む。
一部の実施形態では、単離工程は、ＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現するＢＧＳＣ、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、ＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現するＢＧＳＣの集団を単離することを含む。
一態様では、本開示は、一つまたは複数のＢＧＳＣ、またはＢＧＳＣの集団を、対象の十二指腸、その一部分、またはそこから採取された試料から単離する方法であって、以下の工程
（ａ）腸粘液を除去する工程；
（ｂ）生理学的範囲外にある浸透圧特性を有する培地または溶液を、粘膜層の細胞に浸透圧ショックを誘発する条件下で適用する工程；
（ｃ）機械的、外科的および／または化学的方法により粘膜層またはその細胞の少なくとも一部分を除去または溶解し、粘膜下層を含み得る残部を残し、および／または曝露させる工程；
（ｄ）粘膜層および／または残部に、病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を実質的に殺傷するか、不活化するか、または除去するための培地または溶液を適用する工程；
（ｅ）消化または分離を粘膜下層に適用して、消化物、分離した細胞材料、または細胞懸濁液を生じさせる工程；
（ｆ）任意選択で消化物、分離した細胞材料、または細胞懸濁液由来の細胞の少なくとも一部を培養する工程；
（ｇ）Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９、ＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４、ＣＫ１９の一つまたは複数を発現する細胞、もしくは細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９、ＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４、ＣＫ１９の一つまたは複数を発現する細胞の集団、および／またはＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現するその細胞を単離する工程、を含み、病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を実質的に殺傷するか、不活化するか、または除去する工程は、任意の時点で、または２回以上実施することができる。
一部の実施形態では、腸粘液の除去は、十二指腸組織を圧迫することを含む。
一部の実施形態では、生理学的範囲外にある浸透圧特性を有する培地または溶液は、低張、低浸透圧、高張、または高浸透圧溶液を含む。
一部の実施形態では、生理学的範囲外にある浸透圧特性を有する培地または溶液は、グルコース溶液、高塩溶液、または蒸留水を含む。
一部の実施形態では、除去は、乳化剤および／または界面活性剤の使用を含む化学的破壊によって行なわれる。
一部の実施形態では、界面活性剤および／または乳化剤は、水、生理食塩水および／または緩衝液中にある。
一部の実施形態では、界面活性剤および／または乳化剤は、短期間（１５分未満）適用される。
一部の実施形態では、乳化剤は、レシチン、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ポリソルベート８０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（ポリソルベート４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（ポリソルベート６０）、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート（ポリソルベート６５）、アンモニウムホスファチド、脂肪酸のナトリウム、カリウムおよびカルシウム塩、脂肪酸のマグネシウム塩、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリド、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの酢酸エステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの乳酸エステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドのクエン酸エステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドのモノアセチル酒石酸エステルおよびジアセチル酒石酸エステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの混合酢酸と酒石酸エステル、脂肪酸のスクロースエステル、スクログリセリド、脂肪酸のポリグリセロールエステル、ポリグリセロールポリリシノレエート、脂肪酸のプロパン−１，２−ジオールエステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドと相互作用した熱酸化大豆油、ステアロイル−２−ラクチル酸ナトリウム、ステアロイル−２−ラクチル酸カルシウム、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノパルミテートおよびその組み合わせからなる群から選択される。
一部の実施形態では、界面活性剤は、１−ヘプタンスルホン酸、Ｎ−ラウリルサルコシン、ラウリル硫酸塩、１−オクタンスルホン酸およびタウロコール酸、塩化ベンザルコニウム、セチルピリジニウム、塩化メチルベンズトニウム、臭化デカメトニウム、アルキルベタイン、アルキルアミドアルキルベタイン、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アムモニオ−１−プロパンスルホネート、ホスファチジルコリン、Ｎ−デシルＡ−Ｄ−グルコピラノシド、Ｎ−デシルＡ−Ｄ−マルトピラノシド、Ｎ−ドデシルＢ−Ｄ−マルトシド、Ｎ−オクチルＢ−Ｄ−グルコピラノシド、Ｎ−テトラデシルＢ−Ｄ−マルトシド、トリトン（トリトンＸ−１００）、ノニデット−Ｐ−４０、ポロキサマー１８８、ラウリル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウムおよびその組み合わせからなる群から選択される。
一部の実施形態では、残部は粘膜下層を含む。
一部の実施形態では、消化または分離は酵素的に行われる。
一部の実施形態では、病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を実質的に殺傷するか、不活化するか、または除去するための培地または溶液は、次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）の水溶液、または皮膚または表面の消毒のため使用される任意の溶液または薬剤を含む。
一部の実施形態では、病原体ならびに／または病原性および／または有益な微生物を実質的に殺傷するか、不活化するか、または除去するための培地または溶液の適用は、界面活性剤および／もしくは乳化剤の適用前に行われるか、または消化もしくは分離後に行われるか、または粘液の除去後に行われる。
一部の実施形態では、組織試料は、消化または分離工程前に刻まれる。
一部の実施形態では、消化もしくは分離工程および／または単離工程は、低付着プレートにおいて行われる。
一部の実施形態では、単離工程は、無血清培地、任意選択で、クボタの培地を含む培養条件を用いた培養セレクションを使用して行われる。
一部の実施形態では、単離工程は、血清を含有する培地を含む培養条件を用いた培養セレクションを使用して行われる。
一部の実施形態では、単離された細胞は、スフェロイド、一つまたは複数のオルガノイド、細胞集団、または細胞凝集物を支持または生じる条件下で培養される。
一態様では、本開示は、低付着プレートにおいてＢＧＳＣ、またはＢＧＳＣの集団を培養することにより生じるスフェロイド、オルガノイド、細胞凝集物または細胞集団に関する。
一態様では、本開示は、ＢＳＧＣ、またはＢＳＧＣの集団を懸濁液または３Ｄ培養条件において培養することにより生じるスフェロイド、オルガノイド、細胞凝集物または細胞集団に関する。
一態様では、本開示は、肝臓、膵臓、胃、腸、または他の内胚葉系組織に関係するか、または影響する疾患または状態と診断された対象を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量のＢＧＳＣまたはＢＧＳＣの集団を投与することを含む方法に関する。
一態様では、本開示は、肝臓、膵臓、胃、腸または他の内胚葉系組織に関係するか、または影響する疾患または状態と診断された対象を治療する方法であって、有効量のＢＧＳＣの投与を含む方法に関する。
一態様では、本開示は、肝臓、膵臓、胃、腸または他の内胚葉系組織に関係するか、または影響する疾患または状態と診断された対象を治療する方法であって、有効量のＢＧＳＣの集団の投与を含む方法に関する。
一態様では、本開示は、有効数のＢＧＳＣ、またはＢＧＳＣの集団の投与を含む、自己細胞または遺伝子療法に関する。
一態様では、本開示は、有効数のＢＧＳＣ、またはＢＧＳＣの集団の投与を含む、同種細胞または遺伝子療法に関する。
一態様では、本開示は、肝臓、膵臓、胃、腸、または他の内胚葉系組織に関係するか、または影響する疾患または状態と診断された対象を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量のＢＧＳＣまたはＢＧＳＣの集団を投与することを含み、細胞は、遺伝子操作または改変された細胞である、方法に関する。
一態様では、本開示は、肝臓、膵臓、胃、腸、または他の内胚葉系組織に関係するか、または影響する疾患または状態と診断された対象を治療する方法であって、有効量のＢＧＳＣまたはＢＧＳＣの投与を含み、細胞は、遺伝子操作または改変された細胞である、方法に関する。
一態様では、本開示は、肝臓、膵臓、胃、腸、または他の内胚葉系組織に関係するか、または影響する疾患または状態と診断された対象を治療する方法であって、有効量のＢＧＳＣの集団の投与を含み、細胞は、遺伝子操作または改変された細胞である、方法に関する。
一態様では、本開示は、有効数のＢＧＳＣ、またはＢＧＳＣの集団の投与を含む、自己細胞または遺伝子療法であって、細胞は、遺伝子操作または改変された細胞である、方法に関する。
一態様では、本開示は、有効数のＢＧＳＣ、またはＢＧＳＣの集団の投与を含む、同種細胞または遺伝子療法であって、細胞は、遺伝子操作または改変された細胞である、方法に関する。
一態様では、本開示は、ヒトおよび／または動物のための自家または同種の細胞もしくは遺伝子療法のための、肝臓、膵臓、胃、腸、または他の内胚葉系組織に関係するか、または影響する疾患または状態の治療のための、ＢＧＳＣの細胞の使用に関する。
一態様では、本開示は、ヒトおよび／または動物のための自家または同種の細胞もしくは遺伝子療法のための、肝臓、膵臓、胃、腸、または他の内胚葉系組織に関係するか、または影響する疾患または状態の治療のための、ＢＧＳＣの細胞の使用であって、細胞は、遺伝子操作または修飾されている、使用に関する。
一態様では、本開示は、ヒトおよび／または動物のための自家または同種の細胞もしくは遺伝子療法のための、肝臓、膵臓、胃、腸、または他の内胚葉系組織に関係するか、または影響する疾患または状態の治療のための、ＢＧＳＣの集団の集団の使用に関する。
一態様では、本開示は、ヒトおよび／または動物のための自家または同種の細胞もしくは遺伝子療法のための、肝臓、膵臓、胃、腸、または他の内胚葉系組織に関係するか、または影響する疾患または状態の治療のための、ＢＧＳＣの集団の集団の使用であって、細胞は、遺伝子操作または修飾されている、使用に関する。
一部の実施形態では、スフェロイド、オルガノイド、細胞凝集物または細胞の集団は、ＢＧＳＣ、またはＢＧＳＣの集団を、成熟細胞を含む後の系譜段階の細胞に分化させる能力がある培養条件をさらに含む。
一態様では、本開示は、ブルンナー腺幹／前駆細胞（ＢＧＳＣ）、またはＢＧＳＣの集団を、対象の十二指腸、その一部分、またはそこから採取された試料から単離する方法であって、
（ａ）十二指腸、その一部分、またはそこから採取された試料を消化または分離して、消化物または分離した細胞材料を生じさせること；
（ｂ）消化または分離した細胞材料から：（ｉ）Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９、ＣＫ７、ＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４およびＣＫ１９の一つまたは複数を発現するこれらの細胞、もしくは細胞の少なくとも一部、実質的な部分、または大部分が、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９、ＣＫ７、ＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４、およびＣＫ１９を発現する細胞の集団；および／または（ｉｉ）ＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現するこれらの細胞、もしくは細胞の少なくとも一部、実質的な部分、または大部分が、ＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現する細胞の集団を得ること、を含む、方法に関する。
一部の実施形態では、十二指腸、その一部分、そこから採取された試料、消化物、分離した細胞材料、またはそれらの組み合わせは、病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を実質的に殺傷するか、不活化するか、または除去するための培地または溶液と接触される。
一態様では、本開示は、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する一つまたは複数の多能性細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する細胞の集団を、粘膜層および粘膜下層を有する組織（またはその一部もしくは試料）から単離する方法であって、以下の順序で生じ得るか、または他の実施形態では、異なる順序で生じ得る、次の工程：
（ａ）粘膜層および粘膜下層を有する組織の粘膜層を、生理学的範囲外にある浸透圧特性を有する培地または溶液と、粘膜層の細胞に浸透圧ショックを誘発する条件下で接触させる工程；
（ｂ）機械的、外科的および／または化学的方法により粘膜層またはその細胞の少なくとも一部分を除去または溶解し、粘膜下層を含み得る残部を残し、および／または曝露させる工程；
（ｃ）残部を病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を実質的にさしょうするか、不活化するか、または除去するための培地または溶液と接触させる工程；
（ｄ）残部を消化するか、または分離する工程；
（ｅ）一つまたは複数の多能性細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する細胞の集団を単離する工程、を含む、方法に関する。
一部の実施形態では、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する一つまたは複数の多能性細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する細胞の集団を、粘膜層および粘膜下層を有する組織（またはその一部もしくは試料）から単離する方法は、表面粘液の除去をさらに含む。
一部の実施形態では、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する一つまたは複数の多能性細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する細胞の集団を、粘膜層および粘膜下層を有する組織（またはその一部もしくは試料）から単離する方法であって、生理学的範囲外にある浸透圧特性を有する培地または溶液は、低張、低浸透圧、高張、または高浸透圧溶液を含む。
一部の実施形態では、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する一つまたは複数の多能性細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する細胞の集団を、粘膜層および粘膜下層を有する組織（またはその一部もしくは試料）から単離する方法であって、生理学的範囲外にある浸透圧特性を有する培地または溶液は、グルコース溶液、高塩溶液、または蒸留水を含む。
一部の実施形態では、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する一つまたは複数の多能性細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する細胞の集団を、粘膜層および粘膜下層を有する組織（またはその一部もしくは試料）から単離する方法であって、除去は、乳化剤および／または界面活性剤の使用を含む、化学的破壊により行われる。
一部の実施形態では、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する一つまたは複数の多能性細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する細胞の集団を、粘膜層および粘膜下層を有する組織（またはその一部もしくは試料）から単離する方法であって、界面活性剤および／または乳化剤は、水、生理食塩水および／または緩衝液中にある。
一部の実施形態では、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する一つまたは複数の多能性細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する細胞の集団を、粘膜層および粘膜下層を有する組織（またはその一部もしくは試料）から単離する方法であって、界面活性剤および／または乳化剤は、短期間（１５分未満）適用される。
一部の実施形態では、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する一つまたは複数の多能性細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する細胞の集団を、粘膜層および粘膜下層を有する組織（またはその一部もしくは試料）から単離する方法であって、乳化剤は、レシチン、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ポリソルベート８０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（ポリソルベート４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（ポリソルベート６０）、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート（ポリソルベート６５）、アンモニウムホスファチド、脂肪酸のナトリウム、カリウムおよびカルシウム塩、脂肪酸のマグネシウム塩、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリド、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの酢酸エステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの乳酸エステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドのクエン酸エステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドのモノアセチル酒石酸エステルおよびジアセチル酒石酸エステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの混合酢酸と酒石酸エステル、脂肪酸のスクロースエステル、スクログリセリド、脂肪酸のポリグリセロールエステル、ポリグリセロールポリリシノレエート、脂肪酸のプロパン−１，２−ジオールエステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドと相互作用した熱酸化大豆油、ステアロイル−２−ラクチル酸ナトリウム、ステアロイル−２−ラクチル酸カルシウム、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノパルミテートからなる群から選択される。
一部の実施形態では、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する一つまたは複数の多能性細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する細胞の集団を、粘膜層および粘膜下層を有する組織（またはその一部もしくは試料）から単離する方法であって、界面活性剤は、１−ヘプタンスルホン酸、Ｎ−ラウリルサルコシン、ラウリル硫酸塩、１−オクタンスルホン酸およびタウロコール酸、塩化ベンザルコニウム、セチルピリジニウム、塩化メチルベンズトニウム、臭化デカメトニウム、アルキルベタイン、アルキルアミドアルキルベタイン、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アムモニオ−１−プロパンスルホネート、ホスファチジルコリン、Ｎ−デシルＡ−Ｄ−グルコピラノシド、Ｎ−デシルＡ−Ｄ−マルトピラノシド、Ｎ−ドデシルＢ−Ｄ−マルトシド、Ｎ−オクチルＢ−Ｄ−グルコピラノシド、Ｎ−テトラデシルＢ−Ｄ−マルトシド、トリトン（トリトンＸ−１００）、ノニデット−Ｐ−４０、ポロキサマー１８８、ラウリル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウムからなる群から選択される。
一部の実施形態では、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する一つまたは複数の多能性細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する細胞の集団を、粘膜層および粘膜下層を有する組織（またはその一部もしくは試料）から単離する方法であって、病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を実質的に殺傷するか、不活化するか、または除去するための培地または溶液は、次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）の水溶液、または皮膚または表面の消毒のため使用される任意の溶液または薬剤を含む。
一部の実施形態では、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する一つまたは複数の多能性細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する細胞の集団を、粘膜層および粘膜下層を有する組織（またはその一部もしくは試料）から単離する方法であって、病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を実質的に殺傷するか、不活化するか、または除去するための培地または溶液は、界面活性剤および／もしくは乳化剤の適用前に行われるか、または消化もしくは分離後に行われるか、または粘液の除去後に行われる。
一部の実施形態では、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する一つまたは複数の多能性細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する細胞の集団を、粘膜層および粘膜下層を有する組織（またはその一部もしくは試料）から単離する方法であって、残部は、粘膜下層を含む。
一部の実施形態では、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する一つまたは複数の多能性細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する細胞の集団を、粘膜層および粘膜下層を有する組織（またはその一部もしくは試料）から単離する方法であって、消化または分離は、酵素的に行われる。
一部の実施形態では、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する一つまたは複数の多能性細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する細胞の集団を、粘膜層および粘膜下層を有する組織（またはその一部もしくは試料）から単離する方法であって、組織試料は、消化または分離工程前に刻まれる。
一部の実施形態では、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する一つまたは複数の多能性細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する細胞の集団を、粘膜層および粘膜下層を有する組織（またはその一部もしくは試料）から単離する方法であって、消化または分離は、粘膜下組織を、細胞懸濁液、細胞の混合物、集団、凝集塊または凝集物、および／または組織断片に崩壊する。
一部の実施形態では、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する一つまたは複数の多能性細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する細胞の集団を、粘膜層および粘膜下層を有する組織（またはその一部もしくは試料）から単離する方法であって、単離工程は、無血清培地、任意選択で、クボタの培地を含む培養条件を用いた培養セレクションを使用して行われる。
一部の実施形態では、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する一つまたは複数の多能性細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する細胞の集団を、粘膜層および粘膜下層を有する組織（またはその一部もしくは試料）から単離する方法であって、単離工程は、血清を含有する培地を含む培養条件を用いた培養セレクションを使用して行われる。
一部の実施形態では、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する一つまたは複数の多能性細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する細胞の集団を、粘膜層および粘膜下層を有する組織（またはその一部もしくは試料）から単離する方法であって、単離工程は、低付着プレートにおいて行われる。
