KR20200140836A - 십이지장 브루너샘으로부터의 줄기/전구 세포 및 이들의 단리 및 사용 방법 - Google Patents

십이지장 브루너샘으로부터의 줄기/전구 세포 및 이들의 단리 및 사용 방법 Download PDF

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귀도 카르피노
빈센조 카르디날레
로라 엠. 레이드
도메니코 알바로
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더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐
사피엔자 유니버시타 디 로마
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Abstract

내배엽 줄기 세포의 표현형 형질을 갖고 다능성 마커에 대해 양성인 브루너샘 줄기/전구 세포(BGSC) 및 이들을 인간 십이지장으로부터 단리하는 방법이 본원에 개시된다. 또한, 본 개시내용은 BGSC가 인간 공여자의 십이지장으로부터 쉽게 단리되고 배양으로 확장될 수 있거나 간 및 췌장 계통으로 분화하도록 유도될 수 있으며 재생의료의 임상 프로그램을 위한 세포 공급원을 나타낼 수 있음을 제공한다.

Description

십이지장 브루너샘으로부터의 줄기/전구 세포 및 이들의 단리 및 사용 방법
관련 특허 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2018년 3월 29일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/650,208의 우선권을 주장하며, 그 전문은 본 명세서에 통합된다.
다수의 줄기/전구 세포 니치(stem/progenitor cell niche)는 태아 및 출생 후 인간 담도계(biliary tree) 내의 특정 해부학적 위치에서 지속된다. 줄기/전구 세포 집단은 태아 조직에서 오랫동안 인식되어 왔지만, 성인 조직에서의 이의 지속성은 최근에야 인식되고 있다. 장 음와(intestinal crypts)와 평행을 이루는 샘(gland) 요소인 담관주위샘(peribiliary gland: PBG)은 간외 담관, 큰 간내 담관 및 간-췌장 공통 관 내에 위치한다; 후기 줄기/전구 세포 및 PBG로부터 유래된 줄기/전구 세포는 담낭 내에서 발견된다. 이러한 네트워크는 간-췌장 공통 관의 PBG 내의 줄기/전구 세포로부터 췌장 내의 췌관 샘(pancreatic duct gland: PDG) 내의 수임된 전구체(committed progenitor)까지 연속적이다. 이러한 모든 니치 내의 줄기/전구 세포는 담도계 줄기/전구 세포(BTSC)로 총칭된다. PBG 내의 BTSC는 증식 능력, 자가 재생 및 다분화능(multipotency)을 포함하는 내배엽 줄기/전구 세포의 형질을 가지며; 이들은 증식 능력과 다분화능을 포함하는 PDG의 전구체의 형질을 갖지만, PBG의 줄기/전구 세포보다 자가 복제 능력이 적다.
간-췌장 팽대부 수준에 위치한 BTSC는 원시적이며 몇몇 다능성(pluripotency) 마커(예를 들어, OCT4, SOX2, NANOG)를 공동발현하며 자가 재생하거나 기능성 간세포, 담관세포 및 췌장섬(pancreatic islets)으로 분화할 수 있다(이들이 샘꽈리 세포를 생성할 수 있는지 여부는 진행중인 연구에서 고려되고 있다). BTSC를 함유하는 니치는 간과 췌장으로 확장되어 있다. 인간에서의 상세한 해부학적 연구는 가장 원시적인 줄기 세포가 위치하는 근위 부위인 간-췌장 팽대부로부터 성숙한 세포가 발견되는 원위 부위인 간 또는 췌장까지 확장되는 BTSC 니치 구성에 대한 근위-대-원위 축을 밝혀냈다. 상기 축은 이러한 장기들의 장기형성(organogenesis)을 요약하고 이들의 공통의 발생학적 기원을 반영한다. 실제로, 발생학적 관점에서, 간, 담관계 및 췌장에 대한 공통 전구체는 전장(foregut)을 형성하는 최종 복부 내배엽의 초기 발달 단계에 존재한다. 이러한 발달 단계에서 원시 십이지장은 복부 내배엽 줄기/전구 세포를 보유한다.
동정된 가장 원시적인 줄기/전구체는 십이지장의 점막하 조직(submucosa)에 위치한 브루너샘에서 발견되는 것들이다. 이들 세포는 간과 췌장을 발생시키는 줄기/전구체 니치의 전체 네트워크의 시작점이 될 수 있다. 성체 십이지장으로부터 이들 세포를 단리하는 것은 어려웠으며 지금까지 당업계에 개시된 방법으로는 달성되지 않았다. 이들 세포의 실질적인 중요성은 다양하다. 예를 들어, 이들 세포는 약물 효과의 시험관내 평가를 위해 및 간 및 췌장 발달, 기능, 유지 및/또는 복구(이들이 두 장기 모두의 전구체를 함유하는 경우)의 분석을 위한 모델 시스템(예를 들어, 오가노이드)의 생성을 위해, 간, 췌장 및 기타 내배엽 조직과 관련된 기타 임상 또는 분석 시험을 위해 및 간, 췌장 및/또는 기타 내배엽 조직과 관련되거나 이에 영향을 미치는 질환 또는 병태의 진단 또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 브루너샘의 세포는 내시경 검사에 의해 접근할 수 있는 위치인 십이지장에 있어 자가 또는 이종 세포 요법 또는 유전자 요법을 위한 줄기/전구 세포의 소싱(sourcing)에 매우 유용하다는 점에서 내배엽 줄기/전구 세포의 공급원 중에서 독특하다. 또한, 이들 브루너샘으로부터 유래된 종양은 다양한 형태의 암 요법에 적절한 표적이다. 따라서, "브루너샘 줄기/전구 세포"로서 알려진 관심대상의 세포를 단리하는 방법을 개발하는 것이 당업계에서 여전히 요구된다.
일 측면에서, 본 개시내용은 Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9 및 사이토케라틴 7(CK7)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하고 자가 재생을 지원하는 배양 조건 하에 제한적 또는 최소 분화로 증식할 수 있는 것으로 추가로 특징지어지는, 십이지장으로부터 단리된 줄기/전구 세포(브루너샘 줄기/전구 세포 또는 BGSC로 지칭됨)에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 Lgr5, NIS, CD44 및 CK19로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하고 자가 재생을 지원하는 배양 조건 하에 제한적 또는 최소 분화로 증식할 수 있는 것으로 추가로 특징지어지는, 십이지장으로부터 단리된 줄기/전구 세포(브루너샘 줄기/전구 세포 또는 BGSC로 지칭됨)에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하고 자가 재생을 지원하는 배양 조건 하에 제한적 또는 최소 분화로 증식할 수 있는 것으로 추가로 특징지어지는, 십이지장으로부터 단리된 줄기/전구 세포(브루너샘 줄기/전구 세포 또는 BGSC로 지칭됨)에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44 및 CK19로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하거나 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하고 자가 재생을 지원하는 배양 조건 하에 제한적 또는 최소 분화로 증식할 수 있는 것으로 추가로 특징지어지는, 십이지장으로부터 단리된 줄기/전구 세포(브루너샘 줄기/전구 세포 또는 BGSC로 지칭됨)에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, BGSC에는 실질적으로 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물이 없다. 일부 실시형태에서, BGSC는 적어도 1개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있다. 일부 실시형태에서, BGSC는 적어도 2개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있다. 일부 실시형태에서, BGSC는 적어도 6개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있다. 일부 실시형태에서, BGSC는 적어도 12개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있다.
일부 실시형태에서, BGSC의 자가 재생을 지원하는 배양 조건은 무혈청 배지, 임의로 쿠보타 배지(Kubota's Medium)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 자가-재생을 지원하는 배양 조건은 혈청을 함유하는 배지를 포함한다.
일 측면에서, 본 개시내용은 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9 및 CK7로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하는, 십이지장으로부터 단리된 줄기/전구 세포 집단에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 개시내용은 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 Lgr5, NIS, CD44 및 CK19로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하는, 십이지장으로부터 단리된 줄기/전구 세포 집단에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 개시내용은 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하는, 십이지장으로부터 단리된 줄기/전구 세포 집단에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 개시내용은 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44 및 CK19로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하거나 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하는, 십이지장으로부터 단리된 줄기/전구 세포 집단에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 줄기/전구 세포 집단에는 실질적으로 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물이 없다.
일부 실시형태에서, 줄기/전구 세포 집단은 적어도 1개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있다. 일부 실시형태에서, 줄기/전구 세포 집단은 적어도 2개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있다. 일부 실시형태에서, 줄기/전구 세포 집단은 적어도 6개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있다. 일부 실시형태에서, 줄기/전구 세포 집단은 적어도 12개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있다.
일부 실시형태에서, 줄기/전구 세포 집단의 자가 재생을 지원하는 배양 조건은 무혈청 배지, 임의로 쿠보타 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 줄기/전구 세포 집단의 자가 재생을 지원하는 배양 조건은 혈청을 함유하는 배지를 포함한다.
일 측면에서, 본 개시내용은
(a) 실질적으로 장 점액이 없는 십이지장의 점막층을, 점막층의 세포에 삼투성 쇼크를 유도하는 조건 하에, 생리학적 범위를 벗어나는 삼투질 농도(osmolality) 특성을 갖는 매질 또는 용액과 접촉시키는 단계;
(b) 점막층 또는 이의 세포의 적어도 일부분을 기계적, 외과적 및/또는 화학적 방법에 의해 제거하거나 용해시켜, 점막하층을 포함할 수 있는 나머지를 남기고/거나 노출시키는 단계;
(d) 나머지를 분해 또는 해리시키는 단계; 및
(e) 분해된 나머지로부터 하나 이상의 BGSC 또는 BGSC 집단을 단리하는 단계
를 포함하는, 대상체의 십이지장, 이의 일부분 또는 이로부터 취한 샘플로부터 하나 이상의 BGSC 또는 BGSC 집단을 단리하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 단리 단계는 군 Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44 및 CK19로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하는 BGSC, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44 및 CK19로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하는 BGSC 집단을 단리하는 것을 포함하다.
일부 실시형태에서, 단리 단계는 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하는 BGSC, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대부분이 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하는 BGSC 집단을 단리하는 것을 포함한다.
일 측면에서, 본 개시내용은 대상체의 십이지장, 이의 일부 또는 이로부터 취한 샘플로부터 하나 이상의 BGSC 또는 BGSC 집단을 단리하는 방법으로서, 다음 단계들을 포함하고, 여기서 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물을 실질적으로 사멸, 불활성화 또는 제거하기 위한 단계가 언제든지 또는 1회 이상 수행될 수 있는, 방법에 관한 것이다:
(a) 장 점액을 제거하는 단계;
(b) 점막층의 세포에 삼투성 쇼크를 유도하는 조건 하에, 생리학적 범위를 벗어나는 삼투질 농도 특성을 갖는 매질 또는 용액을 적용하는 단계;
(c) 점막층 또는 이의 세포의 적어도 일부분을 기계적, 외과적 및/또는 화학적 방법에 의해 제거하거나 용해시켜, 점막하층을 포함할 수 있는 나머지를 남기고/거나 노출시키는 단계;
(d) 점막층 및/또는 나머지에 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물을 실질적으로 사멸, 불활성화 또는 제거하기 위한 매질 또는 용액을 적용하는 단계;
(e) 점막하층에 분해 또는 해리를 적용하여 분해, 해리된 세포 물질 또는 세포 현탁액을 생성하는 단계;
(f) 임의로, 상기 분해, 해리된 세포 물질의 적어도 일부 또는 상기 세포 현탁액으로부터 세포를 배양하는 단계; 및
(g) Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19 중 하나 이상을 발현하는 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19 중 하나 이상을 발현하는 세포 집단; 및/또는 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하는 세포를 단리하는 단계.
일부 실시형태에서, 장 점액의 제거는 십이지장 조직을 압착하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 생리학적 범위를 벗어난 삼투질 농도 특성을 갖는 매질 또는 용액은 저장성, 저삼투성, 고장성 또는 고삼투성 용액을 포함한다.
일부 실시형태에서, 생리학적 범위를 벗어나는 삼투질 농도 특성을 갖는 매질 또는 용액은 글루코스 용액, 고염 용액 또는 증류수를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제거는 유화제 및/또는 세제의 사용을 포함하는 화학적 파괴에 의해 수행된다.
일부 실시형태에서, 세제 및/또는 유화제는 물, 식염수 및/또는 완충액 중에 있다.
일부 실시형태에서, 세제 및/또는 유화제는 짧은 기간(15분 미만) 동안 적용된다.
일부 실시형태에서, 유화제는 레시틴, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(폴리소르베이트 20), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(폴리소르베이트 80), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트(폴리소르베이트 40), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트(폴리소르베이트 60), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리스테아레이트(폴리소르베이트 65), 암모늄 포스파티드, 지방산의 나트륨, 칼륨 및 칼슘 염, 지방산의 마그네슘 염, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 아세트산 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 락트산 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 시트르산 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 모노아세틸 및 다아세틸 타르타르산 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 혼합 아세트산 및 타르타르산 에스테르, 지방산의 수크로스 에스테르, 수크로글리세라이드, 지방산의 폴리글리세롤 에스테르, 폴리글리세롤 폴리리시놀레이트, 지방산의 프로판-1,2-디올 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드와 상호작용한 열 산화된 대두유, 나트륨 스테아로일-2-락틸레이트, 칼슘 스테아로일-2-락틸레이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 트리스테아레이트, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노올레이트, 소르비탄 모노팔미테이트 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 세제는 1-헵탄설폰산; N-라우릴사르코신, 라우릴 설페이트, 1-옥탄 설폰산 및 타우로콜산, 벤잘코늄 클로라이드, 세틸피리디늄, 메틸벤제토늄 클로라이드, 데카메토늄 브로마이드, 알킬 베타인, 알킬 아미도알킬 베타인, N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, 포스파티딜콜린, N-데실 A-D-글루코피라노시드, N-데실 A-D-말토피라노시드, N-도데실 B-D-말토시드, N-옥틸 B-D-글루코피라노시드, N-테트라데실 B-D-말토시드, 트리톤(트리톤 X-100), 노니데트-P-40, 폴록사머 188, 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 데옥시콜레이트 및 나트륨 도데실 설페이트 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 나머지는 점막하층을 포함한다.
일부 실시형태에서, 분해 또는 해리는 효소적으로 수행된다.
일부 실시형태에서, 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물을 실질적으로 사멸, 불활성화 또는 제거하기 위한 매질 또는 용액은 차아염소산나트륨(NaClO)의 수용액 또는 피부 또는 표면 소독용으로 사용되는 임의의 용액(들) 또는 제제(들)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물을 실질적으로 사멸, 불활성화 또는 제거하기 위한 매질 또는 용액의 적용은 세제 및/또는 유화제의 적용 전에 실시되거나, 분해 또는 해리 후에 실시되거나, 점액 제거 후에 실시된다.
일부 실시형태에서, 조직 샘플은 분해 또는 해리 단계 전에 세절된다.
일부 실시형태에서, 분해 또는 해리 단계 및/또는 단리 단계는 저부착 플레이트에서 수행된다.
일부 실시형태에서, 단리 단계는 무혈청 배지, 임의로 쿠보타 배지를 포함하는 배양 조건을 이용한 배양 선택을 사용하여 수행된다.
일부 실시형태에서, 단리 단계는 혈청을 함유하는 배지를 포함하는 배양 조건을 이용한 배양 선택을 사용하여 수행된다.
일부 실시형태에서, 단리된 세포는 스페로이드, 하나 이상의 오가노이드, 세포 클러스터 또는 세포 응집체를 지원하거나 생성하는 조건 하에 배양된다.
일 측면에서, 본 개시내용은 저부착 플레이트에서 BGSC 또는 BGSC 집단을 배양함으로써 생성된 스페로이드, 오가노이드, 세포 응집체 또는 세포 클러스터에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 개시내용은 현탁 또는 3D 배양 조건에서 BGSC 또는 BGSC 집단을 배양함으로써 생성된 스페로이드, 오가노이드, 세포 응집체 또는 세포 클러스터에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 개시내용은 유효량의 BGSC 또는 BGSC 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 간, 췌장, 위, 장 또는 기타 내배엽 조직과 관련되거나 이에 영향을 미치는 질환 또는 병태로 진단된 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 개시내용은 유효량의 BGSC의 투여를 포함하는, 간, 췌장, 위, 장 또는 기타 내배엽 조직과 관련되거나 이에 영향을 미치는 질환 또는 병태로 진단된 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 개시내용은 유효량의 BGSC 집단의 투여를 포함하는, 간, 췌장, 위, 장 또는 기타 내배엽 조직과 관련되거나 이에 영향을 미치는 질환 또는 병태로 진단된 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 개시내용은 유효한 수의 BGSC 또는 BGSC 집단의 투여를 포함하는 자가 세포 또는 유전자 요법의 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 개시내용은 유효한 수의 BGSC 또는 BGSC 집단의 투여를 포함하는 동종이계 세포 또는 유전자 요법의 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 개시내용은 유효량의 BGSC 또는 BGSC 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 간, 췌장, 위, 장 또는 기타 내배엽 조직과 관련되거나 이에 영향을 미치는 질환 또는 병태로 진단된 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이고, 여기서 세포는 유전자 조작되거나 변형된 세포이다.
일 측면에서, 본 개시내용은 유효량의 BGSC의 투여를 포함하는, 간, 췌장, 위, 장 또는 기타 내배엽 조직과 관련되거나 이에 영향을 미치는 질환 또는 병태로 진단된 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 세포는 유전자 조작되거나 변형된 세포이다.
일 측면에서, 본 개시내용은 유효량의 BGSC 집단의 투여를 포함하는, 간, 췌장, 위, 장 또는 기타 내배엽 조직과 관련되거나 이에 영향을 미치는 질환 또는 병태로 진단된 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 세포는 유전자 조작되거나 변형된 세포이다.
일 측면에서, 본 개시내용은 유효한 수의 BGSC 또는 BGSC 집단의 투여를 포함하는 자가 세포 또는 유전자 요법의 방법에 관한 것이며, 여기서 세포는 유전자 조작되거나 변형된 세포이다.
일 측면에서, 본 개시내용은 유효한 수의 BGSC 또는 BGSC 집단의 투여를 포함하는 동종이계 세포 또는 유전자 요법의 방법에 관한 것이며, 여기서 세포는 유전자 조작되거나 변형된 세포이다.
일 측면에서, 본 개시내용은 인간 및/또는 동물에 대한 자가 또는 동종이계 세포 또는 유전자 요법을 위한, 간, 췌장, 위, 장 또는 기타 내배엽 조직과 관련되거나 이에 영향을 미치는 질환 또는 병태의 치료를 위한 BGSC의 세포의 용도에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 개시내용은 인간 및/또는 동물에 대한 자가 또는 동종이계 세포 또는 유전자 요법을 위한, 간, 췌장, 위, 장 또는 기타 내배엽 조직과 관련되거나 이에 영향을 미치는 질환 또는 병태의 치료를 위한 BGSC의 세포의 용도에 관한 것이며, 여기서 세포는 유전자 조작되거나 변형되었다.
일 측면에서, 본 개시내용은 인간 및/또는 동물에 대한 자가 또는 동종이계 세포 또는 유전자 요법을 위한, 간, 췌장, 위, 장 또는 기타 내배엽 조직과 관련되거나 이에 영향을 미치는 질환 또는 병태의 치료를 위한 BGSC 집단의 집단의 용도에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 개시내용은 인간 및/또는 동물에 대한 자가 또는 동종이계 세포 또는 유전자 요법을 위한, 간, 췌장, 위, 장 또는 기타 내배엽 조직과 관련되거나 이에 영향을 미치는 질환 또는 병태의 치료를 위한 BGSC 집단의 집단의 용도에 관한 것이며, 여기서 세포는 유전자 조작되거나 변형되었다.
일부 실시형태에서, BGSC 또는 BGSC 집단을 성숙한 세포를 포함하는 후기 계통(lineage) 단계의 세포로 분화시킬 수 있는 배양 조건을 추가로 포함하는, 스페로이드, 오가노이드, 세포 응집체 또는 세포 클러스터.
일 측면에서, 본 개시내용은
(a) 십이지장, 이의 일부분 또는 이로부터 취한 샘플을 분해 또는 해리시켜 분해 또는 해리된 세포 물질을 제공하는 단계;
(b) 상기 분해 또는 해리된 세포 물질로부터: (i) Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44 및 CK19 중 하나 이상을 발현하는 세포, 또는 세포의 적어도 일부, 상당 부분 또는 대다수가 Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44 및 CK19 중 하나 이상을 발현하는 세포 집단; 및/또는 (ii) SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하는 세포, 또는 세포의 적어도 일부, 상당 부분 또는 대다수가 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하는 세포 집단을 수득하는 단계
를 포함하는, 대상체의 십이지장, 이의 일부분 또는 이로부터 취한 샘플로부터 브루너샘 줄기/전구 세포(BGSC) 또는 BGSC 집단을 단리하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 십이지장, 이의 일부분, 이로부터 취한 샘플, 분해물, 해리된 세포 물질 또는 이들의 조합은 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물을 실질적으로 사멸, 불활성화 또는 제거하기 위한 매질 또는 용액과 접촉된다.
