CN112272698A - 来自十二指肠布鲁纳氏腺的干/祖细胞及其分离和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开的是具有内胚层干细胞表型特征且多能性标志物呈阳性的布鲁纳氏腺干/祖细胞(BGSC)，以及从人十二指肠分离它们的方法。此外，本公开提供了从人供体的十二指肠容易地分离BGSC，可以在培养物中扩增BGSC或诱导其分化为肝和胰腺谱系，并且可以作为用于再生医学临床方案的细胞来源。

Description

来自十二指肠布鲁纳氏腺的干/祖细胞及其分离和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年3月29日提交的美国临时申请62/650,208号的优先权，将其整体合并至本文中。
背景
多个干/祖细胞小体(niches)持续存在于胎儿和出生后的人胆管树内的特定解剖位置。尽管早已在胎儿组织中识别出干/祖细胞群，但它们在成年组织中的持久存在是新近才发现的。与肠隐窝平行的腺体(胆管腺PBG)位于肝外胆管、大肝内胆管和肝胰总管内。胆囊内发现了来源于PBG的较晚阶段的干细胞/祖细胞。该网络从肝胰总管PBG中的干/祖细胞延续到胰腺内胰管腺(PDG)中的定向祖细胞。所有这些小体中的干/祖细胞统称为胆管树干/祖细胞(BTSC)。PBG中的BTSC具有内胚层干/祖细胞的特性，包括增殖能力、自我更新和多能性；它们具有PDG中祖细胞的特征，包括增殖能力和多能性，但自我复制能力却低于PBG中的干/祖细胞。
位于肝胰壶腹水平的BTSC是原始的，共表达多种多能性标志物(例如OCT4、SOX2、NANOG)，可以自我更新或分化为功能性肝细胞、胆管细胞和胰岛(它们是否也可以产生腺泡细胞正在研究中)。含有BTSC的小体延伸到肝脏和胰腺中。对人体的详细解剖学研究显示，存在BTSC小体组织的近端到远端轴，其从最原始干细胞所在的近端位置(肝-胰壶腹)到成熟细胞所在的远端部位、肝脏或胰腺。该轴概括了这些器官的器官发生，并反映了它们共同的胚胎起源。实际上，从胚胎学的角度来看，肝脏、胆管系统和胰腺的共同前体在发育的早期阶段存在于形成前肠的确定性腹侧内胚层(definitive ventral endoderm)。在此发育阶段，原始十二指肠具有腹侧内胚层干/祖细胞。
鉴定出的最原始的干/祖细胞是在十二指肠粘膜下层的布鲁纳氏腺中发现的。这些细胞可能是产生肝脏和胰腺的整个干/祖细胞网络的起点。从成人十二指肠分离这些细胞是困难的，并且迄今为止还没有通过本领域公开的方法实现。这些细胞的实际意义是多方面的。例如，这些细胞可用于药物作用的体外评估，以及用于生成模型系统(例如类器官)以分析肝脏和胰腺的发育、功能、维持和/或修复(鉴于这些细胞包含这两个器官的前体)，用于与肝脏、胰腺和其他内胚层组织相关的其他临床或分析测试，以及用于诊断或治疗涉及或影响肝脏、胰腺和/或其他内胚层组织的疾病或状况。来自布鲁纳氏腺的细胞在内胚层干/祖细胞来源中是独特的，因其位置位于可通过内窥镜检查到达的十二指肠，因此可为自体或异源细胞疗法或基因疗法提供干/祖细胞来源。此外，源自这些布鲁纳氏腺的肿瘤是各种形式的癌症治疗方法的逻辑目标。因此，本领域仍然需要开发分离这些目的细胞(称为“布鲁纳氏腺干/祖细胞”)的方法。
概述
在一个方面，本公开涉及从十二指肠分离的干/祖细胞(称为布鲁纳氏腺干/祖细胞或BGSC)，其表达选自Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9和细胞角蛋白7(CK7)的一种或多种标志物，其进一步特征在于能够在支持自我更新的培养条件下以有限或最小限度的分化增殖。
在另一方面，本公开涉及从十二指肠分离的干/祖细胞(称为布鲁纳氏腺干/祖细胞或BGSC)，其表达选自Lgr5、NIS、CD44和CK19的一种或多种标志物，其进一步特征在于能够在支持自我更新的培养条件下以有限或最小限度的分化增殖。
在另一方面，本公开涉及从十二指肠分离的干/祖细胞(称为布鲁纳氏腺干/祖细胞或BGSC)，其表达SOX17和PDX1，其进一步特征在于能够在支持自我更新的培养条件下以有限或最小限度的分化增殖。
在另一方面，本公开涉及从十二指肠分离的干/祖细胞(称为布鲁纳氏腺干/祖细胞或BGSC)，其表达选自Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9 、CK7、Lgr5、NIS、CD44和CK19的一种或多种标志物，或其表达SOX17和PDX1，并且其进一步特征在于能够在支持自我更新的培养条件下以有限或最小限度的分化增殖。
在一些实施方案中，BGSC基本上不含病原体和/或病原性和/或有益微生物。在一些实施方案中，BGSC可以以有限或最小限度的分化增殖至少一个月。在一些实施方案中，BGSC可以以有限或最小限度的分化增殖至少两个月。在一些实施方案中，BGSC可以以有限或最小限度的分化增殖至少六个月。在一些实施方案中，BGSC可以以有限或最小限度的分化增殖至少十二个月。
在一些实施方案中，支持BGSC自我更新的培养条件包括无血清培养基，任选地为Kubota培养基。在一些实施方案中，支持自我更新的培养条件包括含有血清的培养基。
在一个方面，本公开涉及从十二指肠分离的干/祖细胞群，其中至少一些或实质性部分(substantial part)或大部分细胞表达选自Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9和CK7的一种或多种标志物。
在一个方面，本公开涉及从十二指肠分离的干/祖细胞群，其中至少一些或实质性部分或大部分细胞表达选自Lgr5、NIS、CD44和CK19的一种或多种标志物。
在一个方面，本公开涉及从十二指肠分离的干/祖细胞群，其中至少一些或实质性部分或大部分细胞表达SOX17和PDX1。
在一个方面，本公开涉及从十二指肠分离的干/祖细胞群，其中至少一些或实质性部分或大部分细胞表达选自Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9 、CK7、Lgr5、NIS、CD44和CK19的一种或多种标志物，或者其中至少一些或实质性部分或大部分细胞表达SOX17和PDX1。
在一些实施方案中，所述干/祖细胞群基本上不含病原体和/或病原性和/或有益微生物。
在一些实施方案中，所述干细胞/祖细胞群可以以有限或最小限度的分化增殖至少一个月。在一些实施方案中，所述干细胞/祖细胞群可以以有限的或最小限度的分化增殖至少两个月。在一些实施方案中，所述干细胞/祖细胞群可以以有限或最小限度的分化增殖至少六个月。在一些实施方案中，所述干细胞/祖细胞群可以以有限的或最小限度的分化增殖至少十二个月。
在一些实施方案中，支持干/祖细胞群体自我更新的培养条件包括无血清培养基，任选地为Kubota培养基。在一些实施方案中，支持干细胞/祖细胞群体自我更新的培养条件包括含有血清的培养基。
在一个方面，本公开涉及一种从对象的十二指肠、其一部分或取自其的样品中分离一种或多种BGSC或BGSC群体的方法，包括：
(a)在诱导对粘膜层细胞的渗透性休克的条件下，使基本上没有肠粘液的十二指肠粘膜层与渗透压特性不在生理范围内的介质或溶液接触；
(b)通过机械、外科手术和/或化学方法除去或溶解至少一部分粘膜层或其细胞，留下和/或暴露可包括粘膜下层的剩余部分；
(d)消化或解离所述剩余部分；和
(e)从被消化的剩余部分中分离出一种或多种BGSC或BGSC群体。
在一些实施方案中，所述分离步骤包括分离出表达选自Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9 、CK7、Lgr5、NIS、CD44和CK19的一种或多种标志物的BGSC，或分离出其中至少一些或实质性部分或大部分细胞表达选自Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9 、CK7、Lgr5、NIS、CD44和CK19的一种或多种标志物的BGSC群体。
在一些实施方案中，所述分离步骤包括分离出表达SOX17和PDX1的BGSC，或分离出其中至少一些或实质性部分或大部分细胞表达SOX17和PDX1的BGSC群体。
在一个方面，本公开涉及一种从对象的十二指肠、其一部分或取自其的样品中分离一种或多种BGSC或BGSC群体的方法，所述方法包括以下步骤，其中基本上杀死、灭活或去除病原体和/或病原性和/或有益微生物的步骤可在任何时间进行或不止一次进行：
(a)去除肠粘液；
(b)在诱导对粘膜层细胞的渗透性休克的条件下，施加渗透压特性不在生理范围内的介质或溶液；
(c)通过机械、外科手术和/或化学方法除去或溶解至少一部分粘膜层或其细胞，留下和/或暴露可包括粘膜下层的剩余部分；
(d)将一种介质或溶液施加到粘膜层和/或所述剩余部分上，以基本上杀死、灭活或去除病原体和/或病原性和/或有益微生物；
(e)对粘膜下层进行消化或解离以产生消化物、解离的细胞物质或细胞悬液；
(f)任选地培养至少一些所述消化物、解离的细胞物质或来自细胞悬液的细胞；和
(g)分离出表达选自Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9 、CK7、Lgr5、NIS、CD44和CK19的一种或多种标志物的BGSC，或分离出其中至少一些或实质性部分或大部分细胞表达选自Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9 、CK7、Lgr5、NIS、CD44和CK19的一种或多种标志物的BGSC群体；和/或同时表达SOX17和PDX1的细胞。
在一些实施方案中，肠粘液的去除包括挤压十二指肠组织。
在一些实施方案中，渗透压特性不在生理范围内的介质或溶液包括低张力溶液、低渗溶液、高张力溶液或高渗溶液。
在一些实施方案中，渗透压特性不在生理范围内的介质或溶液包括葡萄糖溶液、高盐溶液或蒸馏水。
在一些实施方案中，去除通过化学破坏进行，所述化学破坏包括使用乳化剂和/或洗涤剂。
在一些实施方案中，所述洗涤剂和/或乳化剂在水、盐水和/或缓冲剂中。
在一些实施方案中，短时间使用洗涤剂和/或乳化剂(少于15分钟)。
在一些实施方案中，乳化剂选自卵磷脂、聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸酯(聚山梨酸酯20)、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯(聚山梨酯80)、聚氧乙烯山梨糖醇单棕榈酸酯(聚山梨酯40)、聚氧乙烯山梨糖醇单硬脂酸酯(聚山梨醇酯60)、聚氧乙烯山梨糖醇三硬脂酸酯(聚山梨酯65)、脂肪酸铵、脂肪酸的钠盐、钾盐和钙盐、脂肪酸的镁盐、脂肪酸的单甘油酯和二甘油酯、脂肪酸的甘油单酯的和甘油二酯的乙酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的乳酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的柠檬酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的单-和二乙酰酒石酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的乙酸和酒石酸混合酯、脂肪酸的蔗糖酯、蔗糖甘油酯、脂肪酸聚甘油酯、聚甘油蓖麻油酸酯、脂肪酸的丙基-1,2-二醇酯、与脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯相互作用的热氧化大豆油、硬脂酰-2-乳酸钠、硬脂酰-2-乳酸钙、山梨糖醇单硬脂酸酯、山梨糖醇三硬脂酸酯、山梨糖醇单月桂酸酯、山梨糖醇单油酸酯、山梨糖醇单棕榈酸酯及其混合物。
在一些实施方案中，洗涤剂选自1-庚磺酸、N-月桂基肌氨酸、月桂基硫酸盐、1-辛烷磺酸和牛磺胆酸、苯扎氯铵、十六烷基吡啶、甲基苄索氯铵，溴化十烃季铵、烷基甜菜碱、烷基酰胺基烷基甜菜碱、N-十二烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐、磷脂酰胆碱、N-癸基A-D-葡糖苷、N-癸基A-D-麦芽吡喃糖苷、N-十二烷基Β-D-麦芽糖苷、N-辛基Β-D-葡糖苷、N-十四烷基Β-D-麦芽糖苷、各种Triton(Triton X-100)、Nonidet-P-40、泊洛沙姆188、月桂基硫酸钠、脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠及其组合。
在一些实施方案中，所述剩余部分包括粘膜下层。
在一些实施方案中，所述消化或解离是通过酶进行的。
在一些实施方案中，基本上杀死、灭活或去除病原体和/或病原性和/或有益微生物的介质或溶液包括次氯酸钠(NaClO)的水溶液或用于皮肤或表面消毒的任何溶液或试剂。
在一些实施方案中，基本上杀死、灭活或去除病原体和/或病原性和/或有益微生物的介质或溶液的施用发生在施用洗涤剂和/或乳化剂之前，或者发生在消化或解离之后，或发生在去除粘液之后。
在一些实施方案中，在消化或解离步骤之前切碎组织样品。
在一些实施方案中，消化或解离步骤和/或分离步骤在低附着平板上进行。
在一些实施方案中，分离步骤是通过使用培养选择(culture selection)来进行的，培养条件包括无血清培养基，任选地为Kubota培养基。
在一些实施方案中，分离步骤是通过使用培养选择来进行的，培养条件包括含血清培养基。
在一些实施方案中，分离的细胞在支持或产生细胞球、一种或多种类器官、细胞簇或细胞聚集体的条件下培养。
在一个方面，本发明涉及通过在低附着平板中培养BGSC或BGSC群体而产生的细胞球、类器官、细胞聚集体或细胞簇。
在一个方面，本公开涉及通过在悬浮液或3D培养条件下培养BGSC或BGSC群体而产生的细胞球、类器官、细胞聚集体或细胞簇。
在一个方面，本公开涉及一种治疗被诊断涉及或影响肝、胰腺、胃、肠或其他内胚层组织的疾病或病症的对象的方法，该方法包括向有此需要的对象施用有效量的BGSC或BGSC群体。
在一个方面，本公开涉及一种治疗被诊断涉及或影响肝、胰腺、胃、肠或其他内胚层组织的疾病或病症的对象的方法，该方法包括给予有效量的BGSC。
在一个方面，本公开涉及一种治疗被诊断涉及或影响肝、胰腺、胃、肠或其他内胚层组织的疾病或病症的对象的方法，该方法包括给予有效量的BGSC群体。
在一个方面，本公开涉及一种自体细胞或基因疗法的方法，其包括施用有效数量的BGSC或BGSC群体。
在一个方面，本公开涉及一种同种异体细胞或基因疗法的方法，其包括施用有效数量的BGSC或BGSC群体。
在一个方面，本发明涉及一种治疗被诊断涉及或影响肝、胰腺、胃、肠或其他内胚层组织的疾病或病症的对象的方法，该方法包括向有此需要的对象施用有效量的BGSC或BGSC群体，其中细胞是经过基因改造或修饰的细胞。
在一个方面，本发明涉及一种治疗被诊断涉及或影响肝、胰腺、胃、肠或其他内胚层组织的疾病或病症的对象的方法，该方法包括施用有效量的BGSC，其中细胞是经过基因改造或修饰的细胞。
在一个方面，本发明涉及一种治疗被诊断涉及或影响肝、胰腺、胃、肠或其他内胚层组织的疾病或病症的对象的方法，该方法包括施用有效量的BGSC群体，其中细胞是经过基因改造或修饰的细胞。
在一个方面，本公开涉及一种自体细胞或基因疗法的方法，其包括施用有效数量的BGSC或BGSC群体，其中细胞是经过基因改造或修饰的细胞。
在一个方面，本公开涉及一种同种异体细胞或基因疗法的方法，其包括施用有效数量的BGSC或BGSC群体，其中细胞是经过基因改造或修饰的细胞。
在一个方面，本公开涉及BGSC细胞在以自体或同种异体细胞或基因疗法治疗涉及或影响肝、胰腺、胃、肠或其他内胚层组织的疾病或病症的人和/或动物的用途。
在一个方面，本公开涉及BGSC细胞在以自体或同种异体细胞或基因疗法治疗涉及或影响肝、胰腺、胃、肠或其他内胚层组织的疾病或病症的人和/或动物的用途，其中细胞是经过基因改造或修饰的细胞。
在一个方面，本公开涉及BGSC细胞群体在以自体或同种异体细胞或基因疗法治疗涉及或影响肝、胰腺、胃、肠或其他内胚层组织的疾病或病症的人和/或动物的用途。
在一个方面，本公开涉及BGSC细胞群体在以自体或同种异体细胞或基因疗法治疗涉及或影响肝、胰腺、胃、肠或其他内胚层组织的疾病或病症的人和/或动物的用途，其中细胞是经过基因改造或修饰的细胞。
在一些实施方案中，细胞球、类器官、细胞聚集体或细胞簇，其进一步包含能够将BGSC或BGSC群体分化为后期谱系阶段的细胞(包括成熟细胞)的培养条件。
在一个方面，本公开涉及一种从对象的十二指肠、其一部分或取自其的样品中分离布鲁纳氏腺干/祖细胞(BGSC)或BGSC群体的方法，所述方法包括：
(a)消化或解离十二指肠、其一部分或从十二指肠取出的样品，以提供消化的或解离的细胞材料；
(b)从所述消化的或解离的细胞材料中获得：(i)表达Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9 、CK7、Lgr5、NIS、CD44和CK19中的一种或多种标志物的细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分细胞表达Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9 、CK7、Lgr5、NIS、CD44和CK19中的一种或多种标志物的细胞群体；和/或(ii)同时表达SOX17和PDX1的细胞或其中至少一些或实质性部分或大部分细胞同时表达SOX17和PDX1的细胞群体。
在一些实施方案中，将十二指肠、十二指肠的一部分、从十二指肠获取的样品、消化物、解离的细胞材料或其组合与介质或溶液接触，以基本上杀死、灭活或除去病原体和/或病原性和/或有益微生物。
在一个方面，本公开涉及从具有粘膜层和粘膜下层的组织或其部分或其样品分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分表达一种或多种期望的生物标志物的细胞群体，包括以下步骤，这些步骤可以按以下顺序发生，或者在其他实施方式中，可以按不同的顺序发生：
(a)在引起对粘膜层的细胞的渗透性休克的条件下，使具有粘膜层和粘膜下层的组织的粘膜层与渗透压特性不在生理范围内的介质或溶液接触；
(b)通过机械、外科手术和/或化学方法去除或溶解至少一部分粘膜层或其细胞，留下和/或暴露可包括粘膜下层的剩余部分；
(c)使该剩余部分与介质或溶液接触，以基本上杀死、灭活或去除病原体和/或病原性和/或有益微生物；
(d)消化或解离所述剩余部分；
(e)分离一种或多种多能细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分细胞表达一种或多种期望的生物标志物的细胞群。
在一些实施方案中，从具有粘膜层和粘膜下层的组织或其部分或其样品分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分表达一种或多种期望的生物标志物的细胞群体的方法，进一步包括去除表面粘液。
在一些实施方案中，从具有粘膜层和粘膜下层的组织或其部分或其样品分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分表达一种或多种期望的生物标志物的细胞群体的方法，其中渗透压特性不在生理范围内的介质或溶液包括低张力溶液、低渗溶液、高张力溶液或高渗溶液。