一部の実施形態では、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する一つまたは複数の多能性細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する細胞の集団を、粘膜層および粘膜下層を有する組織（またはその一部もしくは試料）から単離する方法であって、単離された細胞または細胞集団は、スフェロイド、一つまたは複数のオルガノイド、細胞集団、または細胞凝集物を支持または生じる条件下で培養される。
一部の実施形態では、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する一つまたは複数の多能性細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する細胞の集団を、粘膜層および粘膜下層を有する組織（またはその一部もしくは試料）から単離する方法であって、生理学的に許容される培地を用いて１回または複数回の洗浄工程をさらに含む、方法。
一部の実施形態では、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する一つまたは複数の多能性細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する細胞の集団を、粘膜層および粘膜下層を有する組織（またはその一部もしくは試料）から単離する方法であって、組織は、内胚葉系組織である。
一部の実施形態では、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する一つまたは複数の多能性細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する細胞の集団を、粘膜層および粘膜下層を有する組織（またはその一部もしくは試料）から単離する方法であって、組織は、気管、主気管支、食道、胃、十二指腸、小腸、大腸および直腸を含む群から選択される。
一部の実施形態では、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する一つまたは複数の多能性細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する細胞の集団を、粘膜層および粘膜下層を有する組織（またはその一部もしくは試料）から単離する方法であって、組織は、肝臓、膵臓、胆嚢および胆管管を含む群から選択され、胆管管は、総胆管および胆嚢管を含む。
図１は、Ａ）過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）で染色されたヒト十二指腸を示す。十二指腸粘膜は、腸絨毛まで隆起し、腸陰窩（矢頭）で折り畳まれる。粘膜下組織（ＳＭ）は、ＰＡＳ＋腺要素（ブルンナー腺：ＢＧ、点線）が多い。ＢＧは、粘膜筋板（ＭＭ）を介して腸陰窩と解剖学的に連続している。粘膜の粘膜固有層内に位置するＢＧ腺房はほとんどなく、腸陰窩（右画像の矢印）と連続している。Ｂ）ヒト十二指腸におけるサイトケラチン７（ＣＫ７）の免疫組織化学染色。ＣＫ７は、ＢＧによって特異的に発現するが、腸陰窩によって発現するものではない。Ｃ）ヒト十二指腸におけるＳＯＸ９の免疫組織化学染色。腸陰窩とＢＧの両方が、ＳＯＸ９を発現する細胞（矢印）を含有する。Ｄ）ＳＯＸ９（赤色）およびＣＫ７（緑色）の免疫蛍光染色、核は青色で表される。ＢＧでは、ＳＯＸ９は、同じ細胞（矢印）においてＣＫ７と共発現する。 図２は、Ａ）ヒト十二指腸における増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、ＣＤ４４、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、Ｇタンパク質共役受容体５を含有するロイシンリッチリピート（Ｌｇｒ５）、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１の免疫組織化学を示す。ＰＣＮＡ＋、ＣＤ４４＋、ＥｐＣＡＭ＋、およびＬｇｒ５＋細胞は、腸陰窩（矢印）とブルンナー腺（矢印）の両方にある。Ｔｒａ−１−６０＋細胞およびＴｒａ−１−８１＋細胞は、ブルンナー腺（矢印）に存在するが、腸陰窩には存在しない。ＭＭ＝粘膜筋板。Ｂ）多能性に関連する転写因子の免疫組織化学染色および免疫蛍光染色。Ｏｃｔ４ＡとＳＯＸ２は、ブルンナー腺内の細胞で陽性であり、Ｔｒａ−１−６０＋細胞（矢印）で共発現する。 図３は、Ａ）粘膜の化学的および機械的除去の前後のヒト十二指腸のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色切片を示す。まれな腸陰窩（右の画像の点線の円）を除き、表面上皮（絨毛）および腸陰窩（矢頭）内のほぼすべての上皮細胞が、除去された。粘膜下層のブルナー腺は、保存されている（アスタリスク）。Ｂ）粘膜の機械的および化学的除去後のヒト十二指腸におけるサイトケラチン７（ＣＫ７）の免疫組織化学染色。ブルンナー腺のＣＫ７＋細胞は、保持される。Ｃ）粘膜の機械的および化学的除去後のヒト十二指腸におけるＴｒａ−１−６０の免疫組織化学染色。ブルンナー腺のＴｒａ−１−６０＋細胞は、保存される。ＭＭ＝粘膜筋板。 図４は、Ａ〜Ｂ）十二指腸粘膜下層から単離された細胞における上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、Ｇタンパク質共役受容体５（Ｌｇｒ５）を含有するロイシンリッチリピート、およびＴｒａ−１−６０のフローサイトメトリーを示す。ＥｐＣＡＭおよびＴｒａ−１−６０の免疫選別法により、それぞれ、ＥｐＣＡＭ＋（Ａ）およびＴｒａ−１−６０＋（Ｂ）集団の部分的濃縮がもたらされた。Ｃ〜Ｄ）培養セレクションストラテジーにより、さらにＴｒａ−１−６０＋細胞を選別した。Ｃでは、細胞をクボタの培地においてプラスチック上に均一な密度で播種した。細胞は１〜２日の遅延期後に増殖し始め、６〜８日後に１０〜１５個の細胞の小さな集団を形成した。１４日後、大きなコロニーが認められた。各コロニーは、Ｔｒａ−１−６０＋の小型で密集した均一な細胞によって形成された。Ｄでは、細胞はオルガノイド形成用に調整された条件で培養され、単一のブルンナー腺幹細胞（ＢＧＳＣ）は、球状構造に自己組織化し始め、その大きさと数がさらに拡大した。オルガノイド形成は、オルガノイドを形成する主な表現型を表すＴｒａ−１−６０＋細胞の濃縮を決定した。Ｐｈ−Ｃ：位相差。スケールバー＝２００μｍ。 図５は、Ａ〜Ｂ）内胚葉マーカーおよび多能性マーカーの位相差（Ｐｈ−Ｃ）、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）、および過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色、免疫組織化学および免疫蛍光を示す。パネルＡでは、ブルンナー腺幹細胞（ＢＧＳＣ）を自己再生条件（すなわち、無血清クボタの培地）下で培養した。パネルＢでは、オルガノイド形成用に調整した条件下でＢＧＳＣを培養した。両方の条件において、培養細胞は、ブルンナー腺を形成する細胞によりインサイツで観察されるものと類似する典型的な表現型を示した。核は青色で示される。Ｃ〜Ｄ）ＲＴ−ＰＣＲ解析により、内胚葉（Ｃ）および多能性（Ｄ）遺伝子の発現を確認した。胆道系幹／前駆細胞（ＢＴＳＣ）およびＮｔｅｒａ細胞株を、それぞれ、内胚葉および多能性遺伝子の陽性対照として使用した。＊＝他の群に対してｐ＜０．０５。ＧＯＩ＝目的の遺伝子。 図６は、Ａ）インビトロでの肝細胞分化を示す。肝細胞分化についてホルモンで定義した培地（ＨＤＭ−Ｈ）で培養したヒトブルンナー腺幹／前駆細胞（ｈＢＧＳＣ）中のアルブミンの位相差（Ｐｈ−Ｃ）、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色および免疫蛍光染色。ＨＤＭ−Ｈで１４日後、ほとんどの細胞の形態が多角形に形作られた細胞に顕著に変化した。これらの細胞は凝集して多細胞帯を形成し、ＰＡＳ陽性（グリコーゲン貯蔵）であり、アルブミンを発現した。核は青色で示される。ＨＤＭ−肝臓で１４日間培養した細胞における肝細胞マーカーのリアルタイムＰＣＲ。アルブミン（ＡＬＢ）、トランスフェリン（ＴＦ）、およびシトクロムＰ４５０ ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）を含む肝細胞特異的遺伝子は、自己複製条件（すなわち、無血清のクボタの培地：ＫＭ）下での細胞と比較して増加した。初代ヒト肝細胞（ｈＨｅｐ）を陽性対照として使用する。＊＝他の群に対してｐ＜０．０５。ＧＯＩ＝目的の遺伝子。Ｂ）インビトロでの内分泌性膵分化。膵島細胞分化（ＨＤＭ−Ｐ）についてホルモンで定義した培地で培養したヒトブルンナー腺幹／前駆細胞（ｈＢＧＳＣ）におけるニューロゲニン３（ＮＧＮ３）およびインスリンのＰｈ−Ｃ、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色および免疫蛍光。ＨＤＭ−Ｐでの１４日後、膵島様構造が培養物に出現し、これらの凝集物はＮＧＮ３およびインスリン陽性であった。核は青色で示される。ＨＤＭ−Ｐ中で１４日間培養した細胞における膵内分泌マーカーのリアルタイムＰＣＲ。ＰＤＸ１、インスリンおよびグルカゴンは、自己複製条件（すなわち、クボタ培地：ＫＭ）での細胞と比較して、高い増加を示した。正常な膵島細胞を陽性対照として使用した。＊＝ＫＭでのｈＢＧＳＣに対してｐ＜０．０５。ＧＯＩ＝目的の遺伝子。 図７は、脾臓内注射によるＳＣＩＤマウスの肝臓へのヒトブルンナー腺幹細胞（ｈＢＧＳＣ）のインビボ移植を示す。Ａ）３０日後、ヒトミトコンドリア抗原（ｈＭｉｔｏ）を発現する細胞が、マウス肝臓に存在し、主に門脈三管空間の周囲（矢印）に位置した。生理食塩水（Ｖｅｈ）を注射したマウスには陽性細胞は存在しなかった。Ｂ）ｈＭｉｔｏ陽性細胞は、マウス肝臓の肝細胞の５％近くを占めた。Ｃ）ヒトアルブミン（ｈＡＬＢ）遺伝子の発現は、ｈＢＧＳＣを注射したマウスの肝臓においてＲＴ−ｑＰＣＲにより検出されたが、Ｖｅｈを注射したマウスでは検出されなかった（ＮＤ：検出されず）。データは、３回の実験の平均±ＳＤとして表した。Ｄ〜Ｅ）二重免疫蛍光染色により、ヒトアルブミン（ｈＡｌｂ）、Ｈｅｐ−Ｐａｒ１、ｈＭｉｔｏなどの成熟ヒト肝細胞のマーカーの発現を同じ細胞で確認した。核（Ｎｕ）を青色で表示した（ＤＡＰＩ）。 図８は、十二指腸粘膜の選択的可溶化を示す。Ａ）洗浄方法；Ｂ）十二指腸四肢のクランピング；Ｃ）組織切断および粘液除去；Ｄ）こし器による機械的ろ過。 図９は、ヒト十二指腸におけるサイトケラチン７（ＣＫ７）の免疫組織化学を示す。十二指腸壁は、粘液、粘膜下層および粘膜層を含む。ブルンナー腺（ＢＧ）は、粘膜下層内に位置する。ＣＫ７は、ＢＧによって特異的に発現するが、腸陰窩における細胞によって発現するものではない。四角内の領域を、右側の画像で拡大する。 図１０は、Ａ）ヒト十二指腸におけるＳＯＸ９（赤色）およびＬｇｒ５（緑色）の免疫蛍光染色を示す。核は青色で示される。ブルンナーの腺（点線に含まれる）では、Ｌｇｒ５はＳＯＸ９（矢印）と共局在し、その発現は、粘膜筋板の内部に位置する腺房においてより高く、粘膜下層内のより深い層に位置する腺房においてよりも腸陰窩（矢頭）と連続していた。ＭＭ＝粘膜筋板。Ｂ〜Ｄ）ナトリウム／ヨウ素共輸送体（ＮＩＳ）の免疫組織化学染色。ＮＩＳは、腸陰窩（パネルＡおよびＣの矢頭）の底部およびブルンナー腺（パネルＡおよびＢの矢印）で表される。 図１１は、粘膜下層の生存率の保存と合わせた粘膜上皮細胞の除去の失敗したプロトコルおよび手法を示す。手法１番：外科的切開、２番：粘膜下の生理食塩水の事前注射による粘膜切除術、３番：粘膜の掻破。これらのストラテジーは、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）および過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色において示されたように、粘膜層の部分除去および腸絨毛（矢頭）および陰窩（矢印）の保存をもたらした。 図１２は、膵島細胞分化についてホルモンで定義した培地（ＨＤＭ−Ｐ）下で７日間培養したヒトブルンナー腺幹／前駆細胞（ｈＢＧＳＣ）におけるリアルタイムＰＣＲを示す。ＰＤＸ１およびグルカゴン遺伝子は自己複製条件（すなわち、クボタの培地：ＫＭ）下の細胞と比較したとき、７日後には大きく増加するが、インスリン遺伝子はしない。正常な膵島細胞を陽性対照として使用した。＊＝ＫＭでのｈＢＧＳＣに対してｐ＜０．０５。ＧＯＩ＝目的の遺伝子。 図１３は、マウスの十二指腸粘膜下腺が腸陰窩に対して別個の区画を表し、増殖性の特徴を示すことを示す。Ａ）は、マウス（ｍ）十二指腸におけるサイトケラチン１９（Ｃｋ１９）、ＳＯＸ９および増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）についてのヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、および免疫蛍光染色を示す。点線は、腸陰窩と粘膜下腺（ＳＧ：アスタリスク）の境界を個別化する。十二指腸のＳＧは、陰窩よりも細胞質が明瞭であり、その粘液含有量のため、区別可能である。げっ歯類の十二指腸では、腸陰窩およびｊ内陰窩はＣｋ１９陽性であり、ＳＧ（白色のアスタリスク）はほぼ陰性である。ＳＯＸ９＋細胞は、主にＳＧ内に位置し（緑色の細胞）、ＰＣＮＡ＋細胞は、主に腸陰窩内に位置する（赤色の細胞）。核は青色で示される。スケールバー＝２００μｍ（Ｈ＆ＥおよびＣｋ１９）または１００μｍ（ＳＯＸ９／ＰＣＮＡ）。Ｂ）マウス（ｍ）空腸におけるＣｋ１９、ＳＯＸ９およびＰＣＮＡについてのヘマトキシリン・エオシン染色および免疫蛍光染色を示す。げっ歯類の空腸では、腸陰窩および絨毛は、Ｃｋ１９陽性である。十二指腸に関する区別は、ＳＯＸ９＋細胞が陰窩に位置し、ＰＣＮＡを共発現していることである（黄色の矢印）。核は青色で示される。スケールバー＝２００μｍ（Ｈ＆ＥおよびＣｋ１９）または１００μｍ（ＳＯＸ９／ＰＣＮＡ）。Ｃ）タモキシフェン注射の１４日後にＫｒｔ１９ＣｒｅＴｄＴｏｍａｔｏＬＳＬマウスにおけるＣｋ１９およびＴｄＴｏｍａｔｏ（Ｔｄ−Ｔｏｍ）の免疫蛍光染色を示す。マウス（ｍ）空腸では、陽性のものと接して位置する陰性の陰窩（緑色の矢印）と共に、ほとんどの腸陰窩はＴｄ−Ｔｏｍ＋（赤色の矢印）である。Ｔｄ−Ｔｏｍ＋陰窩の上に位置する絨毛は、完全にＴｄ−Ｔｏｍ陽性である。マウス十二指腸では、ＳＧは大部分がｔｄ−Ｔｏｍ−およびＣｋ１９−であるため、ｔｄ−Ｔｏｍ＋陰窩（赤色の矢印）からのその起源を除外する。白色のアスタリスクはＳＧを示す。点線は、腸陰窩とＳＧの間の境界を個別化する。核は青色で示される。スケールバー＝２００μｍ。Ｄ）マウス十二指腸では、ＰＣＮＡ＋５０５およびＳＯＸ９＋細胞は常にＴｄ−Ｔｏｍ陰性である（赤色の矢印）。黄色と緑色の矢印は、Ｔｄ−Ｔｏｍ＋腸陰窩を指し、十二指腸ではＰＣＮＡ陽性、ＳＯＸ９陰性である。核は青色で示される。点線は、腸陰窩とＳＧの間の境界を個別化する。図１３の画像は、ｎ＝５の動物を表す。 図１４は、十二指腸粘膜下層から単離したＴｒａ−１−６０＋細胞が、インビトロで内分泌系の膵臓に限定され、インビボでインスリン＋細胞に分化する能力を示すことを示す。Ａ〜Ｃ）インビトロでの内分泌系の膵分化。パネルＡ）は、ヒト十二指腸粘膜下腺から単離し、膵分化（ＰＭ）について定義した培地または自己複製条件（クボタの培地：ＫＭ）で培養した細胞の位相差（Ｐｈ−Ｃ）およびヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を示す。ＰＭでは、膵島様構造は７日後（ＰＭ７）に現れ、１４日後（ＰＭ１４）に数が増加する；＊他の群に対してｐ＜０．００１。スケールバー＝１００μｍ。ｎ＝５の生物学的複製物。Ｂ）リアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲは、ＰＭ７−１４でのＰＤＸ１遺伝子発現の増加を示し、５８３の核Ｐｄｘ１発現を、免疫蛍光染色により確認する。ｎ＝４の生物学的複製物。Ｃ）は、インスリン（ＩＮＳ）およびグルカゴン（ＧＬＵ）遺伝子発現がＰＭ１４の後で増加することを示す（ｎ＝４の生物学的複製物）。ヒト膵島細胞（ＩＳＬ）を対照として使用する（ｎ＝３の生物学的複製物）。１４日のＰＭでは、膵島様構造が免疫蛍光染色によりインスリンおよびグルカゴンの発現を示す。スケールバー＝１００μｍ。Ｄ〜Ｇ）は、マウスにおいて実験的に誘発した糖尿病が、インビボでのｄＳＧにおける増殖および膵臓形質を誘発し得ることを示す（各群につきｎ＝５の動物）。Ｄ）ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）で処置したマウスは、対照（ＣＴＲ）と比較してｄＳＧの領域画分（アスタリスク）の範囲が増加したことを示す。点線は、ｄＳＧから腸陰窩を個別化する。スケールバー＝２００μｍ。Ｅ）ＳＴＺマウスのｄＳＧは、免疫蛍光（ＩＦ）によって決定される対照と比較して、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、Ｐｄｘ−１、ニューロゲニン３（Ｎｇｎ３）、およびインスリンの発現が増加したことを示す。スケールバー＝１００μｍ。Ｆ）はＩＦスコアのヒートマップを示す。Ｇ）は、げっ歯類の十二指腸由来の標本が、ＲＴ−ＰＣＲ解析によって決定した対照と比較して、ＳＴＺマウスにおけるＮＧＮ３およびＩＮＳ遺伝子の発現をわずかに増加させることを示す。同じマウスの膵臓組織を基準として使用する。Ｈ）２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）を患う患者から得たヒト十二指腸におけるインスリン発現の研究を示す。これらの器官（ｎ＝５の十二指腸）では、まれなインスリン＋細胞がＳＧ内に存在する（矢印）。膵組織を右に示す。スケールバー＝５０μｍ。免疫蛍光染色では、核は青色で表示される。Ａ〜ＤおよびＧについて、エラーバーは平均±ｓ．ｄを示す。Ａ〜ＤおよびＧについて、ｐ値は、両側ｔ検定により決定した。 図１５は、ヒト十二指腸球部の内視鏡生検により得た自己複製ブルンナー腺細胞の取得を示す。Ａ）生検によるブルンナー腺（アステリスク）を含む粘膜下層の採取を示す（左パネル）。ブルンナー腺におけるＳＯＸ９発現細胞は矢印で示さる（右パネル）。Ｂ）は、自己複製条件で胎児十二指腸から単離したブルンナー腺細胞を培養して得たインビトロ細胞コロニー（点線）を示す。
定義
本発明の説明および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別途示されていない限り、複数形を含むことが意図されている。
本明細書で使用される「約」という用語は、量または濃度などの測定可能な値を指す場合、特定量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、またはさらに０．１％の変動を包含することを意味する。
本明細書に開示される任意の成分、範囲、剤形などの選択を説明するために使用される用語または「許容可能」、「有効」もしくは「十分」は、該成分、範囲、剤形などが開示された目的に適しているとことを意図する。
また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、一つまたは複数の関連する列挙された項目のうちの任意のおよび全ての可能性のある組み合わせ、ならびに二者択一（「または」）で解釈された時の組み合わせの欠如を意味し、包含する。
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、組成物および方法が列挙された要素を含むが、他のものを除外しないことを意味することを意図する。本明細書で使用される場合、「本質的に〜から成る」（および文法的変形）という移行句は、列挙した材料またはステップおよび列挙された実施形態の「基本的および新規な特性に実質的に影響を与えないもの」を包含すると解釈されるべきである。Ｉｎ ｒｅ Ｈｅｒｚ，５３７ Ｆ．２ｄ ５４９，５５１−５２，１９０ Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｑ．４６１，４６３（ＣＣＰＡ １９７６）（ｅｍｐｈａｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ）；ＭＰＥＰ § ２１１１．０３を参照のこと。したがって、本明細書で使用される「本質的に〜から成る」という用語は、「含む」と同等として解釈されるべきではない。「から成る」は、他の成分の微量または少量以上の要素、および本明細書に開示される組成物を投与するための実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これらの移行用語の各々によって定義される態様は、本開示の範囲内である。
「同等」または「生物学的同等物」という用語は、特定の分子、生物学的、または細胞材料を指すときに互換的に使用され、所望の構造または機能を維持しながら、最小限の相同性を有するものを意図する。
本明細書で使用される場合、スフェロイドという用語は、細胞を浮遊培養環境で相互作用させることを可能にする三次元（３Ｄ）構造に組織化された、実質的にまたは主に同じタイプの細胞の凝集物を指す場合に使用される。
本明細書で使用される場合、オルガノイドという用語は、細胞が浮遊培養環境で相互作用することを可能にする三次元（３Ｄ）構造に組織化された一つまたは複数のタイプの細胞の凝集物を指す場合に使用される。場合によっては、オルガノイドは、［ヒトもしくは動物］器官または組織の構造および機能の態様を模倣しうる。
本明細書で使用される場合、微生物という用語は、所望される細胞または細胞集団を得るよう処理されている組織の内部または外部に存在する、病原性であるかもしくは疾患を引き起こし得るか、または起こし得ないか、あるいは有益であり得るか、またはあり得ない微生物を指す。
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、ＤＮＡまたはポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを意味する。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。遺伝子の発現レベルは、例えば、細胞または組織試料中のｍＲＮＡまたはタンパク質の量を測定することによって決定されてもよく、さらに、複数の遺伝子の発現レベルは、特定の試料の発現プロファイルを確立するために決定されてもよい。
本明細書で使用される場合、「機能的」という用語は、ある特定の効果を達成することを意図するために、任意の分子、生物学的、または細胞材料を修飾するために使用され得る。
本明細書で使用される場合、「遺伝子」または「遺伝子の」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡがコード（例えば、ｍＲＮＡ）または非コード（例えば、ｎｃＲＮＡ）であるかどうかにかかわらず、ＲＮＡ分子に転写され得るか、またはされ得ない任意の核酸配列を広く含むことを意味する。「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはその類似体のいずれかの任意の長さのヌクレオチドの高分子形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、公知または未知の任意の機能を実施し得る。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメント（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。
「遺伝子操作または改変された」という用語は本明細書で使用される場合、遺伝子または遺伝物質の欠損、付加または調節、組換えＤＮＡ技術、ウイルスベクターまたはエレクトロポレーションを介した遺伝子改変、ＣＲＩＳＰＥＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）またはそれ以外を介した遺伝子ターゲティングまたは編集、ＤＮＡ断片の欠損または付加、遺伝子変異の補正などを非限定的に含む、細胞またはその遺伝物質の任意の形態の改変を広く含むことを意味している。
ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含むことができる。存在する場合、ポリヌクレオチドのアセンブリの前または後に、ヌクレオチド構造に対する修飾を付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断される可能性がある。ポリヌクレオチドは、標識成分との結合などにより、重合後にさらに修飾することができる。この用語はまた、二本鎖分子および一本鎖分子の両方を指す。別途指定または必要な場合を除き、ポリヌクレオチドであるこの技術の任意の態様は、二本鎖型と、二本鎖型を構成することが公知のまたは予測される、それぞれの二つの相補的な一本鎖型との両方を包含する。
「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、二つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチド模倣体の化合物を意味するために、互換的に最も広い意味で使用される。サブユニットは、ペプチド結合によって連結されてもよい。別の態様では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどによって連結されてもよい。タンパク質またはペプチドは、少なくとも二つのアミノ酸を含む必要があり、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得る、アミノ酸の最大数に制限はない。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤおよびＬ両方の光学異性体、アミノ酸類似体、およびペプチド模倣体を含む、天然および／または非天然または合成アミノ酸のいずれかを指す。
本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、互換的に使用され、任意のヒトまたは動物を意味することが意図されている。いくつかの実施形態では、対象は哺乳類であってもよい。さらなる実施形態では、対象は、ヒトまたは非ヒト動物（例えば、マウスまたはラット）であってもよい。
本明細書で使用される場合、「組織」という用語は、生きているもしくは死亡した生物体の組織、または生きているもしくは死亡した生物体の一部の態様由来のまたはそれを模倣するように設計された任意の組織を指す。組織は、健常であり、罹患しており、および／または遺伝子変異もしくは改変を有してもよい。「自然組織」または「生体組織」という用語および変形は、本明細書で使用される場合、その自然状態、または生物体に由来するときから未修飾の状態で存在する生体組織を指す。「微小器官」は、「自然組織」上でモデル化されているか、または「自然組織」を模倣する「生物工学的組織」のセグメントを指す。