일 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 세포 집단을 점막층 및 점막하층을 갖는 조직(또는 이의 일부분 또는 샘플)으로부터 단리하는 방법으로서, 다음 순서로 발생할 수 있거나 다른 실시형태에서 다른 순서로 발생할 수 있는 다음 단계들을 포함하는 방법에 관한 것이다:
(a) 점막층 및 점막하층을 갖는 조직의 점막층을 점막층의 세포에 삼투성 쇼크를 유도하는 조건 하에 생리학적 범위를 벗어나는 삼투질 농도 특성을 갖는 매질 또는 용액과 접촉시키는 단계;
(b) 점막층 또는 이의 세포의 적어도 일부분을 기계적, 외과적 및/또는 화학적 방법에 의해 제거하거나 용해시켜, 점막하층을 포함할 수 있는 나머지를 남기고/거나 노출시키는 단계;
(c) 나머지를 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물을 실질적으로 사멸, 불활성화 또는 제거하기 위한 매질 또는 용액과 접촉시키는 단계;
(d) 나머지를 분해 또는 해리시키는 단계;
(e) 하나 이상의 다분화능 세포, 또는 세포의 적어도 일부, 상당 부분 또는 대다수가 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 세포 집단을 단리하는 단계.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 세포 집단을 점막층 및 점막하층을 갖는 조직(또는 이의 일부분 또는 샘플)으로부터 단리하는 방법으로서, 표면 점액의 제거를 추가로 포함하는 방법.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 세포 집단을 점막층 및 점막하층을 갖는 조직(또는 이의 일부분 또는 샘플)으로부터 단리하는 방법으로서, 생리학적 범위를 벗어나는 삼투질 농도 특성을 갖는 매질 또는 용액이 저장성, 저삼투성, 고장성 또는 고삼투성 용액을 포함하는, 방법.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 세포 집단을 점막층 및 점막하층을 갖는 조직(또는 이의 일부분 또는 샘플)으로부터 단리하는 방법으로서, 생리학적 범위를 벗어나는 삼투질 농도 특성을 갖는 매질 또는 용액이 글루코스 용액, 고염 용액 또는 증류수를 포함하는, 방법.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 세포 집단을 점막층 및 점막하층을 갖는 조직(또는 이의 일부분 또는 샘플)으로부터 단리하는 방법으로서, 제거가 유화제 및/또는 세제의 사용을 포함하는 화학적 파괴에 의해 수행되는, 방법.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 세포 집단을 점막층 및 점막하층을 갖는 조직(또는 이의 일부분 또는 샘플)으로부터 단리하는 방법으로서, 세제 및/또는 유화제가 물, 식염수 및/또는 완충액 중에 있는, 방법.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 세포 집단을 점막층 및 점막하층을 갖는 조직(또는 이의 일부분 또는 샘플)으로부터 단리하는 방법으로서, 세제 및/또는 유화제가 짧은 기간(15분 미만) 동안 적용되는, 방법.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 세포 집단을 점막층 및 점막하층을 갖는 조직(또는 이의 일부분 또는 샘플)으로부터 단리하는 방법으로서, 유화제가 레시틴, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(폴리소르베이트 20), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(폴리소르베이트 80), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트(폴리소르베이트 40), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트(폴리소르베이트 60), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리스테아레이트(폴리소르베이트 65), 암모늄 포스파티드, 지방산의 나트륨, 칼륨 및 칼슘 염, 지방산의 마그네슘 염, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 아세트산 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 락트산 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 시트르산 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 모노아세틸 및 다아세틸 타르타르산 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 혼합 아세트산 및 타르타르산 에스테르, 지방산의 수크로스 에스테르, 수크로글리세라이드, 지방산의 폴리글리세롤 에스테르, 폴리글리세롤 폴리리시놀레이트, 지방산의 프로판-1,2-디올 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드와 상호작용한 열 산화된 대두유, 나트륨 스테아로일-2-락틸레이트, 칼슘 스테아로일-2-락틸레이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 트리스테아레이트, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노올레이트 및 소르비탄 모노팔미테이트를 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 세포 집단을 점막층 및 점막하층을 갖는 조직(또는 이의 일부분 또는 샘플)으로부터 단리하는 방법으로서, 세제가 1-헵탄설폰산, N-라우릴사르코신, 라우릴 설페이트, 1-옥탄 설폰산 및 타우로콜산, 벤잘코늄 클로라이드, 세틸피리디늄, 메틸벤제토늄 클로라이드, 데카메토늄 브로마이드, 알킬 베타인, 알킬 아미도알킬 베타인, N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, 포스파티딜콜린, N-데실 A-D-글루코피라노시드, N-데실 A-D-말토피라노시드, N-도데실 B-D-말토시드, N-옥틸 B-D-글루코피라노시드, N-테트라데실 B-D-말토시드, 트리톤(트리톤 X-100), 노니데트-P-40, 폴록사머 188, 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 데옥시콜레이트 및 나트륨 도데실 설페이트를 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 세포 집단을 점막층 및 점막하층을 갖는 조직(또는 이의 일부분 또는 샘플)으로부터 단리하는 방법으로서, 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물을 실질적으로 사멸, 비활성화 또는 제거하기 위한 매질 또는 용액이 차아염소산나트륨(NaClO)의 수용액 또는 피부 또는 표면의 소독용으로 사용되는 임의의 용액(들) 또는 제제(들)를 포함하는, 방법.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 세포 집단을 점막층 및 점막하층을 갖는 조직(또는 이의 일부분 또는 샘플)으로부터 단리하는 방법으로서, 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물을 실질적으로 사멸, 비활성화 또는 제거하기 위한 매질 또는 용액의 적용이 세제 및/또는 유화제의 적용 전에 실시되거나, 분해 또는 해리 후에 실시되거나, 점액의 제거 후에 실시되는, 방법.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 세포 집단을 점막층 및 점막하층을 갖는 조직(또는 이의 일부분 또는 샘플)으로부터 단리하는 방법으로서, 나머지가 점막하층을 포함하는, 방법.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 세포 집단을 점막층 및 점막하층을 갖는 조직(또는 이의 일부분 또는 샘플)으로부터 단리하는 방법으로서, 분해 또는 해리가 효소적으로 수행되는, 방법.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 세포 집단을 점막층 및 점막하층을 갖는 조직(또는 이의 일부분 또는 샘플)으로부터 단리하는 방법으로서, 조직 샘플이 분해 또는 해리 단계 전에 세절되는, 방법.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 세포 집단을 점막층 및 점막하층을 갖는 조직(또는 이의 일부분 또는 샘플)으로부터 단리하는 방법으로서, 분해 또는 해리가 점막하 조직을 세포 현탁액, 세포 혼합물, 클러스터, 덩어리 또는 응집체 및/또는 조직 단편으로 분해시키는, 방법.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 세포 집단을 점막층 및 점막하층을 갖는 조직(또는 이의 일부분 또는 샘플)으로부터 단리하는 방법으로서, 단리 단계가 무혈청 배지, 임의로 쿠보타 배지를 포함하는 배양 조건을 이용한 배양 선택을 사용하여 수행되는, 방법.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 세포 집단을 점막층 및 점막하층을 갖는 조직(또는 이의 일부분 또는 샘플)으로부터 단리하는 방법으로서, 단리 단계가 혈청을 함유하는 배지를 포함하는 배양 조건을 이용한 배양 선택을 사용하여 수행되는, 방법.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 세포 집단을 점막층 및 점막하층을 갖는 조직(또는 이의 일부분 또는 샘플)으로부터 단리하는 방법으로서, 단리 단계가 저부착 플레이트에서 수행되는, 방법.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 세포 집단을 점막층 및 점막하층을 갖는 조직(또는 이의 일부분 또는 샘플)으로부터 단리하는 방법으로서, 단리된 세포 또는 세포 집단이 스페로이드, 하나 이상의 오가노이드, 세포 클러스터 또는 세포 응집체를 지원하거나 생성하는 조건 하에 배양되는, 방법.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 세포 집단을 점막층 및 점막하층을 갖는 조직(또는 이의 일부분 또는 샘플)으로부터 단리하는 방법으로서, 생리학적으로 허용되는 배지를 사용하는 1회 이상의 세척 단계를 추가로 포함하는 방법.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 세포 집단을 점막층 및 점막하층을 갖는 조직(또는 이의 일부분 또는 샘플)으로부터 단리하는 방법으로서, 조직이 내배엽 조직인, 방법.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 세포 집단을 점막층 및 점막하층을 갖는 조직(또는 이의 일부분 또는 샘플)으로부터 단리하는 방법으로서, 조직이 기관(trachea), 주 기관지, 식도, 위, 십이지장, 소장, 대장 및 직장을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 세포 집단을 점막층 및 점막하층을 갖는 조직(또는 이의 일부분 또는 샘플)으로부터 단리하는 방법으로서, 조직이 간, 췌장, 담낭 및 담도계 관을 포함하는 군으로부터 선택되고, 상기 담도계 관이 공통 관 및 담낭관을 포함하는, 방법.
도 1은 A) 과요오드산-쉬프(PAS)로 염색된 인간 십이지장을 도시한다. 십이지장 점막은 장 융모로 튀어나와 장 음와(화살촉)에서 접혀있다. 점막하 조직(SM)은 PAS+ 샘 요소(브루너샘: BG, 점선)로 채워져 있다. BG는 점막근판(muscolaris mucosae: MM)을 통해 장 음와와 해부학적 연속성이 있다. 소수의 BG 샘꽈리는 점막의 고유층 내부에 위치하고 장 음와와 연속성이 있다. 소수의 BG 샘꽈리는 점막의 고유층 내부에 위치하였으며 장 음와와 연속성이 있었다(우측 이미지의 화살표). B) 인간 십이지장에서의 사이토케라틴 7(CK7)의 면역조직화학. CK7은 BG에 의해 특이적으로 발현되지만 장 음와에 의해서는 발현되지 않는다. C) 인간 십이지장에서의 SOX9의 면역조직화학. 장 음와와 BG 둘 다는 SOX9를 발현하는 세포(화살표)를 함유한다. D) SOX9(적색) 및 CK7(녹색)에 대한 면역형광; 핵은 청색으로 표시된다. BG에서, SOX9는 동일한 세포에서 CK7와 함께 공동발현된다(화살표).
도 2는 A) 인간 십이지장에서의 증식성 세포 핵 항원(PCNA), CD44, 상피 세포 부착 분자(EpCAM), 류신-풍부 반복부 함유 G-단백질 커플링형 수용체 5(Lgr5), Tra-1-60 및 Tra-1-81에 대한 면역조직화학을 도시한다. PCNA+, CD44+, EpCAM+ 및 Lgr5+ 세포는 장 음와(화살표)와 브루너샘(화살표) 둘 다에 위치한다. Tra-1-60+ 및 Tra-1-81+ 세포는 브루너샘(화살표)에 위치하지만, 장 음와에는 위치하지 않는다. MM=점막근판. B) 다능성과 관련된 전사 인자의에 대한 면역조직화학 및 면역형광. Oct4A 및 SOX2는 브루너샘 내의 세포에서 양성이었으며 Tra-1-60+ 세포에서 공동발현된다(화살표).
도 3은 A) 점막의 화학적 및 기계적 제거 전후의 인간 십이지장 절편의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색된 절편을 도시한다. 드문 장 음와(우측 이미지의 점선 원)를 제외한, 표면 상피(융모)와 장 음와(화살촉) 내의 거의 모든 상피 세포가 제거되었다. 점막하 조직의 브루너샘은 보존된다(별표). B) 점막의 기계적 및 화학적 제거 후 인간 십이지장에서의 사이토케라틴 7(CK7)에 대한 면역조직화학. 브루너샘의 CK7+ 세포는 보존된다. C) 점막의 기계적 및 화학적 제거 후 인간 십이지장에서의 Tra-1-60에 대한 면역조직화학. 브루너샘의 Tra-1-60+ 세포는 보존된다. MM=점막근판.
도 4는 A) 내지 B) 십이지장 점막하 조직으로부터 단리된 세포에서 상피 세포 부착 분자(EpCAM), 류신-풍부 반복부 함유 G-단백질 커플링형 수용체 5(Lgr5) 및 Tra-1-60에 대한 유세포계측을 도시한다. EpCAM 및 Tra-1-60 면역분류 절차는 각각 EpCAM+ (A) 및 Tra-1-60+ (B) 집단의 부분적 농축을 초래하였다. C) 내지 D) 배양 선택 전략은 Tra-1-60+ 세포를 추가로 선택하였다. C에서는, 세포를 쿠보타 배지에서 플라스틱상에 클론 밀도(clonal density)로 플레이팅하였다. 세포는 1일 내지 2일의 성장 지체기(lag period) 후에 증식하기 시작하였고 6일 내지 8일 후에 10개 내지 15개 세포의 작은 클러스터를 형성하였다. 14일 후, 큰 콜로니가 관찰되었다. 각 콜로니는 작고 조밀하게 패킹된 균일한 Tra-1-60+ 세포에 의해 형성되었다. D에서는, 세포를 오가노이드 형성에 맞춤화된 배양 조건에서 배양하였다; 단일 브루너샘 줄기 세포(BGSC)는 크기와 개수가 더 확장된 구형 구조로 자가 구조화되기 시작하였다. 오가노이드 형성은 오가노이드를 형성하는 우세한 표현형을 나타내는 Tra-1-60+ 세포가 농축되었음을 밝혔다. Ph-C: 위상차. 축척 막대=200 ㎛.
도 5는 A) 내지 B) 내배엽 및 다능성 마커에 대한 위상차(Ph-C), 헤마톡실린&에오신(H&E) 및 과요오드산-쉬프(PAS) 염색, 면역조직화학 및 면역형광을 도시한다. 패널 A에서는, 브루너샘 줄기 세포(BGSC)를 자가 복제 조건(즉, 무혈청 쿠보타 배지) 하에 배양하였다. 패널 B에서는, BGSC를 오가노이드 형성에 맞춤화된 조건 하에 배양하였다. 두 조건 모두에서, 배양된 세포는 브루너샘을 형성하는 세포에 의해 원 위치에서(in situ) 관찰된 것과 유사한 전형적인 표현형을 보여주었다. 핵은 청색으로 표시된다. C) 내지 D) RT-PCR 분석은 내배엽(C) 유전자 및 다능성(D) 유전자의 발현을 확인시켜 주었다. 담도계 줄기/전구 세포(BTSC) 및 Ntera 세포주는 각각 내배엽 유전자 및 다능성 유전자에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다. 다른 군과 대비 *=p< 0.05. GOI=관심대상 유전자.
도 6은 A) 시험관내 간세포 분화를 도시한다. 간세포 분화용 호르몬 한정 배지(hormonally defined medium)에서의 배양된 브루너샘 줄기/전구 세포(hBGSC)에서의 알부민에 대한 위상차(Ph-C), 과요오드산-쉬프(PAS) 염색 및 면역형광을 도시한다. HDM-H에서 14일 후, 대부분의 세포의 형태특징(morphology)은 다각형 형상의 세포로 현저히 변화하였다. 이들 세포는 응집되어 다세포 다발(cord)을 형성하였고 PAS 양성(글루카곤 저장)이었고 알부민을 발현하였다. 핵은 청색으로 표시된다. HDM-간에서 14일 동안 배양된 세포에서의 간세포 마커의 실시간 PCR 결과. 알부민(ALB), 트랜스페린(TF) 및 사이토크롬 P450 3A4(CYP3A4)를 포함한 간세포 특이적 유전자는 자가 복제 조건(즉, 무혈청 쿠보타 배지: KM) 하의 세포와 비교할 때 증가하였다. 1차 인간 간세포(hHeps)를 양성 대조군으로서 사용하였다. 다른 군과 대비 *=p< 0.05. GOI=관심대상 유전자. B) 시험관내 내분비 췌장 분화. 췌장섬 세포 분화용 호르몬 한정 배지에서 배양된 인간 브루너샘 줄기/전구 세포(hBGSC)에서 뉴로제닌 3(NGN3) 및 인슐린에 대한 Ph-C 및 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색 및 면역형광. HDM-P에서 14일 후, 섬-유사 구조가 배양물에 출현하였다; 이들 응집체는 NGN3 및 인슐린 양성이었다. 핵은 청색으로 표시된다. HDM-P에서 14일 동안 배양된 세포에서의 췌장 내분비 마커에 대한 실시간 PCR 결과. PDX1, 인슐린 및 글루카곤은 자가 복제 조건(즉, 무혈청 쿠보타 배지: KM) 하의 세포와 비교할 때 매우 증가하였다. 정상 췌장섬 세포를 양성 대조군으로서 사용하였다. KM에서의 hBGSC와 대비하여 *=p< 0.05. GOI=관심대상 유전자.
도 7은 비장내 주사에 의해 인간 브루너샘 줄기 세포(hBGSC)를 SCID 마우스의 간에 생체내 이식한 것을 도시한다. A) 30일 후, 인간 미토콘드리아 항원(hMito)을 발현하는 세포는 뮤린(murine) 간에 존재하였으며 대부분 문맥삼분지(portal triad) 공간(화살표) 주변에 위치하였다. 식염수(Veh)가 주사된 마우스에는 양성 세포가 존재하지 않았다. B) hMito 양성 세포는 뮤린 간 내의 간세포의 거의 5%를 차지한다. C) 인간 알부민(hALB) 유전자의 발현은 hBGSC가 주사된 마우스의 간에서 RT-qPCR에 의해 검출되었지만, Veh가 주사된 마우스에서는 검출되지 않았다(ND: 검출되지 않음). 데이터는 3회 실험의 평균 ± SD로서 표현하였다. D) 내지 E) 이중 면역형광은 동일한 세포에서의 인간 알부민(hAlb), Hep-Par1 및 hMito와 같은 성숙한 인간 간세포 마커의 발현을 확인시켜 주었다. 핵(Nu)은 청색으로 표시된다.
도 8은 십이지장 점막의 선택적 가용화를 도시한다. A) 세척 방법; B) 십이지장 말단의 클램핑, C) 조직 슬리팅(slitting) 및 점액 제거; D) 콜랜더를 사용하는 기계적 여과.
도 9는 인간 십이지장에서의 사이토케라틴 7(CK7)에 대한 면역조직화학을 도시한다. 십이지장 벽은 점막, 점막하 조직 및 근육층으로 구성된다. 브루너샘(BG)은 점막하층 내에 위치한다. CK7은 BG에 의해 특이적으로 발현되지만, 장 음와의 세포에 의해서는 그렇지 않다. 박스 안의 영역은 우측 이미지에서 확대되었다.
도 10은 A) 인간 십이지장에서의 SOX9(적색) 및 Lgr5(녹색)에 대한 면역형광을 도시한다. 핵은 청색으로 표시된다. 브루너샘(점선에 포함됨)에서, Lgr5는 SOX9(화살표)와 공동국소화되었고, 이의 발현은 점막하층 내의 더 심부에 위치하는 샘꽈리보다 점막근판 내부에 위치하고 장 음와(화살촉)와 연속성이 있는 샘꽈리에서 더 컸다. MM=점막근판. B) 내지 D) 나트륨/요오드화물 공동수송체(NIS)에 대한 면역조직화학. NIS는 장 음와의 바닥(패널 A와 패널 C의 화살표) 및 브루너샘(패널 A와 패널 B의 화살표)에서 발현된다.
도 11은 점막하 조직 생존력의 보존과 조합된 점막 상피 세포의 제거를 위한 실패한 프로토콜 및 절차를 도시한다. 절차 1번: 외과적 해부, 2번: 점막 아래에 생리식염수를 사전 주사하는 것에 의한 점막절제술, 3번: 점막 찰과. 이러한 전략들은 헤마톡실린&에오신(H&E) 및 과요오드산-쉬프(PAS) 염색에서 나타난 바와 같이 점막 층을 부분적으로 제거하고 장 융모(화살촉) 및 음와(화살표)를 보존하였다.
도 12는 췌장섬 세포 분화용 호르몬 한정 배지(HDM-P)에서 7일 동안 배양된 인간 브루너샘 줄기/전구 세포(hBGSC)의 실시간 PCR을 도시한다. PDX1 유전자 및 글루카곤 유전자는 자가 복제 조건(즉, 쿠보타 배지: KM) 하의 세포와 비교할 때, 7 일 후에 매우 증가하였지만, 인슐린 유전자는 그렇지 않았다. 정상 췌장섬 세포는 양성 대조군으로서 사용하였다. KM에서의 hBGSC와 대비하여 *= p< 0.05. GOI=관심대상 유전자.
도 13은 마우스의 십이지장 점막하 샘이 장 음와와 관련하여 뚜렷한 구획을 나타내고 증식 특징을 보여준다는 것을 도시한다. A)는 뮤린(m) 십이지장에서의 사이토케라틴 19(Ck19), SOX9 및 증식성 세포 핵 항원(PCNA)에 대한 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색 및 면역형광 염색을 도시한다. 점선은 장 음와와 점막하 샘(SG: 별표) 사이의 경계면을 나타낸다. 십이지장의 SG는 음와와 비교하여 더 투명한 세포질을 갖기 때문에 그리고 이의 점액 함량 때문에 구별할 수 있다. 설치류 십이지장에서, 장 음와 및 융모는 Ck19에 양성인 반면, SG(흰색 별표)는 거의 모두 음성이다. SOX9+ 세포는 주로 SG(녹색 세포) 내에 위치하고 PCNA+ 세포는 주로 장 음와(적혈구)에 위치한다. 핵은 청색으로 표시된다. 축척 막대= 200 ㎛(H&E 및 Ck19) 또는 100 ㎛(SOX9/PCNA). B)는 뮤린(m) 공장에서의 Ck19, SOX9 및 PCNA에 대한 헤마톡실린 및 에오신 염색 및 면역형광 염색을 도시한다. 설치류 공장에서, 장 음와 및 융모는 Ck19 양성이다. 십이지장과의 차이점은 SOX9+ 세포가 음와에 위치하고 PCNA(노란색 화살표)를 공동발현한다는 것이다. 핵은 청색으로 표시된다. 축척 막대= 200 ㎛(H&E 및 Ck19) 또는 100 ㎛(SOX9/PCNA). C)는 타목시펜 주사 14일 후 Krt19CreTdTomatoLSL 마우스에서의 Ck19 및 TdTomato(Td-Tom)에 대한 면역형광을 도시한다. 뮤린(m) 공장에서, 대부분의 장 음와는 Td-Tom+(적색 화살표)이고 음성 음와(녹색 화살표)는 양성 음와 가까이에 위치하였다. Td-Tom+ 음와 위에 위치한 융모는 완전히 td-Tom 양성이다. 뮤린 십이지장에서, SG는 주로 td-Tom- 및 Ck19-이므로 이의 기원을 td-Tom+ 음와(적색 화살표)로부터 제외시켰다. 흰색 별표는 SG를 나타낸다. 점선은 장 음와와 SG 사이의 경계면을 나타낸다. 핵은 청색으로 표시된다. 축척 막대= 200 ㎛. D) 뮤린 십이지장에서, PCNA+ 505 및 SOX9+ 세포는 항상 Td-Tom 음성(적색 화살표)이다. 노란색 화살표와 녹색 화살표는 십이지장에서 PCNA 양성이고 SOX9 음성인 Td-Tom+ 장 음와를 가리킨다. 핵은 청색으로 표시된다. 점선은 장 음와와 SG 사이의 경계면을 나타낸다. 도 13의 이미지는 n=5마리 동물을 대표하는 것이었다.
도 14는 십이지장 점막하층으로부터 단리된 Tra-1-60+ 세포가 시험관내에서 내분비 췌장으로 제한될 수 있으며 생체내에서 인슐린+ 세포로 분화할 수 있는 능력을 보여줌을 도시한다. A) 내지 C) 시험관내 내분비 췌장 분화. 패널 A)는 인간 십이지장 점막하 샘으로부터 단리되어 췌장 분화용 한정 배지(PM) 또는 자가 복제 조건(쿠보타 배지: KM)에서 배양된 세포의 위상차(Ph-C) 및 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색을 도시한다. PM에서, 섬-유사 구조가 7일 후(PM7)에 출현하고 14일 후(PM14)에 개수의 증가가 나타난다. 다른 군과 대비 * p< 0. 001. 축척 막대= 100㎛. n= 5개의 생물학적 복제물. B) 실시간(RT)-PCR은 PM7-14에서 증가된 PDX1 유전자 발현을 보여준다; 583 핵 Pdx1 발현은 면역형광에 의해 확인되었다. n=4개의 생물학적 복제물. C)는 PM14(n=4개의 생물학적 복제물) 후 인슐린(INS) 및 글루카곤(GLU) 유전자의 증가된 발현을 도시한다. 인간 췌장섬 세포(ISL)를 참조로서 사용하였다(n=3개의 생물학적 복제물). 14일 PM에서, 면역형광에 의하면 섬-유사 구조는 인슐린 및 글루카곤 발현을 나타낸다. 축척 막대= lOO㎛. D) 내지 G)는 마우스에서 실험적으로 유도된 당뇨병이 생체내 dSG에서 증식 및 췌장 형질을 촉발할 수 있음을 도시한다(n = 각 군에 대해 5마리 동물). D)는 스트렙토조토신(STZ) 처리된 마우스가 대조군(CTR)에 비해 증가된 범위의 dSG 면적 분율(별표)을 가짐을 도시한다. 점선은 dSG로부터의 장 음와를 나타낸다. 축척 막대= 200 ㎛. E)는 면역형광(IF)에 의해 결정시 STZ 마우스의 dSG가 대조군과 비교하여 증식 세포 핵 항원(PCNA), Pdx-1, 뉴로제닌 3(Ngn3) 및 인슐린의 발현이 증가하였음을 도시한다. 축척 막대= 100 ㎛. F)는 IF 점수의 히트맵을 도시한다. G)는, RT-PCR 분석에 의해 결정시, 설치류 십이지장의 표본이 대조군과 비교하여 STZ 마우스에서 NGN3 및 INS 유전자의 발현이 약간 증가하였음을 도시한다. 동일한 마우스의 췌장 조직을 참조로서 사용한다. H)는 2형 당뇨병(T2D)에 걸린 환자로부터 수득된 인간 십이지장에서의 인슐린 발현 연구를 도시한다. 이들 장기(n = 5개 십이지장)에서, 드문 인슐린+ 세포가 SG 내에 존재한다(화살표). 췌장 조직은 우측에 도시된다. 축척 막대= 50 ㎛. 면역형광에서 핵은 청색으로 표시된다. A 내지 D 및 G의 경우, 오차 막대는 평균±s.d를 나타낸다. A 내지 D 및 G의 경우, p-값은 양측 t-검정에 의해 결정하였다.
도 15는 인간 십이지장 구부(duodenal bulb)의 내시경 생검에 의해 수득된 자가 복제성 브루너샘 세포를 도시한다. A)는 생검(좌측 패널)에 의한 브루너샘(별표)을 갖는 점막하층의 무리를 도시한다. 브루너샘에서 SOX9를 발현하는 세포는 화살표(우측 패널)로 표시된다. B)는 태아의 십이지장으로부터 단리된 브루너샘 세포를 자가 복제 조건에서 배양함으로써 수득된 시험관내 세포 콜로니(점선)를 도시한다.