在一些实施方案中，从具有粘膜层和粘膜下层的组织或其部分或其样品分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分表达一种或多种期望的生物标志物的细胞群体的方法，其中渗透压特性不在生理范围内的介质或溶液包括葡萄糖溶液、高盐溶液或蒸馏水。
在一些实施方案中，从具有粘膜层和粘膜下层的组织或其部分或其样品分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分表达一种或多种期望的生物标志物的细胞群体的方法，所述去除通过化学破坏进行，所述化学破坏包括使用乳化剂和/或洗涤剂。
在一些实施方案中，从具有粘膜层和粘膜下层的组织或其部分或其样品分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分表达一种或多种期望的生物标志物的细胞群体的方法，所述洗涤剂和/或乳化剂在水、盐水和/或缓冲剂中。
在一些实施方案中，从具有粘膜层和粘膜下层的组织或其部分或其样品分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分表达一种或多种期望的生物标志物的细胞群体的方法，短时间使用洗涤剂和/或乳化剂(少于15分钟)。
在一些实施方案中，从具有粘膜层和粘膜下层的组织或其部分或其样品分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分表达一种或多种期望的生物标志物的细胞群体的方法，乳化剂选自卵磷脂、聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸酯(聚山梨酸酯20)、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯(聚山梨酯80)、聚氧乙烯山梨糖醇单棕榈酸酯(聚山梨酯40)、聚氧乙烯山梨糖醇单硬脂酸酯(聚山梨醇酯60)、聚氧乙烯山梨糖醇三硬脂酸酯(聚山梨酯65)、脂肪酸铵、脂肪酸的钠盐、钾盐和钙盐、脂肪酸的镁盐、脂肪酸的单甘油酯和二甘油酯、脂肪酸的甘油单酯的和甘油二酯的乙酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的乳酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的柠檬酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的单-和二乙酰酒石酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的乙酸和酒石酸混合酯、脂肪酸的蔗糖酯、蔗糖甘油酯、脂肪酸聚甘油酯、聚甘油蓖麻油酸酯、脂肪酸的丙基-1,2-二醇酯、与脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯相互作用的热氧化大豆油、硬脂酰-2-乳酸钠、硬脂酰-2-乳酸钙、山梨糖醇单硬脂酸酯、山梨糖醇三硬脂酸酯、山梨糖醇单月桂酸酯、山梨糖醇单油酸酯以及山梨糖醇单棕榈酸酯。
在一些实施方案中，从具有粘膜层和粘膜下层的组织或其部分或其样品分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分表达一种或多种期望的生物标志物的细胞群体的方法，所述洗涤剂选自1-庚磺酸、N-月桂基肌氨酸、月桂基硫酸盐、1-辛烷磺酸和牛磺胆酸、苯扎氯铵、十六烷基吡啶、甲基苄索氯铵，溴化十烃季铵、烷基甜菜碱、烷基酰胺基烷基甜菜碱、N-十二烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐、磷脂酰胆碱、N-癸基A-D-葡糖苷、N-癸基A-D-麦芽吡喃糖苷、N-十二烷基Β-D-麦芽糖苷、N-辛基Β-D-葡糖苷、N-十四烷基Β-D-麦芽糖苷、各种Triton(Triton X-100)、Nonidet-P-40、泊洛沙姆188、月桂基硫酸钠、脱氧胆酸钠以及十二烷基硫酸钠。
在一些实施方案中，从具有粘膜层和粘膜下层的组织或其部分或其样品分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分表达一种或多种期望的生物标志物的细胞群体的方法，基本上杀死、灭活或去除病原体和/或病原性和/或有益微生物的介质或溶液包括次氯酸钠(NaClO)的水溶液或用于皮肤或表面消毒的任何溶液或试剂。
在一些实施方案中，从具有粘膜层和粘膜下层的组织或其部分或其样品分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分表达一种或多种期望的生物标志物的细胞群体的方法，基本上杀死、灭活或去除病原体和/或病原性和/或有益微生物的介质或溶液的施用发生在施用洗涤剂和/或乳化剂之前，或者发生在消化或解离之后，或发生在去除粘液之后。
在一些实施方案中，从具有粘膜层和粘膜下层的组织或其部分或其样品分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分表达一种或多种期望的生物标志物的细胞群体的方法，所述剩余部分包括粘膜下层。
在一些实施方案中，从具有粘膜层和粘膜下层的组织或其部分或其样品分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分表达一种或多种期望的生物标志物的细胞群体的方法，所述消化或解离是通过酶进行的。
在一些实施方案中，从具有粘膜层和粘膜下层的组织或其部分或其样品分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分表达一种或多种期望的生物标志物的细胞群体的方法，在消化或解离步骤之前切碎组织样品。
在一些实施方案中，从具有粘膜层和粘膜下层的组织或其部分或其样品分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分表达一种或多种期望的生物标志物的细胞群体的方法，所述消化或解离将粘膜下组织分解为细胞悬液、细胞混合物、细胞簇、细胞团块或细胞聚集体和/或组织碎片。
在一些实施方案中，从具有粘膜层和粘膜下层的组织或其部分或其样品分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分表达一种或多种期望的生物标志物的细胞群体的方法，分离步骤是通过使用培养选择来进行的，培养条件包括无血清培养基，任选地为Kubota培养基。
在一些实施方案中，从具有粘膜层和粘膜下层的组织或其部分或其样品分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分表达一种或多种期望的生物标志物的细胞群体的方法，分离步骤是通过使用培养选择来进行的，培养条件包括含血清培养基。
在一些实施方案中，从具有粘膜层和粘膜下层的组织或其部分或其样品分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分表达一种或多种期望的生物标志物的细胞群体的方法，分离步骤是在低附着平板中进行的。
在一些实施方案中，从具有粘膜层和粘膜下层的组织或其部分或其样品分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分表达一种或多种期望的生物标志物的细胞群体的方法，分离的细胞或细胞群在支持或产生细胞球、一种或多种类器官、细胞簇或细胞聚集体的条件下培养。
在一些实施方案中，从具有粘膜层和粘膜下层的组织或其部分或其样品分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分表达一种或多种期望的生物标志物的细胞群体的方法，其进一步包括一个或多个使用生理上可接受的介质的洗涤步骤。
在一些实施方案中，从具有粘膜层和粘膜下层的组织或其部分或其样品分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分表达一种或多种期望的生物标志物的细胞群体的方法，其中所述组织是内胚层组织。
在一些实施方案中，从具有粘膜层和粘膜下层的组织或其部分或其样品分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分表达一种或多种期望的生物标志物的细胞群体的方法，其中所述组织选自气管、主支气管、食道、胃、十二指肠、小肠、大肠和直肠。
在一些实施方案中，从具有粘膜层和粘膜下层的组织或其部分或其样品分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分表达一种或多种期望的生物标志物的细胞群体的方法，其中所述组织选自肝、胰、胆囊和胆管树导管，其中胆管树导管包括总管和胆囊管。
附图简述
图1显示A)用高碘酸-希夫(PAS)染色的人十二指肠。十二指肠粘膜升高成肠绒毛，并折叠成肠隐窝(箭头)。粘膜下层(SM)充满PAS+腺体成分(布鲁纳氏腺：BG，虚线)。BG通过粘膜肌层(MM)与肠隐窝在解剖学上连续。很少的BG腺泡位于粘膜固有层内，并且与肠隐窝(右图中的箭头)连续。B)人十二指肠中细胞角蛋白7(CK7)的免疫组织化学。CK7由BG特异性表达，但不由肠隐窝表达。C)人十二指肠中SOX9的免疫组织化学。肠隐窝和BG均包含表达SOX9的细胞(箭头)。D)SOX9(红色)和CK7(绿色)的免疫荧光；细胞核显示为蓝色。在BG中，SOX9与CK7在同一细胞中共表达(箭头)。
图2显示A)人类十二指肠中增殖细胞核抗原(PCNA)、CD44、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、含亮氨酸富集重复序列的G蛋白偶联受体5(Lgr5)、Tra-1-60和Tra-1-81的免疫组织化学。PCNA+，CD44+，EpCAM+和Lgr5+细胞位于肠隐窝(箭头)和布鲁纳氏腺(箭头)中。Tra-1-60+和Tra-1-81+细胞位于布鲁纳氏腺(箭头)中，但不在肠隐窝中。MM ＝粘膜肌层。B)与多能性有关的转录因子的免疫组织化学和免疫荧光。Oct4A和SOX2在布鲁纳氏腺内的细胞中呈阳性，并在Tra-1-60+细胞中共表达(箭头)。
图3示出了A)在化学和机械去除粘膜之前和之后的人十二指肠的苏木精和曙红(H＆E)染色的切片。除少数肠隐窝(右图中的虚线圆圈)外，几乎除去了表面上皮(绒毛)和肠隐窝(箭头)内的所有上皮细胞。粘膜下层的布鲁纳氏腺被保留(星号)。B)机械和化学去除粘膜后人十二指肠中细胞角蛋白7(CK7)的免疫组织化学。保留了布鲁纳氏腺中的CK7+细胞。C)机械和化学去除粘膜后，人十二指肠中Tra-1-60的免疫组织化学。保留了布鲁纳氏腺中的Tra-1-60+细胞。MM=粘膜肌层。
图4示出了A-B)从十二指肠粘膜下层分离的细胞中上皮细胞粘附分子(EpCAM)、含亮氨酸富集重复序列的G蛋白偶联受体5(Lgr5)和Tra-1-60的流式细胞术。EpCAM和Tra-1-60免疫分选程序分别导致EpCAM+(A)和Tra-1-60+(B)群体的部分富集。C-D)培养选择策略进一步选择了Tra-1-60+细胞。在C中，将细胞以克隆密度接种在Kubota培养基中的塑料上。细胞在1-2天的滞后期后开始增殖，并在6-8天后形成10-15个细胞的小簇。14天后，观察到大的集落。每个集落都是由Tra-1-60+小的、致密堆积的且均匀的细胞形成的。在D中，细胞在适合类器官形成的条件下培养；单个布鲁纳氏腺干细胞(BGSC)开始自组织成球形结构，从而进一步扩大了大小和数量。类器官的形成决定了Tra-1-60+细胞的富集，Tra-1-60+细胞代表形成类器官的主要表型。Ph-C：相衬。比例尺= 200 µm。
图5示出了A-B)内胚层和多能性标志物的相衬(Ph-C)、苏木精和曙红(H＆E)和高碘酸-希夫(PAS)染色、免疫组化和免疫荧光。在图A中，布鲁纳氏腺干细胞(BGSC)在自我复制条件下(即无血清的Kubota培养基)培养。在图B中，在为类器官形成而定制的条件下培养BGSC。在这两种条件下，培养的细胞均表现出典型的表型，该表型与形成布鲁纳氏腺的细胞在原位观察到的表型相当。细胞核显示为蓝色。C-D)RT-PCR分析证实了内胚层(C)和多能性(D)基因的表达。胆管树干/祖细胞(BTSC)和Ntera细胞系分别用作内胚层和多能性基因的阳性对照。*=相对于另一组p ＜0.05。GOI=感兴趣的基因。
图6示出了A)体外肝细胞分化。在用于肝细胞分化(HDM-H)的激素限定培养基中培养的人类布鲁纳氏腺干/祖细胞(hBGSC)中的相衬(Ph-C)、高碘酸-希夫(PAS)染色和白蛋白的免疫荧光检测。在HDM-H 14天后，大多数细胞的形态明显改变为多边形细胞。这些细胞聚集形成多细胞索，呈PAS阳性(糖原贮积)并表达白蛋白。细胞核显示为蓝色。对在HDM-Liver中培养14天的细胞进行肝细胞标志物的实时PCR。与在自我复制条件下(即无血清Kubota培养基：KM)的细胞相比，肝细胞特异性基因(包括白蛋白(ALB)、转铁蛋白(TF)和细胞色素P450 3A4(CYP3A4))均增加。原代人肝细胞(hHeps)用作阳性对照。* ＝相对于其他组 p ＜0.05。GOI=感兴趣的基因。B)体外内分泌胰腺分化。在用于胰岛细胞分化(HDM-P)的激素限定培养基中培养的人类布鲁纳氏腺干/祖细胞(hBGSC)中神经源素3(NGN3)和胰岛素的Ph-C、苏木精和曙红(H＆E)染色和免疫荧光。在HDM-P中14天后，培养物中出现了胰岛样结构。这些聚集体均为NGN3和胰岛素阳性。核显示为蓝色。在HDM-P中培养14天的细胞中胰腺内分泌标志物的实时PCR。与自我复制条件下(即Kubota培养基：KM)的细胞相比，PDX1、胰岛素和胰高血糖素的含量大大增加。正常胰岛细胞用作阳性对照。*=相对于KM中的hBGSC p <0.05。GOI=感兴趣的基因。
图7显示通过脾脏内注射将人类布鲁纳氏腺干细胞(hBGSC)体内移植到SCID小鼠的肝脏中。A)30天后，表达人类线粒体抗原(hMito)的细胞存在于小鼠肝脏中，并且大部分位于肝门三联征空间(箭头)周围。注射盐水(Veh)的小鼠中没有阳性细胞。B)hMito阳性细胞占鼠肝中肝细胞的近5％。C)通过RT-qPCR在注射hBGSC的小鼠的肝脏中检测到人白蛋白(hALB)基因的表达，但在注射Veh的小鼠的肝脏中未检测到(ND：未检测到)。数据表示为三个实验的平均值±SD。D-E)双重免疫荧光证实了同一细胞中成熟人类肝细胞标志物的表达，例如人白蛋白(hAlb)、Hep-Par1和hMito。核(Nu)显示为蓝色。
图8显示十二指肠粘膜的选择性溶解。A)灌洗法；B)十二指肠端部的夹紧；C)组织切开和粘液清除；D)使用滤器进行机械过滤。
图9显示人十二指肠中细胞角蛋白7(CK7)的免疫组织化学。十二指肠壁由粘膜层，粘膜下层和肌层组成。布鲁纳氏腺(BG)位于粘膜下层。CK7由BG特异性表达，但在肠隐窝中的细胞不表达。右侧图像放大了框中的区域。
图10显示A)人十二指肠中SOX9(红色)和Lgr5(绿色)的免疫荧光。核显示为蓝色。在布鲁纳氏腺(位于虚线内)中，Lgr5与SOX9(箭头)共定位，其在粘膜肌层内部与肠隐窝(箭头)连续的腺泡中的表达高于在粘膜下层深处的腺泡中的表达。MM ＝粘膜肌层。B-D)钠/碘化物转运蛋白(NIS)的免疫组织化学。NIS在肠隐窝的底部(A和C图中的箭头)和布鲁纳氏腺(A和B图中的箭头)中表达。
图11显示去除粘膜上皮细胞与保留粘膜下生存力相结合的不成功的方案和程序。程序＃1：手术解剖，＃2事先在粘膜下注射生理盐水再进行粘膜切除术，＃3刮除粘膜。如苏木精和曙红(H＆E)和高碘酸席夫(PAS)染色所示，这些策略导致了粘膜层的部分去除，并保留了肠绒毛(箭头)和隐窝(箭头)。
图12显示了在用于胰岛细胞分化(HDM-P)的激素限定的培养基中培养7天的人类布鲁纳氏腺干细胞/祖细胞(hBGSC)的实时PCR。与在自我复制条件下(例如，Kubota培养基：KM)的细胞相比，PDX1和胰高血糖素基因(而非胰岛素基因)在7天后高度增加。正常胰岛细胞用作阳性对照。*=相对于KM中的hBGSC p <0.05。GOI=感兴趣的基因。
图13显示小鼠的十二指肠粘膜下腺相对于肠隐窝是不同的区室，并显示出增殖特征。A)描绘了小鼠(m)十二指肠中细胞角蛋白19(Ck19)、SOX9和增殖细胞核抗原(PCNA)的苏木精和曙红(H＆E)染色以及免疫荧光染色。虚线可区分肠隐窝与粘膜下腺之间的界面(SG：星号)。十二指肠中的SG是可区分的，因为与隐窝相比，它们的细胞质更清晰，并且它们的粘液含量也很高。在啮齿动物十二指肠中，肠隐窝和绒毛呈Ck19阳性，而SG(白色星号)几乎呈阴性。SOX9+细胞主要位于SG(绿色细胞)内，而PCNA+细胞主要位于肠隐窝(红色细胞)内。核显示为蓝色。比例尺= 200μm(H＆E和Ck19)或100μm(SOX9/PCNA)。B)显示鼠科动物(m)空肠中Ck19、SOX9和PCNA的苏木精和曙红染色和免疫荧光染色。在啮齿动物的空肠中，肠隐窝和绒毛呈Ck19阳性。与十二指肠的区别是SOX9+细胞位于隐窝中并共表达PCNA(黄色箭头)。核显示为蓝色。比例尺=200μm(H＆E和Ck19)或100μm(SOX9/PCNA)。C)显示他莫昔芬注射后14天在Krt19CreTdTomatoLSL小鼠中Ck19和TdTomato(Td-Tom)的免疫荧光。在鼠科动物(m)的空肠中，大多数肠隐窝是Td-Tom+(红色箭头)，阴性隐窝(绿色箭头)位于阳性隐窝附近。位于Td-Tom+隐窝上方的绒毛完全是td-Tom阳性的。在鼠科动物的十二指肠中，SG主要是td-Tom-和Ck19-，因此排除它们来源于td-Tom+隐窝(红色箭头)。白色星号表示SG。虚线可区分肠隐窝和SG之间的界面。核显示为蓝色。比例尺=200μm。D)在鼠科动物的十二指肠中，PCNA+505和SOX9+细胞始终为Td-Tom阴性(红色箭头)。黄色和绿色箭头指示十二指肠中Td-Tom+肠隐窝为PCNA阳性和SOX9阴性。核显示为蓝色。虚线可区分肠隐窝和SG之间的界面。图13中的图像代表n=5只动物。
图14显示在体外可以将从十二指肠粘膜下分离的Tra-1-60+细胞限制于内分泌胰腺，并显示出体内分化为胰岛素+细胞的能力。A-C)体外内分泌胰腺分化。图A)显示了从人十二指肠粘膜下腺分离并在用于胰腺分化(PM)或自我复制条件(Kubota培养基：KM )的特定培养基中培养的细胞的相衬(Ph-C)和苏木素-曙红(H＆E)染色。在PM中，胰岛样结构在7天后(PM7)出现，数量在14天后(PM14)增加。与其他组相比，* p <0.001。比例尺=100μm。n=5个生物学重复。B)实时(RT)-PCR显示PM7-14中PDX1基因表达增加；通过免疫荧光证实了583核Pdx1表达。n=4个生物学重复。C)描绘了在PM14中胰岛素(INS)和胰高血糖素(GLU)基因表达增加(n=4个生物学重复)。以人胰岛细胞(ISL)为参照(n=3个生物学重复)。在14天PM中，通过免疫荧光，胰岛样结构显示胰岛素和胰高血糖素的表达。比例尺=100μm。D-G)显示了实验性诱导的小鼠糖尿病可在体内在dSG中引发增殖和胰腺特性(每组n=5只动物)。D)显示了与对照(CTR)相比，链脲佐菌素(STZ)处理的小鼠具有增加程度的dSG面积分数(星号)。虚线将dSG与肠隐窝区分开来。比例尺=200μm。E)显示了通过免疫荧光(IF)测定，与对照相比，STZ小鼠中的dSG具有增加的增殖细胞核抗原(PCNA)、Pdx-1、Neurogenin3(Ngn3)和胰岛素的表达。比例尺= 100μm。F)描绘了IF得分的热图。G)描绘了通过RT-PCR分析确定的，与对照相比，来自啮齿动物STZ小鼠十二指肠的标本中，NGN3和INS基因的表达略有增加。相同小鼠的胰腺组织用作参照。H)显示从患有2型糖尿病(T2D)的患者中获得的人十二指肠中胰岛素表达的研究。在这些器官(n=5十二指肠)中，SG中存在很少的胰岛素+细胞(箭头)。胰腺组织显示在右侧。比例尺=50μm。在免疫荧光中，细胞核显示为蓝色。对于A-D和G，误差线表示平均值±s.d。对于A-D和G，p值通过两尾t检验确定。