生体組織は、任意の単一組織（例えば、相互接続され得る細胞の集合）または生物体の体の器官もしくは部分もしくは領域を構成する組織の群を含み得る。組織は、均質または不均一な細胞材料を含んでもよく、または例えば、肺組織、骨格組織、および／または筋組織を含むことができる胸部を含む体の領域で見られるような複合構造であってもよい。例示的組織としては、肝臓、肺、胸腺、皮膚、膵臓、血管、膀胱、腎臓、脳、胆管、十二指腸、腹部大動脈、腸骨静脈、心臓および腸、任意のその組み合わせを含むが、これらに限定されない。
「単離された」という用語は、本明細書で使用される場合、その他の材料を実質的に含まない分子または生物学的もしくは細胞材料を指す。「単離された」という用語はまた、その自然環境から除去された（例えば、インビボからエクスビボまたはインビトロに）材料を説明するためにも使用される。「滅菌」という用語は本明細書で使用される場合、細菌または他の生きた微生物を含まない材料を指す（すなわち、無菌性、滅菌、無菌、防腐性、消毒など）。
単離されたブルンナー腺幹／前駆細胞および細胞培地
本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は真核細胞を指す。様々な実施形態では、この細胞はヒトまたは動物由来であり、幹細胞または前駆細胞、または体細胞であり得る。「細胞の集団」という用語は、細胞の少なくとも一部、または実質的な部分または大部分が、同じまたは異なる起源および／もしくは系譜段階を有する、同じまたは異なる細胞タイプの一つまたは複数の細胞の群を指す。一部の実施形態では、この細胞の集団は、細胞株からもたらされてもよく、一部の実施形態では、この細胞の集団は、その器官もしくは組織、その一部、またはその試料からもたらされてもよい。
「幹細胞」という用語は、自己複製することができ（親細胞と同一の娘細胞を生成）、多能性であり、すなわち、複数のタイプの成体細胞を生じさせることができる細胞集団を指す。本明細書において使用される場合、「前駆細胞」または「前駆体」という用語は多能性でもあるが、前駆細胞または前駆体の多能性の範囲または範囲は、幹細胞の多能性よりも限定されていてもよい。「前駆細胞」または「前駆体」という用語はまた、幹細胞の子孫およびその子孫を包含するように広く定義される。前駆体は、多能性、両能性、または単能性の細胞集団であり得るが、幹細胞より限定された自己複製能を有し得る。運命付けられた前駆体は、特定の系譜に分化することができるものである。幹細胞の非限定的な例としては、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚葉幹細胞、決定された幹細胞、成人幹細胞、周産期幹細胞、羊水由来幹細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、および血管芽細胞が挙げられるが、これらに限定されない。幹細胞と運命づけられた前駆体との間の中間体には、肝芽細胞および膵管前駆体などの細胞集団、および多能性であり得るが、限定的な複製能を有し得る、他の形態の一過性増殖細胞を含まれる。
本開示における目的の細胞は、本明細書ではブルンナー腺幹／前駆細胞（ＢＧＳＣ）と称され、ヒトまたは動物の十二指腸（しかし腸内の他の場所ではない）から誘導され得る。これらのＢＧＳＣは、少なくとも以下の特徴に基づいて、腸幹細胞と区別可能である：
Figure 2021519585
出願人は、十二指腸とそのブルナー腺を、肝臓、膵臓、ならびに他の内胚葉系細胞および組織を生じる、十二指腸の粘膜下層に位置する腺幹／前駆細胞微小環境の一部である重要な幹／前駆細胞として初めて認識した。ＢＧＳＣは、ブルンナー腺（十二指腸粘膜下腺としても知られる）内の細胞の小さな亜集団（例えば、約５％）であり、ＴＲＡ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＮＡＮＯＧなどの多能性遺伝子を発現するものとして認識可能である。ＢＧＳＣは、肝臓、胆管、膵臓、腸、ならびにＬｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４、ＣＫ１９、ＳＯＸ９、およびＥｐＣＡＭを含み得る、および／またはＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を含み得るバイオマーカーを有する他の内胚葉系組織に関連する。
ＢＧＳＣは、上述のように腸幹細胞とは異なり、ＢＧＳＣは、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４およびＣＫ７を発現し、一方、腸幹細胞は発現しない。ＢＧＳＣはまた、ＢＧＳＣが、ＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現するという点で肝幹細胞および膵幹細胞とも区別されるが、肝幹細胞は、ＳＯＸ１７を発現するがＰＤＸ１は発現せず、膵幹細胞はＰＤＸ１を発現するがＳＯＸ１７は発現しない。
したがって、一態様では、本開示は、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９およびＣＫ７からなる群から選択される一つまたは複数のマーカーを発現する十二指腸から単離されたＢＧＳＣに関し、それらは、自己再生を支持する培養条件下で、限定的または最小限の分化で増殖する能力としてさらに特徴付けられる。別の態様では、十二指腸から単離されたＢＧＳＣは、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４およびＣＫ１９からなる群から選択される一つまたは複数のマーカーを発現し、ＢＧＳＣは、自己再生を支持する培養条件下で、限定的または最小限の分化で増殖する能力としてさらに特徴付けられる。別の態様では、十二指腸から単離されたＢＧＳＣは、ＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現し、ＢＧＳＣは、自己再生を支持する培養条件下で、限定的または最小限の分化で増殖する能力としてさらに特徴付けられる。一部の実施形態では、単離されたＢＧＳＣは、Ｔｒａ１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９、ＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４、ＣＫ１９からなる群から選択される一つまたは複数のマーカー、およびＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現してもよい。一部の実施形態では、単離されたＢＧＳＣは、病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を実質的に含まない。
一部の実施形態では、単離されたＢＧＳＣは、少なくとも１カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる。一部の実施形態では、単離されたＢＧＳＣは、少なくとも２カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる。一部の実施形態では、単離されたＢＧＳＣは、少なくとも６カ月間または少なくとも１２カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる。
一部の実施形態では、ＢＧＳＣの自己再生を支持する培養条件は、無血清培地を含む。一部の実施形態では、無血清培地は、クボタの培地を含む。
「培養」または「細胞培養」という用語は、インビトロ環境での細胞の維持を意味する。「細胞培養システム」は本明細書で使用される場合、細胞の集団がエクスビボ（生体外で）で成長し得る培養条件を指す。培養物は、単一タイプの細胞または異なる細胞タイプの混合物を含んでもよい。
細胞培養物は、細胞が、細胞外基質成分のコーティングなどのコーティングを有するかまはた有さない表面に、生物学的流体（例えば、血清またはリンパ液）ならびに／またはホルモン、成長因子およびサイトカインの定義された混合物（ホルモンで定義された培地もしくはＨＤＭ）を添加した栄養培地（ミネラル、ビタミン、アミノ酸、脂質）に播種される単層であるものを含む。ＨＤＭは、特定の成熟系統段階において、特定のタイプの細胞または細胞の集団でその有用性について経験的に定義される。
細胞培養物はまた、低付着ディッシュ上に播種された細胞の浮遊集団または凝集物であり得、および／または懸濁培養であり得る。浮遊集団もしくは凝集物、および／または懸濁培養物を支持する培地は、単層培養に使用されるものと同じ培地であることができる。培地は無血清であり得るか、または血清を含有し得る。無血清培地は、浮遊凝集物に単層を生成させ得る付着タンパク質（例えば、フィブロネクチン）を欠く。浮遊凝集物が実質的または主に一つの細胞タイプを含むなら、それらはスフェロイドと呼ばれる。それらが複数の細胞タイプ（例えば、上皮および間葉系細胞パートナー）を含むなら、それらは、オルガノイドと呼ばれる。ｂ懸濁培養物に浮遊している細胞集団または凝集物、スフェロイドおよびオルガノイドは、３Ｄ微小環境内にあるとみなされ、細胞は３次元で相互作用することができる。
本明細書で使用される「培養培地」は、細胞の培養、成長、または増殖のための栄養液を指す。培養培地は、非限定的に、細胞を特定の状態（例えば、多能性状態、静止状態など）で維持する能力、細胞の成熟を促進する能力、一部の場合では、多能性細胞の特定の系統の細胞への分化を促進する能力などの機能的特性により特徴付けられてもよい。
培地の非限定的な例は、典型的には約１０％のレベルで血清（市販品および農産物のため日常的に屠殺される動物に由来する）を添加した任意の基礎培地である、血清添加培地（ＳＳＭ）である。
「単離された」という用語は本明細書で使用される場合、他の材料（培地および／または細胞外マトリックス、ならびにそれらのそれぞれの成分を除く）を実質的に含まない分子または生物学的物質または細胞材料を指す。「単離された」という用語はまた、その自然環境から除去された（例えば、インビボからエクスビボまたはインビトロに）材料を説明するためにも使用される。
「滅菌、消毒または消毒された」という用語は本明細書で使用される場合、病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物（すなわち、無菌性、滅菌、無菌、防腐性、消毒など）を含まない材料を指す。
ＢＧＳＣの単離された集団
別の態様では、本開示は、細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９およびＣＫ７からなる群から選択される一つまたは複数のマーカーを発現し、自己再生を指示する培養条件下で、限定的または最小限の分化で増殖する能力として特徴付けられる、十二指腸から単離された幹／前駆細胞の集団に関する。別の態様では、本開示は、十二指腸から単離された幹／前駆細胞の集団に関し、細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４およびＣＫ１９からなる群から選択される一つまたは複数のマーカーを発現する。別の態様では、本開示は、十二指腸から単離された幹／前駆細胞の集団に関し、細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、ＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現する。一部の実施形態では、十二指腸から単離された幹／前駆細胞集団における細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、Ｔｒａ １−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９、ＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４、ＣＫ１９からなる群から選択される一つまたは複数のマーカー、およびＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現する。
一部の実施形態では、前述の段落に記載された幹／前駆体の単離された集団は、病原体が実質的に存在しない、ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物が存在しない。
一部の実施形態では、本開示は、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９、ＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４、ＣＫ１９、ＣＤ４４、ＣＫ１９からなる群から選択される一つまたは複数のマーカー、およびＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現する単離されたＢＧＳＣ集団を含む組成物に関し、一部の実施形態では、このＢＧＳＣ集団は滅菌、消毒、または消毒されている。
別の態様では、本開示は、細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、Ｔｒａ １−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９およびＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４およびＣＫ１９からなる群から選択される一つまたは複数のマーカー、およびＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現し、自己再生を支持する培養条件下で、任意選択で低付着プレート上または懸濁液中で、非限定的または最小限の分化で増殖する能力としてさらに特徴付けられる、単離されたＢＧＳＣ集団を培養することによって産生されるオルガノイドに関する。一部の実施形態では、オルガノイドは培地をさらに含み、培地は、ＢＧＳＣを、成熟細胞を含むより後の系統段階細胞に分化する能力がある。
一部の実施形態では、自己再生を支持する培養条件は、無血清培地を含む。一部の実施形態では、無血清培地は、クボタの培地を含む。
一部の実施形態では、無血清培養条件は、上皮細胞または間葉系細胞に関わらず、細胞の特定の成熟系統段階用に設計されたホルモン定義培地（ＨＤＭ）である。ＳＳＭに加えて、上皮細胞または間葉系細胞に関わらず、細胞の特定の成熟系統段階用に設計された無血清のＨＤＭ培地である。この例は、内胚葉系幹／前駆体用に設計された無血清培地である、クボタの培地は、銅および低カルシウムを含まず、インスリン、トランスフェリン／Ｆｅ、および様々な質を添加するが、サイトカインまたは成長因を添加されていない基礎培地（鉱物、アミノ酸、糖、塩、ビタミン、脂質を含有する栄養培地）を含む。この培地は、肝臓、膵臓、肺、および腸由来の内胚葉系幹／前駆細胞を支持することができる。
本明細書で使用する場合、「クボタの培地」は、銅を含有しないが、カルシウム（＜０．５ｍＭ）、セレン、亜鉛、インスリン、トランスフェリン／Ｆｅ、精製アルブミンに結合した遊離脂肪酸の混合物、および任意選択で、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を含有する任意の培地を指す。一部の実施形態では、クボタの培地は、銅、低カルシウム（例えば、０．３ｍＭ）、約１０〜９Ｍのセレン、約０．１％ウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミン（高精製および脂肪酸なし）、約４．５ｍＭのニコチンアミド、約０．１ｎＭの硫酸亜鉛七水和物、約１０〜８Ｍのヒドロコルチゾン（肝臓前駆体には使用されるが膵臓前駆体には使用されない任意の成分）、約５μｇ／ｍｌのトランスフェリン／Ｆｅ、約５μｇ／ｍｌのインスリン、約１０μｇ／ｍｌの高密度リポタンパク質、および精製血清アルブミンに結合した後に加えられた精製遊離脂肪酸の混合物を含まない、任意の培地（例えば、ＲＰＭＩ １６４０またはＤＭＥＭ−Ｆ１２）を含む。遊離脂肪酸混合物は、それぞれ約１００ｍＭのパルミチン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、およびステアリン酸から成る。この培地の調製の非限定的な例示的方法は、他で公開されており、例えば、Ｋｕｂｏｔａ Ｈ，Ｒｅｉｄ ＬＭ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎ．（ＵＳＡ）２０００年；９７：１２１３２〜１２１３７であり、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
幹細胞／前駆体を、肝細胞（ＨＤＭ−Ｈ）または胆管細胞（ＨＤＭ−Ｃ）などの特定の成人運命にするよう設計され得る他の無血清ＨＤＭが存在する。これらのＨＤＭの一部は、本明細書では以下にさらに定義される。一部の実施形態では、培地は、細胞を所与の環境に提示または導入するために使用される「播種培地」であってもよい。他の実施形態では、培地は、細胞の分化を促進するために使用される「分化培地」であってもよい。
このような培地は、栄養素、鉱物、アミノ酸、糖、脂質、および微量元素の混合物である「基礎培地」を含む（例えば、ダルベッコ変法イーグル培地またはＤＭＥ、ならびにＨａｍ’ｓ Ｆ１０またはＦ１２、およびＲＰＭＩ １６４０、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで確立された定義された基礎培地を含む）。これらの基本培地は、血清（血清添加培地もしくはＳＳＭ）または精製されたホルモン、成長因子および栄養素の定義された混合物のいずれかを添加され、ホルモンで定義された培地（ＨＤＭ）であり、エクスビボでの細胞の維持のため使用することができる。本明細書で使用される場合、「ＨＤＭ−Ｈ」は、オルガノイドのため、または成熟肝細胞への内胚葉系幹／前駆体の分化をもたらすように、ＩＶ型コラーゲンおよびラミニンの基質上に播種された単層培養物用に使用されるＨＤＭである。ＨＤＭ−Ｃは、オルガノイドのため使用されるか、または細胞を成熟胆管細胞にするためにＩ型コラーゲンおよびフィブロネクチンの基質に播種された単層のため使用されるＨＤＭである。
特定のホルモンで定義された培地（ＨＤＭ）組成物を、以下にさらに詳細に説明する：
・改変ＫＭ（ＭＫＭ）：以下のＨＤＭの三つはいずれも、０．６ｍＭ濃度、１０−１２Ｍ銅、および２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦに達するようさらにカルシウムを添加したＫＭを使用した。
・肝細胞分化（ＨＤＭ−Ｌ）：ＭＫＭに７ｕｇ／Ｌグルカゴン、２ｇ／Ｌガラクトース、１ｎＭトリヨードチロキシン３（Ｔ３）、１０ｎｇ／ｍｌオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、１０ｎｇ／ｍｌ上皮成長因子（ＥＧＦ）、２０ｎｇ／ｍｌ肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、および１μｍデキサメタゾンを補充して調製した。
・胆管細胞分化（ＨＤＭ−Ｃ）：２０ｎｇ／ｍｌ血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）１６５および１０ｎｇ／ｍｌＨＧＦをＭＫＭに添加することにより調製した。
・膵分化用の定義された培地（ＰＭまたはＨＤＭ−Ｐ）：ヒドロコルチゾンを含まず、さらに２％ Ｂ２７、０．１ｍＭアスコルビン酸、０．２５μＭシクロパミン、１μＭレチノイン酸を添加したＭＫＭを使用して調製し、ｂＦＧＦは、最初の４日間使用され、残りの期間、５０ｎｇ／ｍｌエキセンディン−４および２０ｎｇ／ｍｌＨＧＦで置き換えた。
基底培地は、細胞培養に使用される緩衝液であり、アミノ酸、糖、脂質、ビタミン、ミネラル、塩、微量元素、および細胞周囲の間質液の化学成分を模倣する組成物中の様々な栄養素から成る。さらに、細胞培養培地は通常、生物学的プロセス（例えば、増殖、分化）をもたらすのに必要とされる必須のシグナル伝達分子（ホルモン、成長因子）を提供するために、低い割合（典型的には２〜１０％）の血清を添加した基礎培地からなる。血清は、培養で使用される細胞タイプに対して自己であり得るが、最も一般的には、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマなどの血清などの農業または食品目的で日常的に屠殺され動物由来の血清である。血清はまた、組織分離プロセスの一部である酵素を不活化するためにも使用される。
粘膜層および粘膜下層を有する組織から多能性細胞を単離する方法
別の態様では、本開示は、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する一つまたは複数の多能性幹／前駆細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的に一部、または大部分が所望のバイオマーカーを発現する集団を、粘膜層および粘膜下層を有する組織から単離する方法であって、
（ａ）腸粘液を実質的に含まない十二指腸の粘膜層を、生理学的範囲外にある浸透圧特性を有する培地または溶液と、粘膜層の細胞に浸透圧ショックを誘発する条件下で接触させること；
（ｂ）機械的、外科的および／または化学的方法により粘膜層またはその細胞の少なくとも一部分を除去または溶解し、粘膜下層を含み得る残部を残し、および／または曝露させること；
（ｃ）残部を消化または分離すること；
（ｄ）一つまたは複数のＢＧＳＣまたは細胞の集団を消化された残部から単離すること、を含む方法に関する。
本明細書で使用される場合、「浸透圧ショック」という用語は、細胞に損傷を引き起こす細胞内の生理学的浸透圧に対する浸透圧の変化を指す。一部の実施形態では、浸透圧ショックを細胞に誘発する条件下で、生理学的範囲外にある浸透圧特性を有する培地または溶液を適用することによって、細胞は浸透圧ショックによって損傷される。生理学的範囲外の浸透圧特性を有する培地または溶液は、生理学的浸透圧より低い浸透圧を持つ低張性または低浸透圧または低浸透圧性の溶液であってもよい。生理学的範囲外の浸透圧特性を有する培地または溶液は、生理学的浸透圧より高い浸透圧を持つ高張性または高浸透圧または高浸透圧性の溶液であってもよい。生理学的範囲外の浸透圧特性を有する培地または溶液は、任意の種類の溶液であってもよい。一部の実施形態では、生理学的範囲外にある浸透圧特性を有する培地または溶液は、水、超純水、蒸留水、５％グルコース溶液、高塩溶液などであってもよい。
浸透圧ショックは、生理学的範囲外にある浸透圧特性を有する培地または溶液を管腔に、十二指腸が膨張するのを誘導する量で適用することによって、またはそのような培地または溶液を組織の粘膜層に適用することによって誘発され得る。一部の実施形態では、生理学的範囲外にある浸透圧特性を有する培地または溶液は、約０．５分、１分、約２分、約５分、約１０分または約１５分の間、管腔または粘膜層と接触され得る。
一部の実施形態では、粘膜層および粘膜下層を有する組織由来の一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現している、一つまたは複数の多能性細胞、またはこのような細胞を含む集団を単離する方法は、選別または単離工程の前に、混合物の細胞懸濁液へのさらなる処理を含む。一部の実施形態では、粘膜層および粘膜下層を有する組織由来の一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現している、一つまたは複数の多能性細胞、またはこのような細胞を含む集団を単離する方法は、生理学的に許容される培地を使用した１回または複数回の洗浄工程を含む。
粘膜層および粘膜下層を有する組織由来の一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現している、一つまたは複数の多能性細胞、またはこのような細胞を含む集団を単離する方法を使用して、粘膜層および粘膜下層を有する任意の適当な組織から多能性幹細胞を単離し得る。一部の実施形態では、組織は、内胚葉系組織である。一部の実施形態では、組織は、小腸、大腸、直腸を含む群から選択される。一部の実施形態では、組織は、気管、主気管支、食道、胃および十二指腸を含む群から選択される。
特定の態様では、本開示は、一つまたは複数のＢＧＳＣまたはＢＧＳＣを含む集団を、組織、かかる組織の一部、または対象の十二指腸から採取されたその試料から単離する方法であって、
（ａ）腸粘液を除去すること；
（ｂ）生理学的範囲外にある浸透圧特性を有する培地または溶液を、粘膜層の細胞に浸透圧ショックを誘発する条件下で適用すること；
（ｃ）機械的、外科的および／または化学的方法により粘膜層またはその細胞の少なくとも一部分を除去または溶解し、粘膜下層を含み得る残部を残し、および／または曝露させること；
（ｄ）粘膜層および／または残部に、病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を実質的に殺傷するか、不活化するか、または除去するための培地または溶液を適用すること；
（ｅ）消化または分離を、粘膜下層を含む残部に適用して、消化物、分離した細胞材料、または細胞懸濁液を生じさせること；
（ｆ）任意選択で消化物、分離した細胞材料、または細胞懸濁液由来の細胞の少なくとも一部を培養すること；
（ｇ）Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９、ＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４、ＣＫ１９の一つまたは複数を発現する細胞、もしくは細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９、ＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４、ＣＫ１９の一つまたは複数を発現する細胞の集団、および／またはＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現するその細胞を単離すること、を含む、方法に関する。
本明細書で使用される場合、用語「残部」は、粘膜下層が露出されるように、粘膜層が部分的または完全に破壊および／または除去された、組織、その一部、またはその試料を指す。ＢＧＳＣなどの所望の多能性細胞は、残りの粘膜下層内に含まれる。
一つまたは複数のＢＧＳＣ、またはＢＧＳＣを含む集団を、対象の十二指腸、その一部、またはその試料から単離する方法の一部の実施形態では、除去工程は、乳化剤および／または界面活性剤の使用を含む、化学破壊によって行われる。一部の実施形態では、消毒または滅菌は、次亜塩素酸ナトリウム溶液を用いて工程（ｄ）で行われる。一部の実施形態では、消化は酵素的に行われる。一つまたは複数のＢＧＳＣまたはＢＧＳＣを含む集団を単離する方法の一部の実施形態では、除去または溶解工程後の残部は、粘膜下層を含み、消化された残部は、組織断片を含む。一つまたは複数のＢＧＳＣまたはＢＧＳＣを含む集団を単離する方法の一部の実施形態では、組織もしくは組織部分または試料は、消化工程（ｅ）の前に刻まれる。一つまたは複数のＢＧＳＣまたはＢＧＳＣを含む集団を単離する方法の一部の実施形態では、単離工程（ｆ）は、無血清培地、任意選択で、クボタの培地を含む培養条件での培養セレクションを使用して行われる。一つまたは複数のＢＧＳＣまたはＢＧＳＣを含む集団を単離する方法の一部の実施形態では、単離工程（ｆ）は、血清を含有する培養条件での培養セレクションを用いて行われる。一つまたは複数のＢＧＳＣまたはＢＧＳＣを含む集団を単離する方法の一部の実施形態では、消化工程（ｅ）および／または単離工程（ｆ）は、低付着プレート上で行われる。一つまたは複数のＢＧＳＣを単離する方法の一部の実施形態では、単離された細胞は、スフェロイド、一つまたは複数のオルガノイド、細胞集団、または細胞凝集物を支持または生じる懸濁液または３Ｄ条件下で培養される。