정의
본 발명의 설명 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형(원문의 "a", "an" 및 "the")은 문맥상 명확하게 달리 표시되지 않는 한 복수형도 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 용어 "약"은 양 또는 농도 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 특정된 양의 20%, 10%, 5%, 1%, 0.5% 또는 심지어 0.1%의 변동을 포괄하는 것으로 의도된다.
용어 "허용가능한", "유효한" 또는 "충분한"은 본원에서 개시되는 임의의 성분, 범위, 투여 형태 등의 선택을 설명하기 위해 사용될 경우에 상기 성분, 범위, 투여 형태 등이 개시된 목적에 적합함을 의도한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "및/또는"은 열거된 관련 항목들 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합을 포함할 뿐만 아니라, 대안으로서("또는") 해석되는 경우, 조합의 부재도 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 언급된 요소를 포함하지만 다른 것들을 배제하지는 않는다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 전이 어구(transitional phrase) "로 본질적으로 구성된"(및 문법적 변형어들)은 언급된 재료 또는 단계 "그리고 언급된 실시형태의 기본 및 신규 특성(들)에 실질적으로 영향을 주지 않는 재료 또는 단계"를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 문헌[In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.P.Q. 461, 463 (CCPA 1976)] (원문에서의 강조)을 참조하고; 또한 MPEP § 2111.03을 참조한다. 따라서, 본원에서 사용되는 용어 "로 본질적으로 구성된"은 "포함하는"과 균등한 것으로 해석되지 않아야 한다. "로 구성된"은 다른 성분의 미량 또는 소수의 원소의 더 많은 배제 및 본원에 개시된 조성물을 투여하기 위한 실질적인 방법 단계를 의미한다. 이러한 전이 용어들 각각에 의해 규정되는 양상은 본 발명의 범위 내에 속한다.
용어 "균등물" 또는 "생물학적 균등물"은 특정 분자, 생물학적 물질 또는 세포 물질을 지칭하는 경우 상호교환적으로 사용되고, 원하는 구조 또는 기능성을 여전히 유지하면서 최소한의 상동성을 갖는 것을 의도한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 스페로이드는 세포가 현탁 배양 환경에서 상호작용할 수 있게 하는 3차원(3D) 구조로 구조화된 실질적으로 또는 주로 동일한 유형의 세포의 응집체를 지칭할 때 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 오가노이드는 세포가 현탁 배양 환경에서 상호작용할 수 있게 하는 3차원(3D) 구조로 구조화된 하나 이상의 유형의 세포 응집체를 지칭할 때 사용된다. 일부 경우에, 오가노이드는 [인간 또는 동물] 장기 또는 조직의 구조 및 기능 측면을 모방할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 미생물은 원하는 세포 또는 세포 집단을 수득하기 위해 가공되는 조직 내부 또는 외부에 존재할 수 있는, 병원성 또는 질환 유발성일 수 있거나 병원성 또는 질환 유발성이 아닐 수 있거나 유익할 수 있거나 유익하지 않을 수 있는 미생물을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "발현"은 DNA 또는 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 후속하여 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래된 경우, 발현은 진핵 세포에서의 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다. 유전자의 발현 수준은, 예를 들어, 세포 또는 조직 샘플 중에서 mRNA 또는 단백질의 양을 측정함으로써 결정될 수 있으며; 추가로, 특정 샘플에 대한 발현 프로파일을 확립하기 위해 다수 유전자의 발현 수준이 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "기능적"은 소정의 효과를 달성하고자 의도된 임의의 분자, 생물학적 물질, 또는 세포 물질을 수식하기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "유전자" 또는 "유전적"은 DNA 또는 RNA가 코딩(예를 들어, mRNA) 또는 비-코딩(예를 들어, ncRNA)인지 여부와 관계없이 RNA 분자로 전사될 수 있거나 전사되지 않을 수 있는 임의의 핵산 서열을 광범위하게 포함하고자 한다. 용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용되며, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 이들의 유사체인 임의의 길이의 중합체 형태의 뉴클레오티드를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고 기지의 또는 미지의 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편(예를 들어, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 마이크로RNA, 전달 RNA, 리보솜 RNA, RNAi, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머.
본원에서 사용되는 용어 "유전자 조작되거나 변형된"은 유전자 또는 유전 물질의 결실, 첨가 또는 조정, 재조합 DNA 기술, 바이러스 벡터 또는 전기천공을 통한 유전자 변형, CRISPER(규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복단위: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)를 통한 유전자 표적화 또는 편집 또는 그 밖의 DNA 단편의 결실 또는 첨가, 유전적 돌연변이의 교정 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 세포 또는 이의 유전 물질의 임의의 형태의 변형을 광범위하게 포함하고자 한다.
폴리뉴클레오티드는 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같은 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조의 변형은 폴리뉴클레오티드의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후에, 예컨대 표지화 성분과의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 상기 용어는 또한 이중 가닥 분자와 단일 가닥 분자 둘 다를 지칭한다. 달리 명시되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오티드인 상기 기술의 임의의 측면은 이중 가닥 형태와, 이중 가닥 형태를 구성하는 것으로 알려져 있거나 예측되는 각각 2개의 상보적 단일 가닥 형태 둘 다를 포함한다.
용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 2개 이상의 서브유닛 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩티드미메틱(peptidomimetic)의 화합물을 지칭하기 위해 상호교환적으로 그리고 이의 가장 광의적 의미로 사용된다. 서브유닛은 펩티드 결합에 의해 연결될 수 있다. 또 다른 측면에서, 서브유닛은 다른 결합, 예를 들어, 에스테르, 에테르 결합 등에 의해 연결될 수도 있다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하며, 단백질 또는 펩디드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 개수에 제한을 두지 않는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 광학 이성질체와 L 광학 이성질체 둘 다, 아미노산 유사체 및 펩티도미메틱을 포함하는, 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용되고 임의의 동물을 의미하도록 의도된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물일 수 있다. 추가 실시형태에서, 대상체는 인간 또는 인간이 아닌 동물(예를 들어, 마우스 또는 래트)이다.
용어 "조직"은 살아있거나 죽은 유기체의 조직 또는 살아있거나 죽은 유기체로부터 유래되거나 살아있거나 죽은 유기체의 일부 측면을 모방하도록 설계된 임의의 조직을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 조직은 건강할 수 있고/있거나 질환에 걸릴 수 있고/있거나 유전자 돌연변이 또는 변형을 가질 수 있다. 용어 "천연 조직" 또는 "생물학적 조직" 및 이의 변형어는 그것이 유기체로부터 유래된 경우에 천연 상태로 존재하거나 미변형된 형태로 존재하는 생물학적 조직을 지칭한다. "마이크로-기관(micro-organ)"은 "천연 조직"에서 모델링되거나 이를 모방하는 "생체공학적 조직"의 절편을 지칭한다.
생물학적 조직은 임의의 단일 조직(예를 들어, 상호연결될 수 있는 세포들의 모음) 또는 유기체의 몸체의 장기 또는 부분 또는 영역을 구성하는 조직들의 군을 포함할 수 있다. 조직은 균질한 또는 이질적 세포 물질을 포함할 수 있거나, 예를 들어 폐 조직, 골격 조직 및/또는 근육 조직을 포함할 수 있는 흉곽을 포함하는 신체 영역에서 발견되는 것과 같은 복합 구조일 수 있다. 예시적인 조직은 간, 폐, 갑상선, 피부, 췌장, 혈관, 방광, 신장, 뇌, 담도계, 십이지장, 복부대동맥, 장골정맥, 심장 및 장(이들의 임의의 조합을 포함)으로부터 유래된 조직을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "단리된"은 실질적으로 다른 물질이 없는 분자 또는 생물학적 물질 또는 세포 물질을 지칭한다. 용어 "단리된"은 천연 환경으로부터 제거된 물질(예를 들어, 생체내로부터 생체외 또는 시험관내로)을 설명하는데도 사용된다. 본원에서 사용되는 용어 "멸균"은 세균 또는 기타 살아있는 미생물이 없는(즉, 무균성, 멸균된, 세균이 없는(germ-free), 방부성(antiseptic), 소독된 등) 물질을 지칭한다.
단리된 브루너샘 줄기/전구 세포 및 세포 배양 배지
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포"는 진핵 세포를 지칭한다. 다양한 실시형태에서, 상기 세포는 인간 또는 동물 기원이고, 줄기 세포 또는 전구 세포 또는 체세포일 수 있다. 용어 "세포 집단"은 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 동일하거나 상이한 기원 및/또는 계통 단계를 갖는 동일하거나 상이한 세포 유형의 하나 이상의 세포의 군을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이러한 세포 집단은 세포주로부터 유래될 수 있고; 일부 실시형태에서, 세포 집단은 장기 또는 조직, 이의 일부분 또는 이의 샘플로부터 유래될 수 있다.
용어 "줄기 세포"는 자가 복제할 수 있고(모세포와 동일한 딸 세포를 생산할 수 있고) 다분화성, 즉 하나 이상의 유형의 성체 세포를 생성할 수 있는 세포 집단을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "전구 세포" 또는 "전구체"는 또한 다능성이지만, 전구 세포 또는 전구체의 다분화성의 범위 또는 정도는 줄기 세포의 다분화능보다 더 제한될 수 있다. 용어 "전구 세포" 또는 "전구체"는 또한 줄기 세포의 후손 및 그 자손들을 포함하도록 광범위하게 정의된다. 전구체는 다분화성, 이분화성(bipotent) 또는 단일분화성(unipotent)일 수 있지만 줄기 세포보다 더 제한된 자가 복제 능력을 가질 수 있는 세포 집단이다. 수임된 전구체는 특정 계통으로 분화할 수 있는 것들이다. 줄기 세포의 비제한적 예로는 배아 줄기(ES) 세포, 유도 만능 줄기(induced pluripotent stem: iPS) 세포, 배엽층 줄기 세포, 결정된 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 주산기 줄기 세포, 양수 유래의 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포(MSC) 및 혈관모세포가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.줄기 세포와 수임된 전구체 사이의 중간체는 간모세포 및 췌장관 전구체 및 다분화성일 수 있지만 제한된 자가 복제 능력을 가질 수 있는 다른 형태의 전이 증폭 세포와 같은 세포 집단을 포함한다.
본 개시내용에서 관심대상의 세포는 본원에서 브루너샘 줄기/전구 세포 (BGSC)로 지칭되며 인간 또는 동물의 십이지장로부터 유래될 수 있다(그러나 장의 다른 곳에는 없다). 이러한 BGSC는 적어도 다음의 특징들에 기초하여 장 줄기 세포와 구별될 수 있다:
Figure pct00001
출원인들은, 십이지장 및 이의 브루너샘이, 십이지장의 점막하 조직에 위치한 샘 내의 줄기/전구체 니치 네트워크의 일부분으로서 간, 췌장 및 기타 내배엽 세포와 조직을 생성하고 성인기까지 지속되는 중요한 줄기/전구 세포 니치라는 것을 최초로 인식하였다. BGSC는 브루너샘(십이지장 점막하 샘으로도 공지됨) 내의 세포의 작은 하위집단(예를 들어, 약 5%)이며 TRA-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2 및 NANOG와 같은 다능성 유전자를 발현하는 것으로 인식될 수 있다. BGSC는 Lgr5, NIS, CD44, CK19, SOX9 및 EpCAM을 포함할 수 있고/있거나 SOX17과 PDX1 둘 다를 포함할 수 있는 바이오마커를 갖는 간, 담도계, 췌장, 장 및 기타 내배엽 조직과 관련이 있다.
상기 설명한 바와 같이, BGSC는 장 줄기 세포와는 다르다: BGSC는 Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4 및 CK7을 발현하는 반면에, 장 줄기 세포는 그렇지 않다. BGSC는 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하는 반면에, 간 줄기 세포는 SOX17을 발현하지만 PDX1은 발현하지 않고, 췌장 줄기 세포는 PDX1을 발현하지만 SOX17은 발현하지 않는다는 점에서, BGSC는 간 줄기 세포 및 췌장 줄기 세포와도 다르다.
따라서, 일 측면에서, 본 개시내용은 Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9 및 CK7로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하고 자가 재생을 지원하는 배양 조건 하에 제한적 또는 최소 분화로 증식할 수 있는 것으로 추가로 특징지어지는, 십이지장으로부터 단리된 BGSC에 관한 것이다. 다른 측면에서, 십이지장으로부터 단리된 BGSC는 Lgr5, NIS, CD44 및 CK19로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하고, BGSC는 자가 재생을 지원하는 배양 조건 하에 제한적 또는 최소 분화로 증식할 수 있는 것으로 추가로 특징지어진다. 또 다른 측면에서, 십이지장으로부터 단리된 BGSC는 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하고, BGSC는 자가 재생을 지원하는 배양 조건 하에 제한적 또는 최소 분화로 증식할 수 있는 것으로 추가로 특징지어진다. 일부 실시형태에서, 단리된 BGSC는 Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 및 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단리된 BGSC는 실질적으로 병원체가 없고/없거나 병원성 및/또는 유익한 미생물이 없다.
일부 실시형태에서, 단리된 BGSC는 적어도 1개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단리된 BGSC는 적어도 2개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단리된 BGSC는 적어도 6개월 동안 또는 적어도 12개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식할 수 있다.
일부 실시형태에서, BGSC의 자가 재생을 지원하는 배양 조건은 무혈청 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 무혈청 배지는 쿠보타 배지를 포함한다.
"배양" 또는 "세포 배양"은 시험관내 환경에서 세포를 유지하는 것을 의미 한다. "세포 배양 시스템"은 본원에서 세포 집단이 생체외(신체 외부)에서 성장할 수 있는 배양 조건을 지칭하기 위해 사용된다. 배양물은 단일 유형의 세포 또는 상이한 세포 유형들의 혼합물로 구성될 수 있다.
세포 배양물은 세포가 세포외 매트릭스 성분의 코팅과 같은 코팅이 있거나 없는 표면 및 생물학적 유체(예를 들어, 혈청 또는 림프) 및/또는 호르몬, 성장 인자 및 사이토카인의 한정된 혼합물(호르몬 한정 배지 또는 HDM)이 보충된 영양 배지(미네랄, 비타민, 아미노산, 지질)에 플레이팅된 단층인 것들을 포함한다. HDM은 특정 성숙 계통 단계에서 특정 유형의 세포 또는 세포 집단과 함께 사용할 수 있는 것으로 경험적으로 정의된다.
세포 배양물은 또한 저부착 접시에 플레이팅된 세포의 부유 클러스터 또는 응집체일 수 있고/있거나 현탁 배양물 중에 있을 수 있다. 부유 클러스터 또는 응집체 및/또는 현탁 배양을 지원하는 배지는 단층 배양에 사용되는 것과 동일한 배지일 수 있다. 배지는 무혈청일 수 있거나 혈청을 함유할 수 있다. 무혈청 배지는 부유 응집체를 유발하여 단층을 생성할 수 있는 부착 단백질(예를 들어, 피브로넥틴)이 결여되어 있다. 부유 응집체가 실질적으로 또는 주로 하나의 세포 유형으로 구성될 경우, 이들은 스페로이드로서 지칭된다. 이들이 다수의 세포 유형[예를 들어, 상피 및 중간엽 세포 파트너(들)]으로 구성될 경우, 이들은 오가노이드로서 지칭된다. 현탁 배양물 중에 부유하는 세포 클러스터 또는 응집체, 스페로이드 및 오가노이드는 3D 미세환경에 있는 것으로 간주되며 세포는 3차원 공간에서 상호작용할 수 있다.
"배양 배지"는 본원에서 세포의 배양, 성장 또는 증식을 위한 영양 용액을 지칭하기 위해 사용된다. 배양 배지는 세포를 특정 상태(예를 들어, 다능성 상태, 휴지 상태 등)로 유지시키는 능력, 세포의 성숙을 용이하게 하는 능력 및 일부 경우에는 다분화능 세포의 특정 계통의 세포로의 분화를 촉진하는 능력을 특징으로 할 수 있다.
배양 배지의 비제한적인 예로는 전형적으로 약 10%인 수준에서 혈청이 보충된 임의의 기본 배지(상업적 제품 및 농산품을 위해 일상적으로 도축되는 동물로부터 유래됨)인 혈청 보충 배양 배지(SSM)가 있다.
본원에서 사용되는 용어 "단리된"은 다른 물질이 실질적으로 없는 분자 또는 생물학적 물질 또는 세포 물질을 지칭한다(배양 배지 및/또는 세포외 기질 및 이들의 각 성분은 제외). 용어 "단리된"은 또한 이의 천연 환경으로부터 제거된 물질(예를 들어, 생체내로부터 생체외 또는 시험관내로)을 설명하기 위해 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "멸균, 살균된 또는 소독된"은 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물이 없는(즉, 무균성, 멸균된, 세균이 없는, 방부성, 소독된 등) 물질을 지칭하기 위해 사용된다.
단리된 BGSC 집단
다른 측면에서, 본 개시내용은 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9 및 CK7로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하고 자가 재생을 지원하는 배양 조건 하에 제한적 또는 최소 분화로 증식할 수 있는 것으로 추가로 특징지어지는, 십이지장으로부터 단리된 줄기/전구 세포 집단에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 Lgr5, NIS, CD44 및 CK19로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하는, 십이지장으로부터 단리된 줄기/전구 세포 집단에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하는, 십이지장으로부터 단리된 줄기/전구 세포 집단에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 십이지장으로부터 단리된 줄기/전구 세포 집단 내의 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수는 Tra 1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 마커 및 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현한다.
일부 실시형태에서, 이전 단락에 기재된 단리된 줄기/전구체 집단에는 실질적으로 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물이 없다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19, CD44, CK19로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 및 SOX17와 PDX1 둘 다를 발현하는 단리된 BGSC 집단을 포함하는 조성물에 관한 것이고, 일부 실시형태에서 이러한 BGSC 집단은 멸균, 살균 또는 소독되었다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 Tra 1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9 및 CK7, Lgr5, NIS, CD44 및 CK19으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 및 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하고, 임의로 저부착 플레이트에서 또는 현탁액 중에서, 자가 재생을 지원하는 배양 조건 하에 제한적 또는 최소 분화로 증식할 수 있는 것으로 추가로 특징지어지는 단리된 BGSC 집단을 배양함으로써 생성된 오가노이드에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 오가노이드는 배양 배지를 추가로 포함하고, 여기서 상기 배양 배지는 BGSC를 성숙한 세포를 포함하는 후기 계통 단계 세포로 분화시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 자가 재생을 지원하는 배양 조건은 무혈청 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 무혈청 배지는 쿠보타 배지를 포함한다.
일부 실시형태에서, 무혈청 배양 조건은, 상피 세포인지 중간엽 세포인지 관계 없이, 세포의 특정 성숙 계통 단계를 위해 설계된 호르몬 한정 배지(HDM)이다. SSM 이외에도, 상피 세포인지 중간엽 세포인지 관계 없이, 세포의 특정 성숙 계통 단계를 위해 설계되었고 구리가 없고 저 칼슘을 함유한 기본 배지(미네랄, 아미노산, 당, 염, 비타민, 지질을 포함하는 영양 배지)로 구성되고 인슐린, 트랜스페린/Fe 및 다양한 지질이 보충되었지만 사이토카인 또는 성장 인자가 없는 무혈청 배지인 쿠보타 배지가 있다. 상기 배지는 간, 췌장, 폐 및 장으로부터의 내배엽 줄기/전구 세포를 지원할 수 있다.
본원에서 사용되는 "쿠보타 배지"는 구리를 함유하지 않지만 칼슘(<0.5mM), 셀레늄, 아연, 인슐린, 트랜스페린/Fe, 정제된 알부민에 결합된 유리 지방산의 혼합물 및 임의로 또한 고밀도 지단백질(HDL)을 함유하는 임의의 배지를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 쿠보타 배지는 구리를 함유하지 않고, 저 칼슘(예를 들어, 0.3mM), 약 10 내지 9M 셀레늄, 약 0.1% 소 혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민(고도로 정제되고 지방산이 없음), 약 4.5 mM 니코틴아미드, 약 0.1 nM 황산아연 칠수화물, 약 10 내지 8 M 하이드로코르티손(췌장 전구체가 아닌 간 전구체용으로 사용된 선택적 성분), 약 5 ㎍/ml 트랜스페린/Fe, 약 5 ㎍/ml 인슐린, 약 10 ㎍/ml 고밀도 지단백질 및 정제된 혈청 알부민에 결합한 후 첨가되는 정제된 유리 지방산의 혼합물을 함유한 임의의 배지(예를 들어, RPMI 1640 또는 DMEM-F12)를 포함한다. 유리 지방산 혼합물은 각각 약 100 mM의 팔미트산, 팔미톨레산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산 및 스테아르산으로 구성된다. 이러한 배지의 비제한적인 제조 방법은 다른 곳, 예를 들어 그 개시내용이 본원에 통합된 문헌[Kubota H, Reid LM, Proc. Nat. Acad. Scien. (USA) 2000; 97: 12132-12137]에서 공개되었다.
줄기/전구 세포를 간세포(HDM-H) 또는 담관세포(HDM-C)와 같은 특정 성체 운명으로 유도하도록 설계될 수 있는 다른 무혈청 HDM이 있다. 이러한 HDM 중 일부는 하기에서 추가로 정의된다. 일부 실시형태에서, 배지는 소정의 환경에 세포를 제공하거나 도입하는 데 사용되는 "시딩 배지"일 수 있다. 다른 실시형태에서, 배지는 세포의 분화를 용이하게 하기 위해 사용되는 "분화 배지"일 수 있다.
이러한 배지는 영양소, 미네랄, 아미노산, 당, 지질 및 미량 원소의 혼합물 인 "기본 배지"로 구성된다(예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 DME 및 햄 F10 또는 F12, 및 Roswell Park Memorial Institute에서 확립된 한정된 기본 배지인 RPMI 1640을 포함한다). 이들 기본 배지는 혈청(혈청 보충 배지 또는 SSM) 또는 정제된 호르몬, 성장 인자와 영양소의 한정된 혼합물이 보충된 배지인 호르몬 한정 배지(HDM)일 수 있고 생체외 세포 유지를 위해 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "HDM-H"는 내배엽 줄기/전구체의 성숙한 간세포로의 분화를 유도하는 IV형 콜라겐과 라미닌의 기재에 플레이팅된 단층 또는 오가노이드용으로 사용되는 HDM이다. HDM-C는 오가노이드용으로 사용되거나 세포를 성숙한 담관세포로 유도하는 I형 콜라겐과 피브로넥틴의 기재에 플레이팅된 단층 또는 오가노이드용으로 사용되는 HDM이다.
특정 호르몬 한정 배지(HDM) 조성은 하기에서 더 상세히 설명된다:
· 변형된 KM(MKM): 하기 3가지 HDM 모두 0.6 mM 농도를 달성하기 위한 칼슘, 10-12 M 구리 및 20 ng/ml의 FGF가 추가 보충된 KM을 사용하여 제조하였다.
· 간세포 분화(HDM-L)는 MKM에 7 ㎍/L 글루카곤, 2g/L 갈락토스, l nM 트리요오도티록신 3(T3), 10 ng/ml 온코스타틴 M(OSM); 10 ng/ml 표피 성장 인자(EGF), 20 ng/ml 간세포 성장 인자(HGF) 및 1 ㎛ 덱사메타손을 보충하여 제조하였다.
· 담관세포 분화(HDM-C)는 MKM에 20 ng/ml 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF) 165 및 10 ng/ml HGF를 보충하여 제조하였다.
· 췌장 분화용 한정 배지(PM 또는 HDM-P)는 하이드로코르티손 없는 MKM을 사용하고 2% B27, 0.1mM 아스코르브산, 0.25 μM 사이클로파민, 1 μM 레티노산, bFGF를 보충하여 제조하였으며 처음 4일 동안 사용하고 나머지 시간 동안 50 ng/ml 엑센딘-4 및 20 ng/ml의 HGF로 대체하였다.