图15描绘了通过人十二指肠球的内窥镜活检获得的自我复制的布鲁纳氏腺细胞。A)显示通过活检收集布鲁纳氏腺(星号)的粘膜下层(左图)。布鲁纳氏腺中表达SOX9的细胞用箭头指示(右图)。B)显示了从在自我复制条件下培养的从胎儿十二指肠分离出的布鲁纳氏腺细胞获得的体外细胞集落(虚线)。
详细描述
定义
如在本发明的说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一”、“一个”和“该”也意图包括复数形式，除非上下文另外明确指出。
如本文所用，术语“约”在涉及诸如量或浓度等可测量值时，意在涵盖所指定数量的20％、10％、5％、1％、0.5％或0.1％的变化。
当用于描述本文公开的任何组分、范围、剂型等的选择时，术语 “可接受的”，“有效的”或“足够的”意指所述组分、范围、剂型等适用于本公开的目的。
同样如本文中所使用的，“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关联的所列项目的任何和所有可能的组合，以及当以替代方式(“或”)来解释时不进行组合。
如本文所用，术语“包括”旨在表示所述组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。如本文所用，过渡短语“基本上由...组成”(和语法变体)应解释为涵盖所列举的材料或步骤“以及实质上不影响所列举的实施方式的基本的和新颖的特征的那些材料和步骤”。参见In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.P.Q. 461, 463 (CCPA 1976)着重符为原文)；另请参阅MPEP§2111.03。因此，本文所使用的术语“基本上由...组成”不应解释为等同于“包含”。“由...组成”是指排除痕量或微量元素的其他成分以及用于施用本文公开的组合物的实质性的方法步骤。这些过渡术语中的每一个所定义的方面都在本公开的范围内。
当涉及特定分子、生物材料或细胞材料时，术语“等效”或“生物等效”可互换使用，并且意指那些具有最小同源性而仍保持所需结构或功能的物质。
如本文所使用的，术语球体是指基本上或大部分相同类型的细胞的聚集体，其已经组织成三维(3D)结构，使细胞能够在悬浮培养环境中相互作用。
如本文所用，术语类器官是指已组织成使细胞能够在悬浮培养环境中相互作用的三维(3D)结构的一种或多种类型的细胞的聚集体。在某些情况下，类器官可以模仿[人类或动物]器官或组织的结构和功能。
如本文所用，术语微生物是指可能是或可能不是致病性的或引起疾病的，或者可能有益或可能无益的微生物，其可能驻留在被处理以获得所需细胞或细胞群的组织内部或外部。
如本文所用，术语“表达”是指DNA或多核苷酸被转录成mRNA的过程和/或被转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可包括在真核细胞中剪接mRNA。基因的表达水平可以例如通过测量细胞或组织样品中的mRNA或蛋白质的量来确定。此外，可以确定多个基因的表达水平以建立特定样品的表达谱。
如本文所用，术语“功能性”可用于修饰任何分子、生物材料或细胞材料，表示其实现一定的效果。
如本文所用，术语“基因”或“遗传”意指笼统地包括任何核酸序列，其可被或可不被转录成RNA分子，无论该DNA或RNA是编码的(例如，mRNA)还是非编码的(例如，ncRNA)。术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性示例：基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、microRNA、转移RNA、核糖体RNA、RNAi、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。
如本文所用，术语“经基因工程改造或修饰”意在笼统地包括细胞或其遗传物质的任何形式的修饰，包括但不限于基因或遗传物质的缺失、添加或调节、重组DNA技术、通过病毒载体或电穿孔进行遗传修饰、通过CRISPER(聚簇有规律间隔的短回文重复序列)或其他方式进行基因靶向或编辑、缺失或添加DNA片段、基因突变校正等。
多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在多核苷酸组装之前或之后赋予核苷酸结构修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸成分打断。多核苷酸可在聚合后进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。该术语还指双链和单链分子。除非另有说明或要求，否则本技术的多核苷酸的任何方面都包括双链形式以及已知或预测组成双链形式的两个互补单链形式的每一个。
术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用，并且在其最广义上是指两个或多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或拟肽的化合物。亚基可以通过肽键连接。在另一方面，亚基可以通过其他键(例如酯、醚等)连接。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对可以构成蛋白质或肽序列的最大氨基酸数没有限制。如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L旋光异构体、氨基酸类似物和拟肽。
如本文所用，术语“对象”和“患者”可互换使用，并且旨在表示任何人或动物。在一些实施方案中，对象可以是哺乳动物。在进一步的实施方案中，对象可以是人类或非人类动物(例如小鼠或大鼠)。
术语“组织”在本文中用于指活的或死的生物的组织，或源自或设计为模仿活的或死的生物的某些方面的任何组织。该组织可以是健康的、患病的和/或具有遗传突变或修饰。如本文所用，术语“天然组织”或“生物组织”及其变体是指以其天然状态或自从生物体衍生时未改变的状态存在的生物组织。“微器官”是指模拟或模仿“天然组织”的“生物工程组织”的一部分。
生物组织可以包括任何单个组织(例如，可以相互连接的细胞的集合)或组成生物体的器官或部分或区域的组织群。组织可以包括均质或异质的细胞材料，或者可以是复合结构，诸如在包括胸部的身体区域中发现的复合结构，其可以包括肺组织、骨骼组织和/或肌肉组织。示例性组织包括但不限于源自肝、肺、甲状腺、皮肤、胰腺、血管、膀胱、肾脏、脑、胆管树、十二指肠、腹主动脉、肠骨静脉、心脏和肠的组织，包括其任何组合 。
如本文所用，术语“分离的”是指基本上不含其他材料的分子或生物材料或细胞材料。术语“分离的”也用于描述已经从其天然环境(例如，从体内到离体或体外)移除的材料。如本文所用，术语“无菌的”是指不含细菌或其他活的微生物(即，无菌的(aseptic)、灭菌的、无菌的(germ-free)、防腐的、消毒的等)的材料。
分离的布鲁纳氏腺干/祖细胞和细胞培养基
如本文所用，术语“细胞”是指真核细胞。在各种实施方案中，该细胞是人或动物来源的，并且可以是干细胞或祖细胞或体细胞。术语“细胞群体”是指一群相同或不同细胞类型的一种或多种细胞，其中至少一些或实质性部分或大部分细胞具有相同或不同的起源和/或谱系阶段。在一些实施方案中，该细胞群可衍生自细胞系。在一些实施方案中，该细胞群可以源自器官或组织、其一部分或它们的样本。
术语“干细胞”是指可以自我复制(产生与亲代细胞相同的子代细胞)并且具有多能性的细胞群体，多能性是指可以产生一种以上类型的成年细胞。本文所使用的术语“祖细胞”或“前体”也是多能的，尽管祖细胞或前体的多能性的范围或程度可能比干细胞的多能性更有限。术语“祖细胞”或“前体”也被广义地定义为涵盖干细胞的子代及其后代。祖细胞是可以是多能、双能或单能的细胞群，但与干细胞相比，其自我复制的能力可能更有限。定向祖细胞是可以分化成特定谱系的祖细胞。干细胞的非限制性实例包括但不限于胚胎干(ES)细胞、诱导多能干(iPS)细胞、胚层干细胞、确定性干细胞、成体干细胞、围产期干细胞、羊水来源的干细胞、间充质干细胞(MSC)和成血管细胞。干细胞和定向祖细胞之间的中间形式包括例如成肝细胞和胰导管祖细胞等细胞群，以及其他形式的转运扩增细胞，这些细胞可能是多能的，但自我复制能力可能有限。
本公开中感兴趣的细胞在本文中称为布鲁纳氏腺干/祖细胞(BGSC)，并且可以源自人或动物的十二指肠(在肠中没有其他地方)。这些BGSC至少基于以下特征可与肠干细胞区分开：
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申请人首次认识到十二指肠及其布鲁纳氏腺是重要的干/祖细胞小体，它们是位于十二指肠粘膜下层的腺中的干/祖细胞小体的网络的一部分，产生了肝脏、胰腺和其他内胚层细胞和组织，并持续到成年。BGSC是布鲁纳氏腺(也称为十二指肠粘膜下腺)内细胞的一个小的亚群(例如，约5％)，并且可以识别为表达多能性基因(例如TRA-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2和NANOG)的细胞。BGSC与肝脏、胆道树、胰腺、肠和具有以下生物标志物的其他内胚层组织有关，这些标志物可能包括Lgr5、NIS、CD44、CK19、SOX9和EpCAM，和/或可能同时包括SOX17和PDX1。
如上所述，BGSC与肠干细胞不同：BGSC表达Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4和CK7，而肠干细胞则不表达。BGSC与肝干细胞和胰腺干细胞的区别还在于BGSC同时表达SOX17和PDX1，而肝干细胞表达SOX17但不表达PDX1，而胰腺干细胞表达PDX1但不表达SOX17。
因此，一方面，本公开涉及从十二指肠分离的BGSC，BGSC表达选自Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9和CK7的一种或多种标志物，其进一步的特征是能够在支持自我更新的培养条件下以有限或最小程度的分化增殖。在另一方面，从十二指肠分离的BGSC表达选自Lgr5、NIS、CD44和CK19的一种或多种标志物，并且所述BGSC的特征还在于能够在支持自我更新的培养条件下以有限或最小程度的分化增殖。在另一方面，从十二指肠分离的BGSC表达SOX17和PDX1，并且BGSC的进一步特征在于能够在支持自我更新的培养条件下以有限或最小程度的分化增殖。在一些实施方案中，分离的BGSC可表达选自Tra 1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44、CK19和同时有SOX17和PDX1的一种或多种标志物。在一些实施方案中，分离的BGSC基本上不含病原体和/或不含病原性和/或有益微生物。
在一些实施方案中，分离的BGSC可以以有限或最小程度的分化增殖至少一个月。在一些实施方案中，分离的BGSC可以有限的分化或最小程度的分化增殖至少两个月。在一些实施方案中，分离的BGSC可以以有限的或最小程度的分化增殖至少六个月或至少十二个月。
在一些实施方案中，支持BGSC自我更新的培养条件包含无血清培养基。在一些实施方案中，无血清培养基包含Kubota培养基。
术语“培养”或“细胞培养”是指在体外环境中维持细胞。本文所用的“细胞培养系统”是指其中细胞群可以离体(体外)生长的培养条件。培养物可以由单一类型的细胞或不同细胞类型的混合物组成。
细胞培养物包括单层培养物，其中将细胞涂在有或没有涂层(如细胞外基质成分的涂层)的表面上，并在营养培养基(矿物质、维生素、氨基酸、脂质)中补充生物学液体(例如血清或淋巴液)和/或激素、生长因子和细胞因子的确定混合物(激素确定的培养基或HDM)。HDM是根据经验以其在特定成熟谱系阶段对特定类型的细胞或细胞群的有用性来定义的。
细胞培养物也可以是铺板在低附着皿上的漂浮细胞簇或细胞聚集体，和/或可以是悬浮培养物。支持漂浮的细胞簇或聚集体和/或悬浮培养物的培养基可以是用于单层培养的培养基。培养基可以不含血清，也可以含有血清。无血清培养基缺乏可导致漂浮的聚集体形成单层的附着蛋白(例如纤连蛋白)。如果漂浮的聚集体基本上或主要由一种细胞类型组成，则它们被称为球体。如果它们由多种细胞类型[例如，上皮细胞和间充质细胞伴侣]组成，则它们被称为类器官。漂浮在悬浮培养物中的细胞簇或聚集体、球体和类器官被认为处于3D微环境中，并且细胞能够在三个维度上相互作用。
本文使用的“培养基”是指用于细胞的培养、生长或增殖的营养液。培养基的特征可以在于功能特性，例如但不限于将细胞维持在特定状态(例如多能状态、静止状态等)的能力、促进细胞成熟的能力、以及在某些情况下促进多能细胞分化为特定谱系的细胞的能力。
培养基的非限制性实例是血清补充培养基(SSM)，它是补充有血清(来自通常为商品和农产品而被屠杀的动物)的任何基础培养基，血清水平通常为约10％。
如本文所用，术语“分离的”是指基本上不含其他材料(培养基和/或细胞外基质及其各自的组分除外)的分子或生物材料或细胞材料。术语“分离的”也用于描述已经从其天然环境(例如，从体内到离体或体外)移除的材料。
如本文所用，术语“灭菌的、消毒的或杀菌的”是指不含病原体和/或病原性和/或有益的微生物(即，无菌的、灭菌的、杀菌的、抗菌的、消毒的等)的材料。
分离的BGSC群
在另一方面，本公开涉及从十二指肠分离的干/祖细胞群，其中至少一些或实质性部分或大部分细胞表达选自Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9和CK7的一种或多种标志物，并且其特征还在于能够在支持自我更新的培养条件下以有限或最小限度的分化增殖。在另一方面，本公开涉及从十二指肠分离的干/祖细胞群，其中至少一些或实质性部分或大部分细胞表达选自Lgr5、NIS、CD44和CK19的一种或多种标志物。在另一方面，本公开涉及从十二指肠分离的干/祖细胞群，其中至少一些或实质性部分或大部分细胞表达SOX17和PDX1。在一些实施方案中，从十二指肠分离的干/祖细胞群中的至少一些或实质性部分或大部分细胞表达选自Tra 1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44、CK19以及同时有SOX17和PDX1的一种或多种标志物。
在一些实施方案中，前段中所述的分离的干/祖细胞群基本上不含病原体和/或不含病原性和/或有益微生物。
在一些实施方案中，本公开涉及包含分离的BGSC群体的组合物，其表达选自Tra1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44、CK19以及同时有SOX17和PDX1的一种或多种标志物，并且在某些实施方案中，该BGSC群体已被灭菌、杀菌或消毒。
在另一个方面，本公开涉及通过培养分离的BGSC群体产生的类器官，在BGSC群体中至少一些或实质性部分或大部分细胞表达选自Tra 1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44和CK19以及同时有SOX17和PDX1的一种或多种标志物，并且其进一步特征为能够在支持自我更新的培养条件下以有限的或最小限度的分化增殖，并且任选地可以在低附着板上或悬浮液中进行培养。在一些实施方案中，类器官还包含培养基，其中所述培养基能够将BGSC分化为后期谱系阶段细胞，包括成熟细胞。
在一些实施方案中，支持自我更新的培养条件包括无血清培养基。在一些实施方案中，无血清培养基包含Kubota培养基。
在一些实施方案中，无血清培养条件是针对细胞(上皮细胞或间充质细胞)的特定成熟谱系阶段设计的激素确定培养基(HDM)。除SSM外，还有无血清的HDM培养基，可用于细胞(上皮细胞或间充质细胞)的特定成熟谱系阶段。它的一个例子是Kubota培养基，一种无血清培养基，专为内胚层干/祖细胞设计，由无铜、低钙的基础培养基(含有矿物质、氨基酸、糖、盐、维生素、脂质的营养培养基)组成，并补充有胰岛素、转铁蛋白/铁和各种脂质，但无细胞因子或生长因子。这种培养基可以支持来自肝脏、胰腺、肺和肠的内胚层干/祖细胞。
如本文所用，“Kubota培养基”是指不包含铜但包含钙(<0.5mM)、硒、锌、胰岛素、转铁蛋白/铁、与纯化的白蛋白结合的游离脂肪酸混合物的任何培养基，其任选地包含高密度脂蛋白(HDL)。在一些实施方案中，Kubota培养基包括任何无铜、低钙(例如0.3 mM)、~10-9M硒、~0.1％牛血清白蛋白或人血清白蛋白(高纯度且不含脂肪酸)、~4.5 mM烟酰胺、~0.1 nM七水合硫酸锌、~10-8 M氢化可的松(用于肝但非胰腺前体的可选成分)、~5 µg/ml铁传递蛋白/ Fe、~5 µg/ml胰岛素、~10 µg/ml高密度脂蛋白以及纯化的游离脂肪酸混合物(与纯化的血清白蛋白结合后添加)的培养基(例如RPMI 1640或DMEM-F12)。游离脂肪酸混合物由各~100 mM的棕榈酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和硬脂酸组成。用于制备该培养基的非限制性示例性方法已经在其他地方公开，例如，Kubota H, Reid LM, Proc. Nat. Acad. Scien. (USA) 2000；97:12132-12137，其公开内容被并入本文。
还可以设计其他无血清的HDM，以驱动干/祖细胞到达特定的成年命运，例如肝细胞(HDM-H)或胆管细胞(HDM-C)。一些这样的HDM在下文进一步定义。在一些实施方案中，培养基可以是用于将细胞呈现或引入给定环境的“种子培养基”。在其他实施方案中，培养基可以是用于促进细胞分化的“分化培养基”。
此类培养基由“基础培养基”构成，其是营养素、矿物质、氨基酸、糖、脂质和微量元素的混合物(例子包括Dulbecco改良Eagle培养基或DME以及Ham F10或F12以及RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute建立的确定性基础培养基))。这些基础培养基可以补充血清(补充血清的培养基或SSM)或纯化的激素、生长因子和营养素的确定性混合物(激素定义培养基(HDM))，并用于细胞的离体维持。如本文所用，“ HDM-H”是用于类器官或铺在IV型胶原和层粘连蛋白的基质上的单层培养物以驱动内胚层干/祖细胞分化为成熟肝细胞的HDM。HDM-C是用于类器官或铺在I型胶原和纤连蛋白基质上的单层细胞以驱动细胞成为成熟的胆管细胞的HDM。