機械的破壊／粘膜切除術は、粘膜層を除去する様々な可能な手法およびツールによって行うことができる。一部の実施形態では、細胞表面層は剥離される。小さなビーズを使用して細胞壁をせん断すること、超音波処理を使用して細胞壁を破壊すること、乳鉢および乳棒による粉砕を使用すること、ブレンダーを使用すること、凍結および解凍サイクルを使用すること、マイクロ波を使用して細胞壁内の結合を破壊すること、およびタンパク質を変性させること、または高圧を使用すること等のような、細胞層の機械的破壊の多くの異なる方法が知られている。
一つまたは複数のＢＧＳＣまたはＢＧＳＣを含む細胞の集団を単離する方法の一部の実施形態では、除去または分解工程は、レシチン、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ポリソルベート８０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（ポリソルベート４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（ポリソルベート６０）、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート（ポリソルベート６５）、アンモニウムホスファチド、脂肪酸のナトリウム、カリウムおよびカルシウム塩、脂肪酸のマグネシウム塩、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリド、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの酢酸エステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの乳酸エステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドのクエン酸エステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドのモノアセチル酒石酸エステルおよびジアセチル酒石酸エステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの混合酢酸と酒石酸エステル、脂肪酸のスクロースエステル、スクログリセリド、脂肪酸のポリグリセロールエステル、ポリグリセロールポリリシノレエート、脂肪酸のプロパン−１，２−ジオールエステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドと相互作用した熱酸化大豆油、ステアロイル−２−ラクチル酸ナトリウム、ステアロイル−２−ラクチル酸カルシウム、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノパルミテートから選択される乳化剤の使用を含む、化学的破壊によって行われる。
一つまたは複数のＢＧＳＣを単離する方法の一部の実施形態では、除去または分解工程は、１−ヘプタンスルホン酸、Ｎ−ラウリルサルコシン、ラウリル硫酸塩、１−オクタンスルホン酸およびタウロコール酸、塩化ベンザルコニウム、セチルピリジニウム、塩化メチルベンズトニウム、臭化デカメトニウム、アルキルベタイン、アルキルアミドアルキルベタイン、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アムモニオ−１−プロパンスルホネート、ホスファチジルコリン、Ｎ−デシルＡ−Ｄ−グルコピラノシド、Ｎ−デシルＡ−Ｄ−マルトピラノシド、Ｎ−ドデシルＢ−Ｄ−マルトシド、Ｎ−オクチルＢ−Ｄ−グルコピラノシド、Ｎ−テトラデシルＢ−Ｄ−マルトシド、トリトン（トリトンＸ−１００）、ノニデット−Ｐ−４０、ポロキサマー１８８、ラウリル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、およびドデシル硫酸ナトリウムを含む群から選択される界面活性剤の使用を含む、化学的破壊により行われる。
一態様では、本開示は、一つまたは複数のＢＧＳＣまたはＢＧＳＣを含む細胞集団を対象の十二指腸から採取された組織試料から単離する方法であって、
（ａ）粘膜層を生理学的範囲外にある浸透圧特性を有する溶液を、粘膜層の細胞に浸透圧ショックを誘発する条件下で適用すること；
（ｂ）機械的、外科的および／または化学的方法により粘膜層またはその細胞の少なくとも一部分を除去または溶解し、粘膜下層を含み得る残部を残し、および／または曝露させること；
（ｃ）残部を病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を実質的にさしょうするか、不活化するか、または除去するための培地または溶液と接触させること；
（ｄ）残部を消化または分離して細胞懸濁液をもたらすこと；
（ｅ）任意選択で消化物もしくは分離した細胞材料または組織材料由来の細胞の少なくとも一部を培養すること；
（ｆ）一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する一つまたは複数の多能性細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する細胞の集団を単離すること、を含む、方法に関する。
一部の実施形態では、粘液は、粘膜層を生理学的範囲外にある浸透圧特性を有する溶液と粘膜層の細胞に浸透圧ショックを誘発する条件下で接触させる前に、組織もしくは組織部分または試料から除去される。
別の態様では、本開示は、ＢＧＳＣを十二指腸、その一部、またはそれから採取された試料から単離する方法であって、
（ａ）十二指腸、その一部分、またはそこから採取された試料を消化または分離して、消化物または分離した細胞材料を生じさせること；
（ｂ）消化または分離した細胞材料から：（ｉ）Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９、ＣＫ７、ＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４およびＣＫ１９の一つまたは複数を発現するこれらの細胞、もしくは細胞の少なくとも一部、実質的な部分、または大部分が、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９、ＣＫ７、ＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４、およびＣＫ１９を発現する細胞の集団；および／または（ｉｉ）ＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現するこれらの細胞、もしくは細胞の少なくとも一部、実質的な部分、または大部分が、ＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現する細胞の集団を得ること、を含む、方法に関する。
ＢＧＳＣまたはＢＧＳＣを含む細胞の集団を単離する方法の一部の実施形態では、十二指腸、その一部、それから採取された試料、残部および／あるいは消化物または分離した細胞もしくは組織材料、あるいはその組み合わせは、消毒剤または滅菌媒体、溶液もしくは薬剤と接触される。
本明細書で使用される場合、「消毒剤」という用語は、細菌、ウイルスおよび真菌などの病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を破壊するすべての媒体、溶液または薬剤を含むように意図され、また細菌または真菌胞子を殺傷する媒体、溶液または薬剤も含むように意図されている。一部の実施形態では、消毒剤は次亜塩素酸溶液である。一部の実施形態では、消毒剤は、約０．０１％〜約０．１％の次亜塩素酸ナトリウム、または約０．１％〜約０．２％の次亜塩素酸ナトリウムを含む溶液である。一部の実施形態では、消毒剤は、０．０１％次亜塩素酸ナトリウム溶液、０．０２％次亜塩素酸ナトリウム溶液、０．０５％次亜塩素酸ナトリウム溶液、０．１％次亜塩素酸ナトリウム溶液、０．１５％次亜塩素酸ナトリウム溶液、または０．２％次亜塩素酸ナトリウム溶液である。好ましい実施形態では、消毒剤は０．０５％次亜塩素酸ナトリウム溶液である。
あるいは、一部の実施形態では、消毒剤は、アルコール、水酸化ナトリウム、アルデヒド、酸化剤、ペルオキシ酸およびペルオキソ酸、フェノール類、四級アンモニウム化合物、無機化合物（塩素、ヨウ素、酸および塩基、金属など）、またはテルペン等を含む群から選択される媒体、溶液または薬剤であってもよい。本明細書で使用される場合、消毒剤はまた、ペニシリン、ポリミキシン、リファマイシン、リピアルマイシン、キノロン、またはスルホンアミドなどの抗生物質を含む。
十二指腸、その一部、またはそれから採取された試料を消毒剤または滅菌媒体、溶液または薬剤と接触させることにより、得られたＢＧＳＣをもたらし、ＢＧＳＣを含む細胞の集団は、病原体を実質的に含まず、ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を含まないことは、本開示の知見である。生物学分野の当業者であれば、生物学的および化学的現象は、稀、極めて稀に、完了し、および／または完全に進み、または絶対的な結果を達成もしくは回避することを理解するであろう。したがって、「実質的に」という用語は、多くの生物学的および化学的現象に固有の完全性の可能性のある欠如を拾うために本明細書で使用される。例えば、一部の実施形態では、「病原体が実質的に存在しない、ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物が存在しない」という用語は、病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物の存在が、所望の使用に許容できるか、もしくはＢＧＳＣまたはＢＧＳＣを含む細胞の集団の所望の使用を妨げ得ないレベル、または一般に公知の方法によって決定される目的の試料において検出できないレベルである状況を指し得る。かかる方法には、例えば、グラム陽性、グラム陰性、好気性および嫌気性細菌についての標準的な無菌検査、マイコプラズマならびにエンドトキシン試験を含む。これは、組織、もしくは組織部分または試料から得られたＢＧＳＣ以外の細胞または細胞の集団に関連する「病原体が実質的に存在しない、ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物が存在しない」という用語に適用する。
したがって、本開示の組成物は、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９、ＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４、ＣＫ１９の一つまたは複数のマーカー、およびＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現している、病原体を実質的に含まない、ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を含まないＢＧＳＣまたはＢＧＳＣを含む細胞集団を含んでもよい。
本開示の組成物はまた、生理学的に許容される媒体と組み合わせた、単離されたＢＧＳＣもしくは他の多能性細胞、またはかかる細胞を含む細胞集団を含み得る。本明細書で使用される場合、「生理学的に許容される媒体」という用語は、従来の医薬実施が、ヒト患者などの対象に投与するための医薬組成物を製剤化するため使用する任意の媒体を指す。生理学的に許容可能な媒体は、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、ビタミン、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、および保存剤などの他の補助剤を含有する生理食塩水または等張溶液を含み得る。本発明の組成物は、対象の循環または標的器官もしくは組織に直接、ＢＧＳＣまたはＢＧＳＣを含む細胞集団の注入用に製剤化されてもよい。
したがって、本開示は、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９、ＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４、ＣＫ１９の一つまたは複数のマーカー、およびＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現している、病原体を実質的に含まない、ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を含まないＢＧＳＣまたはＢＧＳＣを含む細胞集団、および生理学的に許容される媒体を含んでもよい。
単離したブルンナー腺幹／前駆細胞（ＢＧＳＣ）の使用方法
本明細書に開示されるＢＧＳＣおよび／またはＢＧＳＣを含む細胞の集団は、医療処置における使用が意図されている。
例えば、本開示は、肝臓、膵臓、胃、十二指腸、小腸、大腸、直腸および／または他の内胚葉系組織に関係するか、または影響する疾患または状態と診断された対象を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量のＢＧＳＣの集団を投与することを含む、方法に関する。
一部の実施形態では、本開示は、肝臓、膵臓、胃、十二指腸、小腸、大腸、直腸および／または他の内胚葉系組織に関係するか、または影響する疾患または状態と診断された対象を治療する方法であって、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９およびＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４、ＣＫ１９からなる群から選択される一つまたは複数のマーカー、およびＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現している、ＢＧＳＣの少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分を含む、有効量の細胞の集団の投与を含む、方法に関する。
別の態様では、本開示は、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９およびＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４、ＣＫ１９からなる群から選択される一つまたは複数のマーカー、およびＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現し、自己再生を指示する培養条件下で、限定的または最小限の分化で増殖する能力として特徴付けられる、有効量のＢＧＳＣ、またはＢＧＳＣの少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、十二指腸から単離された幹／前駆細胞の集団の投与を含む、自己細胞または遺伝子療法に関する。自己細胞または遺伝子療法の一部の実施形態では、細胞は、遺伝子操作または改変された細胞である。
別の態様では、本開示は、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９およびＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４、ＣＫ１９からなる群から選択される一つまたは複数のマーカー、およびＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現し、自己再生を指示する培養条件下で、限定的または最小限の分化で増殖する能力として特徴付けられる、有効量のＢＧＳＣ、またはＢＧＳＣの少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、十二指腸から単離された幹／前駆細胞の集団の投与を含む、同種細胞または遺伝子療法に関する。同種細胞または遺伝子療法の一部の実施形態では、細胞は、遺伝子操作または改変された細胞である。
別の態様では、本開示は、肝臓、膵臓、胃、十二指腸、小腸、大腸、直腸および／または他の内胚葉系組織に関係するか、または影響する疾患または状態の治療のため、および／または任意選択で、遺伝子操作または改変されている細胞を用いて自己もしくは同種細胞または遺伝子療法のための使用のための、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９およびＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４、ＣＫ１９からなる群から選択される一つまたは複数のマーカー、およびＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現し、自己再生を指示する培養条件下で、限定的または最小限の分化で増殖する能力として特徴付けられる、ＢＧＳＣの使用に関する。
別の態様では、本開示は、肝臓、膵臓、胃、十二指腸、小腸、大腸、直腸および／または他の内胚葉系組織に関係するか、または影響する疾患または状態の治療のため、および／または任意選択で、遺伝子操作または改変されている細胞を用いて自己もしくは同種細胞または遺伝子療法のための使用のための、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９およびＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４、ＣＫ１９からなる群から選択される一つまたは複数のマーカー、およびＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現している、ＢＧＳＣの少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分を含む細胞の集団の使用に関する。
本明細書で使用される場合、対象の疾患を「治療する」または疾患の「治療」は、（１）疾患の症状がまだ表れていないか、または限られた症状を表す対象に、症状または疾患が発生するのを防ぐこと、（２）疾患を抑制すること、もしくはその発症を阻止すること、または（３）疾患の退縮または疾患の症状を改善することまたは引き起こすことを指す。当技術分野で理解されているように、「治療」は、臨床結果を含む、有益または望ましい結果を得るための手法である。本技術の目的のための有益または望ましい結果は、検出可能または検出不能にかかわらず、一つまたは複数の症状の緩和または軽減、改善または休止、状態の程度の減弱（疾患を含む）、状態の状況（疾患を含む）の安定化（すなわち、悪化しない）、状態の遅延または減速（疾患を含む）、状態の進行、改善、または緩和（疾患を含む）、状況および寛解（部分的か全身的か）のうちの一つまたは複数を含むことができるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「有効な量」または「有効量」という用語は、強調されている疾患または状態を治療するのに十分な量を指す。有効量は、一回または複数回の投与、塗布または用量で投与することができる。このような送達は、個別の投与単位が使用される期間、組成物の生物学的利用性、投与経路などを含む多くの変数に依存する。しかしながら、任意の特定の患者に対する組成物の特定の量は、使用される特定の薬剤の活性、患者の年齢、体重、健康状態、併存疾患、性別、および患者の食事、投与の時間、代謝および／または排泄の速度、組成物の組み合わせ、治療している特定の疾患または状態（例えば、肝臓疾患）の重症度、ならびに投与の形態を含む種々の要因に依存することが理解される。
開示の実施方法
本明細書の本開示は、ｉ）ヒトおよび／または動物の十二指腸が、多能性または多分化能マーカー、および幹細胞の他のバイオマーカーまたは「幹細胞性」について陽性の内胚葉系幹／前駆細胞の表現型形質を有する、本明細書においてブルンナー腺幹／前駆細胞（ＢＧＳＣ）と称される、ブルンナー腺を含む、細胞を含有すること、ｉｉ）これらの細胞が、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ１−８１、ＯＣＴ４およびＣＫ７発現を含むが、これらに限定されない、粘膜陰窩内の腸幹細胞の表現型とは異なる表現型を有すること、ｉｉｉ）ＢＳＳＣはＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現し、これらの細胞がまた、肝幹細胞（ＳＯＸ１７を発現するがＰＤＸ１は発現しない）の表現型、および膵幹細胞（ＰＤＸ１は発現するがＳＯＸ１７は発現しない）の表現型とは異なる表現型も有すること、ｉｖ）ＢＧＳＣが、少なくとも一部、粘膜上皮細胞（絨毛および陰窩）を破壊するが、少なくとも一部、粘膜下層を維持する、化学的、機械的および／または外科的手法もしくは方法により単離され得ること、ｖ）ＢＧＳＣが、それらが、スフェロイド、オルガノイド、細胞凝集物または細胞集団を形成し、成長する能力である、自己再生特性を示し、多分化能を示す、インビトロで選択され得ること、ｖｉ）インビボで、ＢＧＳＣが、組織に生着し、かかる組織に関連する系統に分化することができること、例えば、ＳＣＩＤマウスの肝臓に生着し、成熟肝細胞に向かって分化すること、を示す。
ブルンナー腺は、十二指腸の粘膜下層内に位置する固有の粘液腺である。これらの腺は、胃では見いだされず、小腸の他の部分（すなわち、空腸および回腸）でも大腸でも見いだされていない。その主な公知の機能は、胃から出る物質の酸性度から十二指腸粘膜を保護する粘液の生成にある。ブルンナー腺の数は、幽門口から十二指腸空腸の湾曲部に向け徐々に減少し、下側および上行性十二指腸部分ではほぼ消失する。十二指腸壁では、ブルンナー腺は、腸陰窩（または腺）と粘膜筋板により分けられているが、それらとの直接的な解剖学的連続性にある。腸陰窩は、腸の陰窩から絨毛軸に従った、腸上皮の連続的な再生に関与する幹細胞の特定の集団を含む。
本明細書において提供されるデータは、粘液細胞のそばで、ブルンナー腺が、ＳＯＸ９、Ｌｇｒ５、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４４、および／またはＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方などの幹細胞マーカーの特定の群を発現する細胞の集団を有することを確立する。これらの細胞は小さく、わずかな細胞質、高い細胞質対核の比を有し、その表現型は、胚の腹側内胚葉の特性と適合する。さらに、これらの細胞の限定された部分集団（ほぼ５％）は、Ｏｃｔ４Ａ、ＳＯＸ２、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１などの多能性マーカーを発現する。さらに、ＢＧＳＳＣは、増殖マーカーＰＣＮＡの発現を示し、これにより、その複製活性を示し、これはおそらくムチン産生細胞の複製に関与している。興味深いことに、幹細胞マーカーの発現は、正確に分布し、多能性マーカーは、より深い腺房に位置する細胞で発現され、一方でＬｇｒ５およびＰＣＮＡは、粘膜筋板近くの細胞内、腸陰窩と連続していた。この分布は、二つの異なるが重複するＢＧＳＣ集団の存在を示唆し、一方の集団は、原始表現型を有し、静止期であり、粘膜下層内に深く位置し、他方の集団は、一過性の増幅特性を示し、粘膜筋板を横断し、腸陰窩と空間上関連している。しかし、「静止」と一過性増幅性ＢＧＳＣ集団の両方が、腸陰窩の細胞（Ｌｇｒ５＋／ＣＫ７−／ＣＫ１９＋／Ｔｒａ−１−６０−）と明確に区別する、表現型（Ｌｇｒ５＋／−／ＣＫ７＋／ＣＫ１９＋／Ｔｒａ−１−６０＋）を示した。
本明細書に開示される態様は、表面上皮を少なくとも部分的に除去するための粘膜層の化学的、機械的または外科的破壊を含む工程、粘膜下層を露出させ得る；粘膜下層の消化もしくは分離；本開示において記載されるマーカーを発現する細胞、細胞を含む細胞の集団の単離、残部をそのままにする工程を含む、ＢＧＳＣ、またはＢＧＳＣの少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分を、ヒト十二指腸から単離するために開発されたアプローチに関するものであり、この方法は、無血清のクボタの培地で維持されたスフェロイド、オルガノイド、細胞凝集物または細胞集団などの培養セレクション条件を含み得る。単離されると、細胞は、インビトロで器官に表される表現型（例えば、Ｌｇｒ５＋／−／ＣＫ７＋／ＣＫ１９＋／Ｔｒａ−１−６０＋／多能性遺伝子＋）と一致し、細胞調製物由来の腸幹細胞の枯渇を確かにする。インビトロでは、ＢＧＳＣは、スフェロイド、オルガノイド、細胞凝集物または細胞集団として成長し、その未分化の表現型を維持することができ、成熟細胞マーカーの発現は無く、ムチン産生の証拠はない。特筆すべきことに、ＢＧＳＣは、特定の分化条件に移したときに、少なくとも肝細胞、胆管細胞および内分泌膵臓系統を含む様々な運命に向かって速やかに成熟することができた。
興味深いことに、過去の報告では、ヒトの胃上皮細胞および十二指腸細胞は、再プログラミングすることなく幹細胞の挙動および多能性を示さなかった（表を参照）ことを示した。本明細書において開示される結果は、対照的に、幹／前駆細胞（ＢＧＳＣ）が、ブルンナー腺を含む、ヒトおよび動物の十二指腸内に見出されることを示す。器官内でのそれらの位置を考慮すると、これらのＢＧＳＣまたはこれらのＢＧＳＣを含む細胞集団は、本開示に記載される方法を使用して容易に単離可能であり、再プログラミングを必要としないが、内胚葉系幹／前駆細胞の特性、特徴および能力を本質的に示し、多能性特性を有する。
この研究では、成熟内皮運命への分化能が試験されている。例えば、ＢＧＳＣは、血管経路を介してマウス肝臓に注入されている。
肝疾患の分野において、同所性肝移植は、現在、急性肝不全および末期慢性肝疾患に対する唯一の根治療法である。肝臓移植は、器官ドナーの深刻な不足により制限されるため、細胞療法戦略は、器官の割り当てを待っている間に肝機能をサポートする実行可能な代替選択肢を表し得る。しかし、肝疾患に対する再生医療アプローチは、持続可能で、容易に利用可能な細胞供給源の同定を必要とする。
本開示は、多能性能力を有する新規の幹細胞微小環境、および適用可能な細胞を出生後の十二指腸から単離する手法を提供する。ヒトＢＧＳＣは、ヒトドナーから入手可能な、容易に利用可能な供給源を表す。細胞は、遺伝子リプログラミングまたは大きな操作を必要とせず、リプログラミングされた細胞と比較して、臨床プログラムにおいてより容易に使用可能（かつ潜在的により安全なアプローチ）であるべきである。さらに、これらは、内視鏡検査を使用して回収し、次に、自家または同種細胞および遺伝子治療に使用することができる細胞供給源としての固有の可能性を有する。