기본 배지는 세포 배양을 위해 사용된 완충액이며 세포 주변의 간질액의 화학적 구성성분을 모방하는 조성으로 아미노산, 당, 지질, 비타민, 미네랄, 염, 미량 원소 및 각종 영양소로 구성된다. 또한, 세포 배양 배지는 일반적으로 생물학적 과정(예를 들어, 증식, 분화)을 구동하는 데 필요한 필수 신호전달 분자(호르몬, 성장 인자)를 제공하기 위해 작은 비율(전형적으로 2 내지 10%) 혈청이 보충된 기본 배지로 구성된다. 혈청은 배양에 사용되는 세포 유형에 대해 자가일 수 있지만, 소, 양, 염소, 말 등으로부터의 혈청과 같은 농업용 또는 식용으로 일상적으로 도축되는 동물로부터의 혈청이 가장 통상적이다. 혈청은 또한 조직 해리 과정의 일부분인 효소를 불활성화하는 데 사용된다.
점막층 및 점막하층을 갖는 조직으로부터 다분화능 세포를 단리하는 방법
또 다른 측면에서, 본 개시내용은
(a) 실질적으로 장 점액이 없는 십이지장의 점막층을, 점막층의 세포에 삼투성 쇼크를 유도하는 조건 하에, 생리학적 범위를 벗어나는 삼투질 농도 특성을 갖는 매질 또는 용액과 접촉시키는 단계;
(b) 점막층 또는 이의 세포의 적어도 일부분을 기계적, 외과적 및/또는 화학적 방법에 의해 제거하거나 용해시켜, 점막하층을 포함할 수 있는 나머지를 남기고/거나 노출시키는 단계;
(c) 나머지를 분해 또는 해리시키는 단계; 및
(d) 분해된 나머지로부터 하나 이상의 BGSC 또는 세포 집단을 단리하는 단계
를 포함하는, 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 줄기/전구 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 원하는 바이오마커(들)를 발현하는 집단을 점막층 및 점막하층을 갖는 조직으로부터 단리하는 방법에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "삼투성 쇼크"는 세포에 손상을 일으키는, 세포 내의 생리학적 삼투압과 비교한 삼투압의 변화를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 세포는, 세포에 삼투성 쇼크를 유도하는 조건 하에 생리학적 범위를 벗어나는 삼투질 농도 특성을 갖는 매질 또는 용액을 적용함으로써 삼투성 쇼크에 의해 손상된다. 생리학적 범위를 벗어나는 삼투질 농도 특성을 갖는 매질 또는 용액은 생리학적 삼투질 농도보다 낮은 삼투질 농도를 갖는 저장성 또는 저삼투질농도(hypoosmolar) 또는 저삼투성 용액일 수 있다. 생리학적 범위를 벗어나는 삼투질 농도 특성을 갖는 매질 또는 용액은 생리학적 삼투질 농도보다 높은 삼투질 농도를 갖는 고장성 또는 고삼투질농도(hyperosmolar) 또는 고삼투성 용액일 수 있다. 생리학적 범위를 벗어나는 삼투질 농도 특성을 갖는 매질 또는 용액은 임의의 종류의 용액일 수 있다. 일부 실시형태에서, 삼투질 농도 특성이 생리학적 범위를 벗어나는 매질 또는 용액은 물, 초순수, 증류수, 5% 글루코스 용액, 고염 용액 등일 수 있다.
삼투성 쇼크는 생리학적 범위를 벗어나는 삼투질 농도 특성을 갖는 매질 또는 용액을 십이지장을 팽창시킬 수 있는 양으로 루멘에 적용하거나 이러한 매질 또는 용액을 조직의 점막층에 적용함으로써 유도될 수 있다. 일부 실시형태에서, 생리학적 범위를 벗어나는 삼투질 농도 특성을 갖는 매질 또는 용액은 약 0.5분, 1분, 약 2분, 약 5분, 약 10분 또는 약 15분 동안 루멘 또는 점막층과 접촉될 수 있다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포 또는 이러한 세포를 포함하는 집단을 점막층 및 점막하층을 갖는 조직으로부터 단리하는 방법은 선택 또는 단리 단계 전에 혼합물을 세포 현탁액으로 추가 가공하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포 또는 이러한 세포를 포함하는 집단을 점막 층 및 점막하층을 갖는 조직으로부터 단리하는 방법은 생리학적으로 허용되는 매질을 사용하는 1회 이상의 세척 단계를 포함한다.
하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포 또는 이러한 세포를 포함하는 집단을 점막층 및 점막하층을 갖는 조직으로부터 단리하는 방법은 점막층 및 점막하층을 갖는 임의의 적합한 조직으로부터 다분화능 줄기 세포를 단리하는 데 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조직은 내배엽 조직이다. 일부 실시형태에서, 조직은 소장, 대장, 직장을 포함하는 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 조직은 기관(trachea), 주 기관지, 식도, 위 및 십이지장을 포함하는 군으로부터 선택된다.
특정 측면에서, 본 개시내용은
(a) 장 점액을 제거하는 단계;
(b) 점막층의 세포에 삼투성 쇼크를 유도하는 조건 하에, 생리학적 범위를 벗어나는 삼투질 농도 특성을 갖는 매질 또는 용액을 적용하는 단계;
(c) 점막층 또는 이의 세포의 적어도 일부분을 기계적, 외과적 및/또는 화학적 방법에 의해 제거하거나 용해시켜, 점막하층을 포함할 수 있는 나머지를 남기고/거나 노출시키는 단계;
(d) 점막층 및/또는 나머지에 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물을 실질적으로 사멸, 불활성화 또는 제거하기 위한 매질 또는 용액을 적용하는 단계;
(e) 점막하층을 포함하는 나머지에 분해 또는 해리를 적용하여 분해, 해리된 세포 물질 또는 세포 현탁액을 생성하는 단계;
(f) 임의로, 상기 분해, 해리된 세포 물질의 적어도 일부 또는 상기 세포 현탁액으로부터의 세포를 배양하는 단계; 및
(g) Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19 중 하나 이상을 발현하는 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19 중 하나 이상을 발현하는 세포 집단; 및/또는 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하는 세포를 단리하는 단계
를 포함하는, 하나 이상의 BGSC 또는 BGSC를 포함하는 집단을 대상체의 십이지장으로부터 취한 조직, 이러한 조직의 일부분 또는 이의 샘플로부터 단리하는 방법에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "나머지"는 점막층이 부분적으로 또는 전체적으로 파괴 및/또는 제거되어 점막하층이 노출된 조직, 이의 일부분 또는 이의 샘플을 지칭한다. BGSC와 같은 원하는 다분화능 세포는 나머지 점막하층 내에 함유되어 있다.
하나 이상의 BGSC 또는 BGSC를 포함하는 집단을 대상체의 십이지장, 이의 일부분 또는 이의 샘플로부터 단리하는 방법의 일부 실시형태에서, 제거 단계는 유화제 및/또는 세제의 사용을 포함하는 화학적 파괴에 의해 수행된다. 일부 실시형태에서, 살균 또는 멸균은 차아염소산나트륨 용액 단계(d)로 수행된다. 일부 실시형태에서, 분해는 효소적으로 수행된다. 하나 이상의 BGSC 또는 BGSC를 포함하는 집단을 단리하는 방법의 일부 실시형태에서, 제거 또는 용해 단계 후의 나머지는 점막하층을 포함하고 분해된 나머지는 조직 단편을 포함한다. 하나 이상의 BGSC 또는 BGSC를 포함하는 집단을 단리하는 방법의 일부 실시형태에서, 조직 또는 조직 부분 또는 샘플은 분해 단계(e) 전에 세절된다. 하나 이상의 BGSC 또는 BGSC를 포함하는 집단을 단리하는 방법의 일부 실시형태에서, 단리 단계(f)는 무혈청 배지, 임의로 쿠보타 배지를 포함하는 배양 조건을 이용한 배양 선택을 사용하여 수행된다. 하나 이상의 BGSC 또는 BGSC를 포함하는 집단을 단리하는 방법의 일부 실시형태에서, 단리 단계(f)는 혈청을 함유하는 배양 조건을 이용한 배양 선택을 사용하여 수행된다. 하나 이상의 BGSC 또는 BGSC를 포함하는 집단을 단리하는 방법의 일부 실시형태에서, 분해 단계(e) 및/또는 단리 단계(f)는 저부착 플레이트에서 수행된다. 하나 이상의 BGSC를 단리하는 방법의 일부 실시형태에서, 단리된 세포는 스페로이드, 하나 이상의 오가노이드, 세포 클러스터 또는 세포 응집체를 지원하거나 생성하는 현탁 또는 3D 조건 하에 배양된다.
기계적 파괴/점막절제술은 점막층을 제거하는 다양한 가능한 절차 및 도구로 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 층은 박리된다. 세포벽을 전단 개방하기 위한 소형 비드의 사용, 세포벽을 파괴하기 위한 초음파 처리의 사용, 막자사발과 막자에 의한 분쇄의 사용, 블렌드의 사용, 동결 및 해동 주기의 사용, 세포벽 내의 결합을 파괴하고 단백질을 변성시키기 위한 마이크로파의 사용 또는 고압의 사용 등과 같은, 세포층을 기계적으로 파괴하는 다양한 방법이 공지되어 있다.
하나 이상의 BGSC 또는 BGSC를 포함하는 세포 집단을 단리하는 방법의 일부 실시형태에서, 제거 또는 용해 단계는 레시틴, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(폴리소르베이트 20), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(폴리소르베이트 80), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트(폴리소르베이트 40), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트(폴리소르베이트 60), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리스테아레이트(폴리소르베이트 65), 암모늄 포스파티드, 지방산의 나트륨, 칼륨 및 칼슘 염, 지방산의 마그네슘 염, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 아세트산 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 락트산 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 시트르산 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 모노아세틸 및 다아세틸 타르타르산 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 혼합 아세트산 및 타르타르산 에스테르, 지방산의 수크로스 에스테르, 수크로글리세라이드, 지방산의 폴리글리세롤 에스테르, 폴리글리세롤 폴리리시놀레이트, 지방산의 프로판-1,2-디올 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드와 상호작용한 열 산화된 대두유, 나트륨 스테아로일-2-락틸레이트, 칼슘 스테아로일-2-락틸레이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 트리스테아레이트, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노올레이트 및 소르비탄 모노팔미테이트를 포함하는 군으로부터 선택된 유화제의 사용을 포함하는 화학적 파괴에 의해 수행된다.
하나 이상의 BGSC를 단리하는 방법의 일부 실시형태에서, 제거 또는 용해 단계는 1-헵탄설폰산; N-라우릴사르코신, 라우릴 설페이트, 1-옥탄 설폰산 및 타우로콜산, 벤잘코늄 클로라이드, 세틸피리디늄, 메틸벤제토늄 클로라이드, 데카메토늄 브로마이드, 알킬 베타인, 알킬 아미도알킬 베타인, N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, 포스파티딜콜린, N-데실 A-D-글루코피라노시드, N-데실 A-D-말토피라노시드, N-도데실 B-D-말토시드, N-옥틸 B-D-글루코피라노시드, N-테트라데실 B-D-말토시드, 트리톤(트리톤 X-100), 노니데트-P-40, 폴록사머 188, 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 데옥시콜레이트 및 나트륨 도데실 설페이트를 포함하는 군으로부터 선택된 세제의 사용을 포함하는 화학적 파괴에 의해 수행된다.
일 측면에서, 본 개시내용은
(a) 점막층을, 점막층의 세포에 삼투성 쇼크를 유도하는 조건 하에, 생리학적 범위를 벗어나는 삼투질 농도 특성을 갖는 용액과 접촉시키는 단계;
(b) 점막층 또는 이의 세포의 적어도 일부분을 기계적, 외과적 및/또는 화학적 방법에 의해 제거하거나 용해시켜, 점막하층을 포함할 수 있는 나머지를 남기고/거나 노출시키는 단계;
(c) 나머지를 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물을 실질적으로 사멸, 불활성화 또는 제거하기 위한 매질 또는 용액과 접촉시키는 단계;
(d) 나머지를 분해 또는 해리시켜 세포 현탁액을 제공하는 단계;
(e) 임의로, 분해 또는 해리된 세포 또는 조직 물질로부터의 세포의 적어도 일부를 배양하는 단계; 및
(f) 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 세포 집단을 단리하는 단계
를 포함하는, 하나 이상의 BGSC 또는 BGSC를 포함하는 세포 집단을 대상체의 십이지장으로부터 취한 조직 샘플로부터 단리하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 점액은, 점막층을 점막층의 세포에 삼투성 쇼크를 유도하는 조건 하에 생리학적 범위를 벗어나는 삼투질 농도 특성을 갖는 용액과 접촉시키기 전에 조직 또는 조직 부분 또는 샘플로부터 제거된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은
(a) 십이지장, 이의 일부분 또는 이로부터 취한 샘플을 분해 또는 해리시켜 분해 또는 해리된 세포 물질을 제공하는 단계;
(b) 상기 분해 또는 해리된 세포 물질로부터: (i) Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44 및 CK19 중 하나 이상을 발현하는 세포, 또는 세포의 적어도 일부, 상당 부분 또는 대다수가 Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44 및 CK19 중 하나 이상을 발현하는 세포 집단; 및/또는 (ii) SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하는 세포, 또는 세포의 적어도 일부, 상당 부분 또는 대다수가 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하는 세포 집단을 수득하는 단계
를 포함하는, 십이지장, 이의 일부분 또는 이로부터 취한 샘플로부터 BGSC를 단리하는 방법에 관한 것이다.
BGSC 또는 BGSC 집단을 단리하는 방법의 일부 실시형태에서, 십이지장, 이의 일부분 또는 이로부터 취한 샘플, 나머지 및/또는 분해 또는 해리된 세포 또는 조직 물질 또는 이들의 조합은 소독제 또는 살균 매질, 용액 또는 제제(들)과 접촉된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "소독제"는 세균, 바이러스 및 진균과 같은 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물을 파괴하는 모든 매질, 용액 또는 제제를 포함하고 또한 세균 또는 진균 포자를 사멸할 수 있는 매질, 용액 또는 제제를 포함하는 것으로 고려된다. 일부 실시형태에서, 소독제는 차아염소산염 용액이다. 일부 실시형태에서, 소독제는 약 0.01% 내지 약 0.1% 차아염소산나트륨, 또는 약 0.1% 내지 약 0.2% 차아염소산나트륨을 함유하는 용액이다. 일부 실시형태에서, 소독제는 0.01% 차아염소산나트륨 용액, 0.02% 차아염소산나트륨 용액, 0.05% 차아염소산나트륨 용액, 0.1% 차아염소산나트륨 용액, 0.15% 차아염소산나트륨 용액 또는 0.2% 차아염소산나트륨 용액이다. 바람직한 실시형태에서, 소독제는 0.05% 차아염소산나트륨 용액이다.
대안적으로, 일부 실시형태에서, 소독제는 알코올, 수산화나트륨, 알데히드, 산화제, 퍼옥시 및 퍼옥소산, 페놀릭(phenolics), 4급 암모늄 화합물, 무기 화합물(예컨대, 염소, 요오드, 산 및 염기, 금속) 또는 테르펜 등을 포함하는 군으로부터 선택된 매질, 용액 또는 제제일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 소독제는 또한 페니실린, 폴리믹신, 리파마이신, 리피아마이신, 퀴놀론 또는 설폰아미드 등과 같은 항생제를 포함한다.
십이지장, 이의 일부분 또는 이로부터 취한 샘플을 소독제 또는 살균 매질, 용액 또는 제제와 접촉시키면, BGSC를 포함하는 수득된 세포 집단의 BGSC에는 실질적으로 병원체가 없고/없거나 병원성 및/또는 유익한 미생물이 없다는 것이 본 개시내용의 발견이다. 생물학 분야의 통상의 기술자는, 설사 있다고 하더라도, 생물학적 및 화학적 현상이 완료되고/되거나 완전성으로 진행하거나 절대적인 결과를 달성하거나 회피하는 경우는 드물다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 용어 "실질적으로"는 본원에서 많은 생물학적 및 화학적 현상에 내재된 완전성의 잠재적 부족을 담아내기 위해 사용된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 용어 "실질적으로 병원체가 없고/거나 병원성 및/또는 유익한 미생물이 없는"은 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물의 존재가 원하는 용도를 위해 허용될 수 있거나 BGSC 또는 BGSC를 포함하는 세포 집단의 원하는 용도를 방해하지 않을 수 있는 수준 또는 일반적으로 공지된 방법에 의해 결정시 관심대상의 샘플에서 검출될 수 없는 수준에 있는 상황을 지칭할 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 그람+, 그람-, 호기성 및 혐기성 세균, 마이코플라스마에 대한 표준 멸균성 시험 및 내독소 시험을 포함한다. 이는 본 개시내용의 방법에 따른, 조직, 조직 부분 또는 샘플로부터 수득된 BGSC 이외의 세포 또는 세포 집단과 관련하여 용어 "실질적으로 병원체가 없고/없거나 병원성 및/또는 유익한 미생물이 없는"에도 동일하게 적용된다.
따라서, 본 개시내용의 조성물은 마커 Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19 중 하나 이상 및 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하는, 실질적으로 병원체가 없고/없거나 병원성 및/또는 유익한 미생물이 없는 BGSC 또는 BGSC를 포함하는 세포 집단을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 또한 단리된 BGSC 또는 다른 다분화능 세포, 또는 이러한 세포들을 포함하는 세포 집단을 생리학적으로 허용되는 매질과 조합하여 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생리학적으로 허용되는 매질"은 인간 환자와 같은 대상체에게 투여하기 위한 약학적 조성물을 제형화하기 위해 통상적인 약제 관행에서 사용되는 임의의 매질을 지칭한다. 생리학적으로 허용되는 매질은 글루코스, 및 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨과 같은 탄수화물; 단백질; 폴리펩티드 또는 글리신과 같은 아미노산; 항산화제; 비타민, EDTA와 같은 킬레이트제 또는 글루타티온; 보조제(예를 들어, 수산화알루미늄); 및 보존제와 같은 기타 보충제를 함유하는 생리 식염수 또는 등장성 용액을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 BGSC 또는 BGSC를 포함하는 세포 집단을 대상체의 순환으로 또는 표적 장기 또는 조직에 직접 주사하기 위해 제형화될 수 있다.
따라서, 본 개시내용은 Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19 중 하나 이상 및 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하는, 실질적으로 병원체가 없고/거나 병원성 및/또는 유익한 미생물이 없는 BGSC 또는 BGSC를 포함하는 집단 및 생리학적으로 허용되는 매질을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
단리된 브루너샘 줄기/전구 세포(BGSC)의 사용 방법
본원에 개시된 BGSC 및/또는 BGSC를 포함하는 세포 집단은 의학적 치료에 사용하기 위해 고려된다.
예를 들어, 본 개시내용은 유효량의 BGSC 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 간, 췌장, 위, 십이지장, 소장, 대장, 직장 및/또는 다른 내배엽 조직과 관련되거나 이에 영향을 미치는 질환 또는 병태로 진단된 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9 및 CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 및 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하는 BGSC의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수를 포함하는 세포 집단의 유효량의 투여를 포함하는, 간, 췌장, 위, 십이지장, 소장, 대장, 직장 및/또는 다른 내배엽 조직과 관련되거나 이에 영향을 미치는 질환 또는 병태로 진단된 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9 및 CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 및 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하고 자가 재생을 지원하는 배양 조건 하에 제한적 또는 최소 분화로 증식할 수 있는 것으로 추가로 특징지어지는 유효한 수의 BGSC, 또는 이러한 BGSC의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수를 포함하는 세포 집단의 투여를 포함하는 자가 세포 또는 유전자 요법의 방법에 관한 것이다. 자가 세포 또는 유전자 요법의 방법의 일부 실시형태에서, 세포는 유전자 조작되거나 변형된 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9 및 CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19 및 SOX17과 PDX1 둘다로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하고 자가 재생을 지원하는 배양 조건 하에 제한적 또는 최소 분화로 증식할 수 있는 것으로 추가로 특징지어지는 유효한 수의 BGSC 또는 이러한 BGSC의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수를 포함하는 세포 집단의 투여를 포함하는 동종이계 세포 또는 유전자 요법의 방법에 관한 것이다. 동종이계 세포 또는 유전자 요법의 방법의 일부 실시형태에서, 세포는 유전자 조작되거나 변형된 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 간, 췌장, 위, 십이지장, 소장, 대장, 직장 및/또는 기타 내배엽 조직과 관련되거나 이에 영향을 미치는 질환 또는 병태의 치료를 위한 및/또는 자가 또는 동종이계 세포 또는 유전자 요법을 위한, Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9 및 CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19 및 SOX17과 PDX1 둘다로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하고 자가 재생을 지원하는 배양 조건 하에 제한적 또는 최소 분화로 증식할 수 있는 것으로 추가로 특징지어지는 BGSC의 용도에 관한 것이며, 여기서 임의로 세포는 유전자 조작되거나 변형되었다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 간, 췌장, 위, 십이지장, 소장, 대장, 직장 및/또는 기타 내배엽 조직과 관련되거나 이에 영향을 미치는 질환 또는 병태의 치료를 위한 및/또는 자가 또는 동종이계 세포 또는 유전자 요법을 위한, Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9 및 CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19 및 SOX17과 PDX1 둘다로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하는 BGSC의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수를 포함하는 세포 집단의 용도에 관한 것이며, 여기서 임의로 세포는 유전자 조작되거나 변형되었다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 대상체에서 질환의 "치료하는" 또는 "치료"는, 검출 가능한지 불가능한지 여부에 관계 없이, (1) 질환의 증상을 아직 나타내지 않거나 제한된 증상을 나타내는 대상체에서 증상 또는 질환이 발생하는 것의 방지; (2) 질환의 억제 또는 질환 발병의 정지; 또는 (3) 질환 또는 질환 증상의 개선 또는 퇴행 유발을 지칭한다. 당업계에서 이해되는 바와 같이, "치료"는 임상 결과를 포함하는 유익하거나 원하는 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 기술의 목적상, 유익하거나 원하는 결과는 하나 이상의 증상의 완화, 개선 또는 중단, 병태(질환을 포함) 정도의 감소, 병태(질환을 포함)의 안정화된(즉, 악화되지 않음) 상태, 병태(질환을 포함) 진행의 지연 또는 둔화, 병태(질환을 포함) 상태의 개선 또는 완화 및 경감(부분적이든 전체이든)을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유효한 양" 또는 "유효량"은 해결하고자 하는 질환 또는 병태를 치료하기에 충분한 양을 지칭한다. 유효량은 1회 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있다. 이러한 전달은 개별 투여 단위가 사용되는 기간, 조성물의 생체이용률, 투여 경로 등을 포함하는 수많은 변수에 의존한다. 그러나, 임의의 특정 환자에 대한 조성물의 구체적 양은 사용되는 특정 제제의 활성, 환자의 연령, 체중, 전반적 건강, 동반이환, 성별 및 식이, 투여 시간, 대사율 및/또는 배설률, 조성물 조합, 치료하고자 하는 특정 질환 또는 병태(예를 들어, 간 질환)의 중증도 및 투여 형태를 포함하는 다양한 요인에 의존할 수 있다.
본 개시내용을 수행하는 방식
본원의 본 개시내용은, i) 인간 및/또는 동물 십이지장은 다능성 또는 다분화능 마커 및 줄기 세포 또는 "줄기세포능(stemness)"의 다른 바이오마커에 대해 양성인 내배엽 줄기/전구 세포의 표현형 형질을 가진, 본원에서 브루너샘 줄기/전구 세포(BGSC)로 지칭되는 브루너샘 내의 세포를 함유하고; ii) 이들 세포는 Tra-1-60, Tral-81, OCT4 및 CK7 발현을 포함하나 이에 한정되지 않는, 장점막 음와 내의 장 줄기 세포의 표현형과 구별되는 표현형을 갖고; iii) 이들 세포는 또한, BGSC가 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현할 수 있기 때문에, 간 줄기 세포(SOX17을 발현하지만 PDX1은 발현하지 않음) 및 췌장 줄기 세포(PDX1을 발현하지만 SOX17은 발현하지 않음)의 표현형과 구별되는 표현형을 가지고; iv) BGSC는 점막 상피 세포(융모 및 음와)를 적어도 부분적으로 파괴하지만 점막하층은 적어도 부분적으로 유지시키는 화학적, 기계적 및/또는 외과적 절차 또는 방법에 의해 단리될 수 있고; v) 자가 재생 특성, 스페로이드, 오가노이드, 세포 응집체 또는 세포 클러스터로서 형성되고 성장하는 능력을 나타내고 다분화능을 나타내는 BGSC는 시험관내에서 선택될 수 있고; vi) 생체내에서, BGSC는 조직에 이식되어 이러한 조직과 관련된 계통으로 분화할 수 있으며, 예를 들어 SCID 마우스의 간에 이식되어 성숙한 간세포로 분화할 수 있음을 입증한다.