特定的激素定义培养基(HDM)成分在下文进行了更详细的描述：
• 改良的KM(MKM)：以下所有三个HDM都使用了KM，并进一步补充钙以达到0.6 mM的浓度，10-12 M的铜和20 ng/ml的FGF。
• 肝细胞分化(HDM-L)：通过在MKM中补充7μg/ L胰高血糖素、2g/L半乳糖、1nM三碘甲状腺素3(T3)、10 ng/ml抑瘤素M(OSM)、10 ng/ml 表皮生长因子(EGF)、20 ng/ml肝细胞生长因子(HGF)和1 µm地塞米松而制备。
• 胆管细胞分化(HDM-C)：通过在MKM中补充20 ng/ml血管内皮细胞生长因子(VEGF)165和10 ng/ml HGF来制备。
• 用于胰腺分化的确定性培养基(PM或HDM-P)：使用不含氢化可的松的MKM制备，并进一步补充2％B27、0.1 mM抗坏血酸、0.25 µM环巴胺、1 µM视黄酸，前4天使用bFGF，剩余的时间用50 ng/ml 艾塞那肽-4和20 ng/ml HGF代替。
基础培养基是用于细胞培养的缓冲液，由氨基酸、糖、脂质、维生素、矿物质、盐、微量元素和各种营养物质组成，可模拟细胞周围组织液的化学成分。另外，细胞培养基通常由基础培养基组成，其补充有小百分比(通常为2-10％)的血清，以提供驱动生物过程(例如增殖、分化)所需的必需信号传导分子(激素、生长因子)。尽管血清可以与培养物中所用的细胞类型是自体同源的，但最常见的是通常出于农业或食品目的而被常规屠宰的动物的血清，例如牛、绵羊、山羊、马等的血清。血清还用于灭活酶，它是组织解离过程的一部分。
从具有粘膜层和粘膜下层的组织中分离多能细胞的方法
在另一方面，本公开涉及一种从具有粘膜层和粘膜下层的组织分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能干/祖细胞或其中至少一些或实质性部分或大部分细胞表达该期望的生物标志物的群体的方法，所述方法包括：
(a)在诱导对粘膜层细胞的渗透性休克的条件下，使基本上不含肠粘液的十二指肠粘膜层与渗透压特性不在生理范围内的介质或溶液接触；
(b)通过机械、外科手术和/或化学方法除去或溶解至少一部分粘膜层或其细胞，留下和/或暴露可包括粘膜下层的剩余部分；
(c)消化或解离所述剩余部分；和
(d)从消化的剩余部分中分离出一种或多种BGSC或细胞群。
如本文所用，术语“渗透性休克”是指相对于细胞内的生理渗透压的渗透压变化，其引起细胞损伤。在一些实施方案中，通过在对细胞诱导渗透性休克的条件下施加渗透压特性不在生理范围内的介质或溶液，从而通过渗透性休克破坏细胞。渗透压特性不在生理范围内的介质或溶液可以是渗透压比生理渗透压低的低张力或低渗透压或低渗溶液。渗透压特性不在生理范围内的介质或溶液可以是渗透压比生理渗透压高的高张力或高渗透压或高渗溶液。渗透压特性不在生理范围内的介质或溶液可以是任何种类的溶液。在一些实施例中，渗透压特性不在生理范围内的介质或溶液可以是水、超纯水、蒸馏水、5％葡萄糖溶液、高盐溶液等。
渗透性休克可以通过将渗透压特性不在生理范围内的介质或溶液以可导致十二指肠膨胀的量施加到内腔来诱导，或者通过将这种介质或溶液施加到组织的粘膜层来诱导。在一些实施方案中，渗透压特性不在生理范围内的介质或溶液可以与内腔或粘膜层接触约0.5分钟、1分钟、约2分钟、约5分钟、约10分钟或约15分钟。
在一些实施方案中，从具有粘膜层和粘膜下层的组织中分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞或包括这种细胞的群体的方法，其包括在选择或分离步骤之前将混合物进一步加工成细胞悬浮液。在一些实施方案中，从具有粘膜层和粘膜下层的组织中分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞或包括这种细胞的群体的方法，其包括使用生理学上可接受的介质进行一个或多个洗涤步骤。
从具有粘膜层和粘膜下层的组织中分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞或群体的方法，可用于从具有粘膜层和粘膜下层的任何合适的组织中分离多能干细胞。在一些实施方案中，该组织是内胚层组织。在一些实施方案中，该组织选自小肠、大肠、直肠。在一些实施方案中，该组织选自气管、主支气管、食道、胃和十二指肠。
在一个特定方面，本公开涉及一种从对象的十二指肠获取的组织、该组织的一部分或该组织的样品中分离一种或多种BGSC或包括BGSC的群体的方法，该方法包括：
(a)去除肠粘液；
(b)在诱导渗透性休克的条件下，将渗透压特性不在生理范围内的介质或溶液施加到粘膜层的细胞上；
(c)通过机械、外科和/或化学方法除去或溶解至少一部分粘膜层或其细胞，留下和/或暴露可包括粘膜下层的剩余部分；
(d)将一种介质或溶液施加到粘膜层和/或所述剩余部分上，以基本上杀死、灭活或去除病原体和/或病原性和/或有益微生物；
(e)对包括粘膜下层在内的所述剩余部分进行消化或解离，以产生消化物、解离的细胞物质或细胞悬液；
(f)任选地从细胞悬液中培养至少一些消化物、解离的细胞物质或细胞；以及
(g)分离表达Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44、CK19 中的一种或多种的细胞或其中至少一些或实质性部分或大部分表达Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44、CK19 中的一种或多种的细胞群和/或同时表达SOX17和PDX1的细胞。
如本文所用，术语“剩余部分”是指粘膜层被部分或完全破坏和/或去除而暴露出粘膜下层的组织、其一部分或该组织的样品。所需的多能细胞(例如BGSC)被包含在剩余的粘膜下层内。
在从对象的十二指肠、其一部分或其样品中分离一种或多种BGSC或包括BGSC的群体的方法的一些实施方案中，去除步骤通过化学破坏来进行，其包括使用乳化剂和/或洗涤剂。在一些实施方案中，用次氯酸钠溶液进行步骤(d)的消毒或灭菌。在一些实施方案中，消化是通过酶进行的。在分离一种或多种BGSC或包括BGSC的群体的方法的一些实施方案中，去除或溶解步骤后的剩余部分包括粘膜下层，而被消化的剩余部分包括组织片段。在分离一种或多种BGSC或包括BGSC的群体的方法的一些实施方案中，在消化步骤(e)之前切碎组织或组织部分或样品。在分离一种或多种BGSC或包括BGSC的群体的方法的一些实施方案中，分离步骤(f)使用具有无血清培养基(可选地为Kubota培养基)的培养条件进行培养选择来进行。在分离一种或多种BGSC或包括BGSC的群体的方法的一些实施方案中，分离步骤(f)是使用具有血清的培养条件的培养选择进行的。在分离一种或多种BGSC或包括BGSC的群体的方法的一些实施方案中，消化步骤(e)和/或分离步骤(f)在低附着板上进行。在分离一种或多种BGSC的方法的一些实施方案中，将分离的细胞在支持或产生球体、一种或多种类器官、细胞簇或细胞聚集体的悬浮液或3D条件下培养。
机械破坏/粘膜切除术可以通过各种可能的去除粘膜层的程序和工具来完成。在一些实施方案中，将细胞表面层剥离。机械破坏细胞层的许多不同方法是已知的，例如使用小珠子剪切细胞壁，使用超声处理破坏细胞壁，使用研钵和研杵研磨，使用搅拌器，使用冷冻和解冻循环，使用微波破坏细胞壁内的键并使蛋白质变性，或使用高压等。
在分离一种或多种BGSC或包括BGSC的细胞群的方法的一些实施方案中，去除或溶解步骤通过化学破坏来进行，所述化学破坏包括使用乳化剂，乳化剂选自卵磷脂、聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸酯(聚山梨酸酯20)、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯(聚山梨酯80)、聚氧乙烯山梨糖醇单棕榈酸酯(聚山梨酯40)、聚氧乙烯山梨糖醇单硬脂酸酯(聚山梨醇酯60)、聚氧乙烯山梨糖醇三硬脂酸酯(聚山梨酯65)、脂肪酸铵、脂肪酸的钠盐、钾盐和钙盐、脂肪酸的镁盐、脂肪酸的单甘油酯和二甘油酯、脂肪酸的甘油单酯的和甘油二酯的乙酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的乳酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的柠檬酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的单-和二乙酰酒石酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的乙酸和酒石酸混合酯、脂肪酸的蔗糖酯、蔗糖甘油酯、脂肪酸聚甘油酯、聚甘油蓖麻油酸酯、脂肪酸的丙基-1,2-二醇酯、与脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯相互作用的热氧化大豆油、硬脂酰-2-乳酸钠、硬脂酰-2-乳酸钙、山梨糖醇单硬脂酸酯、山梨糖醇三硬脂酸酯、山梨糖醇单月桂酸酯、山梨糖醇单油酸酯以及山梨糖醇单棕榈酸酯。
在分离一种或多种BGSC的方法的一些实施方案中，去除或溶解步骤通过化学破坏来进行，所述化学破坏包括使用洗涤剂，所述洗涤剂选自1-庚磺酸、N-月桂基肌氨酸、月桂基硫酸盐、1-辛烷磺酸和牛磺胆酸、苯扎氯铵、十六烷基吡啶、甲基苄索氯铵，溴化十烃季铵、烷基甜菜碱、烷基酰胺基烷基甜菜碱、N-十二烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐、磷脂酰胆碱、N-癸基A-D-葡糖苷、N-癸基A-D-麦芽吡喃糖苷、N-十二烷基Β-D-麦芽糖苷、N-辛基Β-D-葡糖苷、N-十四烷基Β-D-麦芽糖苷、各种Triton(Triton X-100)、Nonidet-P-40、泊洛沙姆188、月桂基硫酸钠、脱氧胆酸钠以及十二烷基硫酸钠。
在一个方面，本公开涉及一种从对象的十二指肠获取的组织样品中分离一种或多种BGSC或包括BGSC的群体的方法，该方法包括：
(a)在诱导对粘膜层细胞的渗透性休克的条件下，使粘膜层与渗透压特性不在生理范围内的溶液接触；
(b)通过机械、外科和/或化学方法去除或溶解至少一部分粘膜层或其细胞，留下和/或暴露可包括粘膜下层的剩余部分；
(c)使所述剩余部分与介质或溶液接触，以基本杀死、灭活或去除病原体和/或病原性和/或有益微生物；
(d)消化或解离所述剩余部分以提供细胞悬浮液；
(e)任选地从消化的或解离的细胞或组织材料中培养至少一些细胞；和
(f)分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分细胞表达一种或多种期望的生物标志物的细胞群。
在一些实施方案中，在使粘膜层与渗透压特性不在生理范围内的溶液接触以诱导对粘膜层细胞的渗透压休克之前，将粘液从组织或组织部分或样品中去除。
在另一方面，本公开涉及从十二指肠、其一部分或取自十二指肠的样品中分离BGSC的方法，其包括：
(a)消化或解离十二指肠、其一部分或取自十二指肠的样品，以提供消化或解离的细胞物质；
(b)从消化或解离的细胞材料中获得：(i)表达Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44、CK19 中的一种或多种的细胞或其中至少一些或实质性部分或大部分表达Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44、CK19 中的一种或多种的细胞群；和/或(ii)同时表达SOX17和PDX1的细胞或其中至少一些或实质性部分或大部分同时表达SOX17和PDX1的细胞群。
在分离BGSC或包括BGSC的细胞群的方法的一些实施方案中，将十二指肠、其一部分、取自其的样品、所述剩余部分和/或消化的或解离的细胞或组织材料或其组合与消毒剂或灭菌介质、溶液或试剂接触。
如本文所用，术语“消毒剂”预期包括破坏病原体和/或诸如细菌、病毒和真菌的病原性和/或有益微生物的所有介质、溶液或试剂，并且还包括能消灭细菌或真菌孢子的培养基、溶液或试剂。在一些实施方案中，消毒剂是次氯酸盐溶液。在一些实施方案中，消毒剂是具有约0.01％至约0.1％的次氯酸钠或约0.1％至约0.2％的次氯酸钠的溶液。在一些实施方案中，消毒剂是0.01％的次氯酸钠溶液、0.02％的次氯酸钠溶液、0.05％的次氯酸钠溶液、0.1％的次氯酸钠溶液、0.15％的次氯酸钠溶液或0.2％的次氯酸钠溶液。在一个优选的实施方案中，消毒剂是0.05％的次氯酸钠溶液。
或者，在一些实施方案中，消毒剂可以是选自乙醇、氢氧化钠、醛、氧化剂、过氧酸、酚类、季铵化合物、无机化合物(例如氯、碘、酸和碱、金属)或萜烯的介质、溶液或试剂。如本文所用，消毒剂还包括抗生素，例如青霉素、多粘菌素、利福霉素、脂环霉素、喹诺酮或磺酰胺等。
本公开的发现是，将十二指肠、其一部分或取自十二指肠的样品与消毒剂或灭菌介质、溶液或药剂接触，导致所获得的BGSC或包括BGSC的细胞群基本上不含病原体和/或不含病原性和/或有益微生物。生物学领域的普通技术人员将理解，生物学和化学现象很少(如果有的话)去完成和/或继续完成或达到或避免绝对结果。因此，本文中使用术语“基本上”来体现许多生物学和化学现象中固有的潜在的完整性缺失(lack of completeness)。例如，在一些实施方案中，术语“基本上不含病原体和/或不含病原性和/或有益微生物”可以指这样的情形，即其中病原体和/或病原性和/或有益微生物的存在水平，对于期望的用途而言可能是可接受的，或者可能不会阻止BGSC或包括BGSC的细胞群体实现其期望用途，或者通过众所周知的方法无法在目标样品中检测到。这样的方法包括例如对革兰氏阳性、革兰氏阴性、需氧和厌氧细菌的标准无菌测试，以及支原体和内毒素测试。这也适用于，根据本公开的方法从组织或组织部分或样品获得除BGSC以外的细胞或细胞群体的情形下有关的术语“基本上不含病原体和/或不含病原性和/或有益微生物”。
因此，本公开的组合物可包含BGSC或包括BGSC的细胞群，其基本上不含病原体和/或不含致病性和/或有益微生物，并且表达一种或多种标志物：Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44、CK19以及同时有SOX17和PDX1。
本公开的组合物还可包含分离的BGSC或其他多能细胞，或包括此类细胞的细胞群，以及生理上可接受的介质。如本文所用，术语“生理上可接受的介质”是指常规药学实践用于配制用于施用于对象(例如人患者)的药物组合物的任何介质。生理上可接受的介质可以包括生理盐水或含有葡萄糖和其他补充剂的等渗溶液，所述其他补充剂例如是碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐、甘露醇)、蛋白质、多肽或氨基酸(例如甘氨酸)、抗氧化剂、维生素、螯合剂(如EDTA或谷胱甘肽)、佐剂(例如氢氧化铝)和防腐剂。本发明的组合物可被配制用于将BGSC或包括BGSC的细胞群体注射到对象的循环系统中或直接注射到靶器官或组织中。
因此，本公开涉及基本上不含病原体和/或不含致病性和/或有益微生物的BGSC组合物或包括BGSC的群体以及生理上可接受的介质的组合物，其中BGSC或群体表达Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44、CK19以及SOX17+PDX1中的一种或多种。
使用分离的布鲁纳氏腺干/祖细胞(BGSC)的方法
本文所公开的BGSC和/或包括BGSC的细胞群被考虑用于医学治疗。
例如，本公开涉及治疗被诊断患有涉及或影响肝脏、胰腺、胃、十二指肠、小肠、大肠、直肠和/或其他内胚层组织的疾病或病症的对象的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的BGSC群体。
在一些实施方案中，本公开涉及一种治疗被诊断患有涉及或影响肝脏、胰腺、胃、十二指肠、小肠、大肠、直肠和/或其他内胚层组织的疾病或病症的对象的方法，包括给予有效量的细胞群，所述细胞群包括至少一些、实质性部分或大部分的BGSC，该BGSC表达选自以下的一种或多种标志物：Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44、CK19以及SOX17+PDX1。
在另一方面，本公开涉及一种自体细胞或基因疗法的方法，该方法包括给予有效数量的BGSC或包括至少一些或实质性部分或大部分的BGSC的细胞群，所述BGSC表达选自以下的一种或多种标志物：Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44、CK19以及SOX17+PDX1，并且进一步的特征是，在支持自我更新的培养条件下能够以有限的或最小限度的分化增殖。在该自体细胞或基因疗法的方法的一些实施方案中，细胞是基因工程改造或修饰的细胞。
在另一方面，本公开涉及一种同种异体细胞或基因疗法的方法，该方法包括给予有效数量的BGSC或包括至少一些或实质性部分或大部分的BGSC的细胞群，所述BGSC表达选自以下的一种或多种标志物：Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44、CK19以及SOX17+PDX1，并且进一步的特征是，在支持自我更新的培养条件下能够以有限的或最小限度的分化增殖。在该同种异体细胞或基因疗法的方法的一些实施方案中，细胞是基因工程改造或修饰的细胞。
在另一方面，本公开涉及BGSC在治疗涉及或影响肝脏、胰腺、胃、十二指肠、小肠、大肠、直肠和/或其他内胚层组织的疾病或病症中的用途和/或在自体或同种异体细胞或基因疗法中的用途，其中BGSC表达选自以下的一种或多种标志物：Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44、CK19以及SOX17+PDX1，并且进一步的特征是，在支持自我更新的培养条件下能够以有限的或最小限度的分化增殖，并且任选地，细胞是基因工程改造或修饰的细胞。
在另一方面，本公开涉及细胞群体在治疗涉及或影响肝脏、胰腺、胃、十二指肠、小肠、大肠、直肠和/或其他内胚层组织的疾病或病症中的用途和/或在自体或同种异体细胞或基因疗法中的用途，其中所述细胞群体包括至少一些、实质性部分或大部分的BGSC，其表达选自以下的一种或多种标志物：Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44、CK19以及SOX17+PDX1，并且任选地，细胞是基因工程改造或修饰的细胞。
如本文所用，对象的疾病的“治疗”是指(1)防止症状或疾病在尚未表现出疾病症状或表现出有限症状的对象中发生；(2)抑制疾病或阻止其发展；或(3)改善或导致疾病或疾病症状的消退。如本领域中所理解的，“治疗”是一种用于获得有益的或期望的结果(包括临床结果)的方法。为了本技术的目的，有益的或期望的结果可以包括一种或多种以下情况，但不限于，减轻、改善或停止一种或多种症状，减轻病况(包括疾病)的程度，稳定(即(不恶化)病况(包括疾病)的状态，病况(包括疾病)的进展的延迟或减慢，病况(包括疾病)的状态的改善或减轻以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。