略語
ＡＦＰ（ＡＦＰ）、α−フェトタンパク質；ＡＬＢ、アルブミン；ＢＴＳＣ、胆管幹細胞；ＣＤ、共通決定因子；ＣＤ４４、ヒアルロナン受容体；ＣＤ１３３、 プロミニン；ＣＦＴＲ、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、ｃＧＭＰ、医薬品適正製造基準；ＣＫ、サイトケラチンタンパク質；ＣＸＣＲ４、ＣＸＣ−ケモカイン受容体４（フシンまたはＣＤ１８４とも呼ばれ；血小板第４因子とも呼ばれる）；ＤＡＰＩ、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール；ＤＰＢＳ、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水；ＥＧＦ、上皮成長因子；ＥｐＣＡＭ、上皮細胞接着分子；ＦＢＳ、ウシ胎児血清（またはＦＣＳ、胎児仔牛血清）；ＦＧＦ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ１０は、ＦＧＦの多くの型の一つである）；ＨＢ、肝芽球；ＨＤＭ、ホルモンで定義される培地；ＨＤＭ−Ｃ、細胞を胆管細胞に限定する系統に設計されているＨＤＭ；ＨＤＭ−Ｈ、細胞を肝細胞に限定する系統に設計されたＨＤＭ；ＨＤＭ−Ｐ、細胞を膵運命に限定する系統に設計されたＨＤＭ、ＨＧＦ、肝細胞成長因子；ＨｐＳＣ、肝幹細胞；ＩＦ、免疫蛍光染色；ＩＨＣ、免疫組織化学；ＫＭ、クボタの培地、内胚葉系幹細胞用に設計された無血清培地；ＫＲＴ、サイトケラチン遺伝子；Ｌｇｒ５、Ｒ−スポンジンに結合するロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５；ＭＫＭ、カルシウム、銅、およびｂＦＧＦを添加したクボタの培地からなる改変されたクボタの培地；ＮＡＮＯＧ、自己再生に決定的に関与する転写因子；ＮＣＡＭ、神経細胞接着分子；ＮＩＳ、ナトリウム／ヨウ素共輸送体；ＯＣＴ４、（オクタマー結合転写因子４）、ＰＯＵ５Ｆ１（ＰＯＵドメイン、クラス５、転写因子１）としても公知、幹細胞によって発現される遺伝子；ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水；ＰＤＸ１、膵臓および十二指腸ホメオボックス１、膵発生に重要な転写因子；ＰＢＧ、胆管周囲腺、胆管幹細胞の幹細胞微小環境；ＲＭＰＩ、ロズウェルパーク記念研究所−研究所の研究者が確立した様々な基礎培地の頭字語；ＲＴ−ＰＣＲ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応；ＳＡＬＬ４、幹細胞の自己再生に重要であると見出されたＳａｌ様タンパク質４；ＳＯＸ、Ｓｒｙ関連ＨＭＧボックス；ＳＯＸ２、自己再生の維持、または胚性幹細胞および決定した幹細胞の多能性に必須である転写因子。 ＳＯＸ９、内胚葉系組織（肝臓、胆道系および膵臓）と関連する転写因子；ＳＯＸ１７、肝臓の分化に必須の転写因子；ＶＥＧＦ、血管内皮細胞成長因子。
材料および方法
ヒト組織ソーシング
ヒトの十二指腸は、イタリア、ローマ、ローマ・ラ・サピエンツァ大学、一般外科および臓器移植「Ｐａｒｉｄｅ Ｓｔｅｆａｎｉｎｉ」部の臓器ドナーから採取した。研究目的で組織を使用するというインフォームド・コンセントは、本発明者らの移植プログラムから取得した。プロトコルは、治験審査委員会の承認を得ており、処理は現行の製造管理および品質管理に関する基準（ｃＧＭＰ）を遵守していた。研究プロトコルは、ローマのウンベルト１世総合病院の倫理委員会によって審査され、承認された。
培地および溶液
すべての培地は滅菌ろ過し（０．２２μｍのフィルター）、使用前は暗所で４℃に保った。ＲＰＭＩ−１６４０、すべての細胞培養物の基礎培地、およびウシ胎児血清（ＦＢＳ）を、ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カールスバッド、カリフォルニア州）から入手した。特に指定がない限り、すべての試薬はＳｉｇｍａ社（セントルイス、ミズーリ州）から入手した。成長因子は、記載されているものを除き、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネアポリス、ミネソタ州）から購入した。
クボタの培地（ＫＭ）は、銅を含まず、低カルシウム（０．３ｍＭ）、１０−９Ｍセレン、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、４．５ｍＭニコチンアミド、０．１ｎＭ硫酸亜鉛七水和物、１０−８Ｍヒドロコルチゾン（またはデキサメタゾン）、５μｇ／ｍｌのトランスフェリン／Ｆｅ、５μｇ／ｍｌインスリン、１０μｇ／ｍｌ高密度リポタンパク質、および精製ヒト血清アルブミンに結合した添加された脂肪酸の混合物からなる、任意の基礎培地（ここではＲＰＭＩ １６４０である）からなる。その調製の詳細なプロトコルは、肝芽球の明確な培地としてＫｕｂｏｔａとＲｅｉｄによって最初に報告された２。その後、クボタの培地は、マウス、げっ歯類、およびヒト肝幹細胞、胆管幹細胞、肝芽細胞、胆嚢由来幹細胞お膵前駆細胞に有効であることが示された３〜９。
分化研究のため、無血清ＫＭにカルシウム（最終濃度：０．６ｍＭ）、銅（１０−１２Ｍ）、および２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加し、改変クボタの培地（ＭＫＭ）と称した。ＭＫＭを基礎として、特定の補助剤と共に使用して、膵島運命（ＨＤＭ−Ｐ）に対して肝臓運命（ＨＤＭ−Ｈ）に向かうＢＧ細胞の選択的分化を誘導するために使用されるホルモンで定義された培地（ＨＤＭ）を調製した：
・肝細胞分化用ＨＤＭ−Ｈは、ＭＫＭに７μｇ／Ｌグルカゴン、２ｇ／Ｌガラクトース、１ｎＭトリヨードチロキシン３（Ｔ３）、１０ｎｇ／ｍｌオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、１０ｎｇ／ｍｌ上皮成長因子（ＥＧＦ）、２０ｎｇ／ｍｌ肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、および１μｍデキサメタゾンを補充して調製した。
・膵島細胞分化用ＨＤＭ−Ｐ：ヒドロコルチゾンを含まないＭＫＭに２％Ｂ２７、０．１ｍＭアスコルビン酸、０．２５μＭシクロパミン、１μＭレチノイン酸を添加し、最初の４日間ｂＦＧＦを添加し、次に５０ｎｇ／ｍｌエキセンディン−４および２０ｎｇ／ｍｌＨＧＦで置換した。
磁気ソーティング法
細胞は、製造業者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．、ドイツ）により特定されたプロトコルにより磁気ビーズ免疫選択使用することにより、ＥｐＣＡＭまたはＴＲＡ−１−６０について選別した。簡潔に述べると、陽性細胞は、ＥｐＣＡＭマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．、カタログ番号１３０−０６１−１０１）またはＴＲＡ−１−６０マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．、カタログ番号１３０−１００−８３２）で磁気標識した。次いで、細胞懸濁液をＭＡＣＳ ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．、カタログ番号１３０−０４２−４０１）に装填し、これをＭＡＣＳセパレーターの磁場に置いた。磁気的に標識された細胞は、カラム内に保持され、非標識細胞はカラムを通過した。磁場からカラムを除去した後、磁気で保持された細胞は、正に選択された細胞分画として溶出された。陽性細胞は、前述されたように細胞数および細胞生存率により評価された。陽性細胞は、１ｍｌ当たり３０万個の細胞の濃度で基底培地に懸濁し、最終細胞懸濁液として使用された。約２０万個の細胞を含むＮ．４アリコートが、フローサイトメトリーのために収集された。
ＧＭＰ条件下での細胞分離および無菌性試験
将来の臨床適用のためｃＧＭＰ条件下でＢＧ幹／前駆細胞を製造するために、十二指腸は、「欧州連合における医薬品規制規則」およびヒト使用のための医薬品の製造管理および品質管理に関する基準の欧州ガイドライン（ＥｕｄｒａＬｅｘ−第４巻、製造管理および品質管理に関する基準）に従って処理された。無菌性試験は、ｃＧＭＰ条件下で「直接接種法」により、ならびにヒトおよび家畜使用のための医薬品の医薬品の製造管理のガイドラインに従って行われた。
細胞培養およびクローン性増殖
十二指腸標本から得られた、分類されていない細胞および分類された細胞（約３×１０５個）を、直径３ｃｍのプラスチック培養皿に播種し、１０％ＦＢＳを含むＫＭで一晩（約１２時間）維持した。その後、無血清ＫＭ中で細胞培養物を維持し、少なくとも２ヵ月間観察した。クローン性増殖を試験するために、単一細胞懸濁液を得て、自己複製培地である、無血清ＫＭ中５００個細胞／ｃｍ２のクローン性播種密度で細胞を播種した。
オルガノイドの調製および培養
遠心分離後、細胞ペレットは、ＫＭ中に懸濁され、３×１０５個の細胞が、直径２．２ ｃｍの１２ウェルプラスチック培養皿に置かれ、１０％ＦＢＳを含むＫＭ中で一晩（約１２時間）維持され、その後、培養物に、無血清ＫＭが与えられた。細胞は、ＫＭ中、３７℃、大気酸素および５％ＣＯ２を有するのインキュベーターで１週間培養され、これにより、より多くの細胞集団を得た。７日後、細胞は、１２ウェルプレートから除去され、細胞のペレットは、冷マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｍａｔｒｉｇｅｌ Ｂａｓｅｍｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｍａｔｒｉｘ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ、フェノールレッドフリー）４００μｌで包埋された。出願人は、１２ウェルプレート１枚当たり２×１０５個の細胞を含む、ゲル４００μｌの体積で播種した。重合（１５分、３７℃）後、ゲルは、オルガノイド培地５００μｌで覆われた。オルガノイド培地は、Ｂ２７、Ｎ２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、および１．２５ｍＭ Ｎ−アセチルシステイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、１０ｎＭガストリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、ならびに成長因子：５０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、１μｇ／ｍｌ組み換えヒトＲ−スポンジン−１（Ｐｅｒｏｔｅｃｈ社）、１００ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ１０（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、２５ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、１０ｍＭニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、５μＭ Ａ８３−０１（Ｔｏｃｒｉｓ社）、および１０μＭ フォルスコリン（ＦＳＫ）を添加したＡｄ−ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に基づく。出願人は、オルガノイドのサイズおよび数を顕微鏡で制御しながら、２〜３日毎に培地を交換した。
１０〜１４日後、細胞回収溶液（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）および氷冷ＰＢＳを使用して、オルガノイドをマトリゲルから取り出した。培養ゲル中のオルガノイドを、細胞回収溶液（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）で緩やかに破壊し、オルガノイドを球全体として保持しながら、マトリゲルを小断片に分解した。次いで、オルガノイドを、穏やかに遠心分離して、管の底に集まったインタクトなオルガノイドを得た。上清の大部分は、ピペットで除去され、オルガノイドペレットは、さらなる分析のため、４％ホルマリンで固定された。
陽性対照
ＮＴＥＲＡ−２クローンＤ１多能性ヒト胚性細胞株（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国ミズーリ州セントルイス、コード：０１０７１２２１）が、フローサイトメトリー、細胞培養およびＲＴ−ＰＣＲ実験のための多能性マーカー（ＳＯＸ２、ＯＣＴ４ＡおよびＮＡＮＯＧ）の陽性対照として使用された１０。さらに、ヒトセミノーマ精巣の断片は、多能性マーカーについての免疫組織化学実験の陽性対照として使用されている。
ヒト結腸腺癌細胞株（ＬＧＣ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｓ．ｒ．Ｌ、ミラノ、イタリア、コード：ＡＴＣＣ−ＨＴＢ−３８）であるＨＴ−２９は、フローサイトメトリーおよびＲＴ−ＰＣＲ実験用のＬｇｒ５抗体の陽性対照として使用された。正常な膵島細胞は、膵島分化についての実験の対照として使用されており、米国カリフォルニア州アーバインのＰｒｏｄｏＬａｂ社から購入された（ＨＩＲ−００１）。
初代ヒト肝細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＮＨＥＰＳ（商標）細胞、コード：ＣＣ−２５９１Ｓ）は、Ｌｏｎｚａ社（スイス、バーゼル）から購入され、肝細胞分化についての実験の陽性対照として使用されている。
正常な膵島細胞は、膵島分化についての実験の対照として使用されており、米国カリフォルニア州アーバインのＰｒｏｄｏＬａｂ社から購入された（ＨＩＲ−００１）。
光学顕微鏡法（ＬＭ）、免疫組織化学染色（ＩＨＣ）、免疫蛍光染色（ＩＦ）
標本は、１０％緩衝ホルマリンで２〜４時間固定され、低温流動パラフィン（５５〜５７℃）に包埋され、３〜４μｍの切片が、標準的なプロトコルに従って、ヘマトキシリン・エオシンおよびシリウスレッド／ファストグリーンで染色された。ＩＨＣについて、内因性ペルオキシダーゼ活性は、メタノール過酸化水素（２．５％）で３０分間のインキュベーションによりブロックされた。ベンダーによって示されるように、プロテイナーゼＫ（Ｄａｋｏ社、コードＳ３０２０）を室温で１０分間適用することにより、抗原が回収された。次いで、切片は、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートされた（補足表１）。試料は、ＰＢＳで５分間２回すすがれ、二次ビオチン化抗体（ＬＳＡＢ＋Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ、Ｄａｋｏ社、コードＫ０６９０；Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）と共に、次いでストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＬＳＡＢ＋Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ、Ｄａｋｏ社、コードＫ０６９０）と共に室温で２０分間インキュベートされた。ジアミノベンジジン（Ｄａｋｏ社）は、基質として使用され、切片は、ヘマトキシリンで対比染色された。細胞培養物での免疫蛍光染色について、スライドチャンバーは、室温で１０分間アセトン中で固定され、次いで、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０ですすがれた。非特異的なタンパク質結合は、５％正常ヤギ血清によってブロッキングされた。固定した細胞は、一次抗体と共にインキュベートされた。次に、細胞は、洗浄され、標識されたアイソタイプ特異的二次抗体（抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−５４６、抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８、抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８、抗体ヤギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−５４６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ社、Ｐａｉｓｌｅｙ、英国）と共に１時間インキュベートされ、細胞核の視覚化のため４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で対比染色された。すべての免疫反応について、陰性対照も含まれ、一次抗体を免疫前血清で置換することからなる。切片は、Ｊｅｎｏｐｔｉｋ Ｐｒｏｇ Ｒｅｓ Ｃ１０ Ｐｌｕｓ Ｖｉｄｅｏｃａｍ（Ｊｅｎａ、ドイツ）を装備した、Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ＤＭ ４５００ Ｂ光学および蛍光顕微鏡（Ｗｅｌｔｚｌａｒ、ドイツ）によってコード化された方法で調べられた。ＩＦ染色はまた、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ−ＳＰ２）によって解析された。ＬＭ、ＩＨＣおよびＩＦは、画像解析システム（ＩＡＳ − Ｄｅｌｔａ Ｓｉｓｔｅｍｉ、ローマ、イタリア）で処理され、盲検法で二人の研究者によって独立して行われた。
ＢＧが占める領域は、画像解析システム（ＩＡＳ−Ｄｅｌｔａ Ｓｉｓｔｅｍｉ、ローマ−イタリア）により評価された。これを使用して、出願人は、ＢＧが占める体積が、腺房が占める総面積として計算され、総十二指腸粘膜下層に対する割合として表されると決定した。すべてのカウントは、各スライドについて六つの重複しないフィールド（倍率×２０）で行われ、各標本から少なくとも三つの異なるスライドが採取された。
ＩＨＣ／ＩＦ染色のため、各スライド／培養物について、陽性細胞数は、六つの重複しないフィールド（倍率×２０）で無作為に盲検でカウントされ、データは％陽性細胞として表される。ＩＦ染色は、デジタルスキャナ（Ａｐｅｒｉｏ Ｓｃａｎｓｃｏｐｅ ＦＬ Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｅｒｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ社、オックスフォード、英国）によって走査され、ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅによって処理された。画像解析アルゴリズムを使用して、単一蛍光色素分子の陽性ピクセル領域の割合または二つの蛍光色素分子の共局在化領域を定量した。グリコーゲン貯蔵能を試験するために、製造業者の手順に従って、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色システム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ＩＮＣ社、カタログ番号３９５）およびα−アミラーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ＩＮＣ社、カタログ番号Ａ ３１７６）消化法（ＰＡＳ染色後）が用いられた。
フローサイトメトリー（ＦＣ）解析
培養中の細胞は、トリプシン処理され、優しくピペット操作することにより分離され、ＰＢＳ中約２×１０５個細胞／ｍＬで懸濁された。単離された細胞は、蛍光一次抗体またはアイソタイプ対照で標識された。細胞内抗原については、細胞は、４％パラホルムアルデヒド中で固定され、一次抗体とインキュベーションする前に、ＰＢＳ−サポニン０．５％−ＦＣＳ１０％で透過処理された。一次抗体は、ＥｐＣＡＭ（ＥｐＣＡＭ−ＦＩＴＣ、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．社、カタログ番号１３０−０８０−３０１）、Ｌｇｒ５（Ｌｇｒ５−ＰＥ、Ｏｒｉｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．社、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、米国、カタログ番号ＴＡ４００００１）、ＴＲＡ−１−６０（ＴＲＡ−１−６０−ＰＥ、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．社、カタログ番号１３０−１００−３４７）を含んでいた。細胞は、ＢＤ ＦＡＣＳｃａｎｔｏ（商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社、ニュージャージー州、米国）により解析された。１万件の現象が取得され、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社、ＮＪ、米国）によって解析された。
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）解析
ＲＮＡ抽出は、無血清ＫＭで６日間維持され、次に、ＫＭまたはＨＤＭの一つのいずれかでさらに７日間インキュベーション（合計１３日間）された組織または培養物で行われた。トータルＲＮＡは、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉの手法により抽出された１１。ＲＮＡの質および量は、既に記載されたＲＮＡ ＳｔＳｅｎｓ解析チップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ハーキュレス、カリフォルニア州、米国）を備えたＥｘｐｅｒｉｏｎ自動電気泳動システムＲＮＡを用いて評価された。ＲＮＡ抽出は、無血清ＫＭで６日間維持され、ＫＭまたはＨＤＭの一つのいずれかでさらに７日間インキュベーション（合計１３日間）された培養物で行われた。アルブミン（ＡＬＢ）、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ３Ａ４）、インスリン（ＩＮＳ）、グルカゴン（ＧＬＵＣ）、ＰＤＸ−１、ＳＯＸ１７、ＯＣＴ４Ａ、ＳＯＸ２、およびＮＡＮＯＧ遺伝子の発現は、細胞および組織から抽出されたトータルＲＮＡ試料について、閉鎖チューブ（ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｂｙ Ｑｉａｇｅｎ、ハンブルク、ドイツ）における逆転写およびＰＣＲ増幅により行われた。これらの遺伝子は、参照として使用されるＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子と同時に増幅された。遺伝子発現は、Ｅｘｐｅｒｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、英国）を用いて行われたオンチップキャピラリーマイクロ電気泳動を用いたアンプリコンの定量により測定された。目的の遺伝子の発現は、目的の遺伝子の濃度および参照遺伝子ＧＡＰＤＨ（装置によりｎｍｏｌ／Ｌで報告される）の比によって計算された（補足表２）。
正常マウスの肝臓へのＢＧＳＣのインビボ移植
５匹のＳＣＩＤ（重症複合免疫不全症）雄マウスは、１２時間の明暗サイクルで２２℃の平均一定温度で部屋に収容され、標準ペレット固形飼料および水に自由にアクセスした。研究プロトコルは、本発明者らの施設ガイドラインに従って行われた。実験手法は、ローマ・ラ・サピエンツァ大学およびローマのウンベルト１世大学病院のＥＵ指令２０１０／６３／ＥＵの動物実験に関する倫理委員会（Ｐｒｏｔ．番号：５４１）によって承認された。脾動脈を介し肝臓に生理食塩水１００μｌ中のヒトＢＧＳＣの懸濁液２×１０６を注入した。偽対照マウスは、生理食塩水１００μｌのみを注入された。全ての動物は、回復まで近くで観察され、食事および水に自由にアクセスできた。死亡例は認められなかった。
移植１カ月後、動物は、屠殺され、肝臓が回収された。肝臓断片は、組織学および免疫組織化学用に１０％緩衝ホルマリン中に、遺伝子発現解析用にトリゾール試薬中に置かれた。壊死および線維症は、それぞれ、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）およびシリウスレッド染色で評価された。マウス肝臓におけるヒトＢＧＳＣ生着、およびそれらの分化は、他で記載されたマウス抗原と反応しない抗ヒト抗体（抗ヒトミトコンドリア、抗ヒトＨｅｐＰａｒ−１、抗ヒトアルブミン）についての免疫組織化学により評価された。免疫組織化学染色染色（抗ヒトミトコンドリア）されたスライドは、ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅによって処理されたデジタルスキャナ（Ａｐｅｒｉｏ Ｓｃａｎｓｃｏｐｅ ＣＳ Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｅｒｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ社、オクスフォード、英国）によりスキャンされた。画像解析アルゴリズムは、抗ヒトミトコンドリア陽性細胞により占められた面積の割合を定量することであった。
マウスにおけるヒトアルブミンについてのＲＴ−ＰＣＲは、前述された通り行われた。簡潔に述べると、ヒトアルブミン用の特異的プライマー（補足表２）をプログラム可能な特異的配列として設計して、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社）を使用することにより、マウス遺伝子からヒトアルブミン遺伝子を特異的に識別した。
統計解析
データは、平均値±標準偏差（ＳＤ）で表される。統計解析は、ＳＰＳＳ統計ソフトウェア（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．社、シカゴ、イリノイ州、米国）により行われた。正規分布でないパラメータの群間差は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定により試験された。統計学的有意は、ｐ値＜０．０５と設定された。
実施例１−粘膜からの細胞の単離