브루너샘은 십이지장의 점막하층에 위치한 독특한 점액샘이다. 상기 샘은 위에서도 발견되지 않고 위 또는 소장의 다른 부분(즉, 공장 및 회장)이나 대장에서도 발견되지 않았다. 이들의 공지된 주요 기능은 위로부터 나오는 물질의 산성으로부터 십이지장 점막을 보호하는 점액 생성에 있다. 브루너샘의 개수는 날문 구멍에서 십이지장공장 굴곡쪽으로 갈수록 점진적으로 감소하여 하단 십이지장 부분과 상행 십이지장 부분에서는 거의 소멸된다. 십이지장 벽에서, 브루너샘은 점막근판에 의해 장 음와(또는 샘)로부터 분되어 있지만, 이들과 직접적인 해부학적 연속성이 있다. 장 음와는 음와-대-융모 축을 따른 장 상피의 지속적인 재생에 관여하는 특정 줄기 세포 집단을 함유한다.
본원에 제공된 데이터는, 점액 세포 외에도, 브루너샘이 SOX9, Lgr5, EpCAM, CD44 및/또는 SOX17과 PDX1 둘 다와 같은 줄기 세포 마커의 특정 성상 (constellation)을 발현하는 세포 집단을 보유하고 있음을 입증한다. 이들 세포는 작고 세포질이 거의 없고 핵 대 세포질 비가 높으며, 이들의 표현형은 배아의 복부 내배엽 프로파일과 양립할 수 있다. 더욱이, 이들 세포의 제한된 하위집단(거의 5%)은 Oct4A, SOX2, Tra-1-60 및 Tra-1-81과 같은 다능성의 마커를 발현한다. 또한, BGSC는 증식 마커 PCNA의 발현을 보여주고, 따라서 이는 아마도 뮤신-생산 세포의 재생과 연루될 수 있는 복제 활성을 가리킨다. 흥미롭게도, 줄기 세포 마커의 발현은 정확하게 분포되어 있었다: 다능성 마커는 더 깊은 샘꽈리에 위치한 세포에서 발현된 반면, Lgr5 및 PCNA는 점막근판 근처에 있고 장 음와와 연속성이 있는 세포에서 발현되었다. 이러한 분포는 상이하지만 중복되는 2가지 BGSC 집단의 존재를 시사한다: 한 집단은 원시 표현형을 갖고 휴지 상태이고 점막하 조직 내의 심부에 위치하고; 다른 하나는 전이-증폭(transit-amplifying) 특징을 나타내고 점막근판을 가로지르고 장 음와와 공간적으로 연관된다. 그러나, "휴지" BGSC 집단과 전이-증폭 BGSC 집단은 둘 다 장 음와의 세포의 표현형(Lgr5+/CK7-/Ck19+/Tra-1-60-)과 명백히 구별되는 표현형(Lgr5+/-/CK7 + /Ck19+/Tra-1-60 + )을 보여주었다.
본원에 개시된 측면은 표면 상피를 적어도 부분적으로 제거하여 점막하층을 노출시킬 수 있는 나머지를 남기는 점막층의 화학적, 기계적 또는 외과적 파괴; 점막하층의 분해 또는 해리; 본 개시내용에 기재된 마커를 발현하는 세포, 또는 이러한 세포를 포함하는 세포 집단의 단리를 포함하는, BGSC, 또는 BGSC의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수를 갖는 집단을 인간 십이지장으로부터 단리하기 위해 개발된 접근법에 관한 것이다; 이러한 방법은 무혈청 쿠보타 배지에서 유지되는 스페로이드, 오가노이드, 세포 응집체 또는 세포 클러스터의 배양과 같은 배양 선택 조건을 포함할 수 있다. 일단 단리되면, 세포는 시험관내에서 장기 내의 설명된 표현형(예를 들어, Lgr5+/-/CK7 +/CK19+/Tra-1-60 + /다능성 유전자+)과 일치하였으며, 이는 세포 제제로부터 장 줄기 세포가 고갈?瑛습? 확인시켜 준다. 시험관내에서, BGSC는 스페로이드, 오가노이드, 세포 응집체 또는 세포 클러스터로서 성장할 수 있었고 성숙한 세포 마커의 발현이 없고 뮤신 생산의 증거가 없이 미분화 표현형을 유지할 수 있었다. 놀랍게도, BGSC는 특정 분화 조건으로 옮겨질 때 적어도 간세포, 담관세포 및 내분비 췌장 계통을 포함하는 다양한 운명으로 빠르게 성숙할 수 있었다.
흥미롭게도, 이전의 보고서는 인간 위 상피 및 십이지장 세포가 재프로그래밍 없이는 줄기 세포 거동 및 다분화능을 나타내지 않았음을 나타냈다(표를 참조). 반대로, 본원에 개시된 결과는 줄기/전구 세포(BGSC)가 브루너 샘을 포함하는 인간 및 동물 십이지장 내에서 발견된다는 것을 입증한다. 장기 내의 이들의 위치를 고려해 볼 때, 이들 BGSC 또는 이들 BGSC를 포함하는 세포 집단은 본 개시내용에 기재된 방법을 사용하여 쉽게 단리할 수 있고, 재프로그래밍이 필요하지 않지만 본질적으로 내배엽 줄기/전구체 특징, 특성 및 능력을 나타내며 다분화능 특성을 갖는다.
본 연구에서 성숙한 내배엽 운명쪽으로의 분화 능력이 시험되었다. 예를 들어, BGSC는 혈관 경로를 통해 뮤린 간으로 주사되었다.
간 질환 분야에서, 현재 동소 간 이식은 급성 간부전 및 말기 만성 간 질환을 위한 유일한 치유적 치료이다. 간 이식은 장기 공여자의 심각한 부족으로 인해 제한되기 때문에, 세포 요법 전략은 장기 할당을 기다리는 동안 간 기능을 지원하는 실행 가능한 대안을 대표할 수 있다. 그러나, 간 질환에 대한 재생의료 접근법은 지속 가능하고 쉽게 이용할 수 있는 세포 공급원의 동정을 필요로 한다.
본 개시내용은 다분화능 능력을 갖는 신규 줄기 세포 니치 및 출생 후 십이지장으로부터 적용 가능한 세포를 단리하는 절차를 제공한다. 인간 BGSC는 인간 공여자로부터 수득될 수 있는 잠재적으로 쉽게 이용 가능한 공급원을 나타낸다. 상기 세포는 유전적 재프로그래밍 또는 주요 조작을 필요로 하지 않으며 재프로그래밍된 세포에 비해 임상 프로그램에서 더 쉽게 사용할 수 있어야 한다(잠재적으로 더 안전한 접근 방식). 또한, 상기 세포는 내시경검사를 사용하여 회수된 다음, 자가 또는 동종이계 세포 및 유전자 요법에 사용될 수 있는 세포 공급원으로서 고유한 잠재력을 갖는다.
약어
AFP, α-태아단백질; ALB, 알부민; BTSC, 담도계 줄기 세포, CD, 공통 결정 인자; CD44, 히알루로난 수용체; CD133, 프로미닌; CFTR, 낭포성 섬유증 막관통 전도도 조절자; cGMP, 현행 의약품 제조 품질관리 기준(current good manufacturing practices); CK, 사이토케라틴 단백질; CXCR4, CXC-케모카인 수용체 4(푸신 또는 CD 184로도 불림; 혈소판 인자 4로도 불림; DAPI, 6-디아미디노-2-페닐인돌; DPBS, 둘베코 인산염 완충 식염수; EGF, 표피 성장 인자, EpCAM, 상피 세포 부착 분자; FBS, 소 태아 혈청(또는 FCS, 소 태아 혈청); FGF, 섬유아세포 성장 인자(FGF 10은 FGF의 다수의 형태 중 하나이다); HB, 간모세포; HDM, 호르몬 한정 배지; HDM-C, 세포를 담관세포로 계통 제한하기 위해 설계된 HDM; HDM-H, 세포를 간세포로 계통 제한하기 위해 설계된 HDM; HDM-P, 세포를 췌장 운명으로 계통 제한하기 위해 설계된 HDM; HGF, 간세포 성장 인자, HpSC, 간 줄기 세포; IF, 면역형광; IHC, 면역조직화학; KM, 쿠보타 배지, 내배엽 줄기 세포용으로 설계된 무혈청 배지; KRT , 사이토케라틴 유전자, Lgr5, R-스폰딘에 결합하는 류신-풍부 반복부 함유 G-단백질 커플링형 수용체 5; MKM, 칼슘, 구리 및 bFGF가 보충된 쿠보타 배지로 이루어진 변형된 쿠보타 배지; NANOG, 자가 재생과 결정적으로 관련된 전사 인자, NCAM, 신경 세포 부착 분자; NIS, 나트륨/요오드화물 공동수송체; OCT4, (8량체-결합 전사 인자 4), 줄기 세포에 의해 발현되는 유전자인 POU5F1(POU 도메인, 클래스 5, 전사 인자 1)로도 알려짐; PBS, 인산염 완충 식염수; PDX1, 췌장 및 십이지장 호메오박스 1, 췌장 발달에 중요한 전사 인자; PBG, 담도주위 샘, 담도계 줄기 세포를 위한 줄기 세포 니치; RMPI, Roswell Memorial Park Institute - 이 머리글자는 이 연구소의 조사관에 의해 확립된 다양한 기본 배지에 사용된다; RT-PCR, 역전사 폴리머라제 연쇄반응; SALL4, 줄기 세포의 자가 복제를 위해 중요한 것으로 밝혀진 Sal-유사 단백질 4; SOX, Sry-관련 HMG 박스; SOX2, 배아 및 결정된 줄기 세포에서 자가 재생 또는 다능성을 유지하기 위해 필수적인 전사 인자. SOX9, 내배엽 조직(간, 창자, 담도계 및 췌장)과 연관된 전사 인자; SOX17, 간의 분화에 필수적인 전사 인자; VEGF, 혈관 내피 세포 성장 인자.
재료 및 방법
인간 조직 소싱
인간 십이지장은 로마 사피엔자 대학교(이탈리아 로마 소재)의 일반외과 및 장기이식 부서의 파리드 스테파니니(Paride Stefanini)의 장기 공여자로부터 수득되었다. 연구 목적을 위한 조직 사용에 대한 사전 동의서는 본 출원인들의 이식 프로그램으로부터 수득되었다. 프로토콜은 임상연구심의위원회(Institutional Review Board)의 승인을 받았으며, 가공은 현행 의약품 제조 품질관리 기준(cGMP)을 준수하였다. 연구 프로토콜은 로마 움베르토 I 대학교 병원의 윤리위원회에 의해 검토 및 승인되었다.
배지 및 용액
모든 배지를 멸균 여과하고(0.22-㎛ 필터) 사용 전에 4℃에서 암실에서 보관하였다. 모든 세포 배양을 위한 기본 배지인 RPMI-1640 및 소 태아 혈청(FBS)은 GIBCO/Invitrogen(캘리포니아주 칼스바드)로부터 입수하였다. 달리 명시하지 않는 한, 모든 시약은 Sigma(미주리주 세인트 루이스)로부터 입수하였다. 언급된 것들을 제외하고 성장 인자는 R&D Systems(미네소타주 미니애폴리스)로부터 구입하였다.
쿠보타 배지(KM)는 구리 없이, 저 칼슘(0.3mM), 10-9 M 셀레늄, 0.1% 소 혈청 알부민(BSA), 4.5 mM 니코틴아미드, 0.1 nM 황산아연 7수화물, 10-8 M 하이드로코르티손(또는 덱사메타손), 5 ㎍/mL 트랜스페린/Fe, 5 ㎍/mL 인슐린, 10 ㎍/mL 고밀도 지단백질 및 정제된 인간 혈청 알부민에 결합되어 첨가된 유리 지방산의 혼합물로 구성된다. 이의 상세한 제조 프로토콜은 쿠보타 및 레이드(Reid)에 의해 간모세포용 한정 배지로서 최초로 보고되었다2. 쿠보타 배지는 뮤린, 설치류 및 인간 간 줄기 세포, 담도계 줄기 세포, 간모세포, 담낭 유래의 줄기 세포 및 췌장 전구체에 효과적인 것으로 나타났다3-9.
분화 연구를 위해, 무혈청 KM 배지에 칼슘(최종 농도: 0.6 mM), 구리(10-12 M) 및 20 ng/mL bFGF를 보충하고 변형된 쿠보타 배지(MKM)라 지칭하였다. MKM은 췌장섬(HDM-P) 운명과 대비하여 간(HDM-H) 운명쪽으로 BG 세포의 선택적 분화를 유도하는 데 사용된 상이한 호르몬 한정 배지(HDM)들을 제조하기 위해 특정 보충제와 함께 기본 배지로서 사용되었다:
· 간 분화용 HDM-H: MKM에 7 ㎍/L 글루카곤, 2 g/L 갈락토스, 1 nM 트리요오도티록신 3(T3), 10 ng/mL 온코스타틴 M(OSM); 10 ng/mL 표피 성장 인자(EGF), 20 ng/mL 간세포 성장 인자(HGF) 및 1 ㎛ 덱사메타손을 보충하여 제조하였다.
· 췌장섬 세포 분화용 HDM-P: 하이드로코르티손이 없이 2% B27, 0.1 mM 아스코르브산, 0.25 μM 사이클로파민, 1 μM 레티노산이 보충된 MKM; bFGF를 처음 4일 동안 첨가한 다음, 50 ng/mL 엑센딘-4 및 20 ng/mL의 HGF로 교체하였다.
자기(magnetic) 분류 절차
세포를 제조업체(Miltenyi Biotec Inc., 독일)에 의해 지정된 프로토콜에 의해 자기 비드 면역선택을 사용하여 EpCAM 또는 TRA-1-60에 대해 분류하였다. 간략하게 언급하면, 양성 세포를 EpCAM MicroBeads(Miltenyi Biotec Inc., 카탈로그 번호 130-061-101) 또는 TRA-1-60 MicroBeads(Miltenyi Biotec Inc., 카탈로그 번호 130-100-832)로 자기적으로 표지하였다. 이어서, 세포 현탁액을 MACS 분리기의 자기장에 배치된 MACS LS 컬럼(Miltenyi Biotec Inc., 카탈로그 번호 130-042-401)에 로딩하였다. 자기적으로 표지된 세포는 컬럼 내에 보유된 반면, 표지되지 않은 세포는 컬럼을 통과하였다. 자기장으로부터 컬럼을 제거한 후, 자기적으로 보유된 세포는 양성으로 선택된 세포 분획으로서 용출되었다. 양성 세포를 앞서 설명한 바와 같이 세포 계수 및 세포 생존력에 의해 평가하였다. 양성 세포를 ml당 300,000개 세포의 농도로 기본 배지에 현탁하고 최종 세포 현탁액으로서 사용하였다. 약 200,000개의 세포를 포함하는 N. 4 분취량을 유세포계측을 위해 수집하였다.
GMP 조건 하의 세포 단리 및 멸균성 시험
향후 임상 적용을 위해 cGMP 조건에서 BG 줄기/전구 세포를 생산하기 위해, 십이지장을 "유럽연합의 의약품 관리 규칙" 및 인체용 의약품 제조 품질관리 기준의 유럽 지침(EudraLex- 볼륨 4 의약품 제조 품질관리 기준)에 따라 처리하였다. 멸균성 시험은 "집적 접종 방법"에 의해 그리고 인체 및 수의용 의약품 제조 품질관리 기준의 지침에 따라 cGMP 조건 하에 수행하였다.
세포 배양 및 클론 확장
담관 조직 표본으로부터 수득된, 분류되지 않은 세포 및 분류된 세포(약 3 x 105)를 3 cm 직경의 플라스틱 배양 접시에 시딩하고 10% FBS를 함유한 KM에서 밤새(약 12 시간) 유지시켰다. 그 후, 세포 배양물을 무혈청 KM에서 유지시키고 적어도 2개월 동안 관찰하였다. 클론 확장을 시험하기 위해, 단일 세포 현탁액을 수득하고, 세포를 자가 복제 배지인 무혈청 KM에 500개 세포/cm2의 클론 시딩 밀도(clonal seeding density)로 플레이팅하였다.
오가노이드 생성 및 배양
원심분리 후, 세포 펠릿 KM에 현탁시키고, 3×105개 세포를 12웰 2.2 cm 직경의 플라스틱 배양 접시에 위치시키고 10% FBS를 함유한 KM에서 밤새(약 12시간) 유지하였다; 그 후, 배양물에 무혈청 KM을 제공하였다. 세포를 1주 동안 대기 산소와 5% CO2로 37℃에서 항온배양기 내의 KM에서 배양하여 더 많은 세포 집단을 수득할 수 있었다. 7일 후, 세포를 12웰 플레이트로부터 제거하고 세포 펠렛을 400 ㎕의 냉 마트리겔(Matrigel)(Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 페놀 레드-비함유)에 포매시켰다. 출원인들은 12웰 플레이트당 2×105개 세포를 함유하는 400 ㎕의 겔 용적을 시딩하였다. 중합(15분, 37℃) 후, 겔을 500 ㎕의 오가노이드 배양 배지로 덮어씌웠다. 오가노이드 배양 배지는 B27, N2(Life Technologies) 및 1.25 mM N-아세틸시스테인(Sigma-Aldrich), 10 nM 가스트린(Sigma-Aldrich) 및 성장 인자: 50 ng/ml EGF (Peprotech), 1 ㎍/ml 재조합 인간 R-스폰딘-1(Perotech), 100 ng/ml FGF10(Peprotech), 25ng/ml HGF(Peprotech), 10mM 니코틴아미드(Sigma-Aldrich), 5 μM A83-01(Tocris) 및 10 μM 포스콜린(FSK)이 보충된 Ad-DMEM/F12(Life Technologies)에 기반하였다. 출원인들은 2일 내지 3일마다 배지를 교체하여 오가노이드의 크기와 수를 미시적으로 제어하였다.
10일 내지 14일 후, 세포 회수 용액(Corning) 및 빙냉 PBS를 사용하여 마트 리겔로부터 오가노이드를 제거하였다. 배양 겔 중의 오가노이드를 세포 회수 용액(Corning)으로 조심스럽게 파괴하여 마트리겔을 작은 조각으로 분해시키면서, 오가노이드를 전체 구체로서 보존하였다. 이어서, 오가노이드를 조심스럽게 원심분리하여 튜브의 바닥에 수집된 온전한 오가노이드를 수득하였다. 상청액의 대부분을 피펫으로 제거하고 추가 분석을 위해 오가노이드 펠릿을 4% 포르말린으로 고정하였다.
양성 대조군
NTERA-2 클론 D1 다능성 인간 배아 세포주(Sigma Aldrich, 미국 미주리주 세이트 루이스; 코드: 01071221)를 유세포계측, 세포 배양 및 RT-PCR 실험을 위한 다능성 마커(SOX2, OCT4A 및 NANOG)에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다10. 또한, 인간 정상피종 고환의 단편을 다능성 마커에 대한 면역조직화학 실험을 위한 양성 대조군으로서 사용하였다.
인간 결장 선암 세포주인 HT-29(LGC Standards SrL, 이탈리아 밀라노; 코드: ATCC-HTB-38)를 유세포계측 및 RT-PCR 실험을 위한 Lgr5 항체에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다. 정상 췌장섬 세포는 췌장섬 분화 실험을 위한 대조군으로서 사용하였으며 ProdoLab(미국 캘리포니아주 어바인)(HIR-001)에서 구입하였다.
1차 인간 간세포(Clonetics™ Human Hepatocyte Cell Systems NHEPS™ Cells, 코드: CC-2591 S)는 Lonza(스위스 바젤)에서 상업적으로 구입하였으며 간세포 분화 실험을 위한 양성 대조군으로서 사용하였다.
정상 췌장섬 세포는 췌장섬 분화 실험을 위한 대조군으로서 사용하였으며 ProdoLab(미국 캘리포니아주 어바인)(HIR-001)에서 구입하였다.
광학현미경(LM), 면역조직화학(IHC) 및 면역형광(IF)
표본을 2시간 내지 4시간 동안 10% 완충된 포르말린에 고정시키고 저온 융합 파라핀(55 내지 57℃)에 포매시키고, 3 내지 4 ㎛ 절편을 표준 프로토콜에 따라 헤마톡실린-에오신 및 시리우스 레드/패스트 그린으로 염색하였다. IHC를 위해, 내인성 퍼옥시다제 활성을 메탄올성 과산화수소(2.5%)에서 30분 동안 항온배양하여 차단하였다. 판매업체에 의해 지시된 바와 같이, 실온에서 10분 동안 프로테이나제 K(Dako, 코드 Sol3020)를 적용함으로써 항원을 회수하였다. 이어서, 절편을 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 항온배양하였다(보충 표 1). 샘플을 5분 동안 PBS로 2회 세정하고, 2차 비오틴화 항체(LSAB+ System-HRP, Dako, 코드 K0690; 덴마크 글로스트럽)에 이어서 스트렙타비딘-HRP(LSAB+ System-HRP, Dako, 코드 K0690)와 함께 실온에서 20분 동안 항온배양하였다. 디아미노벤지딘(Dako)을 기질로서 사용하고, 절편을 헤마톡실린으로 대조염색하였다. 세포 배양물에서의 면역형광을 위해, 슬라이드 챔버를 실온에서 10분 동안 아세톤에 고정시킨 다음, PBS-Tween 20으로 세정하였다. 비특이적 단백질 결합을 5% 정상 염소 혈청에 의해 차단하였다. 고정된 세포를 1차 항체와 함께 항온배양하였다. 이어서, 세포를 세척하고 표지된 이소타입-특이적 2차 항체(항-마우스 AlexaFluor-546, 항-마우스 Alexafluor-488, 항-토끼 Alexafluor-488, 항-염소 AlexaFluor-546, Invitrogen, Life Technologies Ltd, 영국 페이즐리)와 함께 1시간 동안 항온배양하고 세포 핵의 가시화를 위해 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 대조염색하였다. 모든 면역반응에 대해, 음성 대조군도 포함되었으며 1차 항체를 면역전 혈청으로 대체하는 것으로 이루어졌다. 절편/배양물을 Jenoptik Prog Res C1O Plus 비디오캠(독일 제나)이 장착된 Leica Microsystems DM 4500 B 광학 및 형광 현미경(독일 웰츨라)에 의해 코드화 방식으로 검사하였다. IF 염색을 또한 공초점 현미경(Leica TSC-SP2)에 의해 분석하였다. LM, IHC 및 IF 관찰은 이미지 분석 시스템(IAS-Delta Sistemi, 이탈리아 로마)으로 처리되었으며, 2명의 연구원에 의해 맹검 방식으로 독립적으로 수행되었다.
BG가 차지하는 면적을 이미지 분석 시스템(IAS-Delta Sistemi, 이탈리아 로마)에 의해 평가하였다. 이를 사용하여, 출원인들은 BG가 차지하는 용적을 샘꽈리가 차지하는 총 면적으로서 계산하고 전체 십이지장 점막하 조직에 대한 백분율로서 표현하기로 결정하였다. 모든 계수는 각 슬라이드에 대해 6곳의 비중첩 시야(배율x20)에서 수행하였다; 각 표본으로부터 적어도 3개의 상이한 슬라이드를 취하였다.