如本文所用，术语“有效量”是指足以治疗所治疗的疾病或病状的量。有效量可以分成一次或多次施用、应用或剂量。这种递送取决于许多变量，包括使用单个剂量单位的时间段、组合物的生物利用度、给药途径等。然而，应理解，对于任何特定患者来说，组合物的具体量可能取决于多种因素，包括所用特定药物的活性、患者的年龄、体重、总体健康状况、合并发病率、性别和饮食、给药时间、代谢和/ 或排泄速率、药物组合、要治疗的特定疾病或病症(例如肝病)的严重程度和给药形式。
具体实施方式
本文的公开内容表明：i)人和/或动物十二指肠含有在本文中称为布鲁纳氏腺干/祖细胞(BGSC)的细胞(包括在布鲁纳氏腺内的细胞)，其具有内胚层干/祖细胞的表型特征，多能性或多潜能性标志物和其他生物标志物呈阳性；ii)这些细胞具有与粘膜隐窝内的肠干细胞不同的表型，包括但不限于Tra-1-60、Tra1-81、OCT4和CK7表达；iii)这些细胞也具有与肝干细胞(表达SOX17但不表达PDX1)和胰腺干细胞(表达PDX1但不表达SOX17)不同的表型，因为BGSC可能同时表达SOX17和PDX1；iv)可以通过化学、机械和/或手术程序或方法分离BGSC，所述化学、机械和/或手术程序或方法至少部分破坏粘膜上皮细胞(绒毛和隐窝)，但至少部分保留粘膜下层；v)可以在体外选择BGSC，它们显示出自我更新的特性，形成和生长为球体、类器官、细胞聚集体或细胞簇的能力，并显示出多能性；vi)在体内，BGSC能够移植到组织中并分化成与这些组织相关的谱系，例如移植到SCID小鼠的肝脏中并向成熟的肝细胞分化。
布鲁纳氏腺是位于十二指肠粘膜下层的独特黏液腺。在胃、小肠的其他部分(即空肠和回肠)或大肠中均未发现这些腺体。它们的主要已知功能在于产生粘液，该粘液保护十二指肠粘膜免受来自胃的物质的酸性影响。布鲁纳氏腺体的数量从幽门孔到十二指肠空肠弯曲逐渐减少，在十二指肠下部和上升部分几乎消失。在十二指肠壁中，粘膜肌层将布鲁纳氏腺与肠隐窝(或腺体)分开，但它们在解剖学上直接连续。肠隐窝包含特定数量的干细胞，参与沿着隐窝-绒毛轴的肠上皮细胞的持续更新。
本文提供的数据证实，除了粘液细胞外，布鲁纳氏腺还含有表达特定系列的干细胞标志物的细胞群，这些标志物例如是SOX9、Lgr5、EpCAM、CD44和/或SOX17+PDX1。这些细胞很小，胞质很少，核质比很高，它们的表型与胚胎腹侧内胚层的特征相匹配。此外，这些细胞的有限的亚群(近5％)表达多能性标志物，例如Oct4A、SOX2、Tra-1-60和Tra-1-81。此外，BGSC显示出增殖标志物PCNA的表达，从而表明它们的复制活性，可能与粘蛋白产生细胞的更新有关。有趣的是，干细胞标志物的表达是精确分布的：多能性标志物在深部腺泡中的细胞中表达，而Lgr5和PCNA在粘膜肌层附近与肠隐窝连续的细胞中表达。这种分布表明存在两个不同但重叠的BGSC种群：一个种群具有原始表型，是静止的并且位于粘膜下层深处。另一个种群显示了转运扩增(transit-amplifying)特征，穿过粘膜肌层，并且在空间上与肠隐窝相联。然而，“静止的”和转运扩增的BGSC群体均表现出可与肠道隐窝的细胞(Lgr5+/CK7-/CK19+/Tra-1-60-)明显区分开的表型(Lgr5+/-/CK7+/CK19+/Tra-1-60+)。
本文公开的方面涉及已开发出的从人十二指肠分离BGSC或具有至少一些或实质性部分或大部分BGSC的群体的方法，包括：化学、机械或手术破坏粘膜层以至少部分去除表面上皮细胞，留下可暴露出粘膜下层的剩余部分；消化或解离粘膜下层；分离表达本公开中描述的标志物的细胞或包括这样的细胞的细胞群；这种方法包括选择培养条件，例如在无血清Kubota培养基中维持的球体、类器官、细胞聚集体或细胞团的培养。一旦分离，细胞在体外即与在器官中描述的表型(例如Lgr5+/-/CK7+/CK19+/Tra-1-60+/多能性基因+)匹配，从而证实了细胞制备物中肠干细胞的消耗。在体外，BGSC能够以球体、类器官、细胞聚集体或细胞簇的形式生长，并保持其未分化表型，而没有表达成熟细胞标志物，也没有粘蛋白产生的迹象。值得注意的是，当转移到特定的分化条件下时，BGSC能够迅速走向各种命运，包括至少向肝细胞、胆管细胞和内分泌胰腺谱系发展。
有趣的是，以前的报告指出，如果不重新编程，人胃上皮和十二指肠细胞不会显示干细胞行为和多能性(见表)。相反，本文公开的结果证明了在人类和动物十二指肠(包括布鲁纳氏腺)中发现了干/祖细胞(BGSC)。鉴于它们在器官中的位置，这些BGSC或包括这些BGSC的细胞群体可以使用本公开中描述的方法容易地分离，并且不需要重新编程，而是固有地显示内胚层干/祖细胞的特征、特性和能力，并且具有多能性。
在这项研究中，已经测试了向成熟内胚层命运分化的能力。例如，已经通过血管途径将BGSC注射到鼠肝中。
在肝病领域，原位肝移植目前是急性肝衰竭和终末期慢性肝病的唯一治疗方法。由于肝脏移植受到器官供体严重短缺的限制，因此细胞治疗策略可能是在等待器官分配时支持肝功能的可行替代方案。然而，用于肝脏疾病的再生医学方法需要确定可持续且容易获得的细胞来源。
本公开提供了具有多能性能力的新颖的干细胞小体以及从产后的十二指肠分离适用细胞的方法。人BGSC是可从人类供体获得的潜在易得来源。与重新编程的细胞相比，这些细胞不需要进行基因重编程或进行重大操作，因此在临床程序中应更易于使用(并且可能是更安全的方法)。此外，它们作为细胞来源具有独特的潜力，可以使用内窥镜检查取得，然后用于自体或同种异体细胞和基因疗法。
缩略词
AFP，甲胎蛋白；ALB，白蛋白；BTSC，胆管树干细胞；CD，共同决定基；CD44，透明质酸受体；CD133，prominin；CFTR，囊性纤维化跨膜电导调节蛋白；cGMP，当前的良好生产规范；CK，细胞角蛋白；CXCR4，CXC趋化因子受体4(也称为fusin或CD184；也称为血小板因子4)；DAPI，6-二脒基-2-苯基吲哚；DPBS，Dulbecco磷酸盐缓冲盐水；EGF，表皮生长因子；EpCAM，上皮细胞粘附分子；FBS，胎牛血清(或FCS，胎牛血清)；FGF，成纤维细胞生长因子(FGF 10是FGF的多种形式之一)；HB，成肝细胞；HDM，激素定义培养基；HDM-C，用于谱系限制细胞为胆管细胞的HDM；HDM-H，用于谱系限制细胞为肝细胞的HDM；HDM-P，用于谱系限制细胞为胰腺命运的HDM；HGF，肝细胞生长因子；HpSC，肝干细胞；IF，免疫荧光；IHC，免疫组化；KM，Kubota培养基，一种专为内胚层干细胞设计的无血清培养基；KRT，细胞角蛋白基因；Lgr5，与R-spondin结合的富含亮氨酸的含重复序列的G蛋白偶联受体5；MKM，改良的Kubota培养基，由补充了钙、铜和bFGF的Kubota培养基组成；NANOG，与自我更新深度相关的转录因子；NCAM，神经细胞粘附分子；NIS，钠/碘同向转运体；OCT4(八聚物结合转录因子4)，也称为POU5F1(POU结构域，5类，转录因子1)，一种由干细胞表达的基因；PBS，磷酸盐缓冲盐水；PDX1，胰腺和十二指肠同源盒1，一种对胰腺发育至关重要的转录因子；PBG，胆管腺，胆管树干细胞的干细胞小体；RMPI，Roswell Memorial Park Institute-该研究所的研究人员建立的各种基础培养基均使用首字母缩写词；RT-PCR，逆转录聚合酶链反应；SALL4，Sal样蛋白4，对干细胞的自我复制很重要；SOX，与Sry相关的HMG盒子；SOX2是一种转录因子，对于维持胚胎干细胞和确定性干细胞中的自我更新或多能性至关重要。SOX9，与内胚层组织(肝、肠、胆管树和胰腺)相关的转录因子；SOX17，是肝分化必不可少的转录因子；VEGF，血管内皮细胞生长因子。
材料和方法
人体组织寻源
人十二指肠是从意大利罗马的Sapienza University of Rome的“ ParideStefanini” Department of General Surgery and Organ Transplantation 的器官捐赠者那里获得的。从我们的移植计划中获得了将组织用于研究目的的知情同意。协议已获得机构审查委员会的批准，并且处理符合当前的良好生产规范(cGMP)。Umberto IPoliclinico of Rome道德委员会审查并批准了该研究方案。
介质和溶液
所有介质均经过无菌过滤(0.22-μm过滤器)，并在使用前于4°C避光保存。RPMI-1640(所有细胞培养的基础培养基)和胎牛血清(FBS)从GIBCO/Invitrogen (Carlsbad, CA)获得。除非另有说明，否则所有试剂均购自Sigma (St. Louis, MO)。除另有说明外，生长因子购自R&D Systems (Minneapolis, MN)。
“Kubota培养基(KM)”由任何基础培养基(此处为RPMI 1640)组成，其无铜、低钙(0.3 mM)、含10-9 M硒、0.1％牛血清白蛋白(BSA)、4.5 mM烟酰胺、0.1 nM七水合硫酸锌、10-8 M氢化可的松(或地塞米松)、5 µg/ml转铁蛋白/ Fe、5 µg/ml胰岛素、10 µg/ml高密度脂蛋白以及添加时与纯化的人血清白蛋白结合的游离脂肪酸混合物。Kubota和Reid首先报道了其制备的详细方案，作为成肝细胞的确定性培养基2。此后，Kubota培养基已被证明对鼠类、啮齿动物和人肝干细胞、胆管树干细胞、成肝细胞、胆囊来源的干细胞和胰腺祖细胞有效3-9。
为了进行分化研究，在无血清的KM中添加钙(最终浓度：0.6 mM)、铜(10-12 M)和20ng/ml bFGF，并称为改良的Kubota培养基(MKM)。MKM用作基础，并与特定的补充剂一起制备不同的激素定义培养基(HDM)，用于诱导BG细胞向胰岛(HDM-P)以及肝(HDM-H)选择性分化：
•用于肝分化的HDM-H：其制备过程是向MKM补充7μg/ L胰高血糖素、2 g/L半乳糖、1nM三碘甲状腺素3(T3)、10 ng/ml抑瘤素M(OSM)；10 ng/ml表皮生长因子(EGF)、20 ng/ml肝细胞生长因子(HGF)以及1 µm地塞米松。
•用于胰腺胰岛细胞分化的HDM-P：向不含氢化可的松的MKM补充2％B27、0.1 mM抗坏血酸、0.25 µM环巴胺、1 µM视黄酸；在最初的4天添加bFGF，然后用50 ng/ml exendin-4和20 ng/ml HGF代替。
磁性分选程序
通过使用磁珠免疫选择，按照制造商(Miltenyi Biotec Inc., Germany)规定的规程，对细胞进行EpCAM或TRA-1-60分选。简言之，用EpCAM MicroBeads (Miltenyi BiotecInc.,货号#130-061-101)或TRA-1-60 MicroBeads (Miltenyi Biotec Inc., 货号 #130-100-832)磁性标记阳性细胞。然后，将细胞悬液加载到置于MACS分离器的磁场中的MACS LS柱(Miltenyi Biotec Inc., 货号#130-042-401)上。磁性标记的细胞保留在柱内，而未标记的细胞则通过。从磁场中移出色谱柱后，将磁性保留的细胞洗脱为阳性选择的细胞部分。如前所述通过细胞计数和细胞生存力评估阳性细胞。将阳性细胞以每毫升300,000个细胞的浓度悬浮在基础培养基中，并用作最终的细胞悬浮液。收集N.4等分试样，其包含大约200,000个细胞，用于流式细胞术。
GMP条件下的细胞分离和无菌测试
为了在cGMP条件下生产BG干/祖细胞以备将来临床应用，按照“欧盟药品管理规定”和欧洲人用药品生产管理规范(EudraLex-第4卷良好生产管理指引)对十二指肠进行处理。无菌测试是在cGMP条件下，通过“直接接种方法”并按照人用和兽用药品的良好生产规范进行。
细胞培养和克隆扩增
从十二指肠样品中获得的未分选和分选的细胞(约3 x 105)被接种到直径3 cm的塑料培养皿中，并在含10％FBS的KM中过夜(~12小时)。此后，将细胞培养物保持在无血清的KM中并观察至少2个月。为了测试克隆扩增，获得单细胞悬液，并将细胞以500个细胞/cm2的克隆接种密度接种于无血清KM(一种自我复制培养基)中。
类器官的制备和培养
离心后，将细胞沉淀物悬浮在KM中，并将3×105个细胞置于12孔2.2厘米直径的塑料培养皿中，并在含10％FBS的KM中放置过夜(~12小时)；此后，为培养物提供无血清的KM。将细胞在KM中于培养箱中培养1周，37°C、大气氧气、5％CO2，从而获得更多的细胞群。7天后，将细胞从12孔板中移出，并将细胞沉淀包埋在400μl冷基质胶中(Corning Matrigel降低基底膜基质生长因子，无酚红)。申请人接种了体积为400μl的凝胶，每个12孔板含2×105个细胞。聚合后(15分钟，37°C)，凝胶上覆盖有500μl的类器官培养基。类器官培养基基于Ad-DMEM/F12 (Life Technologies)，并补充了B27、N2(Life Technologies)和1.25 mM N-乙酰半胱氨酸(Sigma-Aldrich)、10 nM胃泌素(Sigma-Aldrich)和生长因子：50 ng/ml EGF(Peprotech)、1μg/ ml重组人R-Spondin-1(Perotech)、100 ng/ml FGF10(Peprotech)、25ng/ml HGF(Peprotech)、10 mM烟酰胺(Sigma-Aldrich)、5μM A83-01(Tocris)和10μMForskolin(FSK)。申请人每2-3天更换一次培养基，在显微镜下控制类器官的大小和数量。
10-14天后，使用细胞回收液(Corning)和冰冷的PBS从Matrigel中移除类器官。用细胞回收液(Corning)轻轻破坏培养凝胶中的类器官，以将Matrigel破碎成小碎片，同时将类器官保留为整个球体。然后将类器官缓慢离心，以获得收集在试管底部的完整类器官。用移液管除去大部分上清液，并用4％福尔马林固定类器官沉淀以进行进一步分析。
阳性对照
NTERA-2克隆D1多能人类胚胎细胞系(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA；代码:01071221)被用作多能性标志物(SOX2、OCT4A和NANOG)的阳性对照，用于流式细胞分析、细胞培养和RT-PCR实验10。此外，人睾丸精原细胞的片段用作多能性标志物免疫组织化学实验的阳性对照。
HT-29是人结肠腺癌细胞系(LGC Standards S.r.L，Milan, Italy；代码：ATCC-HTB-38)，被用作Lgr5抗体的阳性对照，用于流式细胞术和RT-PCR实验。正常的胰岛细胞被用作胰岛分化实验的对照，并购自ProdoLab, Irvine CA US (HIR-001)。
原代人肝细胞(Clonetics™人肝细胞系统NHEPS™细胞，代码：CC-2591S)购自Lonza (Basel, Switzerland)，并用作肝细胞分化实验的阳性对照。
正常的胰岛细胞被用作胰岛分化实验的对照，并购自ProdoLab, Irvine CA US(HIR-001)。
光学显微镜(LM)、免疫组织化学(IHC)和免疫荧光(IF)
根据标准操作规范，将样品在10％福尔马林缓冲液中固定2-4小时，包埋在低温融合石蜡(55-57°C)中，并用苏木精-伊红和Sirius red/Fast green对3-4μm切片染色。对于IHC，在甲醇过氧化氢(2.5％)中孵育30分钟可阻断内源性过氧化物酶活性。如供应商所指示的，通过在室温下应用蛋白酶K(Dako，代码S3020)10分钟来回收抗原。然后将切片与一抗在4°C孵育过夜(补充表1)。样品用PBS漂洗两次，每次5分钟，然后在室温下与生物素化的二抗(LSAB+ System-HRP, Dako, 代码K0690；Glostrup, Denmark)孵育20分钟，然后与链霉亲和素-HRP(LSAB+ System-HRP, Dako, 代码K0690)一起孵育。二氨基联苯胺(Dako)用作底物，切片用苏木精复染。为了在细胞培养物上进行免疫荧光，将载玻片室在室温下在丙酮中固定10分钟，然后用PBS-Tween 20漂洗。非特异性蛋白结合被5％正常山羊血清阻断。固定细胞与一抗一起孵育。然后，将细胞洗涤并与标记的同种型特异性二抗(抗小鼠AlexaFluor-546、抗小鼠Alexafluor-488、抗兔Alexafluor-488、抗山羊AlexaFluor-546，Invitrogen, Life Technologies Ltd, Paisley, UK)孵育1小时，并用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染以可视化细胞核。对于所有的免疫反应，还包括阴性对照，包括用免疫前血清代替一抗。切片/培养物由配备有Jenoptik Prog Res C10 Plus摄像头(Jena,Germany)的Leica Microsystems DM 4500 B光学和荧光显微镜(Weltzlar, Germany)以编码方式进行检查。还通过共聚焦显微镜(Leica TCS-SP2)分析了IF染色。LM、IHC和IF观测是通过图像分析系统(IAS-Delta Sistemi，意大利罗马)进行处理的，并且由两名研究人员以盲法独立进行。
通过图像分析系统(IAS-Delta Sistemi，意大利罗马)评估了BG占据的区域。通过使用它，申请人确定BG占据的体积已被计算为腺性腺泡占据的总面积，并表示为相对于十二指肠粘膜下层总面积的百分比。每张载玻片的所有计数均在六个不重叠的视野(放大倍数x20)中进行；每个标本至少要取3张不同的载玻片。
对于IHC/IF染色，每个载玻片/培养物在六个不重叠的视野(放大倍数x 20)中以随机、盲法的方式对阳性细胞的数量进行计数，并将数据表示为阳性细胞百分比。IF染色也通过数字扫描仪(AperioScanscope FL System, Aperio Technologies, Inc, Oxford,UK)进行扫描，并由ImageScope处理。图像分析算法已用于量化单个荧光团或两个荧光团共定位区域的正像素面积的比例。为了测试糖原贮存能力，按照制造商的程序采用高碘酸-希夫(PAS)染色系统(Sigma Aldrich，INC，货号395)和α-淀粉酶(Sigma Aldrich，INC，货号A3176)消化程序(再进行PAS染色)。
流式细胞术(FC)分析
用胰蛋白酶消化培养的细胞，通过轻柔吸移使其解离，并以大约2 x 105细胞/ ml的浓度悬浮在PBS中。用荧光一抗或同种型对照标记分离的细胞。对于细胞内抗原，在与一抗孵育之前，将细胞固定在4％多聚甲醛中，并用PBS-皂苷0.5％-FCS 10％透化。一抗包括EpCAM(EpCAM-FITC, MiltenyiBiotec Inc., 货号#130-080-301)、Lgr5(Lgr5-PE, OrigeneTechnologies Inc., Rockville, MD, USA 货号 #TA400001)、TRA-1-60(TRA-1-60-PE,MiltenyiBiotec Inc., 货号#130-100-347)。通过BD FACScantoTM流式细胞仪(Becton,Dickinson and Company, NJ, USA)分析细胞。通过BD FACSDivaTM软件(Becton,Dickinson and Company, NJ, USA)获取并分析了上万个事件。
逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析
在于无血清KM中维持6天的组织或培养物上进行RNA提取，然后在KM或其中一种HDM中再培养7天(共13天)。如前所述，通过Chomczynski和Sacchi 11的方法提取总RNA。使用配备有RNA StSens分析芯片(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)的Experion自动电泳系统RNA评估RNA的质量和数量。RNA提取是在无血清KM中保持6天的培养物中进行的，然后在KM或其中一种HDM中再培养7天(共13天)。通过逆转录进行白蛋白(ALB)、细胞色素P450(CYP3A4)、胰岛素(INS)、胰高血糖素(GLUC)、PDX-1、SOX17、OCT4A、SOX2和NANOG基因的表达，并在封闭的试管中从细胞和组织中提取的总RNA样品进行PCR扩增(OneStep RT-PCR byQiagen, Hamburg, Germany)。将这些基因与用作参考的GAPDH管家基因共同扩增。基因表达通过使用芯片上毛细管微电泳对扩增子进行定量，使用Experion System (Bio-Rad,UK)进行测量。目的基因的表达通过目的基因与参考基因GAPDH的浓度之比(仪器以nmol/L报告)来计算(补充表2)。
BGSC的体内移植到正常小鼠的肝脏中
将五只SCID(严重的免疫缺陷综合症)雄性小鼠饲养在平均温度为22°C的房间中，进行12小时的明暗循环，并可以自由使用标准的颗粒食物和水。按照我们的机构指南进行研究方案。实验程序得到Sapienza University of Rome和Umberto I University Hospitalof Rome的欧盟指令2010/63/EU的动物实验伦理委员会的批准(方案编号：541)。通过脾动脉将2×106的溶于100μl盐水中的人BGSC悬浮液注射至肝脏。模拟对照(sham-control)小鼠仅输注100μl盐水。严密监视所有动物，直到恢复，并允许它们自由获取食物和水。没有观察到死亡。
移植后一个月，处死动物，并收获肝脏。将肝片段置于10％缓冲的福尔马林中进行组织学和免疫组化，并置于Trizol试剂中进行基因表达分析。在苏木精和曙红(H＆E)和Sirius Red染色中分别评估了坏死和纤维化。如其他地方所述，通过免疫组织化学评估了人类BGSC移植到鼠肝中的分化情况，以评估不与小鼠抗原反应的抗人抗体(抗人线粒体抗体、抗人HepPar-1抗体、抗人白蛋白抗体)。用ImageScope处理的数字扫描仪(AperioScanscope CS System, Aperio Technologies, Inc, Oxford, UK)扫描免疫组织化学染色的(抗人线粒体)载玻片。图像分析算法将量化抗人线粒体阳性细胞所占面积的比例。
如先前所述进行小鼠中人白蛋白的RT-PCR。简言之，通过使用Universal ProbeLibrary Assay Design Center (Roche)，将人白蛋白的特异性引物(补充表2)设计为可编程的特异性序列，以从鼠基因中特异性区分人白蛋白基因。
统计分析
数据表示为平均值±标准差(SD)。统计学分析通过SPSS统计软件(SPSS Inc. ChicagoIL, USA)进行。通过Mann-Whitney U检验对非正态分布参数的组间差异进行了检验。统计学显著性设置为p值<0.05。
实施例1-从粘膜中分离细胞
包括肝-胰腺壶腹和胰腺的人十二指肠是从意大利罗马的Sapienza University ofRome 的‘‘Paride Stefanini’’ Department of General Surgery and OrganTransplantation的器官供体中获得的。通过我们的移植计划，获得知情同意将组织用于研究目的。所有样本均来自19至73岁之间的成年人。方案获得我们机构审查委员会的批准，并且处理符合当前的良好生产规范(cGMP)。该研究方案由罗马的Umberto I UniversityHospital伦理委员会审查和批准。小心地将人十二指肠与胰腺分开，并通过外科手术切除含有肝胰壶腹的肠。用手术刀将十二指肠切成薄片。此后，如前所述处理组织标本。简言之，在补充有0.1％牛血清白蛋白、1 nM硒、抗生素、I型胶原酶(300胶原消化单位/ml)(Sigma-Aldrich Italy)、0.3 mg/ml脱氧核糖核酸酶(Sigma-Aldrich, Italy)的RPMI 1640中消化组织，温度为37ºC，频繁搅拌30-45分钟。悬浮液通过800微米金属筛网过滤器(IDEALEACLRI9 inox不锈钢)过滤，并在重新悬浮前以270g旋转10分钟。此后，使细胞悬浮液连续通过100和30微米的网孔过滤器。然后，通过Fast-Read 102 (Biosigma Srl, Venice,Italy)进行细胞计数，并通过Trypan Blue试验(表示为活细胞占总细胞的百分比)进行细胞活力的测定。当用于人十二指肠时，先前开发并成功用于肝脏和胆道树的相同方法反而导致了大聚集体的产生。这些大的聚集体包含被包被的和被压碎的细胞，这些细胞不断地(N=10)导致产生非存活的分离的细胞，从而无法获得细胞培养物。据推测，这是由于消化组织的物理和化学性质导致的，其被粘液和由粘膜上皮细胞释放的降解产物高度饱和，并且导致形成一种结合了在手术过程中被压碎的细胞的分子网。实际上，在动物或人类中建立的从肠中分离细胞的方法避免粘膜上皮的破坏。
通过这种方法获得的培养物的另一个特征是频繁的污染(6/10)。由于这些结果，采取的策略是将粘膜上皮与粘膜下层分开，以保留布鲁纳氏腺并避免上述微生物污染问题。尝试了四种不同的策略：1)手术解剖(N=3)，2)事先在粘膜下注射生理盐水再进行粘膜切除术(N=3)，3)刮除粘膜(N=3)，4)选择性溶解粘膜(N=10)。除了通过注入肠腔的特定洗涤剂溶液选择性溶解十二指肠粘膜外，所有方法均证明不合逻辑且与初始方法产生相同的结果。
不成功和不理想的分离程序
小心地将人十二指肠与胰腺分开，并通过外科手术切除含有肝胰壶腹的整个部分的肠。用手术刀将十二指肠切成薄片。此后，在补充有0.1％牛血清白蛋白、1 nM硒、抗生素、I型胶原酶(300胶原消化单位/ml)(Sigma-Aldrich Italy)、0.3 mg/ml脱氧核糖核酸酶(Sigma-Aldrich, Italy)的RPMI 1640中消化组织，温度为37ºC，频繁搅拌30-45分钟。悬浮液通过800微米金属筛网过滤器(IDEALE ACLRI9 inox不锈钢)过滤，并在重新悬浮前以270g旋转10分钟。此后，使细胞悬浮液连续通过100和30微米的网孔过滤器。然后，通过Fast-Read 102 (Biosigma Srl, Venice, Italy)进行细胞计数，并通过Trypan Blue试验(表示为活细胞占总细胞的百分比)进行细胞活力的测定。
当用于人十二指肠时(N=5)，先前开发并成功用于肝脏和胆道树的相同方法导致了分离出40,816,000(标准差)个细胞并且通过Trypan Blue试验测定仅一半是存活的(存活率43+/-12.8 %)。不论活细胞的数量如何，分离的细胞都无法粘附并在培养物中存活，其中出现的大的聚集体包含被包被的和被压碎的细胞，导致细胞死亡，无法获得细胞培养物。而且，通过这种方法获得的培养物总是被细菌污染(5/5)。
这种失败的结果可能是由于被消化的组织的物理和化学特性所致，该组织已被粘液和粘膜上皮细胞释放的降解产物高度饱和，并导致细胞滞留在粘膜碎片中并在过程中被压碎。
另一个关键点是在粘膜层内存在肠干细胞小体(肠隐窝)。鉴于这些发现，我们选择将粘膜上皮与粘膜下层分开。这些操作通过4种不同的策略完成：1)手术解剖(N=3)，2)在粘膜下注射生理盐水后进行粘膜切除术(N=3)，3)刮除粘膜(N=3)和4)选择性溶解粘膜层(N=10)。就粘膜去除而言，最佳策略是策略＃4，因为策略＃1-3导致部分去除了粘膜层，并且存在肠隐窝(图11)。此外，在细胞分离和生存率方面，策略4导致了最佳方法。
通过在肠腔注入特定洗涤剂溶液选择性溶解十二指肠粘膜。
分离胰头附近的十二指肠后，将Vater的壶腹完全切除，并用外科手术夹钳将肠闭合。打开十二指肠的末端，通过从上至下按压组织将肠粘液从下切口中挤出并除去。这一部分的操作非常重要，因为组织应尽可能不含粘液。通过使用25 ml的血清移液管，从上端切口将约200 ml的蒸馏水(Gibco, Italy)冲洗入十二指肠；保持下端切口被夹住以收集水(图8A)。之后，通过夹住两个末端约20分钟以保持肠道完全充满蒸馏水，以诱导对粘膜上皮细胞选择性的渗透性损伤。以这种方式，十二指肠将看起来是弓形的(图8B)。打开下端并除去水后，通过使用25 ml血清移液管将十二指肠内部用100 ml DPBS(Gibco)洗涤两次。通过使用25 ml血清移液管，从上端切口将约200 ml DPBS(Gibco，意大利)冲洗入十二指肠。通过类似的步骤，将十二指肠内部充满洗涤剂溶液(100毫升)，并保持充满1分钟，该溶液由0.5毫升磷脂酰胆碱(Sigma-Aldrich, Italy)、20mg脱氧胆酸(Sigma-Aldrich, Italy)和99.5 ml的DPBS(Gibco，意大利)组成。通过打开下端再次除去溶液，并用100ml DPBS洗涤十二指肠内部。最后，将十二指肠转移到10cm无菌培养皿中，并通过纵向切口打开(图8C)。
通过使用无菌手术刀在上/下以及横向上进一步剥离粘膜，要特别注意从组织的小褶皱(折叠)处去除粘液。在具有100ml DPBS(Gibco，意大利)的无菌容器中洗涤组织。通过将组织浸入200 ml的0.05％次氯酸钠中几秒钟，然后通过用DPBS溶液冲洗来进行清洗，从而获得灭菌肠道。然后，使用无菌剪刀和手术刀将组织切成小块。在机械和化学程序去除粘膜之后，收集标本并进行处理以进行组织形态分析。此后，如先前所述处理组织标本(图8D)。简言之，将组织碎片收集在装有消化缓冲液的两个M管(Milteny Biotec, Germany)中并振摇。为了达到组织的解离状态，进行了一个或两个循环的MACS Dissociator(MilteniyBiotec，德国)程序(应注意到溶液的不透明性以及非常小的组织碎片的产生)。将消化缓冲液预热至34°C，持续10分钟(该温度下酶具有最佳效率)。机械解剖后，将含有组织碎片的溶液在含有DTT的溶液(Sigma-Aldrich，意大利)中稀释(组成的详细信息请参见下文)，然后放入两个50 ml的Falcon管中。将Falcon管以1,300 rpm(300 g)离心5分钟。收集沉淀，并插入75平方cm的存在150ml消化缓冲液的烧瓶中。将该烧瓶用封口膜(Parafilm，美国)密封，在水加热器中水平放置约30分钟，37℃，5％CO2，不时摇动以控制消化。此后，将烧瓶垂直放置约10分钟以使细胞在重力作用下沉降。溶液表面的漂浮上清液含有杂质，可以使用10 ml血清移液管丢弃。
酶消化后，将包含组织片段的缓冲液放入四个50 ml Falcon管中。将Falcon管以1,300 rpm(300 g)离心5分钟。将沉淀收集到两个50 ml Falcon管中，并用含DTT的溶液稀释(组成的详细信息请参阅下文)，然后将管在1300 rpm(300 g)下离心5分钟。收集上清液并将其置于800微米金属筛网过滤器(IDEALE ACLRI9 inox不锈钢)上，并与新鲜的细胞洗涤物一起过滤。将滤液材料收集在无菌容器中。在过滤过程中，使用刮刀和注射器的柱塞(Terumo＃SS-20ES2)促进滤过并进一步分解组织。用两个小瓶的DNase Pulmozyme 2500U/2.5 ml(Roche，Italy)处理平均200 ml的所得悬浮液(图8D)。
从胎儿十二指肠和从成年对象的内镜十二指肠活检中分离BGSC
与为从成年完整十二指肠获得细胞而优化的程序相比，从十二指肠活检和胎儿器官中分离BGSC的方法不那么复杂。
在Department of Translational and Precision Medicine的胃镜检查期间，用镊子在肠球(bulb)水平从远端取出十二指肠活检组织。受过训练的肠胃病医生使用此方法来获得用于多种疾病的材料。该过程用柔性内窥镜在内窥镜下完成。内窥镜是经口导入的。活体组织是通过观察获得的，从而避免了带有任何动脉或静脉。收集的活组织的组织学检查显示，BG存在于从肠球(而非十二指肠远端)获得的活组织中(图15A)。BG位于粘膜下层中粘膜肌层的正下方。然后，在此过程中，从每位患者的十二指肠球上收集2至4个活检样本，并将其用于分离细胞。
通过在幽门水平切下近端和在Treitz韧带水平切开远端，从胎儿收获胎儿十二指肠(18-22周：在妇产科进行治疗性流产)。通过在肝胰壶腹水平去除胰脏和胰内胆管而将它们除去。
随后，将整个胎儿十二指肠或整个十二指肠活检组织进一步用手术刀和MACS解离器(Miltenyi Biotec)进行分解，并在含有300 U/ml I型胶原酶(Sigma Aldrich)和0.3mg/ml脱氧核糖核酸酶(Sigma Aldrich)的缓冲液中在37°C消化20–30分钟。使用磁珠(Miltenyi biotec)对新鲜分离的细胞进行TRA1-60阳性细胞的免疫选择。
该分选导致从胎儿十二指肠平均分离出1200万个活细胞(N=3)，从十二指肠球活检组织分离出100,000个活细胞(N=2)。分离过程的平均时间为5小时。将细胞以每毫升一百万个细胞的浓度悬浮在无菌的10％葡萄糖溶液中，并在培养前于4°C的控制温度下保持45分钟。根据该方案的自我复制布鲁纳氏腺细胞在图15B中示出。所有程序均根据“欧盟药品规章”和《欧洲人用药品GMP指南》(EudraLex，第4卷，良好生产规范)进行。通过针对革兰氏+、革兰氏-、需氧和厌氧细菌、真菌的标准无菌测试和内毒素测试评估细胞产物，并立即通过流式细胞术(FC)对TRA1-60(Miltenyi Biotec，人类；稀释度1:50)进行表征。
实施例2-组织和细胞的表征
人十二指肠组织的研究
成人十二指肠(N=10)的粘膜升高到肠绒毛中并在肠腺(隐窝)中折叠，肠腺可以被横向切割并可在固有层深处观察到(图1A)。在十二指肠的近端部分(上部和降段)，粘膜下层包含腺体元素(十二指肠腺或布鲁纳氏腺：BG)，共同占粘膜下层面积的9.95±2.68％和总壁面积的4.62±1.93％。BG主要由PAS阳性粘液细胞组成(图1A)。BG通过粘膜肌层与肠隐窝在解剖学上连续。少数BG腺泡位于粘膜固有层内，并与肠隐窝连续(图1A)。在十二指肠的远端部分(下部和升段)，BG逐渐消失，下部几乎没有腺体元素(每20x视野近1个)，而在升段几乎没有腺体。
在人十二指肠中，免疫组织化学分析表明，BG细胞和肠隐窝部分共享表型性状。关于细胞角蛋白的表达，肠隐窝和BG均为CK19阳性。相反，CK7由一些BG细胞特异性表达，但不由肠腺表达(图1B和图9)。肠腺和BG都含有表达SOX9的细胞(内胚层干细胞的标志物，图1C)。在BG中，SOX9与CK7在同一细胞中共表达。
而且，肠腺和BG包含表达PCNA(增殖标志物)和几种其他干/祖细胞标志物(例如CD44、EpCAM和Lgr5)的细胞(图2A)。在BG中，Lgr5与SOX9共定位，并且其在位于粘膜肌层内部与肠隐窝连续的腺泡中的表达要比位于粘膜下层内更深处的腺泡中的表达高(图10A)。
BG细胞的亚群表达多能性标志物(图2)。有趣的是，Tra-1-60和Tra-1-81由BG细胞表达，而不由肠隐窝中的细胞表达(图2A)。Tra-1-60与SOX2和Oct4A在同一BG细胞中共定位(图2B)。最后，BG包含表达NIS的细胞，NIS也由肠隐窝表达(图10B)。
总而言之，对干细胞/祖细胞标志物表达的半定量分析表明，BG包含由SOX9+(9.12％±3.30)细胞和增殖细胞(PCNA+：4.82％±1.33)组成的小体。此外，BG的小体包含表达内胚层干细胞特征的细胞，例如Lgr5(4.76％±1.04)、EpCAM(8.80％±0.65)；近5％的细胞表达多能性标志物，例如Tra-1-60、Tra-1-81、Oct4A和SOX2。有趣的是，与肠道腺体直接连续的腺泡中PCNA+/SOX9+/Lgr5+细胞(SOX9+/Lgr5+: 11.80% ± 4.40；PCNA+: 5.95% ±2.25；p< 0.05)比黏膜下层深处的腺泡中的数量(SOX9+/Lgr5+: 4.80% ± 1.50；PCNA+:0.98% ± 0.62；p< 0.05)更多。相比之下，位于粘膜下层较深位置的腺泡中的多能性细胞更多。
啮齿动物十二指肠组织的研究
与人类一样，啮齿动物十二指肠的粘液腺位于黏膜下层。啮齿类动物SG与肠隐窝直接连接，而没有完整的粘膜肌层。由于粘液含量的原因，它们具有清晰的细胞质，因此它们可与隐窝区分开(图13A)。SG限于啮齿动物十二指肠的近端部分。研究SOX9和PCNA的表达时，SOX9+细胞位于SG中，而PCNA+细胞主要位于隐窝中(26.1±5.7％)，只有少数SG细胞为PCNA阳性(6.7±2.2%;相对隐窝p<0.01)。十二指肠SG和隐窝的Ck19表达也不同，前者几乎为阴性，后者为阳性(图13A)。在小鼠空肠中，隐窝含有SOX9+、PCNA+和Ck19+细胞(图13B)。基于这种表型特征和SG中PCNA+细胞的百分比较低，我们引入了Krt19CreTdTomatoLSL小鼠谱系追踪模型，以评估SG更新是否从十二指肠隐窝中的Ck19+/PCNA+细胞进行。首先，分析空肠以估计肠隐窝中的重组效率(图13C)。td-Tomato (Td-Tom)阳性隐窝的百分比为72±6％，阴性隐窝紧邻阳性隐窝。td-Tom+隐窝上方的绒毛始终为td-Tom阳性，因此，位于td-Tom-隐窝上方的绒毛为td-Tom阴性。当检查小鼠十二指肠时，Ck19-SG几乎是都是td6 Tom-细胞，包括位于130 td-Tom+隐窝正下方的细胞(图13C)；并且一致地，SG内的PCNA+和SOX9+细胞是td-Tom-(图13D)。综上所述，这些数据表明，与十二指肠隐窝相比，啮齿动物SG中的细胞增殖速率较低。此外，在生理条件下，十二指肠隐窝细胞不支持SG更新，并且SG中的SOX9+和PCNA+细胞并非源自Ck19+隐窝细胞。
成功的BGSC分离和培养程序
在如实施例1中那样对十二指肠组织进行化学和机械处理之后，除去了表面上皮细胞和粘膜层的几乎所有隐窝，同时保留了固有层和粘膜肌层的结缔组织(图3A)。由于它们在粘膜肌层下和粘膜下层中的解剖位置，因此可以保存BG。因此，BG显得是完整的并保留了它们的CK7+(图3B)、Tra-1-60+(图3C)和SOX9+(未显示)细胞。