肝−膵膨大部および膵臓を含むヒトの十二指腸を、イタリア、ローマ、ローマ・ラ・サピエンツァ大学、一般外科および臓器移植「Ｐａｒｉｄｅ Ｓｔｅｆａｎｉｎｉ」部の臓器ドナーから採取した。研究目的で組織を使用するというインフォームド・コンセントを、本発明者らの移植プログラムを通じて取得した。全ての試料を、１９〜７３歳の成人から採取した。プロトコルを、本発明者らの治験審査委員会の承認を得ており、処理は現行の製造管理および品質管理に関する基準（ｃＧＭＰ）を遵守していた。研究プロトコルは、ローマのウンベルト１世大学病院の倫理委員会によって審査され、承認された。ヒトの十二指腸を、膵臓から慎重に分離し、肝膵管膨大部を含む腸を外科的に摘出した。十二指腸をメスでスライスに切断した。その後、組織試料を前述の通り処理した。簡潔に述べると、組織を、０．１％ウシ血清アルブミン、１ｎＭセレン、抗生物質、Ｉ型コラゲナーゼ（３００コラーゲン消化単位／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、イタリア）、０．３ｍｇ／ｍｌデオキシリボヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、イタリア）を添加したＲＰＭＩ１６４０中、３７℃で、３０〜４５分間頻繁に攪拌しながら消化させた。懸濁液を、８００ミクロンの金属メッシュフィルター（ＩＤＥＡＬＥ ＡＣＬＲＩ９ ｉｎｏｘステンレス鋼）を通して濾過し、２７０ｇで１０分間遠心分離して、その後、再懸濁した。その後、細胞懸濁液を、１００および３０ミクロンのメッシュフィルターに連続で通過させ、次に、細胞計数を、Ｆａｓｔ−Ｒｅａｄ １０２（Ｂｉｏｓｉｇｍａ Ｓｒｌ社、ベネツィア、イタリア）により行い、トリパンブルーアッセイにより細胞生存率（全細胞に対する生細胞の割合％として表示）を測定した。ヒトの十二指腸に用いられた場合、肝臓および胆管に対して既に開発され、活用された同じ方法により、代わりにマクロ凝集物を得た。これらのマクロ凝集物は、常に（Ｎ＝１０）生存不能な単離された細胞を導き、細胞培養物を得るのを不可能にする、コーティングされ、破砕された細胞を含んだ。これは、粘膜上皮細胞から放出される粘液や分解産物で高度に飽和している消化組織の物理的および化学的性質により、手技中に破砕される細胞を取り込んでいる分子ウェブのようなものとなると推測した。実際に、腸から細胞を単離するために動物またはヒトで確立された方法は、粘膜上皮の破壊を回避する。
この方法により得られた培養の別の特徴は、頻繁な汚染であった（６／１０）。これらの結果から、ブルンナー腺を保持し、上述の微生物汚染の問題を回避するために、粘膜上皮を粘膜下層から分離するストラテジーを適合した。四つの異なるストラテジー：１）外科的切開術（Ｎ＝３）、２）粘膜下での生理食塩水の従前の注入による粘膜切除術（Ｎ＝３）、３）粘膜の擦過（Ｎ＝３）、４）粘膜の選択的可溶化（Ｎ＝１０）を試した。全ての方法が、腸管内腔に注入した特定の界面活性剤溶液による十二指腸粘膜の選択的可溶化を除き、非論理的であり、初期方法と同一の結果が得られた。
失敗におわり、準最適な単離方法
ヒトの十二指腸を、膵臓から慎重に分離し、肝膵管膨大部を含む腸の全体部分を外科的に摘出した。十二指腸をメスでスライスに切断した。その後、組織標本を、０．１％ウシ血清アルブミン、１ｎＭセレン、抗生物質、Ｉ型コラゲナーゼ（３００コラーゲン消化単位／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、イタリア）、０．３ｍｇ／ｍｌデオキシリボヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、イタリア）を添加したＲＰＭＩ１６４０中、３７℃で、３０〜４５分間頻繁に攪拌しながら消化させた。懸濁液を、８００ミクロンの金属メッシュフィルター（ＩＤＥＡＬＥ ＡＣＬＲＩ９ ｉｎｏｘステンレス鋼）を通して濾過し、２７０ｇで１０分間遠心分離して、その後、再懸濁した。その後、細胞懸濁液を、１００および３０ミクロンのメッシュフィルターに連続で通過させ、次に、細胞計数を、Ｆａｓｔ−Ｒｅａｄ １０２（Ｂｉｏｓｉｇｍａ Ｓｒｌ社、ベネツィア、イタリア）により行い、トリパンブルーアッセイにより細胞生存率（全細胞に対する生細胞の割合％として表示）を測定した。
ヒトの十二指腸（Ｎ＝５）で用いた場合、肝臓および胆管に対して以前に開発され、首尾よく利用された同じ方法により、４０，８１６，０００個（標準偏差）の細胞を単離し、そのうちの半数のみが、トリパンブルーアッセイによって生存していた（生存率４３±１２．８％）。生細胞数に関わらず、単離した細胞は、マクロ凝集物が、被覆され、破砕した細胞を含み、細胞死をもたらし、細胞培養を得ることを不可能にすることを明らかにした培養において、接着し、生存できなかった。さらに、この方法により得られた培養物は、常に細菌に汚染されていた（５／５）。
この不成功な結果は、粘膜上皮細胞によって放出される粘液および消化産物で高度に飽和した消化した組織の物理的および化学的特性に起因し得、これは、粘膜破片内の細胞の封じ込めにつながり、処置中に粉砕される。
別の重要な点は、粘膜層内の腸幹細胞微小環境（腸陰窩）の存在であった。これらの所見を得て、本発明者らは、粘膜上皮を粘膜下層から分離することを決めた。四つの異なるストラテジー：１）外科的切開術（Ｎ＝３）、２）粘膜下での生理食塩水の注入後の粘膜切除術（Ｎ＝３）、３）粘膜の擦過（Ｎ＝３）、および４）粘膜層の選択的可溶化（Ｎ＝１０）により、これらを行った。ストラテジー番号１〜３は、腸陰窩の存在を伴う粘膜層の部分的除去をもたらしたので、粘膜除去という点で最善のストラテジーは、ストラテジー番号４であった（図１１）。さらに、ストラテジー番号４は、細胞単離および生存率の点で最善のアプローチをもたらした。
腸管内腔に注入した特定の界面活性剤溶液による十二指腸粘膜の選択的可溶化
膵頭付近で十二指腸を分離後、ベイターの膨大部を全摘し、腸を、外科クランプで挟むことにより、閉鎖した。十二指腸の四肢を開放し、組織を上部から下部に押すことにより、下位の石灰部からそれを絞り出すことにより、腸管粘液を除去した。組織は、可能な限り少ない粘液を含むべきであるので、この部分の操作は非常に重要である。２５ｍｌの血清学的ピペットを使用することにより、蒸留水（Ｇｉｂｃｏ社、イタリア）約２００ｍｌを、上肢の切開部から十二指腸に流し入れ、下肢の切開部を挟んで、水を回収した（図８Ａ）。その後、約２０分間両四肢を挟んで、粘膜上皮細胞に選択的に浸透圧障害を惹起することにより、蒸留水で腸を完全に満たした。この方法で、十二指腸は膨らんで見える（図８Ｂ）。下肢を開き、水を除去した後、２５ｍｌの血清学的ピペットを用いることにより、ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）１００ｍｌで２回、十二指腸内を洗浄した。２５ｍＬの血清学的ピペットを使用することにより、ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社、イタリア）約２００ｍＬを上肢切開部から十二指腸に流し入れた。同様の手順を採用することにより、内部十二指腸を充填し、ホスファチジルコリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、イタリア）０．５ｍｌ、デオキシコール酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、イタリア）２０ｍｇ、ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社、イタリア）９９．５ｍｌからなる界面活性剤溶液（１００ｍｌ）で１分間充填を維持した。下腿を開放することにより、溶液を再度除去し、内部の十二指腸を、ＤＰＢＳ１００ｍｌで洗浄した。最後に、十二指腸を１０ｃｍの無菌ペトリディッシュに移し、縦切開により開いた（図８Ｃ）。
組織の小さなポリカ（折り目）から粘液を除去するために細心の注意を払いながら、上下ならびに横方向に無菌の外科用メスを使用し、最新の注意を払い、組織の小さな皺襞（折り畳み）から粘液を除去することにより、粘膜のさらなる剥離を行った。ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社、イタリア）１００ｍｌを含む無菌の容器で、組織を洗浄した。組織を０．０５％次亜塩素酸ナトリウム２００ｍｌに数秒間浸漬し、続いてＤＰＢＳ溶液ですすぐことによって洗浄し、無菌通過させた。次いで、無菌のはさみおよび外科用メスを使用することにより、組織を小片に切断した。粘膜を除去するための機械的および化学的手法の後、標本を収集し、組織形態学的分析のため処理した。その後、組織試料を前述の通り処理した（図８Ｄ）。簡潔に述べると、組織断片を、消化緩衝液を充填した二つのＭチューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃ社、ドイツ）に集め、振とうした。分離状態の組織に至るために、ＭＡＣＳ分離器（Ｍｉｌｔｅｎｉｙ Ｂｉｏｔｅｃ社、ドイツ）のプログラムを１または２サイクル行った（溶液の不透明度は、非常に小さな組織片の産生とともに記載されるべきである）。消化緩衝液を、３４℃まで１０分間予め加温した（酵素が最高の効率を持つ温度）。機械的分離後、組織断片を含む溶液を、ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、イタリア）を含む溶液（以下の組成の詳細を参照）で希釈し、２本の５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに入れた。Ｆａｌｃｏｎチューブを、１，３００ｒｐｍ（３００ｇ）で５分間遠心分離した。ペレットを集め、消化緩衝液１５０ｍｌの存在下で７５ｃｍの角型培養フラスコに入れた。フラスコをパラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ社、米国）で密封し、消化を制御するために時々振とうしながら、３７℃および５％ＣＯ２で約３０分間、水加熱器に水平に置いた。その後、フラスコを約１０分間垂直に置き、細胞を重力によって沈殿させた。溶液の表面の浮遊上清は、不純物を含み、１０ｍｌの血清学的ピペットを使用して破棄し得る。
酵素消化後、組織断片を含有する緩衝液を、四つの５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに入れた。Ｆａｌｃｏｎチューブを、１，３００ｒｐｍ（３００ｇ）で５分間遠心分離した。ペレットを二つの５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに集め、ＤＴＴを含有する溶液（以下の組成の詳細を参照）で希釈し、次いで、チューブを１，３００ｒｐｍ（３００ｇ）で５分間遠心分離した。上清を集め、８００ミクロンの金属メッシュフィルター（ＩＤＥＡＬＥ ＡＣＬＲＩ９ ｉｎｏｘステンレス鋼）上に置き、新鮮な細胞洗浄液で濾過した。ろ液を、無菌容器に集めた。スクレーパーおよびシリンジ（Ｔｅｒｕｍｏ ＃ＳＳ−２０ＥＳ２）のプランジャーを使用して、通過物を濾過し、濾過中に、組織をさらに解体した。得られた懸濁液、平均２００ｍｌを、ＤＮａｓｅ Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ ２５００Ｕ／２．５ｍｌ（Ｒｏｃｈｅ社、イタリア）のバイアル２本で処理した（図８Ｄ）。
胎児十二指腸および成人対象で行った内視鏡十二指腸生検からのＢＧＳＣの単離
ＢＧＳＣを十二指腸生検および胎児器官から単離する方法は、成人の無傷の十二指腸から細胞を得るのに最適化された手法と比較して、あまり複雑ではない。
十二指腸生検を、移植および精密医療部での胃カメラ検査中に、球状部のレベルで、鉗子を使用して遠隔で採取した。訓練を受けた消化器専門医が、幅広い疾患についての材料を得るためにこの方法を使用する。内視鏡下で柔軟な内視鏡を用いて、手技を行った。内視鏡は経口で導入した。目視で生検を得て、これにより、動脈も静脈も回避した。収集した生検の組織学的検査により、ＢＧが、球状部から得られた生検には存在するが、遠位十二指腸から得られた生検には存在せず（図１５Ａ）、ＢＧが、粘膜筋層のすぐ下の粘膜下層にあることを明らかにした。次に、この手技中に、患者１人当たり、十二指腸球部から二から四つの生検を収集し、細胞を単離するために使用した。
近位では幽門部のレベルで、遠位ではトライツ靱帯のレベルで切除することにより、胎児の十二指腸を胎児（第１８〜２２週：産婦人科での治療的流産）から回収した。膵臓および膵管内胆管を、肝膵膨大部のレベルでそれらを除去することにより、除去した。
続いて、胎児十二指腸全体または十二指腸生検全体を、外科用メスおよびＭＡＣＳ分離器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）により、さらに解離させ、３００Ｕ／ｍｌ Ｉ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）および０．３ｍｇ／ｍｌデオキシリボヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含む緩衝液中、３７℃で２０〜３０分間消化させた。新たに単離した細胞を、磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ社）を使用してＴＲＡ１−６０陽性細胞について免疫選別した。
選別により、胎児十二指腸から平均１，２００万個の生細胞（Ｎ＝３）、および十二指腸球状部生検から１００，０００個の生細胞（Ｎ＝２）を得た。単離手技の時間は、平均５時間であった。細胞を、１ｍＬあたり１００万個の細胞で無菌の１０％グルコース溶液に懸濁し、培養前に４℃の制御した温度下で４５分間維持した。このプロトコルによる自己複製しているブルンナー腺細胞を、図１５Ｂに示す。すべての手技を、「欧州連合における医薬品規制規則」およびヒト使用のための医薬品の製造管理および品質管理に関する基準の欧州ガイドライン（ＥｕｄｒａＬｅｘ−第４巻、製造管理および品質管理に関する基準）に従って行った。細胞生成物を、グラム陽性、グラム陰性、好気性および嫌気性細菌、真菌、ならびにエンドトキシン試験についての標準的な無菌試験により評価し、ＴＲＡ１−６０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、ヒト、希釈率１：５０）のフローサイトメトリー（ＦＣ）により直ちに特徴付けた。
実施例２−組織および細胞の特徴決定
ヒト十二指腸組織での研究
成人のヒト十二指腸の粘膜（Ｎ＝１０）を、腸内絨毛まで隆起させ、横に切断され、固有層内深くで観察される、腸の腺（陰窩）で折り畳んだ（図１Ａ）。十二指腸の近位部（上部および下行部）では、粘膜下層は、腺要素（十二指腸腺またはブルンナー腺：ＢＧ）を含有し、これは、まとめると、９．９５±２．６８％の粘膜下層面積および４．６２±１．９３％の全壁面積を占めた。ＢＧは、主にＰＡＳ陽性粘液細胞から構成された（図１Ａ）。ＢＧは、粘膜筋板を介して腸陰窩と解剖学的に連続している。粘膜の粘膜固有層内に位置するＢＧ腺房はほとんどなく、腸陰窩と連続していた（図１Ａ）。十二指腸の遠位部（下部および上行部）では、ＢＧは徐々に消失し、下部では腺成分がほとんどみられず（２０倍の視野に約１個）、上行部にはほとんど腺が認められなかった。
ヒト十二指腸では、免疫組織化学的解析により、ＢＧ細胞および腸陰窩が、部分的に表現型形質を共有することを示した。サイトケラチン発現に関しては、腸陰窩とＢＧの両方が、ＣＫ１９陽性であり、対照的に、ＣＫ７は、一部のＢＧ細胞によって特異的に発現されたが、腸の腺によっては発現されなかった（図１Ｂおよび図９）。腸の腺とＢＧの両方が、ＳＯＸ９（内胚葉系幹細胞のマーカー、図１Ｃ）を発現する細胞を含んでおり、ＢＧでは、ＳＯＸ９は、同一細胞内でＣＫ７と共発現した。
さらに、腸の腺およびＢＧは、増殖マーカーであるＰＣＮＡ、およびＣＤ４４、ＥｐＣＡＭ、およびＬｇｒ５などのいくつかの他の幹／前駆細胞マーカーを発現している細胞を含有していた（図２Ａ）。ＢＧでは、Ｌｇｒ５はＳＯＸ９と共局在し、その発現は、粘膜筋板の内部に位置する腺房においてより高く、粘膜下層内のより深い層に位置する腺房においてよりも腸陰窩と連続していた（図１０Ａ）。
ＢＧ細胞の亜集団は、多能性マーカーを発現した（図２）。興味深いことに、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１は、ＢＧ細胞によって発現されたが、腸陰窩内の細胞によっては発現されなかった（図２Ａ）。Ｔｒａ−１−６０は、同じＢＧ細胞においてＳＯＸ２およびＯｃｔ４Ａと共局在化した（図２Ｂ）。最後に、ＢＧは、ＮＩＳを発現する細胞を含み、これは腸陰窩によっても発現された（図１０Ｂ）。
要約すると、幹／前駆細胞マーカー発現の半定量的解析により、ＢＧが、ＳＯＸ９＋（９．１２％±３．３０）細胞および増殖細胞（ＰＣＮＡ＋：４．８２％±１．３３）から構成された微小環境を含むことが明らかになった。さらに、ＢＧの微小環境は、Ｌｇｒ５（４．７６％±１．０４）、ＥｐＣＡＭ（８．８０％±０．６５）などの内胚葉系幹細胞形質を発現する細胞を含有し、細胞のほぼ５％が、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、Ｏｃｔ４Ａ、およびＳＯＸ２などの多能性マーカーを発現していた。興味深いことに、ＰＣＮＡ＋／ＳＯＸ９＋／Ｌｇｒ５＋細胞は、粘膜下層のより深くに位置するもの（ＳＯＸ９＋／Ｌｇｒ５＋：４．８０％±１．５０；ＰＣＮＡ＋：０．９８％±０．６２；ｐ＜０．０５）においてより、腸の腺と直接的に連続性の腺房においてより多かった（ＳＯＸ９＋／Ｌｇｒ５＋：１１．８０％±４．４０；ＰＣＮＡ＋：５．９５％±２．２５；ｐ＜０．０５）。対照的に、多能性細胞は、粘膜下層内のより深い位置に位置する腺房においてより多かった。
げっ歯類十二指腸組織における研究
ヒトにおいて同様に、げっ歯類の十二指腸は、粘膜下に位置した、粘液腺を含んでいた。げっ歯類ＳＧは、完全な粘膜筋層を含まない腸陰窩と直接関連していた。それらは、粘液含有量により、その透明な細胞質のおかげで、陰窩と区別可能であった（図１３Ａ）。ＳＧは、げっ歯類十二指腸近位部に限定した。ＳＯＸ９およびＰＣＮＡの発現を研究したとき、ＳＯＸ９＋細胞はＳＧ内に存在し、一方、ＰＣＮＡ＋細胞は、主に陰窩に位置し（２６．１±５．７％）、少数のＳＧ細胞のみがＰＣＮＡ陽性であった（６．７±２．２％、陰窩に対してｐ＜０．０１）。十二指腸ＳＧおよび陰窩はまた、Ｃｋ１９発現に関して異なっており、前者はほぼ陰性であり、後者は陽性であった（図１３Ａ）。マウス空腸では、陰窩は、ＳＯＸ９＋、ＰＣＮＡ＋、およびＣｋ１９＋である細胞を含有していた（図１３Ｂ）。この表現型特性およびＳＧ内のＰＣＮＡ＋細胞の割合の低さに基づき、本発明者らは、Ｋｒｔ１９ＣｒｅＴｄＴｏｍａｔｏＬＳＬマウス系統追跡モデルを導入して、ＳＧ複製が、十二指腸陰窩内のＣｋ１９＋／ＰＣＮＡ＋細胞から進んだかどうかを評価した。まず、空腸を解析して、腸陰窩における組み換え効率を推定した（図１３Ｃ）。ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ（Ｔｄ−Ｔｏｍ）陽性の陰窩の割合は、７２±６％であり、陰性の陰窩は、陽性の陰窩の横に位置していた。ｔｄ−Ｔｏｍ＋陰窩の上の絨毛は、常にｔｄ−Ｔｏｍ陽性となり、一方、これにより、ｔｄ−Ｔｏｍ−陰窩の直ぐ上の縦横は、ｔｄ−Ｔｏｍ陰性であった。マウスの十二指腸を調べたとき、Ｃｋ１９−ＳＧはほとんど全てが１３０ｔｄ−Ｔｏｍ＋陰窩のすぐ下に位置する細胞を含めｔｄ６ Ｔｏｍ−であり（図１３Ｃ）、一貫して、ＳＧ内のＰＣＮＡ＋細胞およびＳＯＸ９＋細胞は、ｔｄ−Ｔｏｍ−であった（図１３Ｄ）。まとめると、これらのデータは、げっ歯類ＳＧにおける細胞増殖率が、十二指腸陰窩と比較して低いことを示している。さらに、生理学的条件では、ＳＧ複製は、十二指腸陰窩細胞によって支持されず、ＳＧ中のＳＯＸ９＋およびＰＣＮＡ＋細胞は、Ｃｋ１９＋陰窩細胞から誘導されない。
成功したＢＧＳＣ単離および培養法
実施例１の十二指腸組織の化学的および機械的処理の後、粘膜層の表面上皮およびほぼすべての陰窩を除去し、一方、固有層および粘膜筋板の結合組織は残存した（図３Ａ）。これにより、粘膜筋板の下、および粘膜下層内の海場宇学的位置のおかげで、ＢＧの保存を可能にし、従って、ＢＧは無傷なままであり、それらのＣＫ７＋（図３Ｂ）、Ｔｒａ−１−６０＋（図３Ｃ）、およびＳＯＸ９＋（示していない）細胞を保持した。
十二指腸粘膜下層は、方法に記載されるようにさらに処理され、生存率＞８０％（８５±５％）で約３５０±１億個の細胞を単離した。ＦＣは、新たに単離した細胞の４０．０±１８．５％がＥｐＣＡＭ＋であったことを示した。細胞をＥｐＣＡＭに対して免疫選別したとき、細胞集団は、７０．３±１９．３％のＥｐＣＡＭ＋細胞に濃縮し（選別前に対してｐ＜０．０５）、そのうちこれらの細胞の４６．３％±７．３個がまた、Ｌｇｒ５＋であった（図４Ａ）。十二指腸から単離した細胞も、Ｔｒａ−１−６０発現についてフローサイトメトリー（ＦＣ）により調べた。ＦＣは、新たに単離した細胞の５．８±１．６％がＴｒａ−１−６０＋であったことを示した。細胞をＴｒａ−１−６０に対して免疫選別したとき、細胞集団は、３０．４±１９．８％のＴｒａ−１−６０＋細胞に濃縮し（選別前に対してｐ＜０．０５）、Ｔｒａ−１−６０＋細胞の７．３％±４．２も、ＥｐＣＡＭ＋であった（代表的な散布図を図４Ｂに示す）。磁気免疫選別の後、汚染している細胞集団を、プラスチック上およびオルガノイドとしての二つの異なる培養セレクションアプローチによってさらに除去した。最初に、単一細胞懸濁液を得て、無血清クボタの培地中のプラスチック上５００個の細胞／ｃｍ２のクローン性播種密度で播種し、培地により、内胚葉系幹／前駆細胞の生存および自己複製が可能になるが、成熟細胞の生存および自己複製は可能ではなく、間葉系細胞の生存または自己複製のいずれかはかのうではない。これらの条件下で、Ｔｒａ−１−６０＋細胞のみが増殖可能であり（図４Ｃ）、１〜２日の遅延期後に増殖し始め、６〜８日間培養後に１０〜１５個の細胞の小さな集団を形成した（図４Ｃ）。１４日後、大きなコロニーを観察した（図４Ｃ）。各コロニーは、高い細胞質対核の比を有する、小さく（直径＝１２．０６±５．７６ｍ）、密集した、均一の細胞により主に形成された。自己複製培養条件は、ＢＴＳＣについての培養セレクションで前述した通り、ほぼすべての間葉系細胞（示していない）の消失をもたらした。第二に、オルガノイド形成用に調整した培養条件において、単一のＢＧＳＣは、大きさおよび数がさらに拡大した球状構造として自己組織化を開始した。一般に、オルガノイドは、培養３〜５日後に視認でき、その平均直径は、約１３〜１４日以内に２．３±５ｍｍに達した。オルガノイド形成は、オルガノイドを形成する優性細胞表現型を表すＴｒａ−１−６０＋細胞の濃縮を決定した（図４Ｄ）。
ＢＧＳＣの２ＤコロニーおよびＢＧＳＣ由来オルガノイドの表現型特性
プラスチック上およびＫＭ（自己複製条件、図５Ａ）において、表現型解析は、どのように培養物が、ＣＫ７、ＳＯＸ９、ＥｐＣＡＭ、Ｌｇｒ５、および多能性マーカー（ＳＯＸ２、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１）を発現する細胞から構成されるかを示した。
平行して、オルガノイド（図５Ｂ）は、ＣＫ７＋およびＣＫ１９＋細胞から構成され、オルガノイド細胞が、内胚葉系幹細胞（ＥｐＣＡＭ、Ｐｄｘ１）ならびに多能性マーカー（Ｏｃｔ４ＡおよびＴｒａ−１−６０）のマーカーを発現した。オルガノイドは、ＰＡＳ陰性（杯細胞特性）であり、ビリン、ＣＦＴＲ、アルブミン、Ｈｅｐ−Ｐａｒ１、およびインスリンなどのいくつかの成熟細胞マーカーが陰性であった（データは示していない）。
ＢＧＳＣ表現型を、ＲＴ−ＰＣＲによってさらに調べ、適切な正の対照との比較により、プラスチック上およびオルガノイド中の単層のＢＧＳＣが、内胚葉のバイオマーカー（例えば、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ１７、およびＰＤＸ１、図５Ｃ）および多能性（例えば、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４Ａ、およびＮＡＮＯＧ、図５Ｄ）遺伝子を発現したことを明らかにした。これらの条件では、肝細胞系統のマーカー（すなわち、アルブミン）、胆管細胞系統のマーカー（すなわち、ＣＦＴＲ）、およびβ−膵臓細胞系統のマーカー（すなわち、インスリン）について、細胞はほぼ陰性であった（データは示されていない）。
ＢＧＳＣのインビトロでの分化能
ＢＧから単離した細胞の分化能は、肝臓（ＨＤＭ−Ｈ）または内分泌膵臓（ＨＤＭ−Ｐ）系統への分化を誘発するように特異的に調整した別個の培地へとそれらを移すことによって評価した。
ＨＤＭ−Ｈにおいて７〜１４日後（図６Ａ）、大部分の細胞の形態は、小さい紡糸形細胞から多角形（立方体）形細胞に顕著に変化した。これらの細胞は、凝集して多細胞コードを形成し、ＫＭで培養した細胞と比較して直径が長く（ｐ＜０．０１）、細胞サイズは、正常な二倍体である成体ヒト肝細胞の細胞サイズと一致した。ＩＦは、これらの大きな多角形細胞がアルブミンを発現したことを示した（図６Ａ）。さらに、ＰＡＳ染色は、ＨＤＭ−Ｈ中のＰＡＳ陽性細胞の存在を示した（図６Ａ）が、ＫＭでの細胞では存在せず（示していない）、α−アミラーゼによる消化後、目に見えるＰＡＳ染色は検出できなかった（示していない）。これは、ＨＤＭ−Ｈ中で培養した細胞のグリコーゲン貯蔵能を支持した。ＲＴ−ＰＣＲ解析（図６Ａ）は、ＫＭの細胞と比較したとき、ＨＤＭ−Ｈでの細胞が、アルブミン（約２倍）、トランスフェリン（中間またはゾーン２；＞１００倍）、およびＣＹＰ３Ａ４（薬物代謝、後期またはゾーン３遺伝子；＞１００倍）遺伝子を含む肝細胞特異的遺伝子の発現を増加させたことを示した。
ＨＤＭ−Ｐで１４日間後、膵島様構造を観察し、これらの構造は、Ｎｇｎ３およびインスリンを発現する密集した細胞から構成された（図６Ｂ）。ＨＤＭ−Ｐでの７日後、ＲＴ−ＰＣＲ解析により、インスリンおよびグルカゴン遺伝子発現ではなく、ＰＤＸ１発現が、ＫＭでの細胞における知見と比較して増加したことを示した（図１２）。ＨＤＭ−Ｐでの１４日後、ＫＭでの細胞についてのものと比較して、ＰＤＸ１、インスリンおよびグルカゴン遺伝子発現の有意な増加を検出した（図６Ｂ）。
Ｔｒａ−１−６０＋十二指腸ＳＧ細胞を、インビトロでβ−膵臓運命に直ぐに限定することができ、ＳＧは、インビボでインスリン発現細胞を自発的に生成することができる。十二指腸ＳＧから単離した細胞のインビトロ分化能を、それらを調整した培地（ＰＭ）に移して、内分泌膵島系統への分化を誘導することにより評価した。ＰＭでの７日後、稀な膵島様構造の存在を、観察し（１回の培養当たり１．４±０．５）（図１４Ａ）、ＲＴ−ＰＣＲ解析により、インスリン遺伝子ではなく、ＰＤＸ１遺伝子が、ＫＭと比較してＰＭでアップレギュレートされたことを示した。並行して、膵島様構造は、免疫蛍光分析によって決定したように、ＰＤＸ１の発現を示したが、インスリンの発現は示されなかった（図１４Ｂ）。ＰＭでの１４日後、膵島様構造の数は、７日間と比較して有意に増加した（１回の培養あたり４．８±０．８、ｐ＜０．０１）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、ＫＭと比較して１４日間のＰＭで高かったが、ＲＴ−ＰＣＲ解析に基づき、７日間のＰＭと比較して低かった（図１４Ｂ）。インスリンおよびグルカゴン遺伝子発現は、１４日で著しく増加した（図１４Ｃ）、対照として使用した膵島のレベルに達する。１４日後、インスリン＋およびグルカゴン＋細胞は、膵島様構造で出現した（図１４Ｃ）。