IHC/IF 염색의 경우, 양성 세포의 수를 각 슬라이드/배양에 대해 6곳의 비중첩 시야(배율 x20)에서 맹검 방식으로 무작위로 계수하였고, 데이터를 양성 세포%로서 표현하였다. IF 염색을 또한 디지털 스캐너(AperioScanscope FL System, Aperio Technologies, Inc, 영국 옥스포드)에 의해 스캔하고 ImageScope에 의해 처리하였다. 이미지 분석 알고리즘을 사용하여 단일 형광단에 대한 양의 픽셀 영역의 비율 또는 두 형광단의 공동국소화를 갖는 영역을 정량하였다. 글리코겐 저장 능력을 시험하기 위해, 과요오드산-쉬프(PAS) 염색 시스템(Sigma Aldrich, INC, 카탈로그 번호 395) 및 α-아밀라제(Sigma Aldrich, INC, 카탈로그 번호 A 3176) 분해 절차(이어서 PAS 염색)를 제조업체의 절차에 따라 사용하였다.
유세포계측(FC) 분석
배양물의 세포를 트립신 처리하고, 조심스럽게 피펫팅하여 해리시키고, PBS에 약 2 x 105 세포/ml로 현탁하였다. 단리된 세포를 형광성 1차 항체 또는 이소타입 대조군으로 표지하였다. 세포내 항원의 경우, 세포를 1차 항체와 함께 항온배양하기 전에 4% 파라포름알데히드에 고정시키고 PBS-사포닌 0.5%-FCS 10%로 투과화하였다. 1차 항체로는 EpCAM(EpCAM-FITC, MiltenyiBiotec Inc., 카탈로그 번호 130-080-301), Lgr5(Lgr5-PE, Origene Technologies Inc., 미국 메릴랜드주 락빌 카탈로그 번호 TA400001), TRA-1-60(TRA-1-60-PE, MiltenyiBiotec Inc., 카탈로그 번호 130-100-347)가 포함되었다. 세포는 BD FACScanto™ 유세포계측기(Becton, Dickinson and Company, 미국 뉴저지주)로 분석하였다. BD FACSDiva™ 소프트웨어(Becton, Dickinson and Company, 미국 뉴저지주)에 의해 10,000건의 이벤트를 획득하고 분석하였다.
역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-qPCR) 분석
RNA 추출을 무혈청 KM에서 6일 동안 유지된 조직 또는 배양물에서 수행한 다음, KM 또는 HDM 중 하나에서 추가로 7일 항온배양(총 13일)하였다. 총 RNA를 Chomczynski와 Sacchi의 절차에 의해 추출하였다11. RNA 품질 및 양은 이미 설명된 바와 같은 RNA StSens 분석 칩(Bio-Rad Laboratories, 미국 캘리포니아주 허큘리스)이 장착된 Experion Automated Electrophoresis System RNA로 평가하였다. RNA 추출은 무혈청 KM에서 6일 동안 유지되고 KM 또는 HDM 중 하나에서 추가로 7일 항온배양(총 133일)을 거친 배양물에서 수행하였다. 알부민(ALB), 사이토크롬 P450(CYP3A4), 인슐린(INS), 글루카곤(GLUC), PDX-1, SOX17, OCT4A, SOX2 및 NANOG 유전자의 발현은 세포 및 조직으로부터 추출된 총 RNA 샘플에 대해 밀폐된 튜브에서 수행된 역전사 및 qPCR 증폭(독일 함부르크 소재의 Qiagen에 의한 OneStep RT-qPCR)에 의해 실시하였다. 이들 유전자를 참조로서 사용된 GAPDH 하우스키핑 유전자와 함께 공동증폭시켰다. 유전자 발현은 Experion System(Bio-Rad, UK)으로 수행된 온칩(on-chip) 모세관 미세전기영동으로 앰플리콘을 정량하여 측정하였다. 관심대상의 유전자의 발현은 관심대상의 유전자와 참조 유전자 GAPDH의 농도 비에 의해 계산하였다(기기에 의해 nmol/L로 보고됨)(보충 표 2).
정상 마우스의 간으로의 BGSC의 생체내 이식
5마리의 SCID(중증 복합 면역결핍증) 수컷 마우스를 22℃의 평균 항온의 방에서 12시간 명암 주기로 사육하고 표준 펠렛 차우와 물에 자유롭게 접근할 수 있게 하였다. 연구 프로토콜은 로마 사피엔자 대학교 및 로마 움베르토 I 대학교 병원(Prot.#: 541)의 EU 지시 문서 2010/63/EU의 동물 시험에 관한 윤리위원회에 의해 승인되었다. 100 μl 식염수 중의 2×106의 인간 BGSC의 현탁액을 비장동맥을 경유해 간에 주사하였다. 샴(sham) 대조군 마우스에게는 100 μl 식염수만을 주입하였다. 모든 동물을 회복할 때까지 면밀히 모니터링하고, 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있게 하였다. 사망률은 관찰되지 않았다.
이식 1개월 후에, 동물을 희생시키고 이들의 간을 수거하였다. 간 단편을 조직학 및 면역조직화학을 위해 10% 완충된 포르말린에 넣고, 유전자 분석을 위해 트리졸 시약에 넣었다. 괴사 및 섬유증을 각각 헤마톡실린과 에오신(H&E) 및 시리우스 레드 염색으로 평가하였다.
뮤린 간에서의 인간 BGSC 생착 및 이들의 분화를 다른 곳에 설명된 바와 같이 마우스 항원과 반응하지 않는 항-인간 항체(항-인간 미토콘드리아, 항-인간 HepPar-1, 항-인간 알부민)에 대한 면역조직화학에 의해 평가하였다. 면역조직화학 염색된(항-인간 미토콘드리아) 슬라이드를 디지털 스캐너(AperioScanscope CS System, Aperio Technologies, Inc, 영국 옥스포드)에 의해 스캔하고 ImageScope에 의해 처리하였다. 이미지 분석 알고리즘을 사용하여 항-인간 미토콘드리아-양성 세포가 차지하는 면적의 비율을 정량하였다.
마우스에서 인간 알부민에 대한 RT-PCR은 이전에 설명한 바와 같이 수행하였다. 간략히 언급하면, 인간 알부민에 대한 특이적 프라이머(보충 표 2)를, Universal Probe Library Assay Design Center(Roche)를 사용하여, 뮤린 유전자로부터 인간 알부민 유전자를 특이적으로 구별하기 위한 프로그램 가능한 특이적 서열로서 설계하였다.
통계 분석
데이터는 평균±표준편차(SD)로서 표현하였다. 통계 분석은 SPSS 통계 소프트웨어(SPSS Inc. 미국 일리노이주 시카고)에 의해 수행하였다. 비정규 분포 파라미터에 대한 군들 간의 차이는 만-위트니 U 검정(Mann-Whitney U test)에 의해 검정하였다. 통계적 유의성은 p-값 <0.05로 설정하였다.
실시예 1 - 점막으로부터 세포 단리
간-췌장 팽대부와 췌장을 포함하는 인간 십이지장은 로마 사피엔자 대학교(이탈리아 로마 소재)의 일반외과 및 장기이식 부서의 파리드 스테파니니의 장기 공여자로부터 수득하였다. 연구 목적을 위한 조직 사용에 대한 사전 동의서는 본 출원인들의 이식 프로그램으로부터 수득하였다. 모든 샘플은 19세 내지 73세의 성인으로부터 유래한 것이었다. 프로토콜은 임상연구심의위원회의 승인을 받았으며, 가공은 현행 의약품 제조 품질관리 기준(cGMP)을 준수하였다. 연구 프로토콜은 로마 움베르토 I 대학교 병원의 윤리위원회에 의해 검토 및 승인되었다. 인간의 십이지장을 췌장으로부터 조심스럽게 분리하고 간-췌장 팽대부를 함유하는 장을 외과적으로 제거하였다. 십이지장을 메스를 사용하여 조각으로 절단하였다. 그 후, 조직 표본을 이전에 설명한 바와 같이 가공하였다. 간단히 언급하면, 조직을 30분 내지 45분 동안 빈번하게 교반하면서 37℃에서 0.1% 소 혈청 알부민, 1 nM 셀레늄, 항생제, I형 콜라게나제(300 콜라겐 분해 단위/ml)(Sigma-Aldrich Italy), 0.3 mg/ml 데옥시-리보뉴클레아제(Sigma Aldrich, 이탈리아)가 보충된 RPMI 1640에서 분해시켰다. 현탁액을 800 미크론 금속 메쉬 필터(IDEALE ACLRI9 inox 스테인리스 스틸)를 통해 여과하고, 재현탁하기 전에 270g에서 10분 동안 회전시켰다. 그 후, 세포 현탁액을 100 미크론 메쉬 필터 및 30 미크론 메쉬 필터를 통해 연속적으로 통과시켰다; 이어서, Fast-Read 102(Biosigma Srl, 이탈리아 베니스)에 의해 세포 계수를 수행하고 트립판 블루 분석(총 세포에 대한 생존 세포의 %로서 표현)에 의해 세포 생존력을 시험하였다. 이전에 개발되었고 간과 담도계에 대해 성공적으로 사용된 동일한 방법은, 인간의 십이지장에서 대신 사용될 때, 거대 응집체의 생성을 초래하였다. 이러한 거대 응집체는 코팅되고 분쇄된 세포를 함유하였으며, 이는 비-생존성의 단리된 세포를 지속적으로(N=10)을 야기하여 세포 배양물을 수득하는 것을 불가능하게 만들었다. 이것은 점막 상피 세포에 의해 방출되는 점액과 분해 산물로 고도로 포화된 분해된 조직의 물리적 특성과 화학적 특성에 기인하며 이것은 절차 동안에 분쇄되는 일종의 분자 웹 통합 세포를 야기하는 것으로 추측된다. 실제로, 동물 또는 인간에서 확립된 장으로부터 세포를 단리하는 방법은 점막 상피의 파괴를 피한다.
상기 방법에 의해 수득된 배양물의 또 다른 특징은 빈번한 오염(6/10)이었다. 이러한 결과들로 인해, 브루너샘을 유지하고 상기 설명한 미생물 오염 문제를 피하기 위해 점막 상피를 점막하 조직으로부터 분리하는 전략이 채택되었다. 4가지 상이한 전략: 1) 외과적 해부(N=3), 2) 점막 아래에 생리 식염수를 사전 주사하는 것에 의한 점막절제술(N=3), 3) 점막 찰과(N=3), 4) 점막의 선택적 가용화(N=10)가 시도되었다. 모든 방법은 장 루멘에 주사된 특정 세제 용액에 의한 십이지장 점막의 선택적 가용화를 제외하고는 초기 방법과 동일하고 비논리적인 결과를 산출하였다.
실패한 차선의 단리 절차
인간의 십이지장을 췌장으로부터 조심스럽게 분리하고 간-췌장 팽대부를 포함하는 장의 전체 부분을 외과적으로 제거하였다. 십이지장을 메스를 사용하여 조각으로 절단하였다. 그 후, 조직 표본을 30분 내지 45분 동안 빈번하게 교반하면서 37℃에서 0.1% 소 혈청 알부민, 1 nM 셀레늄, 항생제, I형 콜라게나제(300 콜라겐 분해 단위/ml)(Sigma-Aldrich Italy), 0.3 mg/ml 데옥시-리보뉴클레아제(Sigma Aldrich, 이탈리아)가 보충된 RPMI 1640에서 분해시켰다. 현탁액을 800 미크론 금속 메쉬 필터(IDEALE ACLRI9 inox 스테인리스 스틸)를 통해 여과하고, 재현탁하기 전에 270g에서 10분 동안 회전시켰다. 그 후, 세포 현탁액을 100 미크론 메쉬 필터 및 30 미크론 메쉬 필터를 통해 연속적으로 통과시켰다; 이어서, Fast-Read 102(Biosigma Srl, 이탈리아 베니스)에 의해 세포 계수를 수행하고 트립판 블루 분석(총 세포에 대한 생존 세포의 %로서 표현)에 의해 세포 생존력을 수행하였다.
이전에 개발되었고 간과 담도계에 대해 성공적으로 사용된 동일한 방법은, 인간의 십이지장(N=5)에서 사용될 때, 40,816,000개(표준편차) 세포를 단리하였으며, 트립판 블루 분석에 의하면 이중 절반만이 생존성이었다(생존력 43+/- 12.8%). 생존 세포의 수와 관계 없이, 단리된 세포는 배양물에서 부착하고 생존할 수 없었고, 여기서 코팅되고 분쇄된 세포를 함유하는 거대 응집체가 출현하였고 세포 사멸로 이어져 세포 배양물을 수득할 수 없게 되었다. 또한, 이러한 방법에 의해 수득된 배양물은 항상 세균에 의해 오염되었다(5/5).
이러한 실패한 결과는 점막 상피 세포에 의해 방출되는 분해 산물과 점액으로 고도로 포화된 분해된 조직의 물리적 특성과 화학적 특성으로 인한 것일 수 있으며, 이는 점막 파편 내에 세포가 포획되어 절차 동안 분쇄되게 한다.
또 다른 중요한 점은 점막층 내의 장 줄기 세포 니치(장 음와)의 존재였다. 이러한 조사결과들을 고려하여, 본 출원인들은 점막하 조직으로부터 점막 상피를 분리하기로 결정하였다. 이것들은 4가지의 상이한 전략: 1) 외과적 해부(N=3), 2) 점막 아래에 생리 식염수를 주사한 후의 점막절제술(N=3), 3) 점막 찰과(N=3), 4) 점막층의 선택적 가용화(N=10)에 의해 실행되었다. 점막 제거 측면에서 최상의 전략은 전략 4번이었는데, 전략 1번 내지 4번은 장 음와의 존재로 인해 점막층을 부분적으로 제거하였기 때문이다(도 11). 또한, 전략 4번은 세포 단리 및 생존력 측면에서 최상의 접근법은 초래하였다.
장 루멘에 주사된 특정 세제 용액에 의한 십이지장 점막의 선택적 가용화 .
췌장 두부 근처의 십이지장을 분리한 후, 바터 팽대부를 완전히 제거하고, 장을 외과용 클램프로 클램핑하여 폐쇄하였다. 십이지장의 말단을 개방하였다; 조직을 위에서부터 아래로 가압하여 하부 절개부로부터 압착시켜 장 점액을 제거하였다. 조직에 가능한 한 점액이 없어야하므로 작업 중 이 부분은 매우 중요하다. 25 ml 혈청학적 피펫을 사용하여, 약 200 ml의 증류수(Gibco, 이탈리아)를 상부 말단 절개부로부터 십이지장으로 플러싱하였다; 하부 말단 절개부는 물을 모으기 위해 클램핑된 상태로 유지하였다(도 8A). 그 후, 점막 상피 세포에 선택적인 삼투성 손상을 유도하기 위해 약 20분 동안 양쪽 말단을 클램핑하여 장을 증류수로 완전히 충전하였다. 이러한 방식으로, 십이지장은 팽창되어 보일 것이다(도 8B). 하부 말단을 개방하여 물을 제거한 후, 25 ml 혈청학적 피펫을 사용하여 100ml의 DPBS(Gibco)로 내부 십이지장을 2회 세척하였다. 25ml 혈청학적 피펫을 사용하여, 약 200ml의 DPBS(이탈리아 깁코)를 상부 말단 절개부로부터 십이지장으로 플러싱하였다. 유사한 절차를 채택하여, 내부 십이지장에 0.5 ml의 포스파티딜콜린(Sigma-Aldrich, 이탈리아), 20 mg 데옥시콜산(Sigma-Aldrich, 이탈리아), 99.5 ml의 DPBS(Gibco, 이탈리아)로 구성된 세제 용액(100ml)으로 충전하고 충전한 상태를 1분 동안 유지하였다. 하부 말단을 개방하여 용액을 다시 제거하고, 내부 십이지장을 100 ml DPBS로 세척하였다. 마지막으로, 십이지장을 10 cm 멸균 페트리 접시로 옮기고 종방향 절개에 의해 개방하였다(도 8C).
점막의 추가 박리는 조직의 작은 주름(접힘)으로부터 점액을 제거하기 위해 세심한 주의를 기울여 상/하 및 횡 방향으로 멸균 메스를 사용하여 수득하였다. 조직을 멸균 용기에서 100ml DPBS(Gibco, 이탈리아)로 세척하였다. 조직을 0.05% 차아염소산나트륨 200ml에 수초 동안 침지시킨 후 DPBS 용액을 이용한 세정을 통해 세척하여 멸균 통로를 수득하였다. 이어서, 조직을 멸균 가위와 메스를 사용하여 작은 조각으로 절단하였다. 점막을 제거하기 위한 기계적 및 화학적 절차 후, 표본을 수집하고 조직형태학적 분석을 위해 가공하였다. 그 후, 조직 표본을 이전에 설명한 바와 같이 가공하였다(도 8D). 간략하게 언급하면, 조직 단편을 분해 완충액으로 충전된 2개의 M 튜브(Milteny Biotec, 독일)에 수집하고 진탕하였다. 조직의 해리 상태에 도달하기 위해, MACS 해리기(Dissociator)(Milteniy Biotec, 독일)의 프로그램의 1 또는 2 사이클을 수행하였다(용액의 불투명도는 매우 작은 조직 조각의 생성과 함께 기록되어야 한다). 분해 완충액을 10분 동안 34℃(효소가 가장 효율적인 온도)로 예열하였다. 기계적 해부 후, 조직 단편을 함유하는 용액을 DTT(Sigma-Aldrich, Italy)를 함유하는 용액(하기 조성의 세부사항을 참고)에 희석시키고 2개의 50ml 팔콘(Falcon) 튜브에 넣었다. 팔콘 튜브를 1,300 rpm(300g)에서 5분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 수집하고 150ml의 분해 완충액의 존재 하에 75cm2 배양 플라스크에 삽입하였다. 플라스크를 파라필름(Parafilm, 미국)으로 밀봉하고, 분해를 제어하기 위해 수시로 진탕하면서 약 30분 동안 37℃ 및 5% CO2에서 온수기에 수평으로 위치시켰다. 그 후, 플라스크를 약 10분 동안 수직으로 위치시켜 세포가 중력에 의해 침전되도록 하였다. 용액의 표면에 부유하는 상청액은 불순물을 함유하고 있으며 10 ml 혈청학적 피펫을 사용하여 폐기할 수 있다.
효소적 분해 후, 조직 단편을 함유하는 완충액을 4개의 50ml 팔콘 튜브에 넣었다. 팔콘 튜브를 1,300 rpm(300g)에서 5분 동안 원심분리하였다. 펠릿을 2개의 50 ml 팔콘 튜브에 수집하고 DTT를 함유하는 용액(하기 조성의 세부사항을 참고)으로 희석시킨 다음, 튜브를 1,300 rpm(300g)에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 수집하고 800-미크론 금속 메쉬 필터(IDEALE ACLRI9 inox 스테인리스 스틸)에 놓고 신선한 세포 세척액으로 여과하였다. 여액 물질을 멸균 용기에 수집하였다. 스크레이퍼 및 주사기 플런저(Terumo #SS - 20ES2)를 사용하여 통과를 용이하게 하고 여과 동안 조직을 추가로 절제하였다. 평균 200 ml의 생성된 현탁액을 2개 바이알의 DNase 풀모자임 2500 U/2.5 ml(Roche, 이탈리아)로 처리하였다(도 8D).
태아 십이지장 및 성인 대상체에서 수행된 내시경 십이지장 생검으로부터의 BGSC 단리
십이지장 생검 및 태아 장기으로부터 BGSC를 단리하는 방법은 성인의 온전한 십이지장으로부터 세포를 수득하기 위해 최적화된 절차에 비해 덜 복잡하다.
십이지장 생검은 중개의학 및 정밀의학과에서 위내시경 검사 동안에 겸자를 사용하여 구부 수준에서 말단에서 채취되었다. 이러한 방법은 훈련된 위장병 전문의에 의해 광범위한 질환에 대한 물질을 수득하기 위해 사용된다. 절차는 연성 내시경을 사용하여 내시경적으로 실시하였다. 내시경은 경구 도입하였다. 생검은 육안으로 보아서 임의의 동맥이나 정맥을 피함으로써 수득하였다. 수집된 생검의 조직학적 검사는 BG가 구부로부터 수득된 생검에는 존재하지만 원위 십이지장으로부터 수득된 생검에는 존재하지 않는다는 것을 밝혔다(도 15A); BG는 점막근판 바로 아래의 점막하층에 있다. 그 다음, 이 절차 동안 환자당 십이지장 구부로부터 2개 내지 4개의 생검을 수집하고 세포를 단리하는데 사용하였다.
태아 십이지장을 유문 수준에서 근위로 절단하고 트라이츠 인대 수준에서 말단에서 절단하여 태아(18주 내지 22주: 산부인과에서 치료적 낙태)로부터 수거하였다. 췌장 및 췌장내 담관은 간-췌장 팽대부 수준에서 제거하여 채취하였다.
이어서, 전체 태아 십이지장 또는 전체 십이지장 생검을 메스와 MACS 해리 기(Miltenyi Biotec)에 의해 조심스럽게 해체시키고 37℃에서 20분 내지 30분 동안 300 U/ml I형 콜라게나제(Sigma Aldrich) 및 0.3 mg/ml 데옥시리보뉴클레아제(Sigma Aldrich)를 함유하는 완충액 중에서 분해시켰다. 새로 단리된 세포를 자기 비드(Miltenyi biotec)를 사용하여 TRA1-60- 양성 세포에 대해 면역선택하였다.
분류에 의해, 태아 십이지장(N=3)으로부터 평균 1200만개의 생존 세포가 단리되고 십이지장 구부 생검(N=2)으로부터 100,000개의 생존 세포가 단리되었다. 단리 절차의 기간은 평균 5시간이었다. 세포를 멸균 10% 글루코스 용액에 ml당 100만개 세포로 현탁하고 배양 전에 4℃의 제어된 온도 하에 45분 동안 유지하였다. 이러한 프로토콜에 따른 자가 복제 브루너샘 세포는 도 15B에 도시되어 있다. 모든 절차는 "유럽연합의 의약품 관리 규칙" 및 인체용 의약품에 대한 GMP의 유럽 지침(EudraLex- 볼륨 4 의약품 제조 품질관리 기준 지침)에 따라 수행하였다. 세포 생성물을 그람+, 그람-, 호기성 및 혐기성 세균, 진균(mycetes)에 대한 표준 멸균성 시험 및 내독소 시험으로 평가하였고 TRA1-60(Miltenyi Biotec, 인간; 희석율 1:50)에 대한 유세포계측(FC)으로 즉시 특성구명하였다.
실시예 2 - 조직 및 세포의 특성규명
인간 십이지장 조직에 관한 연구
성인 십이지장(N = 10)의 점막은 장 융모로 튀어 나와 장 샘(음와)에서 접혀있었으며, 이는 횡 방향으로 절단될 수 있고 고유층에서 철저히 관찰될 수 있다(도 1A). 십이지장의 근위부(상부 및 하행)에서, 점막하 조직은 점막하 면적의 9.95±2.68% 및 전체 벽 면적의 4.62±1.93%를 총괄적으로 차지하는 샘 요소(십이지장 샘 또는 브루너샘: BG)를 함유하였다. BG는 대부분 PAS-양성 점액 세포로 구성되었다(도 1A). BG는 점막근판을 통해 장 음와와 해부학적 연속성이 있었다. 소수의 BG 샘꽈리는 점막의 고유층 내부에 위치하였으며 장 음와와 연속성이 있었다(도 1A). 십이지장의 원위부(하단 및 상행)에서, BG는 점차 소멸되었는데 하단 부분에 샘 요소가 거의 없고(20x시야당 거의 1개) 상행 부분에는 사실상 샘이 없다.
인간 십이지장에서, 면역조직화학적 분석은 BG 세포와 장 음와가 표현형적 형질을 부분적으로 공유한다는 것을 나타냈다. 사이토케라틴 발현과 관련하여, 장 음와와 BG는 둘 다 CK19 양성이었다; 대조적으로, CK7은 일부 BG 세포에 의해 특이 적으로 발현되었지만 장 샘에 의해서는 발현되지 않았다(도 1B 및 도 9). 장 샘과 BG는 둘 다 SOX9(내배엽 줄기 세포의 마커, 도 1C)를 발현하는 세포를 함유하였다; BG에서, SOX9는 동일한 세포에서 CK7과 함께 공동발현되었다.