如方法部分所述进一步处理十二指肠粘膜下层，分离出近350±100百万个细胞，存活率> 80％(85±5％)。FC显示40.0±18.5％的新鲜分离的细胞是EpCAM+。当针对EpCAM免疫分选细胞时，细胞群富集至70.3±19.3％EpCAM+细胞(相对于预分选，p <0.05)，其中这些细胞中的46.3％±7.3也是Lgr5+(图4A)。还通过流式细胞术(FC)研究了从十二指肠分离的细胞中Tra-1-60的表达。FC显示新鲜分离的细胞的5.8±1.6％是Tra-1-60+。对Tra-1-60进行免疫分选时，细胞群富集至30.4±19.8％Tra-1-60+细胞(相对于预分选，p <0.05)和Tra-1-60+的7.3％±4.2 也是EpCAM+(代表性散点图在图4B中示出)。磁免疫分选后，通过在塑料上和培养为类器官的两种不同培养选择方法进一步去除污染的细胞群。首先，获得单细胞悬液并以500个细胞/cm2的克隆接种密度接种在含无血清Kubota培养基的塑料上，该培养基允许内胚层干细胞/祖细胞的存活和自我复制，但不允许成熟细胞或间充质细胞的存活和自我复制。在这些条件下，仅Tra-1-60+细胞能够增殖(图4C)。它们在1-2天的滞后期后开始增殖，并在培养6-8天后形成10-15个细胞的小簇(图4C)。14天后，观察到大的集落(图4C)。每个集落主要由小的(直径= 12.06±5.76 µm)、密集堆积、均匀且具有高核质比的细胞形成。自我复制培养条件导致几乎所有间充质细胞(未显示)的消失(如先前在BTSC的培养选择中所述)。其次，在适合类器官形成的培养条件下，单个BGSC开始自组织为球形结构，尺寸和数量进一步扩大。通常，类器官在培养3-5天后可见，其平均直径在大约13-14天内达到2.3±5 mm。类器官的形成决定了Tra-1-60+细胞的富集，Tra-1-60+细胞是形成类器官的主要细胞表型(图4D)。
BGSC 2D克隆和BGSC衍生的类器官的表型特征
在塑料上和在KM中(自我复制条件，图5A)，表型分析表明培养物如何由表达CK7、SOX9、EpCAM、Lgr5和多能性标志物(SOX2、Tra-1-60、Tra-1-81)的细胞组成。
并行地，类器官(图5B)由CK7+和CK19+细胞组成；类器官细胞表达内胚层干细胞标志物(EpCAM、Pdx1)和多能性标志物(Oct4A和Tra-1-60)。类器官是PAS阴性的(杯状细胞特征)，并且对一些成熟细胞标志物(如Villin、CFTR、白蛋白、Hep-Par1和胰岛素)呈阴性(数据未显示)。
通过RT-PCR进一步研究了BGSC表型；与充足的阳性对照的比较显示，在塑料上的单层BGSC和在类器官中的BGSC表达内胚层基因生物标志物(例如EpCAM、SOX17和PDX1，图5C)和多能性生物标志物(例如SOX2、OCT4A和NANOG，图5D)。在这些情况下，细胞大多对肝细胞(即白蛋白)、胆管细胞(即CFTR)和β-胰腺细胞(即胰岛素)谱系的标志物呈阴性(数据未显示)。
BGSC的体外分化潜能
通过将从BG分离的细胞转移到专门为诱导向肝(HDM-H)或内分泌胰腺(HDM-P)谱系分化的不同培养基中，评估了它们的分化潜能。
在HDM-H中7到14天后(图6A)，大多数细胞的形态发生了显著变化，从小的纺锤形细胞变为多边形(立方体)形细胞。与在KM中培养的细胞相比，这些细胞聚集形成多细胞索，并具有更大的直径(p <0.01)。细胞大小相当于正常的二倍体成人肝细胞的大小。IF显示这些大的多边形细胞表达白蛋白(图6A)。此外，PAS染色显示在HDM-H中存在PAS阳性细胞(图6A)，但在KM细胞中不存在(未显示)，并且用α-淀粉酶消化后，未检测到可见的PAS染色(未显示)。这支持了在HDM-H中培养的细胞的糖原贮存能力。RT-PCR分析(图6A)显示，与KM中的细胞进行比较时，HDM-H中细胞的肝细胞特异性基因的表达增加，包括白蛋白(≈2倍)、转铁蛋白(中期或2区；> 100倍)和CYP3A4(药物代谢，晚期或3区基因；>100倍)。
在HDM-P中放置14天后，观察到胰岛样结构。这些结构由表达Ngn3和胰岛素的紧密堆积的细胞组成(图6B)。在HDM-P中7天后，RT-PCR分析表明，与KM细胞中的发现相比，PDX1而非胰岛素和胰高血糖素基因表达增加(图12)。在HDM-P中放置14天后，与KM中的细胞相比，检测到PDX1、胰岛素和胰高血糖素基因表达的显著增加(图6B)。
Tra-1-60+十二指肠SG细胞可以在体外迅速限制为β-胰腺命运，并且SG可以在体内自发产生胰岛素表达细胞。通过将从十二指肠SG分离出的细胞转移到定制以诱导向内分泌胰岛谱系的分化培养基(PM)中，来评估其体外分化潜能。在PM中7天后，观察到少量的胰岛样结构的存在(每个培养物1.4±0.5)(图14A)。RT-PCR分析表明，与KM相比，PDX1而不是胰岛素基因在PM中上调。并行地，通过免疫荧光分析确定，胰岛样结构显示PDX1的表达，但不表达胰岛素(图14B)。在PM中放置14天后，与7天相比，胰岛样结构的数量显著增加(每个培养物4.8±0.8；p <0.01)。基于RT-PCR分析，PDX1基因表达在14天PM中比KM高，但比在7天PM中低(图14B)。胰岛素和胰高血糖素基因的表达在14天时极度增加(图14C)，达到用作对照的胰岛的水平。14天后，胰岛素+和胰高血糖素+细胞以胰岛样结构出现(图14C)。
为了研究十二指肠SG细胞在体内定向至内分泌胰腺命运的潜能，我们调查了小鼠实验性诱导的糖尿病是否可以引起获得特定胰腺性状。因此，研究了两种不同的链脲佐菌素(STZ)模型。高剂量STZ模型的特征是血糖水平快速升高和高死亡率。低剂量STZ模型显示血糖升高较慢且不太明显，并且生存期较长，从而延长了观察时间。当用高STZ剂量处理小鼠并在14天后处死时，与对照相比，十二指肠SG程度增加(图14D)。此外，与对照相比，更高百分比的SG细胞表达PCNA、PDX1和NGN3(图14E-F)。最后，在2/5经STZ处理的小鼠中，在十二指肠SG内观察到胰岛素+和胰高血糖素+细胞(图14E-F)，但在对照中没有观察到。然而，没有发现与血糖曲线相关。这些数据与来自啮齿动物十二指肠的样品的RT-PCR分析一致，其特征是与胰腺内分泌命运有关的基因的表达增加(图14G)。当给予低剂量的STZ时，这些特征没有出现(数据未显示)。最后，研究了从2型糖尿病(T2D)患者获得的人十二指肠中胰岛素的表达。在来自T2D患者的十二指肠SG中发现少量(＜5％)的胰岛素+细胞，但是在正常对象的十二指肠SG中则未发现(图14H)。
未分化的人BGSC体内移植到小鼠肝脏中
通过经由血管途径的注射(脾脏注射)移植到SCID小鼠的肝脏中，研究了BGSC产生体内成熟的肝细胞的潜力。如先前报道，通过免疫染色仅与人抗原反应的特异性抗体(即抗人线粒体、抗人细胞核抗体、抗人白蛋白抗体和抗人HepPar-1抗体)评估BGSC的植入。细胞注射后一个月，在小鼠肝脏内观察到人(h)线粒体+细胞(图7A)；阳性细胞主要位于门管区周围，一些细胞也向小叶中心位置延伸。在注射的小鼠中，人抗原+细胞占宿主肝细胞质量的近5.1±1.3％(图7B)。此外，h-线粒体+移植的细胞对成熟肝细胞标志物例如白蛋白(图7D)和HepPar-1(图7E)呈阳性。在小叶间胆管内观察到少量抗人细胞核抗体阳性的细胞。这些细胞对CK19呈阳性(数据未显示)。
为了证实移植的hBGSC的有效植入和分化，申请人进一步研究了鼠肝中人白蛋白mRNA的表达。在从注射的小鼠收获的肝脏中可测量人白蛋白mRNA(图7C)，但在模拟对照小鼠(输注盐水)中未检测到。
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Claims (138)

1.从十二指肠分离的干/祖细胞(称为布鲁纳氏腺干/祖细胞或BGSC)，其表达一种或多种选自Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9和细胞角蛋白7(CK7)的标志物，并且其进一步特征在于能够在支持自我更新的培养条件下以有限的或最小限度的分化增殖。
2.根据权利要求1所述的分离的BGSC，其基本上不含病原体和/或病原性和/或有益微生物。
3.根据权利要求1所述的分离的BGSC，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少一个月。
4.根据权利要求1所述的分离的BGSC，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少两个月。
5.根据权利要求1所述的分离的BGSC，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少六个月。
6.根据权利要求1所述的分离的BGSC，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少十二个月。
7.根据权利要求1所述的分离的BGSC，其中支持自我更新的培养条件包括无血清培养基，任选地为Kubota培养基。
8.根据权利要求1所述的分离的BGSC，其中支持自我更新的培养条件包括含有血清的培养基。
9.从十二指肠分离的干/祖细胞(称为布鲁纳氏腺干/祖细胞或BGSC)，其表达一种或多种选自Lgr5、NIS、CD44和CK19的标志物，其进一步特征是能够在支持自我更新的培养条件下以有限或最小限度的分化增殖。
10.根据权利要求9所述的分离的BGSC，其基本上不含病原体和/或病原性和/或有益微生物。
11.根据权利要求9所述的分离的BGSC，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少一个月。
12.根据权利要求9所述的分离的BGSC，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少两个月。
13.根据权利要求9所述的分离的BGSC，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少六个月。
14.根据权利要求9所述的分离的BGSC，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少十二个月。
15.根据权利要求9所述的分离的BGSC，其中支持自我更新的培养条件包括无血清培养基，任选地为Kubota培养基。
16.根据权利要求9所述的分离的BGSC，其中支持自我更新的培养条件包括含有血清的培养基。
17.从十二指肠分离的干/祖细胞(称为布鲁纳氏腺干/祖细胞或BGSC)，其表达SOX17和PDX1，并且其进一步特征在于能够在支持自我更新的培养条件下以有限或最小限度的分化增殖。
18.根据权利要求17所述的分离的BGSC，其基本上不含病原体和/或病原性和/或有益微生物。
19.根据权利要求17所述的分离的BGSC，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少一个月。
20.根据权利要求17所述的分离的BGSC，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少两个月。
21.根据权利要求17所述的分离的BGSC，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少六个月。
22.根据权利要求17所述的分离的BGSC，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少十二个月。
23.根据权利要求17所述的分离的BGSC，其中支持自我更新的培养条件包括无血清培养基，任选地为Kubota培养基。
24.根据权利要求17所述的分离的BGSC，其中支持自我更新的培养条件包括含有血清的培养基。
25.从十二指肠分离的干/祖细胞(称为布鲁纳氏腺干/祖细胞或BGSC)，其表达一种或多种选自Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44和CK19的标志物，或同时表达SOX17和PDX1，且进一步的特征是能够在支持自我的培养条件下以有限或最小限度的分化增殖。
26.根据权利要求25所述的分离的BGSC，其基本上不含病原体和/或病原性和/或有益微生物。
27.根据权利要求25所述的分离的BGSC，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少一个月。
28.根据权利要求25所述的分离的BGSC，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少两个月。
29.根据权利要求25所述的分离的BGSC，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少六个月。
30.根据权利要求25所述的分离的BGSC，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少十二个月。
31.根据权利要求25所述的分离的BGSC，其中支持自我更新的培养条件包括无血清培养基，任选地为Kubota培养基。
32.根据权利要求25所述的分离的BGSC，其中支持自我更新的培养条件包括含有血清的培养基。
33.从十二指肠分离的干/祖细胞群，其中至少一些或实质性部分或大部分细胞表达一种或多种选自Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9和CK7的标志物。
34.根据权利要求33所述的细胞群，其基本上不含病原体和/或病原性和/或有益微生物。
35.根据权利要求33所述的细胞群，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少一个月。
36.根据权利要求33所述的细胞群，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少两个月。
37.根据权利要求33所述的细胞群，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少六个月。
38.根据权利要求33所述的细胞群，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少十二个月。
39.根据权利要求33所述的细胞群，其中支持自我更新的培养条件包括无血清培养基，任选地为Kubota培养基。
40.根据权利要求33所述的细胞群，其中支持自我更新的培养条件包括含有血清的培养基。
41.从十二指肠分离的干/祖细胞群，其中至少一些或实质性部分或大部分细胞表达一种或多种选自Lgr5、NIS、CD44和CK19的标志物。
42.根据权利要求41所述的细胞群，其基本上不含病原体和/或病原性和/或有益微生物。
43.根据权利要求41所述的细胞群，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少一个月。
44.根据权利要求41所述的细胞群，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少两个月。
45.根据权利要求41所述的细胞群，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少六个月。
46.根据权利要求41所述的细胞群，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少十二个月。
47.根据权利要求41所述的细胞群，其中支持自我更新的培养条件包括无血清培养基，任选地为Kubota培养基。
48.根据权利要求41所述的细胞群，其中支持自我更新的培养条件包括含有血清的培养基。
49.从十二指肠分离的干/祖细胞群，其中至少一些或实质性部分或大部分细胞表达SOX17和PDX1。
50.根据权利要求49所述的细胞群，其基本上不含病原体和/或病原性和/或有益微生物。
51.根据权利要求49所述的细胞群，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少一个月。
52.根据权利要求49所述的细胞群，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少两个月。
53.根据权利要求49所述的细胞群，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少六个月。
54.根据权利要求49所述的细胞群，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少十二个月。
55.根据权利要求49所述的细胞群，其中支持自我更新的培养条件包括无血清培养基，任选地为Kubota培养基。
56.根据权利要求49所述的细胞群，其中支持自我更新的培养条件包括含有血清的培养基。
57.从十二指肠分离的干/祖细胞群，其中至少一些或实质性部分或大部分细胞表达一种或多种选自Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44和CK19的标志物，或者其中至少一些或实质性部分或大部分细胞同时表达SOX17和PDX1。
58.根据权利要求57所述的细胞群，其基本上不含病原体和/或病原性和/或有益微生物。
59.根据权利要求57所述的细胞群，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少一个月。
60.根据权利要求57所述的细胞群，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少两个月。
61.根据权利要求57所述的细胞群，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少六个月。
62.根据权利要求57所述的细胞群，其能够以有限的或最小限度的分化增殖至少十二个月。
63.根据权利要求57所述的细胞群，其中支持自我更新的培养条件包括无血清培养基，任选地为Kubota培养基。
64.根据权利要求57所述的细胞群，其中支持自我更新的培养条件包括含有血清的培养基。
65.一种从对象的十二指肠、其一部分或从其获得的样品中分离一种或多种BGSC或权利要求33、权利要求41、权利要求49和/或权利要求57所述的细胞群的方法，包括：
(a)在诱导对粘膜层细胞的渗透性休克的条件下，使基本上不含肠粘液的十二指肠粘膜层与渗透压特性不在生理范围内的介质或溶液接触；
(b)通过机械、外科和/或化学方法除去或溶解至少一部分粘膜层或其细胞，留下和/或暴露可包括粘膜下层的剩余部分；
(d)消化或解离所述剩余部分；和
(e)从消化的剩余部分中分离出一种或多种BGSC或权利要求33、权利要求41、权利要求49和/或权利要求57所述的细胞群。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述分离步骤包括分离表达一种或多种选自Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44和CK19的标志物的BGSC，或其中至少一些或实质性部分或大部分细胞表达一种或多种选自Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44和CK19的标志物的BGSC细胞群。
67.根据权利要求65所述的方法，其中所述分离步骤包括分离表达SOX17和PDX1的BGSC，或其中至少一些或实质性部分或大部分细胞表达SOX17和PDX1的BGSC群体。
68.根据权利要求65所述的方法，其中使十二指肠组织基本上不含肠粘液，任选地通过挤压十二指肠组织实现。
69.根据权利要求65所述的方法，其中，所述渗透压特性不在生理范围内的介质或溶液包括低张力、低渗、高张力或高渗溶液。