十二指腸ＳＧ細胞のインビボで内分泌系膵運命に運命付ける能力を研究するために、本発明者らは、マウスにおいて実験的に誘導した糖尿病が、特定の膵臓形質の取得を誘発し得るかどうかを調べた。したがって、二つの異なるストレプトゾトシン（ＳＴＺ）モデルを研究した。高用量ＳＴＺモデルを、血糖レベルの急激な増大および高い死亡率により特徴付ける。低用量ＳＴＺモデルは、グリセミアのより緩徐で目立たない増加および生存期間の延長を示し、これにより、観察時間が延長した。マウスを高いＳＴＺ用量で処置し、１４日後に屠殺したとき、対照と比較して、十二指腸ＳＧ程度が、増加した（図１４Ｄ）。さらに、より高い割合のＳＧ細胞が、対照と比較して、ＰＣＮＡ、ＰＤＸ１およびＮＧＮ３を発現したた（図１４Ｅ〜Ｆ）。最後に、対照では観察されなかったが、２／５のＳＴＺ処置マウスでは、インスリン＋およびグルカゴン＋細胞を、十二指腸ＳＧ内で観察した（図１４Ｅ〜Ｆ）。しかし、血糖特性との相関は認められなかった。これらのデータは、膵臓内分泌運命と関連する遺伝子の発現の増加を特徴とする、げっ歯類十二指腸由来の標本のＲＴ−ＰＣＲ分析と一致した（図１４Ｇ）。低いＳＴＺ用量を投与したとき、これらの特性は、出現しなかった（データは示していない）。最後に、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）を患う患者から得たヒト十二指腸におけるインスリン発現を研究した。稀な（＜５％）インスリン＋細胞は、Ｔ２Ｄ患者由来の十二指腸ＳＧには見られるが、正常対象由来のものでは見られなかった（図１４Ｈ）。
未分化ヒトＢＧＳＣのマウス肝臓へのインビボ移植
ＢＧＳＣが、インビボで成熟肝細胞を生成する能力を、血管経路を通じた注射（脾臓注射）を介して、ＳＣＩＤマウスの肝臓への移植により調べた。これまでに報告されたように、ヒト抗原（すなわち、抗ヒトミトコンドリア、抗ヒト核、抗ヒトアルブミン、および抗ヒトＨｅｐＰａｒ−１）とのみ反応する特異的抗体についての免疫染色により、ＢＧＳＣの生着を評価した。細胞注入の１ヵ月後、マウス肝臓内でヒト（ｈ）ミトコンドリア＋細胞を観察し（図７Ａ）、陽性細胞は、主に門脈腔の周囲に位置し、一部の細胞も小葉中心位方向に拡大した。注射したマウスでは、宿主肝細胞のほぼ５．１±１．３％を、ヒト抗原＋細胞により表した（図７Ｂ）。さらに、ｈ−ミトコンドリア＋生着細胞は、アルブミン（図７Ｄ）およびＨｅｐＰａｒ−１（図７Ｅ）なろの成熟肝細胞マーカー陽性であった。稀に、抗ヒト核陽性細胞を、小葉間胆管内で観察した。これらの細胞は、ＣＫ１９陽性であった（データは示していない）。
移植したｈＢＧＳＣの効果的な生着および分化を確認するために、出願人は、マウス肝臓におけるヒトアルブミンｍＲＮＡ発現をさらに調べた。ヒトアルブミンｍＲＮＡは、注射したマウスから回収した肝臓で測定可能であった（図７Ｃ）が、偽対象マウス（生理食塩水を注入）では検出しなかった。

参考文献
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Ｓｃｈｍｅｌｚｅｒ Ｅ，Ｚｈａｎｇ Ｌ，Ｂｒｕｃｅ Ａ，Ｗａｕｔｈｉｅｒ Ｅ，Ｌｕｄｌｏｗ Ｊ，Ｙａｏ ＨＬ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｆｅｔａｌ ａｎｄ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ｄｏｎｏｒｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２００７；２０４：１９７３−１９８７．
Ｋａｊｓｔｕｒａ Ｊ，Ｒｏｔａ Ｍ，Ｈａｌｌ ＳＲ，Ｈｏｓｏｄａ Ｔ，Ｄ’Ａｍａｒｉｏ Ｄ，Ｓａｎａｄａ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１１；３６４：１７９５−１８０６．
Ｒｉｃｃｉｏ Ｍ，Ｃａｒｎｅｖａｌｅ Ｇ，Ｃａｒｄｉｎａｌｅ Ｖ，Ｇｉｂｅｌｌｉｎｉ Ｌ，Ｄｅ Ｂｉａｓｉ Ｓ，Ｐｉｓｃｉｏｔｔａ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｆａｓ／Ｆａｓ ｌｉｇａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙ ｕｎｄｅｒｌｉｅｓ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｂｉｌｉａｒｙ Ｔｒｅｅ Ｓｔｅｍ／Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ ２０１４；６１：１０９７−１１０５．
Ｈｕｇｈｅｓ ＮＲ，Ｂｈａｔｈａｌ ＰＳ，Ｆｒａｎｃｉｓ ＤＭ．Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｏｆ ｇａｓｔｒｉｃ ｍｕｃｏｕｓ ｎｅｃｋ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍｕｃｏｕｓ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ，ｐｙｌｏｒｉｃ，ａｎｄ Ｂｒｕｎｎｅｒ’ｓ ｇｌａｎｄｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １９９４；４７：５３−５７．
Ｋｒａｕｓｅ ＷＪ．Ｂｒｕｎｎｅｒ’ｓ ｇｌａｎｄｓ：ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ，ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｆｉｌｅ．Ｐｒｏｇ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ２０００；３５：２５９−３６７．
Ｃｌｅｖｅｒｓ Ｈ．Ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃｒｙｐｔ，ａ ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ ２０１３；１５４：２７４−２８４．
Ｓｔｅｖｅｎｓ ＭＬ，Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ Ｐ，Ｒａｎｋｉｎ ＳＡ，Ｍａｃｄｏｎａｌｄ Ｍ，Ｊａｇａｎｎａｔｈａｎ Ｓ，Ｙｕｋａｗａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｎｔ／ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ ａｎｄ ＢＭＰ／Ｓｍａｄ１ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ ｆｏｒｅｇｕｔ ａｎｄ ｈｉｎｄｇｕｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｇｒａｍｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０１７；１４４：１２８３−１２９５．
Ｗａｎｇ Ｙ，Ｑｉｎ Ｊ，Ｗａｎｇ Ｓ，Ｚｈａｎｇ Ｗ，Ｄｕａｎ Ｊ，Ｚｈａｎｇ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇａｓｔｒｉｃ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ Ｅｎｄｏｄｅｒｍａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｕｓｉｎｇ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０１６；１９：４４９−４６１．
Ｌｅｍａｉｇｒｅ ＦＰ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｆｏｒ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００９；１３７：６２−７９．
Ｕｄａｇｅｒ Ａ，Ｐｒａｋａｓｈ Ａ，Ｇｕｍｕｃｉｏ ＤＬ．Ｄｉｖｉｄｉｎｇ ｔｈｅ ｔｕｂｕｌａｒ ｇｕｔ：ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｇａｎ ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ ａｔ ｔｈｅ ｐｙｌｏｒｕｓ．Ｐｒｏｇ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｔｒａｎｓｌ Ｓｃｉ ２０１０；９６：３５−６２．
Ｗａｎｄｚｉｏｃｈ Ｅ，Ｚａｒｅｔ ＫＳ．Ｄｙｎａｍｉｃ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｐａｎｃｒｅａｓ ａｎｄ ｌｉｖｅｒ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００９；３２４：１７０７−１７１０．
Ｂｕｒｋｅ ＺＤ，Ｔｏｓｈ Ｄ．Ｏｎｔｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ａｎｄ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ ２０１２；８：５８６−５９６．
Ｆｏｒｂｅｓ ＳＪ，Ｇｕｐｔａ Ｓ，Ｄｈａｗａｎ Ａ．Ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ：Ｆｒｏｍ ｌｉｖｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｔｏ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｙ．Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ ２０１５；６２：Ｓ１５７−１６９．
Ｈａｎｎｏｕｎ Ｚ，Ｓｔｅｉｃｈｅｎ Ｃ，Ｄｉａｎａｔ Ｎ，Ｗｅｂｅｒ Ａ，Ｄｕｂａｒｔ−Ｋｕｐｐｅｒｓｃｈｍｉｔｔ Ａ．Ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ ２０１６；６５：１８２−１９９．
Ｒｅｉｄ ＬＭ．Ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ（ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｌｉｖｅｒ，ｂｉｌｉａｒｙ ｔｒｅｅ，ａｎｄ ｐａｎｃｒｅａｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１６；６４：４−７．
Ｒｅｚｖａｎｉ Ｍ，Ｇｒｉｍｍ ＡＡ，Ｗｉｌｌｅｎｂｒｉｎｇ Ｈ．Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｌａｂ−ｍａｄｅ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１６；６４：２８７−２９４．

Claims (138)

  1. Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９およびサイトケラチン７（ＣＫ７）からなる群から選択される一つまたは複数のマーカーを発現し、自己再生を支持する培養条件下で、限定的または最小限の分化での増殖能としてさらに特徴付けられる、十二指腸から単離された幹／前駆細胞（ブルンナー腺幹／前駆細胞またはＢＧＳＣと称される）。
  2. 病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を実質的に含まない、請求項１に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  3. 少なくとも１カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項１に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  4. 少なくとも２カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項１に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  5. 少なくとも６カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項１に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  6. 少なくとも１２カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項１に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  7. 自己再生を支持する前記培養条件が、無血清培地、任意選択でクボタの培地を含む、請求項１に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  8. 自己再生を支持する前記培養条件が、血清を含有する培地を含む、請求項１に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  9. Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４およびＣＫ１９からなる群から選択される一つまたは複数のマーカーを発現し、自己再生を支持する培養条件下で、限定的または最小限の分化での増殖能としてさらに特徴付けられる、十二指腸から単離された幹／前駆細胞（ブルンナー腺幹／前駆細胞またはＢＧＳＣと称される）。
  10. 病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を実質的に含まない、請求項９に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  11. 少なくとも１カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項９に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  12. 少なくとも２カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項９に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  13. 少なくとも６カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項９に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  14. 少なくとも１２カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項９に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  15. 自己再生を支持する前記培養条件が、無血清培地、任意選択でクボタの培地を含む、請求項９に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  16. 自己再生を支持する前記培養条件が、血清を含有する培地を含む、請求項９に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  17. ＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現し、自己再生を支持する培養条件下で、限定的または最小限の分化での増殖能としてさらに特徴付けられる、十二指腸から単離された幹／前駆細胞（ブルンナー腺幹／前駆細胞またはＢＧＳＣと称される）。
  18. 病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を実質的に含まない、請求項１７に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  19. 少なくとも１カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項１７に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  20. 少なくとも２カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項１７に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  21. 少なくとも６カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項１７に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  22. 少なくとも１２カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項１７に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  23. 自己再生を支持する前記培養条件が、無血清培地、任意選択でクボタの培地を含む、請求項１７に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  24. 自己再生を支持する前記培養条件が、血清を含有する培地を含む、請求項１７に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  25. Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９、ＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４およびＣＫ１９からなる群から選択される一つまたは複数のマーカーを発現するか、またはＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現し、自己再生を支持する培養条件下で、限定的または最小限の分化での増殖能としてさらに特徴付けられる、十二指腸から単離された幹／前駆細胞（ブルンナー腺幹／前駆細胞またはＢＧＳＣと称される）。
  26. 病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を実質的に含まない、請求項２５に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  27. 少なくとも１カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項２５に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  28. 少なくとも２カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項２５に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  29. 少なくとも６カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項２５に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  30. 少なくとも１２カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項２５に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  31. 自己再生を支持する前記培養条件が、無血清培地、任意選択でクボタの培地を含む、請求項２５に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  32. 自己再生を支持する前記培養条件が、血清を含有する培地を含む、請求項２５に記載の単離されたＢＧＳＣ。
  33. 十二指腸から単離された幹／前駆細胞の集団であって、前記細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９およびＣＫ７からなる群から選択される一つまたは複数のマーカーを発現する、集団。
  34. 病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を実質的に含まない、請求項３３に記載の集団。
  35. 少なくとも１カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項３３に記載の集団。
  36. 少なくとも２カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項３３に記載の集団。
  37. 少なくとも６カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項３３に記載の集団。
  38. 少なくとも１２カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項３３に記載の集団。
  39. 自己再生を支持する前記培養条件が、無血清培地、任意選択でクボタの培地を含む、請求項３３に記載の集団。
  40. 自己再生を支持する前記培養条件が、血清を含有する培地を含む、請求項３３に記載の集団。
  41. 十二指腸から単離された幹／前駆細胞の集団であって、前記細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４およびＣＫ１９からなる群から選択される一つまたは複数のマーカーを発現する、集団。
  42. 病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を実質的に含まない、請求項４１に記載の集団。
  43. 少なくとも１カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項４１に記載の集団。
  44. 少なくとも２カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項４１に記載の集団。
  45. 少なくとも６カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項４１に記載の集団。
  46. 少なくとも１２カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項４１に記載の集団。
  47. 自己再生を支持する前記培養条件が、無血清培地、任意選択でクボタの培地を含む、請求項４１に記載の集団。
  48. 自己再生を支持する前記培養条件が、血清を含有する培地を含む、請求項４１に記載の集団。
  49. 十二指腸から単離された幹／前駆細胞の集団であって、前記細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、ＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現する、集団。
  50. 病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を実質的に含まない、請求項４９に記載の集団。
  51. 少なくとも１カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項４９に記載の集団。
  52. 少なくとも２カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項４９に記載の集団。
  53. 少なくとも６カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項４９に記載の集団。
  54. 少なくとも１２カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項４９に記載の集団。
  55. 自己再生を支持する前記培養条件が、無血清培地、任意選択でクボタの培地を含む、請求項４９に記載の集団。
  56. 自己再生を支持する前記培養条件が、血清を含有する培地を含む、請求項４９に記載の集団。
  57. 十二指腸から単離された幹／前駆細胞の集団であって、前記細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９、ＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４およびＣＫ１９からなる群から選択される一つまたは複数のマーカーを発現するか、または前記細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、ＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現する、集団。
  58. 病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を実質的に含まない、請求項５７に記載の集団。
  59. 少なくとも１カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項５７に記載の集団。
  60. 少なくとも２カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項５７に記載の集団。
  61. 少なくとも６カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項５７に記載の集団。
  62. 少なくとも１２カ月間、限定的または最小限の分化で増殖することができる、請求項５７に記載の集団。
  63. 自己再生を支持する前記培養条件が、無血清培地、任意選択でクボタの培地を含む、請求項５７に記載の集団。
  64. 自己再生を支持する前記培養条件が、血清を含有する培地を含む、請求項５７に記載の集団。
  65. 対象の十二指腸、その一部分、またはそこから採取された試料から、一つまたは複数のＢＧＳＣ、または請求項３３、請求項４１、請求項４９および／または請求項５７に記載の細胞の集団を単離する方法であって、
    （ａ）腸粘液を実質的に含まない十二指腸の粘膜層を、生理学的範囲外にある浸透圧特性を有する培地または溶液と、前記粘膜層の細胞に浸透圧ショックを誘発する条件下で接触させること；
    （ｂ）機械的、外科的および／または化学的方法により前記粘膜層または前記その細胞の少なくとも一部分を除去または溶解し、粘膜下層を含み得る残部を残し、および／または曝露させること；
    （ｄ）前記残部を消化するか、または分離すること；および
    （ｅ）一つまたは複数のＢＧＳＣ、または請求項３３、請求項４１、請求項４９および／または請求項５７に記載の細胞の集団を前記消化された残部から単離すること、を含む方法。