더욱이, 장 샘 및 BG는 증식 마커인 PCNA 및 CD44, EpCAM 및 Lgr5와 같은 몇몇 다른 줄기/전구 세포 마커를 발현하는 세포를 함유하였다(도 2A). BG에서, Lgr5는 SOX9와 공동국소화되었고, 이의 발현은 점막하층 내의 더 심부에 위치하는 샘꽈리보다 점막근판 내부에 위치하고 장 음와와 연속성이 있는 샘꽈리에서 더 컸다(도 10A).
BG 세포의 하위집단은 다능성 마커를 발현하였다(도 2). 흥미롭게도, Tra-1-60 및 Tra-1-81은 BG 세포에 의해 발현되었지만 장 음와 내의 세포에 의해서는 발현되지 않았다(도 2A). Tra-1-60은 동일한 BG 세포에서 SOX2 및 Oct4A와 공동국소화되었다(도 2B). 마지막으로, BG는 NIS를 발현하는 세포를 함유하였으며, 이는 장 음와에 의해서도 발현되었다(도 10B).
요약하면, 줄기/전구 세포 마커 발현에 대한 반정량적 분석은 BG가 SOX9+(9.12% ± 3.30) 세포와 증식성 세포(PCNA+: 4.82% ± 1.33)로 구성된 니치를 포함한다는 것을 밝혔다. 게다가, BG의 니치는 Lgr5(4.76% ± 1.04), EpCAM (8.80% ± 0.65)과 같은 내배엽 줄기 세포 형질을 발현하는 세포를 함유하였다; 세포의 거의 5%는 Tra-1-60, Tra-1-81, Oct4A 및 SOX2와 같은 다능성 마커를 발현하였다. 흥미롭게도, PCNA+/SOX9+/Lgr5+ 세포는 점막하 조직에서 더 심부에 위치한 샘꽈리(SOX9+/Lgr5+: 4.80% ± 1.50; PCNA+: 0.98% ± 0.62; p <0.05)보다 장 샘과 직접적 연속성이 있는 샘꽈리(SOX9+/Lgr5+: 11.80% ± 4.40; PCNA+: 5.95% ± 2.25; p <0.05)에 더 많았다. 대조적으로, 다능성 세포는 점막하층 내의 더 깊은 위치에 위치한 샘꽈리에 더 많았다.
설치류 십이지장 조직에 관한 연구
인간에서와 마찬가지로, 설치류 십이지장은 점막하 조직에 위치한 점액샘을 함유하였다. 설치류 SG는 완전한 점막근판이 없이 장 음와와 직접적 연속성이 있었다. 이들은 점액 내용물로 인한 투명한 세포질 덕분에 음와와 구별될 수 있었다(도 13A). SG는 설치류 십이지장의 근위 부분으로 제한되었다. SOX9 및 PCNA의 발현을 연구했을 때, SOX9+ 세포는 SG에 존재한 반면, PCNA+ 세포는 주로 음와(26.1±5.7%)에 위치하였으며 소수의 SG 세포만이 PCNA 양성이었다(6.7±2.2%, 음와 대비 p <0.01). 십이지장 SG 및 음와는 또한 Ck19 발현에 있어 상이하였는데, 전자는 거의 음성이고 후자는 양성이었다(도 13A). 마우스 공장에서, 음와는 SOX9+, PCNA+ 및 Ck19+인 세포를 함유하였다(도 13B). 이러한 표현형 프로파일 및 SG 내의 PCNA+ 세포의 낮은 비율에 기초하여, 본 출원인들은 Krt19CreTdTomatoLSL 마우스 계통 추적 모델을 도입하여, SG 재생이 십이지장 음와 내의 Ck19+/PCNA+ 세포에서 진행되었는지 여부를 평가하였다. 먼저, 공장을 분석하여 장 음와에서의 재조합 효율을 추정하였다(도 13C). td-Tomato(Td-Tom) 양성 음와의 비율은 72±6%였으며 양성 음와 옆에 음성 음와가 있었다. 따라서, td-Tom+ 음와 위의 융모는 항상 td-Tom 양성인 반면에, td-Tom- 음와 바로 위에 위치한 융모는 td-Tom 음성이었다. 마우스 십이지장을 조사하였을 때, 130 td-Tom + 음와 바로 아래에 위치한 세포를 포함하여 Ck19- SG는 거의 모두 td6 Tom-였다(도 13C); 일관되게, SG 내의 PCNA+ 및 SOX9+ 세포는 td-Tom-였다(도 13D). 종합하면, 이들 데이터는 설치류 SG에서의 세포 증식률이 십이지장 음와에 비해 낮다는 것을 가리킨다. 더욱이, 생리학적 조건에서, SG 재생은 십이지장 음와 세포에 의해 지원되지 않고 SG 내의 SOX9+ 및 PCNA+ 세포는 Ck19+ 음와 세포로부터 유래되지 않는다.
성공적인 BGSC 단리 및 배양 절차
실시예 1에서와 같이 십이지장 조직의 화학적 및 기계적 처리 후, 표면 상피와 점막층의 거의 모든 음와가 제거된 반면, 고유층의 연결 조직 및 점막근판은 보유되었다(도 3A). 이것은 점막근판 아래 및 점막하 조직 내의 해부학적 위치 덕분에 BG가 보존될 수 있게 하였다; 따라서, BG는 온전한 것처럼 보였고 이의 CK7+(도 3B), Tra-1-60+(도 3C) 및 SOX9+(도시하지 않음) 세포를 보유하였다.
십이지장 점막하 조직은 방법에서 설명된 바와 같이 추가로 가공하였으며, 거의 350 ± 1억개의 세포가 80% 초과의(85 ± 5%) 생존율로 단리되었다. FC는 새로 단리된 세포의 40.0±18.5%가 EpCAM+였음을 보여주었다. 세포를 EpCAM에 대해 면역분류하였을 때, 세포 집단은 70.3 ± 19.3% EpCAM+ 세포(사전분류 대비 p< 0.05)로 농축되었으며, 이들 세포 중 46.3% ± 7.3는 또한 Lgr5+였다(도 4A). 십이지장으로부터 단리된 세포를 Tra-1-60 발현에 대해 유세포계측(FC)에 의해서도 조사하였다. FC는 새로 단리된 세포의 5.8 ± 1.6%가 Tra-1-60+였음을 보여주었다. 세포를 Tra-1-60에 대해 면역분류하였을 때, 세포 집단은 30.4 ± 19.8% Tra-1-60+ 세포(사전분류 대비 p< 0.05)로 농축되었고, Tra-1-60+ 세포의 7.3% ± 4.2는 또한 EpCAM+였다(대표적인 산점도는 도 4B에 도시되어 있다). 자기 면역분류 후, 오염 세포 집단은 플라스틱상에서의 및 오가노이드로서의 2가지 상이한 배양 선택 접근법에 의해 추가로 제거하였다. 첫째, 단일 세포 현탁액을 수득하고, 내배엽 줄기/전구체의 생존 및 자가 복제를 허용하지만 성숙한 세포나 중간엽 세포의 생존 및 자가 복제는 허용하지 않는 배지인 무혈청 쿠보타 배지에서 플라스틱상에 500개 세포/cm2의 클론 시딩 밀도로 플레이팅하였다. 이들 조건에서는 Tra-1-60+ 세포만이 증식할 수 있었다(도 4C); 이들 세포는 1일 내지 2일의 성장 지체기 후에 증식하기 시작하였고 배양 6일 내지 8일 후에 10개 내지 15개 세포의 작은 클러스터를 형성하였다(도 4C). 14일 후, 큰 콜로니가 관찰되었다(도 4C). 각 콜로니는 대부분, 높은 핵 대 세포질 비를 갖는 작고(직경 = 12.06 ± 5.76 ㎛) 조밀하게 패킹된 균일한 세포에 의해 형성되었다. 자가 복제 배양 조건은, BTSC에 대한 배양 선택에서 이전에 설명한 바와 같이, 거의 모든 중간엽 세포(표시되지 않음)의 소멸을 초래하였다. 둘째, 오가노이드 형성에 맞춤화된 배양 조건에서, 단일 BGSC는 크기와 개수가 더 확장된 구형 구조로서 자가 구조화되기 시작하였다. 일반적으로, 오가노이드는 배양 3일 내지 5일 후에 가시적이었으며 이의 평균 직경은 약 13일 내지 14일 이내에 2.3 ± 5mm에 도달하였다. 오가노이드 형성은 오가노이드를 형성하는 우세한 세포 표현형을 나타내는 Tra-1-60+ 세포가 농축되었음을 밝혔다(도 4D).
BGSC 2D-콜로니 및 BGSC 유래의 오가노이드의 표현형 형질
플라스틱상 및 KM(자기 복제 조건, 도 5A)에서, 표현형 분석은 배양물이 어떻게 CK7, SOX9, EpCAM, Lgr5 및 다능성 마커(SOX2, Tra-1-60, Tra-1-81)를 발현하는 세포로 구성되었는지를 입증하였다.
동시에, 오가노이드(도 5B)는 CK7+ 세포 및 Ck19+ 세포로 구성되었다; 오가노이드 세포는 내배엽 줄기 세포의 마커(EpCAM, Pdx1) 및 다능성 마커(Oct4A 및 Tra-1-60)를 발현하였다. 오가노이드는 PAS 음성(배상 세포(goblet cell) 특징)이었고 빌린(Villin), CFTR, 알부민, Hep-Par1 및 인슐린과 같은 몇몇 성숙한 세포 마커에 대해 음성이었다(데이터는 제시되지 않음).
BGSC 표현형을 RT-PCR에 의해 추가로 조사하였다; 적절한 양성 대조군과의 비교는 플라스틱상의 단층 및 오가노이드 내의 BGSC가 내배엽의 바이오마커(예를 들어, EpCAM, SOX17 및 PDX1, 도 5C) 및 다능성 바이오마커(예를 들어 SOX2, OCT4A 및 NANOG, 도 5D) 유전자를 발현하였다는 것을 밝혔다. 이들 조건에서, 세포는 간세포(즉, 알부민), 담관세포(즉, CFTR) 및 β-췌장 세포(즉, 인슐린) 계통의 마커에 대해 대부분 음성이었다(데이터는 제시하지 않음).
BGSC의 시험관내 분화 잠재성
BG로부터 단리된 세포의 분화 잠재성은 이들 세포를 간(HDM-H) 또는 내분비 췌장(HDM-P) 계통으로의 분화를 유도하도록 특별히 맞춤화된 별개의 배지로 옮겨서 평가하였다.
HDM-H에서 7일 내지 14일 후(도 6A), 대부분의 세포의 형태특징은 작은 방추 형상의 세포로부터 다각형(직육면체) 형상의 세포로 현저히 변화하였다. 이들 세포는 응집되어 다세포 다발을 형성하였고 KM에서 배양된 세포에 비해 더 큰 직경을 가졌다(p<0.01); 세포 크기는 정상의 2배체 성인 간세포에 상응하였다. IF는 이러한 큰 다각형 세포들이 알부민을 발현하였음을 보여주었다(도 6A). 게다가, PAS 염색은 HDM-H에서 PAS-양성 세포의 존재를 보여주었지만(도 6A), KM에서 세포의 존재를 보여주지 않았으며(도시되지 않음), α-아밀라아제로 분해한 후, 가시적인 PAS 염색이 검출되지 않았다(도시되지 않음). 이것은 HDM-H에서 배양된 세포의 글리코겐-저장 능력을 뒷받침하였다. RT-PCR 분석(도 6A)은 HDM-H에서의 세포가 KM에서의 세포와 비교할 때 알부민(약 2 배), 트랜스페린(중간 또는 구역 2; >100배) 및 CYP3A4(약물 대사, 후기 또는 구역 3 유전자; >100배) 유전자를 포함하는 간세포 특이적 유전자의 발현이 증가하였음을 입증하였다.
HDM-P에서 14일 후, 섬-유사 구조가 관찰되었다; 이러한 구조는 Ngn3 및 인슐린을 발현하는 조밀하게 패킹된 세포로 구성되었다(도 6B). HDM-P에서 7일 후, RT-PCR 분석은 PDX1 유전자 발현이 KM에서의 세포의 조사결과와 비교하여 증가하였지만 인슐린 및 글루카곤 유전자 발현은 그렇지 않다는 것을 입증하였다(도 12). HDM-P에서 14일 후, KM에서의 세포에 대한 것과 비교하여 PDX1, 인슐린 및 글루카곤 유전자 발현의 유의한 증가가 검출되었다(도 6B).
Tra-1-60+ 십이지장 SG 세포는 시험관내에서 β-췌장 운명으로 빠르게 제한될 수 있으며 SG는 생체내에서 인슐린 발현 세포를 자발적으로 생성할 수 있다. 십이지장 SG로부터 단리된 세포의 시험관내 분화 능력은 이들 세포를 내분비 췌장섬 계통쪽으로 분화를 유도하도록 맞춤화된 배지(PM)로 옮겨서 평가하였다. PM에서 7일 후, 드문 섬-유사 구조의 존재가 관찰되었다(배양물당 14±0.5)(도 14A). RT-PCR 분석은 PDX1 유전자는 KM에 비해 PM에서 상향 조절되었지만 인슐린 유전자는 그렇지 않다는 것을 나타냈다. 동시에, 면역형광 분석에 의해 결정시 섬-유사 구조는 PDX1의 발현을 나타냈지만, 인슐린의 발현은 나타내지 않았다(도 14B). PM에서 14일 후, 섬-유사 구조의 수는 7일에 비해 유의하게 증가하였다(배양물당 4.8±0.8, p<0.0l). PDX1 유전자 발현은 RT-PCR 분석에 기반하여 KM에 비해 14일 PM에서 더 높았지만, 7일 PM에 비해서는 낮았다(도 14B). 인슐린 및 글루카곤 유전자 발현은 14일차에 극도로 증가하여(도 14C) 대조군으로서 사용된 췌장섬의 수준에 도달하였다. 14일 후, 인슐린+ 및 글루카곤+ 세포가 섬-유사 구조로 출현하였다(도 14C).
생체내에서 내분비 췌장 운명으로 수임되는 십이지장 SG 세포의 능력을 연구하기 위해, 본 출원인들은 마우스에서 실험적으로 유도된 당뇨병이 특정 췌장 형질의 획득을 촉발할 수 있는지 여부를 조사하였다. 따라서, 2가지 상이한 스트렙토 조토신(STZ) 모델을 연구하였다. 고용량 STZ 모델은 혈당 수준의 급격한 증가 및 높은 사망률을 특징으로 한다. 저용량 STZ 모델은 연장된 관찰 시간을 가능하게 하는 느리고 덜 뚜렷한 혈당 증가 및 더 긴 생존 기간을 나타냈다. 마우스를 고 STZ 용량으로 처리하고 14일 후 희생시켰을 때, 십이지장 SG 범위가 증가하였다(도 14D). 더욱이, 대조군과 비교하여 더 높은 비율의 SG 세포가 PCNA, PDX1 및 NGN3을 발현하였다(도 14E 내지 도 14F). 마지막으로, 2마리/5마리 STZ-처리된 마우스에서는 인슐린+ 및 글루카곤+ 세포가 십이지장 SG 내에서 관찰되었지만 대조군에서는 그렇지 않았다(도 14E 내지 도 14F). 그러나, 혈당 프로파일과의 상관관계는 발견되지 않았다. 이들 데이터는 췌장 내분비 운명과 관련된 유전자의 증가된 발현을 특징으로 하는 설치류 십이지장 표본의 RT-PCR 분석에 부합하였다(도 14G). 저 STZ 용량이 투여되었을 때, 이러한 특징들은 나타나지 않았다(데이터는 제시하지 않음). 마지막으로, 2형 당뇨병(T2D)에 걸린 환자로부터 수득된 인간 십이지장에서 인슐린의 발현을 연구하였다. 드문(<5%) 인슐린+ 세포는 T2D 환자의 십이지장 SG에서 발견될 수 있었지만, 정상 대상체의 십이지장 SG에서는 발견되지 않았다(도 14H).
뮤린 간으로의 미분화된 인간 BGSC의 생체내 이식
생체내에서 성숙한 간세포를 생성하는 BGSC의 잠재성을 혈관 경로를 경유한 주사(비장 주사)를 통해 SCID 마우스의 간에 이식하여 조사하였다. BGSC의 생착은 이전에 보고된 바와 같은 인간 항원과만 반응하는 특이적 항체(즉, 항-인간 미토콘드리아, 항-인간 핵, 항-인간 알부민 및 항-인간 HepPar-1)에 대한 면역염색에 의해 평가하였다. 세포 주사 1개월 후, 인간(h) 미토콘드리아+ 세포가 뮤린 간에서 관찰되었다(도 7A); 양성 세포는 대부분 문맥 공간 주변에 위치하였으며, 일부 세포는 중심엽 위치쪽으로 확장되어 있었다. 주사된 마우스에서, 숙주 간세포 질량의 거의 5.1 ± 1.3%가 인간 항원+ 세포로서 표시되었다(도 7B). 게다가, h-미토콘드리아+ 생착된 세포는 알부민(도 7D) 및 HepPar-1(도 7E)과 같은 성숙한 간세포 마커에 대해 양성이었다. 드물게, 항-인간 핵에 대해 양성인 세포가 소엽간 담관 내에서 관찰되었다. 이들 세포는 CK19에 대해 양성이었다(데이터는 제시하지 않음).
이식된 hBGSC의 효과적인 생착 및 분화를 확인하기 위해, 출원인들은 뮤린 간에서의 인간 알부민 mRNA 발현을 추가로 조사하였다. 인간 알부민 mRNA는 주사된 마우스로부터 수거된 간에서 측정 가능하였지만(도 7C), 샴-대조군 마우스(식염수가 주입됨)에서는 검출되지 않았다.
참고문헌
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006

Claims (138)

  1. Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9 및 사이토케라틴 7(CK7)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하고 자가 재생을 지원하는 배양 조건 하에 제한적 또는 최소 분화로 증식할 수 있는 것으로 추가로 특징지어지는, 십이지장으로부터 단리된 줄기/전구 세포(stem/progenitor cell)(브루너샘 줄기/전구 세포 또는 BGSC로 지칭됨).
  2. 제1항에 있어서, 실질적으로 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물이 없는 단리된 BGSC.
  3. 제1항에 있어서, 적어도 1개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 단리된 BGSC.
  4. 제1항에 있어서, 적어도 2개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 단리된 BGSC.
  5. 제1항에 있어서, 적어도 6개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 단리된 BGSC.
  6. 제1항에 있어서, 적어도 12개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 단리된 BGSC.
  7. 제1항에 있어서, 자가 재생을 지원하는 배양 조건이 무혈청 배지, 임의로 쿠보타 배지(Kubota's Medium)를 포함하는, 단리된 BGSC.
  8. 제1항에 있어서, 자가 재생을 지원하는 배양 조건이 혈청을 함유하는 배지를 포함하는, 단리된 BGSC.
  9. Lgr5, NIS, CD44 및 CK19로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하고 자가 재생을 지원하는 배양 조건 하에 제한적 또는 최소 분화로 증식할 수 있는 것으로 추가로 특징지어지는, 십이지장으로부터 단리된 줄기/전구 세포(브루너샘 줄기/전구 세포 또는 BGSC로 지칭됨).
  10. 제9항에 있어서, 실질적으로 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물이 없는 단리된 BGSC.
  11. 제9항에 있어서, 적어도 1개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 단리된 BGSC.
  12. 제9항에 있어서, 적어도 2개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 단리된 BGSC.
  13. 제9항에 있어서, 적어도 6개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 단리된 BGSC.
  14. 제9항에 있어서, 적어도 12개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 단리된 BGSC.
  15. 제9항에 있어서, 자가 재생을 지원하는 배양 조건이 무혈청 배지, 임의로 쿠보타 배지를 포함하는, 단리된 BGSC.
  16. 제9항에 있어서, 자가 재생을 지원하는 배양 조건이 혈청을 함유하는 배지를 포함하는, 단리된 BGSC.
  17. SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하고 자가 재생을 지원하는 배양 조건 하에 제한적 또는 최소 분화로 증식할 수 있는 것으로 추가로 특징지어지는, 십이지장으로부터 단리된 줄기/전구 세포(브루너샘 줄기/전구 세포 또는 BGSC로 지칭됨).
  18. 제17항에 있어서, 실질적으로 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물이 없는 단리된 BGSC.
  19. 제17항에 있어서, 적어도 1개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 단리된 BGSC.
  20. 제17항에 있어서, 적어도 2개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 단리된 BGSC.
  21. 제17항에 있어서, 적어도 6개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 단리된 BGSC.
  22. 제17항에 있어서, 적어도 12개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 단리된 BGSC.
  23. 제17항에 있어서, 자가 재생을 지원하는 배양 조건이 무혈청 배지, 임의로 쿠보타 배지를 포함하는, 단리된 BGSC.
  24. 제17항에 있어서, 자가 재생을 지원하는 배양 조건이 혈청을 함유하는 배지를 포함하는, 단리된 BGSC.
  25. Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44 및 CK19로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하거나 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하고 자가 재생을 지원하는 배양 조건 하에 제한적 또는 최소 분화로 증식할 수 있는 것으로 추가로 특징지어지는, 십이지장으로부터 단리된 줄기/전구 세포(브루너샘 줄기/전구 세포 또는 BGSC로 지칭됨).
  26. 제25항에 있어서, 실질적으로 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물이 없는 단리된 BGSC.
  27. 제25항에 있어서, 적어도 1개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 단리된 BGSC.
  28. 제25항에 있어서, 적어도 2개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 단리된 BGSC.
  29. 제25항에 있어서, 적어도 6개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 단리된 BGSC.
  30. 제25항에 있어서, 적어도 12개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 단리된 BGSC.
  31. 제25항에 있어서, 자가 재생을 지원하는 배양 조건이 무혈청 배지, 임의로 쿠보타 배지를 포함하는, 단리된 BGSC.
  32. 제25항에 있어서, 자가 재생을 지원하는 배양 조건이 혈청을 함유하는 배지를 포함하는, 단리된 BGSC.
  33. 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9 및 CK7로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하는, 십이지장으로부터 단리된 줄기/전구 세포 집단
  34. 제33항에 있어서, 실질적으로 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물이 없는 집단.
  35. 제33항에 있어서, 적어도 1개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 집단.
  36. 제33항에 있어서, 적어도 2개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 집단.
  37. 제33항에 있어서, 적어도 6개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 집단.
  38. 제33항에 있어서, 적어도 12개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 집단.
  39. 제33항에 있어서, 자가 재생을 지원하는 배양 조건이 무혈청 배지, 임의로 쿠보타 배지를 포함하는, 집단.
  40. 제33항에 있어서, 자가 재생을 지원하는 배양 조건이 혈청을 함유하는 배지를 포함하는, 집단.
  41. 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 Lgr5, NIS, CD44 및 CK19로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하는, 십이지장으로부터 단리된 줄기/전구 세포 집단.
  42. 제41항에 있어서, 실질적으로 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물이 없는 집단.
  43. 제41항에 있어서, 적어도 1개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 집단.
  44. 제41항에 있어서, 적어도 2개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 집단.
  45. 제41항에 있어서, 적어도 6개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 집단.
  46. 제41항에 있어서, 적어도 12개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 집단.
  47. 제41항에 있어서, 자가 재생을 지원하는 배양 조건이 무혈청 배지, 임의로 쿠보타 배지를 포함하는, 집단.
  48. 제41항에 있어서, 자가 재생을 지원하는 배양 조건이 혈청을 함유하는 배지를 포함하는, 집단.
  49. 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하는, 십이지장으로부터 단리된 줄기/전구 세포 집단.
  50. 제49항에 있어서, 실질적으로 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물이 없는 집단.
  51. 제49항에 있어서, 적어도 1개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 집단.
  52. 제49항에 있어서, 적어도 2개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 집단.