70.根据权利要求65所述的方法，其中所述渗透压特性不在生理范围内的介质包括葡萄糖溶液、高盐溶液或蒸馏水。
71.根据权利要求65的方法，其中至少一部分粘膜层或其细胞的去除通过化学破坏来进行，所述化学破坏包括使用乳化剂和/或洗涤剂。
72.根据权利要求65所述的方法，其中所述洗涤剂和/或乳化剂在水、盐水和/或缓冲液中。
73.根据权利要求65所述的方法，其中短时间施加所述洗涤剂和/或乳化剂(少于15分钟)。
74.根据权利要求65所述的方法，其中所述乳化剂选自卵磷脂、聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸酯(聚山梨酸酯20)、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯(聚山梨酯80)、聚氧乙烯山梨糖醇单棕榈酸酯(聚山梨酯40)、聚氧乙烯山梨糖醇单硬脂酸酯(聚山梨醇酯60)、聚氧乙烯山梨糖醇三硬脂酸酯(聚山梨酯65)、脂肪酸铵、脂肪酸的钠盐、钾盐和钙盐、脂肪酸的镁盐、脂肪酸的单甘油酯和二甘油酯、脂肪酸的甘油单酯的和甘油二酯的乙酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的乳酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的柠檬酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的单-和二乙酰酒石酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的乙酸和酒石酸混合酯、脂肪酸的蔗糖酯、蔗糖甘油酯、脂肪酸聚甘油酯、聚甘油蓖麻油酸酯、脂肪酸的丙基-1,2-二醇酯、与脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯相互作用的热氧化大豆油、硬脂酰-2-乳酸钠、硬脂酰-2-乳酸钙、山梨糖醇单硬脂酸酯、山梨糖醇三硬脂酸酯、山梨糖醇单月桂酸酯、山梨糖醇单油酸酯、山梨糖醇单棕榈酸酯及其混合物。
75.根据权利要求65所述的方法，其中洗涤剂选自1-庚磺酸、N-月桂基肌氨酸、月桂基硫酸盐、1-辛烷磺酸和牛磺胆酸、苯扎氯铵、十六烷基吡啶、甲基苄索氯铵，溴化十烃季铵、烷基甜菜碱、烷基酰胺基烷基甜菜碱、N-十二烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐、磷脂酰胆碱、N-癸基A-D-葡糖苷、N-癸基A-D-麦芽吡喃糖苷、N-十二烷基Β-D-麦芽糖苷、N-辛基Β-D-葡糖苷、N-十四烷基Β-D-麦芽糖苷、各种Triton(Triton X-100)、Nonidet-P-40、泊洛沙姆188、月桂基硫酸钠、脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠及其组合。
76.根据权利要求65所述的方法，其中所述剩余部分包括粘膜下层。
77.根据权利要求65所述的方法，其中所述消化或解离是通过酶进行的。
78.根据权利要求65所述的方法，其中在消化或解离步骤之前切碎组织样品。
79.根据权利要求65所述的方法，其中消化或解离步骤和/或分离步骤在低附着平板上进行。
80.根据权利要求65所述的方法，其中分离步骤是通过使用培养选择来进行的，培养条件包括无血清培养基，任选地为Kubota培养基。
81.根据权利要求65所述的方法，其中分离步骤是通过使用培养选择来进行的，培养条件包括含血清培养基。
82.根据权利要求65所述的方法，其中在支持或产生球体、一种或多种类器官、细胞簇或细胞聚集体的条件下培养分离的细胞。
83.一种从对象的十二指肠、其一部分或取自其的样品中分离一种或多种BGSC或权利要求33、权利要求41、权利要求49和/或权利要求57所述的BGSC群体的方法，所述方法包括以下步骤，其中基本上杀死、灭活或去除病原体和/或病原性和/或有益微生物的步骤可在任何时间进行或不止一次进行：
(a)去除肠粘液；
(b)在诱导对粘膜层细胞的渗透性休克的条件下，施加渗透压特性不在生理范围内的介质或溶液；
(c)通过机械、外科手术和/或化学方法除去或溶解至少一部分粘膜层或其细胞，留下和/或暴露可包括粘膜下层的剩余部分；
(d)将一种介质或溶液施加到粘膜层和/或所述剩余部分上，以基本上杀死、灭活或去除病原体和/或病原性和/或有益微生物；
(e)对粘膜下层进行消化或解离以产生消化物、解离的细胞物质或细胞悬液；
(f)任选地培养至少一些所述消化物、解离的细胞物质或来自细胞悬液的细胞；和
(g)分离出表达选自Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9 、CK7、Lgr5、NIS、CD44和CK19的一种或多种标志物的细胞，或分离出其中至少一些或实质性部分或大部分细胞表达选自Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9 、CK7、Lgr5、NIS、CD44和CK19的一种或多种标志物的细胞群体；和/或同时表达SOX17和PDX1的细胞。
84.根据权利要求83所述的方法，其中肠粘液的去除包括挤压十二指肠组织。
85.根据权利要求83所述的方法，其中渗透压特性不在生理范围内的介质或溶液包括低张力溶液、低渗溶液、高张力溶液或高渗溶液。
86.根据权利要求83所述的方法，其中渗透压特性不在生理范围内的介质或溶液包括葡萄糖溶液、高盐溶液或蒸馏水。
87.根据权利要求83所述的方法，其中去除通过化学破坏进行，所述化学破坏包括使用乳化剂和/或洗涤剂。
88.根据权利要求83所述的方法，其中所述洗涤剂和/或乳化剂在水、盐水和/或缓冲剂中。
89.根据权利要求83所述的方法，其中短时间使用洗涤剂和/或乳化剂(少于15分钟)。
90.根据权利要求83所述的方法，其中洗涤剂选自1-庚磺酸、N-月桂基肌氨酸、月桂基硫酸盐、1-辛烷磺酸和牛磺胆酸、苯扎氯铵、十六烷基吡啶、甲基苄索氯铵，溴化十烃季铵、烷基甜菜碱、烷基酰胺基烷基甜菜碱、N-十二烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐、磷脂酰胆碱、N-癸基A-D-葡糖苷、N-癸基A-D-麦芽吡喃糖苷、N-十二烷基Β-D-麦芽糖苷、N-辛基Β-D-葡糖苷、N-十四烷基Β-D-麦芽糖苷、各种Triton(Triton X-100)、Nonidet-P-40、泊洛沙姆188、月桂基硫酸钠、脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠及其组合。
91.根据权利要求83所述的方法，其中乳化剂选自卵磷脂、聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸酯(聚山梨酸酯20)、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯(聚山梨酯80)、聚氧乙烯山梨糖醇单棕榈酸酯(聚山梨酯40)、聚氧乙烯山梨糖醇单硬脂酸酯(聚山梨醇酯60)、聚氧乙烯山梨糖醇三硬脂酸酯(聚山梨酯65)、脂肪酸铵、脂肪酸的钠盐、钾盐和钙盐、脂肪酸的镁盐、脂肪酸的单甘油酯和二甘油酯、脂肪酸的甘油单酯的和甘油二酯的乙酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的乳酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的柠檬酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的单-和二乙酰酒石酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的乙酸和酒石酸混合酯、脂肪酸的蔗糖酯、蔗糖甘油酯、脂肪酸聚甘油酯、聚甘油蓖麻油酸酯、脂肪酸的丙基-1,2-二醇酯、与脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯相互作用的热氧化大豆油、硬脂酰-2-乳酸钠、硬脂酰-2-乳酸钙、山梨糖醇单硬脂酸酯、山梨糖醇三硬脂酸酯、山梨糖醇单月桂酸酯、山梨糖醇单油酸酯、山梨糖醇单棕榈酸酯及其混合物。
92.根据权利要求83所述的方法，其中所述剩余部分包括粘膜下层。
93.根据权利要求83所述的方法，其中基本上杀死、灭活或去除病原体和/或病原性和/或有益微生物的介质或溶液包括次氯酸钠(NaClO)的水溶液或用于皮肤或表面消毒的任何溶液或试剂。
94.根据权利要求83所述的方法，其中基本上杀死、灭活或去除病原体和/或病原性和/或有益微生物的介质或溶液的施用发生在施用洗涤剂和/或乳化剂之前，或者发生在消化或解离之后，或发生在去除粘液之后。
95.根据权利要求83所述的方法，其中所述消化或解离是通过酶进行的。
96.根据权利要求83所述的方法，其中在消化或解离步骤之前切碎组织样品。
97.根据权利要求83所述的方法，其中消化或解离步骤和/或分离步骤在低附着平板上进行。
98.根据权利要求83所述的方法，其中分离步骤是通过使用培养选择来进行的，培养条件包括无血清培养基，任选地为Kubota培养基。
99.根据权利要求83所述的方法，其中分离步骤是通过使用培养选择来进行的，培养条件包括含血清培养基。
100.根据权利要求83所述的方法，其中在支持或产生球体、一种或多种类器官、细胞簇或细胞聚集体的条件下培养分离的细胞。
101.通过在低附着平板上培养权利要求1、权利要求9、权利要求17或权利要求25的细胞或权利要求33、权利要求41、权利要求49或权利要求57的细胞群而产生的细胞球、类器官、细胞聚集体或细胞簇。
102.通过在悬浮液或3D培养条件下培养权利要求1、权利要求9、权利要求17或权利要求25的细胞或权利要求33、权利要求41、权利要求49或权利要求57的细胞群而产生的细胞球、类器官、细胞聚集体或细胞簇。
103.一种治疗被诊断涉及或影响肝脏、胰腺、胃、肠或其他内胚层组织的疾病或病症的对象的方法，该方法包括向有此需要的对象施用有效量的BGSC或BGSC群体。
104.一种治疗被诊断涉及或影响肝脏、胰腺、胃、肠或其他内胚层组织的疾病或病症的对象的方法，该方法包括施用有效量的权利要求1、权利要求9、权利要求17或权利要求25所述的细胞。
105.一种治疗被诊断涉及或影响肝脏、胰腺、胃、肠或其他内胚层组织的疾病或病症的对象的方法，该方法包括施用有效量的权利要求33、权利要求41、权利要求49或权利要求57所述的细胞群。
106.一种自体细胞或基因疗法的方法，包括施用有效数量的权利要求1、权利要求9、权利要求17或权利要求25的细胞，或权利要求33、权利要求41、权利要求49或权利要求57的细胞群。
107.一种同种异体细胞或基因疗法的方法，包括施用有效数量的权利要求1、权利要求9、权利要求17或权利要求25的细胞，或权利要求33、权利要求41、权利要求49或权利要求57的细胞群。
108.根据权利要求103、104、105、106和/或107所述的方法，其中所述细胞是基因工程改造或修饰的细胞。
109.权利要求1、权利要求9、权利要求17或权利要求25的细胞用于以自体或同种异体细胞或基因疗法治疗涉及或影响肝、胰腺、胃、肠或其他内胚层组织的疾病或病症的人和/或动物的用途。
110.根据权利要求109所述的权利要求1、权利要求9、权利要求17或权利要求25的细胞的用途，其中所述细胞是基因工程改造或修饰的细胞。
111.权利要求33、权利要求41、权利要求49或权利要求57的细胞群用于以自体或同种异体细胞或基因疗法治疗涉及或影响肝、胰腺、胃、肠或其他内胚层组织的疾病或病症的人和/或动物的用途。
112.根据权利要求111所述的权利要求33、权利要求41、权利要求49或权利要求57的细胞群的用途，其中所述细胞是基因工程改造或修饰的细胞。
113.根据权利要求101或权利要求102所述的细胞球、类器官、细胞聚集体或细胞簇，其进一步包含能够将BGSC或权利要求33、权利要求41、权利要求49或权利要求57的细胞群分化为包括成熟细胞在内的后期谱系阶段的细胞的培养条件。
114.一种从对象的十二指肠、其一部分或取自其的样品中分离布鲁纳氏腺干/祖细胞(BGSC)或权利要求33、41、49或57的细胞群的方法，所述方法包括：
(a)消化或解离十二指肠、其一部分或取自其的样品，以提供消化物或解离的细胞材料；
(b)从所述消化物或解离的细胞材料中获得：(i)表达Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9 、CK7、Lgr5、NIS、CD44和CK19中的一种或多种标志物的细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分细胞表达Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9 、CK7、Lgr5、NIS、CD44和CK19中的一种或多种标志物的细胞群体；和/或(ii)同时表达SOX17和PDX1的细胞或其中至少一些或实质性部分或大部分细胞同时表达SOX17和PDX1的细胞群体。
115.根据权利要求114所述的方法，其中将十二指肠、其一部分、从其获取的样品、消化物、解离的细胞材料或其组合与介质或溶液接触，以基本上杀死、灭活或除去病原体和/或病原性和/或有益微生物。
116.一种从具有粘膜层和粘膜下层的组织或其部分或其样品分离表达一种或多种期望的生物标志物的一种或多种多能细胞或其中至少一些或实质性部分或大部分表达一种或多种期望的生物标志物的细胞群体的方法，包括以下步骤，这些步骤可以按以下顺序发生，或者在其他实施方式中，可以按不同的顺序发生：
(a)在引起对粘膜层的细胞的渗透性休克的条件下，使具有粘膜层和粘膜下层的组织的粘膜层与渗透压特性不在生理范围内的介质或溶液接触；
(b)通过机械、外科手术和/或化学方法去除或溶解至少一部分粘膜层或其细胞，留下和/或暴露可包括粘膜下层的剩余部分；
(c)使该剩余部分与介质或溶液接触，以基本上杀死、灭活或去除病原体和/或病原性和/或有益微生物；
(d)消化或解离所述剩余部分；
(e)分离一种或多种多能细胞，或其中至少一些或实质性部分或大部分细胞表达一种或多种期望的生物标志物的细胞群。
117.根据权利要求116所述的方法，其进一步包括去除表面粘液。
118.根据权利要求116所述的方法，其中所述渗透压特性不在生理范围内的介质或溶液包括低张力、低渗、高张力或高渗溶液。
119.根据权利要求116所述的方法，其中所述渗透压特性不在生理范围内的介质包括葡萄糖溶液、高盐溶液或蒸馏水。
120.根据权利要求116的方法，其中所述去除通过化学破坏来进行，所述化学破坏包括使用乳化剂和/或洗涤剂。
121.根据权利要求116所述的方法，其中所述洗涤剂和/或乳化剂在水、盐水和/或缓冲液中。
122.根据权利要求116所述的方法，其中短时间施加所述洗涤剂和/或乳化剂(少于15分钟)。
123.根据权利要求120所述的方法，其中乳化剂选自卵磷脂、聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸酯(聚山梨酸酯20)、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯(聚山梨酯80)、聚氧乙烯山梨糖醇单棕榈酸酯(聚山梨酯40)、聚氧乙烯山梨糖醇单硬脂酸酯(聚山梨醇酯60)、聚氧乙烯山梨糖醇三硬脂酸酯(聚山梨酯65)、脂肪酸铵、脂肪酸的钠盐、钾盐和钙盐、脂肪酸的镁盐、脂肪酸的单甘油酯和二甘油酯、脂肪酸的甘油单酯的和甘油二酯的乙酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的乳酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的柠檬酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的单-和二乙酰酒石酸酯、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的乙酸和酒石酸混合酯、脂肪酸的蔗糖酯、蔗糖甘油酯、脂肪酸聚甘油酯、聚甘油蓖麻油酸酯、脂肪酸的丙基-1,2-二醇酯、与脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯相互作用的热氧化大豆油、硬脂酰-2-乳酸钠、硬脂酰-2-乳酸钙、山梨糖醇单硬脂酸酯、山梨糖醇三硬脂酸酯、山梨糖醇单月桂酸酯、山梨糖醇单油酸酯以及山梨糖醇单棕榈酸酯。
124.根据权利要求116所述的方法，其中所述洗涤剂选自1-庚磺酸、N-月桂基肌氨酸、月桂基硫酸盐、1-辛烷磺酸和牛磺胆酸、苯扎氯铵、十六烷基吡啶、甲基苄索氯铵，溴化十烃季铵、烷基甜菜碱、烷基酰胺基烷基甜菜碱、N-十二烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐、磷脂酰胆碱、N-癸基A-D-葡糖苷、N-癸基A-D-麦芽吡喃糖苷、N-十二烷基Β-D-麦芽糖苷、N-辛基Β-D-葡糖苷、N-十四烷基Β-D-麦芽糖苷、各种Triton(Triton X-100)、Nonidet-P-40、泊洛沙姆188、月桂基硫酸钠、脱氧胆酸钠以及十二烷基硫酸钠。
125.根据权利要求116所述的方法，其中基本上杀死、灭活或去除病原体和/或病原性和/或有益微生物的介质或溶液包括次氯酸钠(NaClO)的水溶液或用于皮肤或表面消毒的任何溶液或试剂。
126.根据权利要求116所述的方法，其中基本上杀死、灭活或去除病原体和/或病原性和/或有益微生物的介质或溶液的施用发生在施用洗涤剂和/或乳化剂之前，或者发生在消化或解离之后，或发生在去除粘液之后。
127.根据权利要求116所述的方法，其中所述剩余部分包括粘膜下层。
128.根据权利要求116所述的方法，其中所述消化或解离是通过酶进行的。
129.根据权利要求116所述的方法，其中在消化或解离步骤之前切碎组织样品。
130.根据权利要求116所述的方法，其中所述消化或解离将粘膜下组织分解为细胞悬液、细胞混合物、细胞簇、细胞团块或细胞聚集体和/或组织碎片。
131.根据权利要求116所述的方法，其中分离步骤是通过使用培养选择来进行的，培养条件包括无血清培养基，任选地为Kubota培养基。
132.根据权利要求116所述的方法，其中分离步骤是通过使用培养选择来进行的，培养条件包括含血清培养基。
133.根据权利要求116所述的方法，其中所述分离步骤在低附着板中进行的。
134.根据权利要求116所述的方法，其中在支持或产生球体、一种或多种类器官、细胞簇或细胞聚集体的条件下培养分离的细胞或细胞群体。
135.根据权利要求116所述的方法，其包括使用生理上可接受的介质的一个或多个洗涤步骤。
136.根据权利要求116所述的方法，其中所述组织是内胚层组织。
137.根据权利要求116所述的方法，其中所述组织选自气管、主支气管、食道、胃、十二指肠、小肠、大肠和直肠。
138.根据权利要求116所述的方法，其中所述组织选自肝脏、胰腺、胆囊和胆管树导管，其中所述胆管树导管包括总管和胆囊管。
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