  66. 前記単離する工程が、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９、ＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４、およびＣＫ１９からなる群から選択される一つまたは複数のマーカーを発現するＢＧＳＣか、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９、ＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４、およびＣＫ１９からなる群から選択される一つまたは複数のマーカーを発現するＢＧＳＣの集団か、を単離することを含む、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記単離する工程が、ＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現するＢＧＳＣか、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、ＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現するＢＧＳＣの集団か、を単離することを含む、請求項６５に記載の方法。
  68. 前記十二指腸組織が、任意選択で、前記十二指腸組織を圧迫することによって腸粘液を実質的に含まない状態にされる、請求項６５に記載の方法。
  69. 生理学的範囲外にある浸透圧特性を有する前記培地または溶液が、低張、低浸透圧、高張、または高浸透圧溶液を含む、請求項６５に記載の方法。
  70. 生理学的範囲外にある浸透圧特性を有する前記培地が、グルコース溶液、高塩溶液、または蒸留水を含む、請求項６５に記載の方法。
  71. 前記粘膜層または前記その細胞の少なくとも一部分の除去が、乳化剤および／または界面活性剤の使用を含む化学的破壊によって行われる、請求項６５に記載の方法。
  72. 前記界面活性剤および／または乳化剤が、水、生理食塩水および／または緩衝液中にある、請求項６５に記載の方法。
  73. 前記界面活性剤および／または乳化剤が、短期間（１５分未満）適用される、請求項６５に記載の方法。
  74. 前記乳化剤が、レシチン、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ポリソルベート８０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（ポリソルベート４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（ポリソルベート６０）、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート（ポリソルベート６５）、アンモニウムホスファチド、脂肪酸のナトリウム、カリウムおよびカルシウム塩、脂肪酸のマグネシウム塩、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリド、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの酢酸エステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの乳酸エステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドのクエン酸エステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドのモノアセチル酒石酸エステルおよびジアセチル酒石酸エステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの混合酢酸と酒石酸エステル、脂肪酸のスクロースエステル、スクログリセリド、脂肪酸のポリグリセロールエステル、ポリグリセロールポリリシノレエート、脂肪酸のプロパン−１，２−ジオールエステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドと相互作用した熱酸化大豆油、ステアロイル−２−ラクチル酸ナトリウム、ステアロイル−２−ラクチル酸カルシウム、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノパルミテートおよびその組み合わせからなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
  75. 前記界面活性剤が、１−ヘプタンスルホン酸、Ｎ−ラウリルサルコシン、ラウリル硫酸塩、１−オクタンスルホン酸およびタウロコール酸、塩化ベンザルコニウム、セチルピリジニウム、塩化メチルベンズトニウム、臭化デカメトニウム、アルキルベタイン、アルキルアミドアルキルベタイン、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アムモニオ−１−プロパンスルホネート、ホスファチジルコリン、Ｎ−デシルＡ−Ｄ−グルコピラノシド、Ｎ−デシルＡ−Ｄ−マルトピラノシド、Ｎ−ドデシルＢ−Ｄ−マルトシド、Ｎ−オクチルＢ−Ｄ−グルコピラノシド、Ｎ−テトラデシルＢ−Ｄ−マルトシド、トリトン（トリトンＸ−１００）、ノニデット−Ｐ−４０、ポロキサマー１８８、ラウリル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウムおよびその組み合わせを含む群から選択される、請求項６５に記載の方法。
  76. 前記残部が粘膜下層を含む、請求項６５に記載の方法。
  77. 消化または分離が酵素的に行われる、請求項６５に記載の方法。
  78. 前記組織試料が、前記消化または分離工程の前に刻まれる、請求項６５に記載の方法。
  79. 前記消化もしくは分離工程および／または前記単離工程が、低付着プレートにおいて行われる、請求項６５に記載の方法。
  80. 前記単離工程が、無血清培地、任意選択で、クボタの培地を含む培養条件を用いた培養セレクションを使用して行われる、請求項６５に記載の方法。
  81. 前記単離工程が、血清を含有する培地を含む培養条件を用いた培養セレクションを使用して行われる、請求項６５に記載の方法。
  82. 前記単離された細胞が、スフェロイド、一つまたは複数のオルガノイド、細胞集団、または細胞凝集物を支持または生じる条件下で培養される、請求項６５に記載の方法。
  83. 一つまたは複数のＢＧＳＣ、または請求項３３、請求項４１、請求項４９および／または請求項５７に記載の細胞の集団を、対象の十二指腸、その一部分、またはそこから採取された試料から単離する方法であって、以下の工程
    （ａ）前記腸粘液を除去する工程；
    （ｂ）生理学的範囲外にある浸透圧特性を有する培地または溶液を、粘膜層の細胞に浸透圧ショックを誘発する条件下で適用する工程；
    （ｃ）機械的、外科的および／または化学的方法により前記粘膜層または前記その細胞の少なくとも一部分を除去または溶解し、粘膜下層を含み得る残部を残し、および／または曝露させる工程；
    （ｄ）前記粘膜層および／または前記残部に、病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を実質的に殺傷するか、不活化するか、または除去するための培地または溶液を適用する工程；
    （ｅ）消化または分離を前記粘膜下層に適用して、消化物、分離した細胞材料、または細胞懸濁液を生じさせる工程；
    （ｆ）任意選択で前記消化物、分離した細胞材料、または前記細胞懸濁液由来の細胞の少なくとも一部を培養する工程；および
    （ｇ）Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９、ＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４、ＣＫ１９の一つまたは複数を発現する細胞か、もしくは細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９、ＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４、ＣＫ１９の一つまたは複数を発現する細胞の集団か、および／またはＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現するその細胞を単離する工程、を含み、病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を実質的に殺傷するか、不活化するか、または除去する前記工程が、任意の時点で、または２回以上実施することができる、方法。
  84. 腸粘液の前記除去が前記十二指腸組織を圧迫することを含む、請求項８３に記載の方法。
  85. 生理学的範囲外にある浸透圧特性を有する前記培地または溶液が、低張、低浸透圧、高張、または高浸透圧溶液を含む、請求項８３に記載の方法。
  86. 生理学的範囲外にある浸透圧特性を有する前記培地または溶液が、グルコース溶液、高塩溶液、または蒸留水を含む、請求項８３に記載の方法。
  87. 除去が、乳化剤および／または界面活性剤の使用を含む化学的破壊によって行なわれる、請求項８３に記載の方法。
  88. 前記界面活性剤および／または乳化剤が、水、生理食塩水および／または緩衝液中にある、請求項８３に記載の方法。
  89. 前記界面活性剤および／または乳化剤が、短期間（１５分未満）適用される、請求項８３に記載の方法。
  90. 前記界面活性剤が、１−ヘプタンスルホン酸、Ｎ−ラウリルサルコシン、ラウリル硫酸塩、１−オクタンスルホン酸およびタウロコール酸、塩化ベンザルコニウム、セチルピリジニウム、塩化メチルベンズトニウム、臭化デカメトニウム、アルキルベタイン、アルキルアミドアルキルベタイン、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アムモニオ−１−プロパンスルホネート、ホスファチジルコリン、Ｎ−デシルＡ−Ｄ−グルコピラノシド、Ｎ−デシルＡ−Ｄ−マルトピラノシド、Ｎ−ドデシルＢ−Ｄ−マルトシド、Ｎ−オクチルＢ−Ｄ−グルコピラノシド、Ｎ−テトラデシルＢ−Ｄ−マルトシド、トリトン（トリトンＸ−１００）、ノニデット−Ｐ−４０、ポロキサマー１８８、ラウリル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウムおよびその組み合わせを含む群から選択される、請求項８３に記載の方法。
  91. 前記乳化剤が、ｂレシチン、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ポリソルベート８０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（ポリソルベート４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（ポリソルベート６０）、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート（ポリソルベート６５）、アンモニウムホスファチド、脂肪酸のナトリウム、カリウムおよびカルシウム塩、脂肪酸のマグネシウム塩、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリド、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの酢酸エステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの乳酸エステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドのクエン酸エステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドのモノアセチル酒石酸エステルおよびジアセチル酒石酸エステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの混合酢酸と酒石酸エステル、脂肪酸のスクロースエステル、スクログリセリド、脂肪酸のポリグリセロールエステル、ポリグリセロールポリリシノレエート、脂肪酸のプロパン−１，２−ジオールエステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドと相互作用した熱酸化大豆油、ステアロイル−２−ラクチル酸ナトリウム、ステアロイル−２−ラクチル酸カルシウム、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノパルミテートおよびその組み合わせを含む群から選択される、請求項８３に記載の方法。
  92. 前記残部が粘膜下層を含む、請求項８３に記載の方法。
  93. 病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を実質的に殺傷するか、不活化するか、または除去するための前記培地または溶液が、次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）の水溶液、または皮膚または表面の消毒のため使用される任意の溶液または薬剤を含む、請求項８３に記載の方法。
  94. 病原体ならびに／または病原性および／または有益な微生物を実質的に殺傷するか、不活化するか、または除去するための培地または溶液の適用が、前記界面活性剤および／もしくは乳化剤の前記適用前に行われるか、または前記消化もしくは分離後に行われるか、または粘液の前記除去後に行われる。請求項８３に記載の方法。
  95. 消化または分離が酵素的に行われる、請求項８３に記載の方法。
  96. 前記組織試料が、前記消化または分離工程の前に刻まれる、請求項８３に記載の方法。
  97. 前記消化もしくは分離工程および／または前記単離工程が、低付着プレートにおいて行われる、請求項８３に記載の方法。
  98. 前記単離工程が、無血清培地、任意選択で、クボタの培地を含む培養条件を用いた培養セレクションを使用して行われる、請求項８３に記載の方法。
  99. 前記単離工程が、血清を含有する培地を含む培養条件を用いた培養セレクションを使用して行われる、請求項８３に記載の方法。
  100. 前記単離された細胞が、スフェロイド、一つまたは複数のオルガノイド、細胞集団、または細胞凝集物を支持または生じる条件下で培養される、請求項８３に記載の方法。
  101. 請求項１、請求項９、請求項１７もしくは請求項２５に記載の細胞、または請求項３３、請求項４１、請求項４９もしくは請求項５７に記載の細胞の集団を低付着プレート中で培養することによって産生される、スフェロイド、オルガノイド、細胞凝集物または細胞の集団。
  102. 請求項１、請求項９、請求項１７もしくは請求項２５に記載の細胞、または請求項３３、請求項４１、請求項４９もしくは請求項５７に記載の細胞の集団を懸濁または３Ｄ培養条件下で培養することによって産生される、スフェロイド、オルガノイド、細胞凝集物または細胞の集団。
  103. 肝臓、膵臓、胃、腸、または他の内胚葉系組織に関係するか、または影響する疾患または状態と診断された対象を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量のＢＧＳＣまたはＢＧＳＣの集団を投与することを含む、方法。
  104. 有効量の請求項１、請求項９、請求項１７または請求項２５に記載の細胞の投与を含む、肝臓、膵臓、胃、腸または他の内胚葉系組織に関係するか、または影響する疾患または状態と診断された対象を治療する方法。
  105. 有効量の請求項３３、請求項４１、請求項４９または請求項５７に記載の細胞の集団の投与を含む、肝臓、膵臓、胃、腸または他の内胚葉系組織に関係するか、または影響する疾患または状態と診断された対象を治療する方法。
  106. 有効な数の請求項１、請求項９、請求項１７もしくは請求項２５に記載の細胞、または請求項３３、請求項４１、請求項４９もしくは請求項５７に記載の細胞の集団の投与を含む、自己細胞または遺伝子療法。
  107. 有効な数の請求項１、請求項９、請求項１７もしくは請求項２５に記載の細胞、または請求項３３、請求項４１、請求項４９もしくは請求項５７に記載の細胞の集団の投与を含む、同種細胞または遺伝子療法。
  108. 前記細胞が遺伝子操作された細胞または改変された細胞である、請求項１０３、請求項１０４、請求項１０５、請求項１０６および／または請求項１０７に記載の方法。
  109. ヒトおよび／または動物のための自家または同種の細胞もしくは遺伝子療法のための、肝臓、膵臓、胃、腸、または他の内胚葉系組織に関係するか、または影響する疾患または状態の治療のための、請求項１、請求項９、請求項１７または請求項２５に記載の細胞の使用。
  110. 前記細胞が遺伝子操作または改変されている、請求項１０９に記載の請求項１、請求項９、請求項１７または請求項２５に記載の細胞の使用。
  111. ヒトおよび／または動物のための自家または同種の細胞もしくは遺伝子療法のための、肝臓、膵臓、胃、腸、または他の内胚葉系組織に関係するか、または影響する疾患または状態の治療のための、請求項３３、請求項４１、請求項４９または請求項５７に記載の細胞の集団の使用。
  112. 前記細胞が遺伝子操作または改変されている、請求項１１１に記載の請求項３３、請求項４１、請求項４９または請求項５７に記載の細胞の集団の使用。
  113. ＢＧＳＣ、または請求項３３、請求項４１、請求項４９または請求項５７に記載の細胞の集団を成熟細胞を含む後の系譜段階の細胞に分化させる能力がある培養条件をさらに含む、請求項１０１または請求項１０２に記載のスフェロイド、オルガノイド、細胞凝集物または細胞の集団。
  114. ブルンナー腺幹／前駆細胞（ＢＧＳＣ）、または請求項３３、４１、４９もしくは５７に記載の集団を、対象の十二指腸、その一部分、またはそこから採取された試料から単離する方法であって、
    （ａ）十二指腸、その一部分、またはそこから採取された試料を消化または分離して、消化物または分離した細胞材料を生じさせること；
    （ｂ）前記消化物または分離した細胞材料から：（ｉ）Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９、ＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４およびＣＫ１９の一つまたは複数を発現する細胞、もしくは細胞の少なくとも一部、実質的な部分、または大部分が、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９、ＣＫ７、Ｌｇｒ５、ＮＩＳ、ＣＤ４４、およびＣＫ１９を発現する細胞の集団；および／または（ｉｉ）ＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現する細胞、もしくは細胞の少なくとも一部、実質的な部分、または大部分が、ＳＯＸ１７とＰＤＸ１の両方を発現する細胞の集団を得ること、を含む、方法。
  115. 前記十二指腸、その一部分、そこから採取された試料、前記消化物、前記分離した細胞材料、またはそれらの組み合わせが、病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を実質的に殺傷するか、不活化するか、または除去するための培地または溶液と接触される、請求項１１４に記載の方法。
  116. 一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する一つまたは複数の多能性細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する細胞の集団を、粘膜層および粘膜下層を有する組織（またはその一部もしくは試料）から単離する方法であって、以下の順序で生じ得るか、または他の実施形態では、異なる順序で生じ得る、次の工程：
    （ａ）粘膜層および粘膜下層を有する組織の粘膜層を、生理学的範囲外にある浸透圧特性を有する培地または溶液と、前記粘膜層の細胞に浸透圧ショックを誘発する条件下で接触させる工程；
    （ｂ）機械的、外科的および／または化学的方法により前記粘膜層または前記その細胞の少なくとも一部分を除去または溶解し、粘膜下層を含み得る残部を残し、および／または曝露させる工程；
    （ｃ）前記残部を病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を実質的に殺傷するか、不活化するか、または除去するための培地または溶液と接触させる工程；
    （ｄ）前記残部を消化するか、または分離する工程；
    （ｅ）一つまたは複数の多能性細胞、または細胞の少なくとも一部、または実質的な部分、または大部分が、一つまたは複数の所望のバイオマーカーを発現する細胞の集団を単離する工程、を含む、方法。
  117. 表面粘液の除去をさらに含む、請求項１１６に記載の方法。
  118. 生理学的範囲外にある浸透圧特性を有する前記培地または溶液が、低張、低浸透圧、高張、または高浸透圧溶液を含む、請求項１１６に記載の方法。
  119. 生理学的範囲外にある浸透圧特性を有する前記培地または溶液が、グルコース溶液、高塩溶液、または蒸留水を含む、請求項１１６に記載の方法。
  120. 除去が、乳化剤および／または界面活性剤の使用を含む化学的破壊によって行なわれる、請求項１１６に記載の方法。
  121. 前記界面活性剤および／または乳化剤が、水、生理食塩水および／または緩衝液中にある、請求項１１６に記載の方法。
  122. 前記界面活性剤および／または乳化剤が、短期間（１５分未満）適用される、請求項１１６に記載の方法。
  123. 前記乳化剤が、レシチン、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ポリソルベート８０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（ポリソルベート４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（ポリソルベート６０）、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート（ポリソルベート６５）、アンモニウムホスファチド、脂肪酸のナトリウム、カリウムおよびカルシウム塩、脂肪酸のマグネシウム塩、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリド、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの酢酸エステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの乳酸エステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドのクエン酸エステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドのモノアセチル酒石酸エステルおよびジアセチル酒石酸エステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの混合酢酸と酒石酸エステル、脂肪酸のスクロースエステル、スクログリセリド、脂肪酸のポリグリセロールエステル、ポリグリセロールポリリシノレエート、脂肪酸のプロパン−１，２−ジオールエステル、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドと相互作用した熱酸化大豆油、ステアロイル−２−ラクチル酸ナトリウム、ステアロイル−２−ラクチル酸カルシウム、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、およびソルビタンモノパルミテートを含む群から選択される、請求項１２０に記載の方法。
  124. 前記界面活性剤が、１−ヘプタンスルホン酸、Ｎ−ラウリルサルコシン、ラウリル硫酸塩、１−オクタンスルホン酸およびタウロコール酸、塩化ベンザルコニウム、セチルピリジニウム、塩化メチルベンズトニウム、臭化デカメトニウム、アルキルベタイン、アルキルアミドアルキルベタイン、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アムモニオ−１−プロパンスルホネート、ホスファチジルコリン、Ｎ−デシルＡ−Ｄ−グルコピラノシド、Ｎ−デシルＡ−Ｄ−マルトピラノシド、Ｎ−ドデシルＢ−Ｄ−マルトシド、Ｎ−オクチルＢ−Ｄ−グルコピラノシド、Ｎ−テトラデシルＢ−Ｄ−マルトシド、トリトン（トリトンＸ−１００）、ノニデット−Ｐ−４０、ポロキサマー１８８、ラウリル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、およびドデシル硫酸ナトリウムを含む群から選択される、請求項１１６に記載の方法。
  125. 病原体ならびに／または病原性および／もしくは有益な微生物を実質的に殺傷するか、不活化するか、または除去するための前記培地または溶液が、次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）の水溶液、または皮膚または表面の消毒のため使用される任意の溶液または薬剤を含む、請求項１１６に記載の方法。
  126. 病原体ならびに／または病原性および／または有益な微生物を実質的に殺傷するか、不活化するか、または除去するための前記培地または溶液の適用が、前記界面活性剤および／もしくは乳化剤の前記適用前に行われるか、または前記消化もしくは分離後に行われるか、または粘液の前記除去後に行われる、請求項１１６に記載の方法。
  127. 前記残部が粘膜下層を含む、請求項１１６に記載の方法。
  128. 消化または分離が酵素的に行われる、請求項１１６に記載の方法。
  129. 前記組織試料が、前記消化または分離工程の前に刻まれる、請求項１１６に記載の方法。
  130. 前記消化または分離が、粘膜下組織を細胞懸濁液、細胞の混合物、集団、塊もしくは凝集物、および／または組織断片に崩壊する、請求項１１６に記載の方法。
  131. 前記単離工程が、無血清培地、任意選択で、クボタの培地を含む培養条件を用いた培養セレクションを使用して行われる、請求項１１６に記載の方法。
  132. 前記単離工程が、血清を含有する培地を含む培養条件を用いた培養セレクションを使用して行われる、請求項１１６に記載の方法。
  133. 前記単離工程が、低付着プレートにおいて行われる、請求項１１６に記載の方法。
  134. 前記単離された細胞または細胞集団が、スフェロイド、一つまたは複数のオルガノイド、細胞集団、または細胞凝集物を支持または生じる条件下で培養される、請求項１１６に記載の方法。
  135. 生理学的に許容される培地を使用した１回または複数回の洗浄工程を含む、請求項１１６に記載の方法。
  136. 前記組織が内胚葉系組織である、請求項１１６に記載の方法。
  137. 前記組織が、気管、主気管支、食道、胃、十二指腸、小腸、大腸および直腸を含む群から選択される、請求項１１６に記載の方法。
  138. 前記組織が、肝臓、膵臓、胆嚢および胆管を含む群から選択され、前記胆管が総胆管および胆嚢管を含む、請求項１１６に記載の方法。
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