  53. 제49항에 있어서, 적어도 6개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 집단.
  54. 제49항에 있어서, 적어도 12개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 집단.
  55. 제49항에 있어서, 자가 재생을 지원하는 배양 조건이 무혈청 배지, 임의로 쿠보타 배지를 포함하는, 집단.
  56. 제49항에 있어서, 자가 재생을 지원하는 배양 조건이 혈청을 함유하는 배지를 포함하는, 집단.
  57. 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44 및 CK19로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하거나 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하는, 십이지장으로부터 단리된 줄기/전구 세포 집단.
  58. 제57항에 있어서, 실질적으로 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물이 없는 집단.
  59. 제57항에 있어서, 적어도 1개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 집단.
  60. 제57항에 있어서, 적어도 2개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 집단.
  61. 제57항에 있어서, 적어도 6개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 집단.
  62. 제57항에 있어서, 적어도 12개월 동안 제한적 또는 최소 분화로 증식될 수 있는 집단.
  63. 제57항에 있어서, 자가 재생을 지원하는 배양 조건이 무혈청 배지, 임의로 쿠보타 배지를 포함하는, 집단.
  64. 제57항에 있어서, 자가 재생을 지원하는 배양 조건이 혈청을 함유하는 배지를 포함하는, 집단.
  65. (a) 실질적으로 장 점액이 없는 십이지장의 점막층을, 점막층의 세포에 삼투성 쇼크를 유도하는 조건 하에, 생리학적 범위를 벗어나는 삼투질 농도 특성을 갖는 매질 또는 용액과 접촉시키는 단계;
    (b) 점막층 또는 이의 세포의 적어도 일부분을 기계적, 외과적 및/또는 화학적 방법에 의해 제거하거나 용해시켜, 점막하층을 포함할 수 있는 나머지를 남기고/거나 노출시키는 단계;
    (d) 나머지를 분해 또는 해리시키는 단계; 및
    (e) 분해된 나머지로부터 제33항, 제41항, 제49항 및/또는 제57항의 하나 이상의 BGSC 또는 세포 집단을 단리하는 단계
    를 포함하는, 제33항, 제41항, 제49항 및/또는 제57항의 하나 이상의 BGSC 또는 세포 집단을 대상체의 십이지장, 이의 일부분 또는 이로부터 취한 샘플로부터 단리하는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 단리 단계가 군 Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44 및 CK19로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하는 BGSC, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44 및 CK19로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하는 BGSC 집단을 단리하는 것을 포함하는, 방법.
  67. 제65항에 있어서, 단리 단계가 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하는 BGSC, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대부분이 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하는 BGSC 집단을 단리하는 것을 포함하는, 방법.
  68. 제65항에 있어서, 십이지장 조직이, 임의로 십이지장 조직을 압착함으로써 실질적으로 장 점액이 없게 되는, 방법.
  69. 제65항에 있어서, 생리학적 범위를 벗어난 삼투질 농도 특성을 갖는 매질 또는 용액이 저장성, 저삼투성, 고장성 또는 고삼투성 용액을 포함하는, 방법.
  70. 제65항에 있어서, 생리학적 범위를 벗어나는 삼투질 농도 특성을 갖는 매질이 글루코스 용액, 고염 용액 또는 증류수를 포함하는, 방법.
  71. 제65항에 있어서, 점막층 또는 이의 세포의 적어도 일부분의 제거가 유화제 및/또는 세제의 사용을 포함하는 화학적 파괴에 의해 수행되는, 방법.
  72. 제65항에 있어서, 세제 및/또는 유화제가 물, 식염수 및/또는 완충액 중에 있는, 방법.
  73. 제65항에 있어서, 세제 및/또는 유화제가 짧은 기간(15분 미만) 동안 적용되는, 방법.
  74. 제65항에 있어서, 유화제가 레시틴, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(폴리소르베이트 20), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(폴리소르베이트 80), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트(폴리소르베이트 40), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트(폴리소르베이트 60), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리스테아레이트(폴리소르베이트 65), 암모늄 포스파티드, 지방산의 나트륨, 칼륨 및 칼슘 염, 지방산의 마그네슘 염, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 아세트산 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 락트산 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 시트르산 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 모노아세틸 및 다아세틸 타르타르산 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 혼합 아세트산 및 타르타르산 에스테르, 지방산의 수크로스 에스테르, 수크로글리세라이드, 지방산의 폴리글리세롤 에스테르, 폴리글리세롤 폴리리시놀레이트, 지방산의 프로판-1,2-디올 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드와 상호작용한 열 산화된 대두유, 나트륨 스테아로일-2-락틸레이트, 칼슘 스테아로일-2-락틸레이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 트리스테아레이트, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노올레이트, 소르비탄 모노팔미테이트 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
  75. 제65항에 있어서, 세제가 1-헵탄설폰산; N-라우릴사르코신, 라우릴 설페이트, 1-옥탄 설폰산 및 타우로콜산, 벤잘코늄 클로라이드, 세틸피리디늄, 메틸벤제토늄 클로라이드, 데카메토늄 브로마이드, 알킬 베타인, 알킬 아미도알킬 베타인, N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, 포스파티딜콜린, N-데실 A-D-글루코피라노시드, N-데실 A-D-말토피라노시드, N-도데실 B-D-말토시드, N-옥틸 B-D-글루코피라노시드, N-테트라데실 B-D-말토시드, 트리톤(트리톤 X-100), 노니데트-P-40, 폴록사머 188, 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 데옥시콜레이트 및 나트륨 도데실 설페이트 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
  76. 제65항에 있어서, 나머지가 점막하층을 포함하는, 방법.
  77. 제65항에 있어서, 분해 또는 해리가 효소적으로 수행되는, 방법.
  78. 제65항에 있어서, 조직 샘플이 분해 또는 해리 단계 전에 세절되는, 방법.
  79. 제65항에 있어서, 분해 또는 해리 단계 및/또는 단리 단계가 저부착 플레이트에서 수행되는, 방법.
  80. 제65항에 있어서, 단리 단계가 무혈청 배지, 임의로 쿠보타 배지를 포함하는 배양 조건을 이용한 배양 선택을 사용하여 수행되는, 방법.
  81. 제65항에 있어서, 단리 단계가 혈청을 함유하는 배지를 포함하는 배양 조건을 이용한 배양 선택을 사용하여 수행되는, 방법.
  82. 제65항에 있어서, 단리된 세포가 스페로이드, 하나 이상의 오가노이드, 세포 클러스터 또는 세포 응집체를 지원하거나 생성하는 조건 하에 배양되는, 방법.
  83. 제33항, 제41항, 제49항 및/또는 제57항의 하나 이상의 BGSC 또는 세포 집단을 대상체의 십이지장, 이의 일부 또는 이로부터 취한 샘플로부터 단리하는 방법으로서, 다음 단계들을 포함하고, 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물을 실질적으로 사멸, 불활성화 또는 제거하기 위한 단계가 언제든지 또는 1회 이상 수행될 수 있는, 방법:
    (a) 장 점액을 제거하는 단계;
    (b) 점막층의 세포에 삼투성 쇼크를 유도하는 조건 하에, 생리학적 범위를 벗어나는 삼투질 농도 특성을 갖는 매질 또는 용액을 적용하는 단계;
    (c) 점막층 또는 이의 세포의 적어도 일부분을 기계적, 외과적 및/또는 화학적 방법에 의해 제거하거나 용해시켜, 점막하층을 포함할 수 있는 나머지를 남기고/거나 노출시키는 단계;
    (d) 점막층 및/또는 나머지에 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물을 실질적으로 사멸, 불활성화 또는 제거하기 위한 매질 또는 용액을 적용하는 단계;
    (e) 점막하층에 분해 또는 해리를 적용하여 분해, 해리된 세포 물질 또는 세포 현탁액을 생성하는 단계;
    (f) 임의로, 상기 분해, 해리된 세포 물질의 적어도 일부 또는 상기 세포 현탁액으로부터 세포를 배양하는 단계; 및
    (g) Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19 중 하나 이상을 발현하는 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44, CK19 중 하나 이상을 발현하는 세포 집단; 및/또는 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하는 세포를 단리하는 단계.
  84. 제83항에 있어서, 장 점액의 제거가 십이지장 조직을 압착하는 것을 포함하는, 방법.
  85. 제83항에 있어서, 생리학적 범위를 벗어난 삼투질 농도 특성을 갖는 매질 또는 용액이 저장성, 저삼투성, 고장성 또는 고삼투성 용액을 포함하는, 방법.
  86. 제83항에 있어서, 생리학적 범위를 벗어나는 삼투질 농도 특성을 갖는 매질 또는 용액이 글루코스 용액, 고염 용액 또는 증류수를 포함하는, 방법.
  87. 제83항에 있어서, 제거가 유화제 및/또는 세제의 사용을 포함하는 화학적 파괴에 의해 수행되는, 방법.
  88. 제83항에 있어서, 세제 및/또는 유화제가 물, 식염수 및/또는 완충액 중에 있는, 방법.
  89. 제83항에 있어서, 세제 및/또는 유화제가 짧은 기간(15분 미만) 동안 적용되는, 방법.
  90. 제83항에 있어서, 세제가 1-헵탄설폰산; N-라우릴사르코신, 라우릴 설페이트, 1-옥탄 설폰산 및 타우로콜산, 벤잘코늄 클로라이드, 세틸피리디늄, 메틸벤제토늄 클로라이드, 데카메토늄 브로마이드, 알킬 베타인, 알킬 아미도알킬 베타인, N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, 포스파티딜콜린, N-데실 A-D-글루코피라노시드, N-데실 A-D-말토피라노시드, N-도데실 B-D-말토시드, N-옥틸 B-D-글루코피라노시드, N-테트라데실 B-D-말토시드, 트리톤(트리톤 X-100), 노니데트-P-40, 폴록사머 188, 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 데옥시콜레이트 및 나트륨 도데실 설페이트 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
  91. 제83항에 있어서, 유화제가 레시틴, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(폴리소르베이트 20), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(폴리소르베이트 80), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트(폴리소르베이트 40), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트(폴리소르베이트 60), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리스테아레이트(폴리소르베이트 65), 암모늄 포스파티드, 지방산의 나트륨, 칼륨 및 칼슘 염, 지방산의 마그네슘 염, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 아세트산 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 락트산 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 시트르산 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 모노아세틸 및 다아세틸 타르타르산 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 혼합 아세트산 및 타르타르산 에스테르, 지방산의 수크로스 에스테르, 수크로글리세라이드, 지방산의 폴리글리세롤 에스테르, 폴리글리세롤 폴리리시놀레이트, 지방산의 프로판-1,2-디올 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드와 상호작용한 열 산화된 대두유, 나트륨 스테아로일-2-락틸레이트, 칼슘 스테아로일-2-락틸레이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 트리스테아레이트, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노올레이트, 소르비탄 모노팔미테이트 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
  92. 제83항에 있어서, 나머지가 점막하층을 포함하는, 방법.
  93. 제83항에 있어서, 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물을 실질적으로 사멸, 불활성화 또는 제거하기 위한 매질 또는 용액이 차아염소산나트륨(NaClO)의 수용액 또는 피부 또는 표면 소독용으로 사용되는 임의의 용액(들) 또는 제제(들)를 포함하는, 방법.
  94. 제83항에 있어서, 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물을 실질적으로 사멸, 불활성화 또는 제거하기 위한 매질 또는 용액의 적용이 세제 및/또는 유화제의 적용 전에 실시되거나, 분해 또는 해리 후에 실시되거나, 점액 제거 후에 실시되는, 방법.
  95. 제83항에 있어서, 분해 또는 해리가 효소적으로 수행되는, 방법.
  96. 제83항에 있어서, 조직 샘플이 분해 또는 해리 단계 전에 세절되는, 방법.
  97. 제83항에 있어서, 분해 또는 해리 단계 및/또는 단리 단계가 저부착 플레이트에서 수행되는, 방법.
  98. 제83항에 있어서, 단리 단계가 무혈청 배지, 임의로 쿠보타 배지를 포함하는 배양 조건을 이용한 배양 선택을 사용하여 수행되는, 방법.
  99. 제83항에 있어서, 단리 단계가 혈청을 함유하는 배지를 포함하는 배양 조건을 이용한 배양 선택을 사용하여 수행되는, 방법.
  100. 제83항에 있어서, 단리된 세포가 스페로이드, 하나 이상의 오가노이드, 세포 클러스터 또는 세포 응집체를 지원하거나 생성하는 조건 하에 배양되는, 방법.
  101. 제1항, 제9항, 제17항 또는 제25항 중 어느 한 항의 세포 또는 제33항, 제41항, 제49항 또는 제57항 중 어느 한 항의 세포 집단을 저부착 플레이트에서 배양함으로써 생성된 스페로이드, 오가노이드, 세포 응집체 또는 세포 클러스터.
  102. 제1항, 제9항, 제17항 또는 제25항 중 어느 한 항의 세포 또는 제33항, 제41항, 제49항 또는 제57항 중 어느 한 항의 세포 집단을 현탁 또는 3D 배양 조건에서 배양함으로써 생성된 스페로이드, 오가노이드, 세포 응집체 또는 세포 클러스터.
  103. BGSC 또는 BGSC 집단의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 간, 췌장, 위, 장 또는 기타 내배엽 조직과 관련되거나 이에 영향을 미치는 질환 또는 병태로 진단된 대상체를 치료하는 방법.
  104. 제1항, 제9항, 제17항 또는 제25항 중 어느 한 항의 세포의 유효량의 투여를 포함하는, 간, 췌장, 위, 장 또는 기타 내배엽 조직과 관련되거나 이에 영향을 미치는 질환 또는 병태로 진단된 대상체를 치료하는 방법.
  105. 제33항, 제41항, 제49항 또는 제57항 중 어느 한 항의 세포 집단의 유효량의 투여를 포함하는, 간, 췌장, 위, 장 또는 기타 내배엽 조직과 관련되거나 이에 영향을 미치는 질환 또는 병태로 진단된 대상체를 치료하는 방법.
  106. 제1항, 제9항, 제17항 또는 제25항 중 어느 한 항의 세포 또는 제33항, 제41항, 제49항 또는 제57항 중 어느 한 항의 세포 집단의 유효한 수의 투여를 포함하는, 자가 세포 또는 유전자 요법의 방법.
  107. 제1항, 제9항, 제17항 또는 제25항 중 어느 한 항의 세포 또는 제33항, 제41항, 제49항 또는 제57항 중 어느 한 항의 세포 집단의 유효한 수의 투여를 포함하는, 동종이계 세포 또는 유전자 요법의 방법.
  108. 제103항, 제104항, 제105항, 제106항 및/또는 제107항에 있어서, 세포가 유전자 조작되거나 변형된 세포인, 방법.
  109. 인간 및/또는 동물에 대한 자가 또는 동종이계 세포 또는 유전자 요법을 위한, 간, 췌장, 위, 장 또는 기타 내배엽 조직과 관련되거나 이에 영향을 미치는 질환 또는 병태의 치료를 위한 제1항, 제9항, 제17항 또는 제25항 중 어느 한 항의 세포의 용도.
  110. 제109항에 있어서, 세포가 유전자 조작되거나 변형된 세포인, 제1항, 제9항, 제17항 또는 제25항 중 어느 한 항의 세포의 용도.
  111. 인간 및/또는 동물에 대한 자가 또는 동종이계 세포 또는 유전자 요법을 위한, 간, 췌장, 위, 장 또는 기타 내배엽 조직과 관련되거나 이에 영향을 미치는 질환 또는 병태의 치료를 위한 제33항, 제41항, 제49항 또는 제57항 중 어느 한 항의 세포 집단의 용도.
  112. 제111항에 있어서, 세포가 유전자 조작되거나 변형된 세포인, 제33항, 제41항, 제49항 또는 제57항 중 어느 한 항의 세포 집단의 용도.
  113. 제101항 또는 제102항에 있어서, BGSC 또는 제33항, 제41항, 제49항 또는 제57항 중 어느 한 항의 세포 집단을 성숙한 세포를 포함하는 후기 계통(lineage) 단계의 세포로 분화시킬 수 있는 배양 조건을 추가로 포함하는 스페로이드, 오가노이드, 세포 응집체 또는 세포 클러스터.
  114. (a) 십이지장, 이의 일부분 또는 이로부터 취한 샘플을 분해 또는 해리시켜 분해 또는 해리된 세포 물질을 제공하는 단계;
    (b) 상기 분해 또는 해리된 세포 물질로부터: (i) Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44 및 CK19 중 하나 이상을 발현하는 세포, 또는 세포의 적어도 일부, 상당 부분 또는 대다수가 Tra-1-60, Tra-1-81, OCT4, SOX2, NANOG, EpCAM, SOX9, CK7, Lgr5, NIS, CD44 및 CK19 중 하나 이상을 발현하는 세포 집단; 및/또는 (ii) SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하는 세포, 또는 세포의 적어도 일부, 상당 부분 또는 대다수가 SOX17과 PDX1 둘 다를 발현하는 세포 집단을 수득하는 단계
    를 포함하는, 브루너샘 줄기/전구 세포(BGSC) 또는 제33항, 제41항, 제49항 또는 제57항 중 어느 한 항의 집단을 대상체의 십이지장, 이의 일부분 또는 이로부터 취한 샘플로부터 단리하는 방법.
  115. 제114항에 있어서, 십이지장, 이의 일부분, 이로부터 취한 샘플, 분해물, 해리된 세포 물질 또는 이들의 조합이, 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물을 실질적으로 사멸, 불활성화 또는 제거하기 위한 매질 또는 용액과 접촉되는, 방법.
  116. 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 다분화능 세포, 또는 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분 또는 대다수가 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 세포 집단을 점막층 및 점막하층을 갖는 조직(또는 이의 일부분 또는 샘플)으로부터 단리하는 방법으로서, 다음 순서로 발생할 수 있거나 다른 실시형태에서 다른 순서로 발생할 수 있는 다음 단계들을 포함하는 방법:
    (a) 점막층 및 점막하층을 갖는 조직의 점막층을 점막층의 세포에 삼투성 쇼크를 유도하는 조건 하에 생리학적 범위를 벗어나는 삼투질 농도 특성을 갖는 매질 또는 용액과 접촉시키는 단계;
    (b) 점막층 또는 이의 세포의 적어도 일부분을 기계적, 외과적 및/또는 화학적 방법에 의해 제거하거나 용해시켜, 점막하층을 포함할 수 있는 나머지를 남기고/거나 노출시키는 단계;
    (c) 나머지를 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물을 실질적으로 사멸, 불활성화 또는 제거하기 위한 매질 또는 용액과 접촉시키는 단계;
    (d) 나머지를 분해 또는 해리시키는 단계;
    (e) 하나 이상의 다분화능 세포, 또는 세포의 적어도 일부, 상당 부분 또는 대다수가 하나 이상의 원하는 바이오마커를 발현하는 세포 집단을 단리하는 단계.
  117. 제116항에 있어서, 표면 점액의 제거를 추가로 포함하는 방법.
  118. 제116항에 있어서, 생리학적 범위를 벗어나는 삼투질 농도 특성을 갖는 매질 또는 용액이 저장성, 저삼투성, 고장성 또는 고삼투성 용액을 포함하는, 방법.
  119. 제116항에 있어서, 생리학적 범위를 벗어나는 삼투질 농도 특성을 갖는 매질 또는 용액이 글루코스 용액, 고염 용액 또는 증류수를 포함하는, 방법.
  120. 제116항에 있어서, 제거가 유화제 및/또는 세제의 사용을 포함하는 화학적 파괴에 의해 수행되는, 방법.
  121. 제116항에 있어서, 세제 및/또는 유화제가 물, 식염수 및/또는 완충액 중에 있는, 방법.
  122. 제116항에 있어서, 세제 및/또는 유화제가 짧은 기간(15분 미만) 동안 적용되는, 방법.
  123. 제120항에 있어서, 유화제가 레시틴, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(폴리소르베이트 20), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(폴리소르베이트 80), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트(폴리소르베이트 40), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트(폴리소르베이트 60), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리스테아레이트(폴리소르베이트 65), 암모늄 포스파티드, 지방산의 나트륨, 칼륨 및 칼슘 염, 지방산의 마그네슘 염, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 아세트산 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 락트산 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 시트르산 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 모노아세틸 및 다아세틸 타르타르산 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 혼합 아세트산 및 타르타르산 에스테르, 지방산의 수크로스 에스테르, 수크로글리세라이드, 지방산의 폴리글리세롤 에스테르, 폴리글리세롤 폴리리시놀레이트, 지방산의 프로판-1,2-디올 에스테르, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드와 상호작용한 열 산화된 대두유, 나트륨 스테아로일-2-락틸레이트, 칼슘 스테아로일-2-락틸레이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 트리스테아레이트, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노올레이트 및 소르비탄 모노팔미테이트를 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
  124. 제116항에 있어서, 세제가 1-헵탄설폰산; N-라우릴사르코신, 라우릴 설페이트, 1-옥탄 설폰산 및 타우로콜산, 벤잘코늄 클로라이드, 세틸피리디늄, 메틸벤제토늄 클로라이드, 데카메토늄 브로마이드, 알킬 베타인, 알킬 아미도알킬 베타인, N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, 포스파티딜콜린, N-데실 A-D-글루코피라노시드, N-데실 A-D-말토피라노시드, N-도데실 B-D-말토시드, N-옥틸 B-D-글루코피라노시드, N-테트라데실 B-D-말토시드, 트리톤(트리톤 X-100), 노니데트-P-40, 폴록사머 188, 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 데옥시콜레이트 및 나트륨 도데실 설페이트를 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
  125. 제116항에 있어서, 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물을 실질적으로 사멸, 불활성화 또는 제거하기 위한 매질 또는 용액이 차아염소산나트륨(NaClO)의 수용액 또는 피부 또는 표면 소독용으로 사용되는 임의의 용액(들) 또는 제제(들)를 포함하는, 방법.
  126. 제116항에 있어서, 병원체 및/또는 병원성 및/또는 유익한 미생물을 실질적으로 사멸, 불활성화 또는 제거하기 위한 매질 또는 용액의 적용이 세제 및/또는 유화제의 적용 전에 실시되거나, 분해 또는 해리 후에 실시되거나, 점액 제거 후에 실시되는, 방법.
  127. 제116항에 있어서, 나머지가 점막하층을 포함하는, 방법.
  128. 제116항에 있어서, 분해 또는 해리가 효소적으로 수행되는, 방법.
  129. 제116항에 있어서, 조직 샘플이 분해 또는 해리 단계 전에 세절되는, 방법.
  130. 제116항에 있어서, 분해 또는 해리가 점막하 조직을 세포 현탁액, 세포 혼합물, 클러스터, 덩어리 또는 응집체 및/또는 조직 단편으로 분해시키는, 방법.
  131. 제116항에 있어서, 단리 단계가 무혈청 배지, 임의로 쿠보타 배지를 포함하는 배양 조건을 이용한 배양 선택을 사용하여 수행되는, 방법.
  132. 제116항에 있어서, 단리 단계가 혈청을 함유하는 배지를 포함하는 배양 조건을 이용한 배양 선택을 사용하여 수행되는, 방법.
  133. 제116항에 있어서, 단리 단계가 저부착 플레이트에서 수행되는, 방법.
  134. 제116항에 있어서, 단리된 세포 또는 세포 집단이 스페로이드, 하나 이상의 오가노이드, 세포 클러스터 또는 세포 응집체를 지원하거나나 생성하는 조건 하에 배양되는, 방법.
  135. 제116항에 있어서, 생리학적으로 허용되는 배지를 사용하는 1회 이상의 세척 단계를 추가로 포함하는 방법.
  136. 제116항에 있어서, 조직이 내배엽 조직인, 방법.
  137. 제116항에 있어서, 조직이 기관(trachea), 주 기관지, 식도, 위, 십이지장, 소장, 대장 및 직장을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
  138. 제116항에 있어서, 조직이 간, 췌장, 담낭 및 담도계 관을 포함하는 군으로부터 선택되고, 상기 담도계 관이 공통 관 및 담낭관을 포함하는, 방법.
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